CN106796240A - 糖尿病性肾病的早期预测标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于体外检测患有糖尿病并且是正常白蛋白尿的受试者患糖尿病性肾病风险的方法。本发明的另一方面涉及一种用于体外鉴定糖尿病性肾病预测标志物的方法。最后，本发明涉及一种试剂盒，其包括用于检测至少两种选自下组的蛋白质的工具：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型、抗凝血酶‑III、α‑1‑抗胰蛋白酶、胶原蛋白α‑1(I)链、α‑烯醇酶、组蛋白H2B 1‑O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌‑α‑2‑糖蛋白。

Description

糖尿病性肾病的早期预测标志物
本发明属于糖尿病性肾病预测的技术领域。
糖尿病的特征在于血液中异常高水平的葡萄糖。1型糖尿病(IDDM：胰岛素依赖性糖尿病)是由胰岛的胰脏β细胞的破坏引起的，通常导致绝对胰岛素缺乏。2型糖尿病(NIDDM：非胰岛素依赖性糖尿病)的特征在于异常胰岛素抗性，其可与胰岛素贫乏症相关。糖尿病性肾病(DN)是影响糖尿病患者的一种肾小球病变。DN影响约25-40％的1型或2型糖尿病患者，并且是这些患者终末期肾病(ESRD)的主要原因。糖尿病性肾病的特征在于肾小球滤过率的改变和尿中蛋白质的逐渐异常增加。微量白蛋白尿(尿白蛋白排泄约30-300毫克/24小时)是早期DN的第一个临床症状，并且已经是诊断DN的标准测试。微量白蛋白尿阶段可持续约10年。然后，尿白蛋白的量增加超过300毫克/24小时(大量白蛋白尿)，这表明明显的DN和ESRD增加的风险。
一些研究已经使用了差异蛋白质组学方法来搜索用于诊断DN的新标志物。通常，这样的研究基于患有DN的糖尿病患者的尿蛋白质组与对照受试者(健康受试者或无DN的糖尿病患者)的尿蛋白质组的比较。
Sharma等人的文章(《蛋白质组学》2005，5，2648-2655)使用二维差异凝胶电泳分析(2D DIGE)显示，与健康受试者相比，患晚期DN且具有大量白蛋白尿的糖尿病患者的尿样本中的α1抗胰蛋白酶(AAT)增加。
在另一项研究(Rao等人，《糖尿病护理》30：629-637，2007)中，通过蛋白质鉴定相关的2D DIGE，使用LC-MS/MS，将具有正常白蛋白尿、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿的2型糖尿病患者的尿蛋白质组和对照受试者的尿蛋白质组进行比较。与正常白蛋白尿糖尿病患者相比，在DN大量白蛋白尿症患者中发现7种蛋白质以较高的相对丰度表达，4种蛋白质以较低的相对丰度表达。
Cho等人(《蛋白质组学的临床应用》2007，1，352-361)通过双向凝胶电泳(2D-GE)和ESI-Q-TOF MS/MS测试了具有正常白蛋白尿和具有微量白蛋白尿的2型糖尿病患者的血清蛋白质组。作者鉴定出一组18个蛋白质点，与正常白蛋白尿相比，在微量白蛋白尿患者中呈下调或上调，并且他们建议蛋白质DBP(维生素D结合蛋白)可能是2型DN的诊断标志物。
在Bellei等人的研究中(《蛋白质组学的临床应用》2008，2，478-491)，通过2D-GE分离以及随后进行的ESI-Q-TOF MS/MS鉴定，在患有2型糖尿病的正常白蛋白尿患者的尿中和患有DN并且相比健康受试者显示出微量白蛋白尿的2型糖尿病患者的尿中，可以发现不同表达的15种蛋白。
Afkarian等人(《分子与细胞蛋白质组学》9：2195-2204，2010)在取自健康志愿者的样本上进行基于iTRAQ(同位素标记相对和绝对定量技术)的蛋白质组学方法之前，实验了冷冻尿样本处理的不同方案。显示了在DN大量白蛋白尿患者和没有DN的糖尿病正常白蛋白尿患者之间差异表达的37种蛋白质的列表。
Jin等人(《实验糖尿病研究》，第2012卷，文章ID：168602)在正常白蛋白尿和微量白蛋白尿糖尿病患者中使用iTRAQ方法，鉴定出193种差异表达的蛋白质。在通过蛋白质印迹和MRM的选择和随后的验证之后，3种蛋白质(α1抗胰蛋白酶、α-1酸性糖蛋白1和前列腺干细胞抗原)被认为是DN的良好生物标志物。
Rossing等人(《美国肾脏病学会杂志》，2008)通过毛细管电泳-质谱(CE-MS)分析鉴定了在患有或不患有DN的糖尿病患者的尿中不同表达的一组生物标志物(主要是I型胶原蛋白的片段和尿调节素的片段)，并发现该组生物标志物允许区分患有微量白蛋白尿的糖尿病患者与向明显DN(即大量白蛋白尿)逐渐发展的糖尿病患者。因此，这样的生物标志物可以被认为是微量白蛋白尿患者是否患DN的预测标志物。然而，该出版物没有提供关于在正常白蛋白尿患者体内预测性标志物的数据。
由于在上述研究中鉴定的生物标志物仅在那些已经显示出尿白蛋白水平增加的患者体内观察到(即，当DN或至少DN的早期阶段已经形成时，才观察到差异表达)，因此，这些生物标志物只能引起诊断目的的兴趣，具体地确认DN的诊断，例如通过高水平的尿白蛋白的检测来确定。
然而，从这些研究中不能得出任何指示，表明这样的生物标志物在正常白蛋白尿患者DN发病方面的预测性价值。因此，仍然需要提供一种DN的早期预测标志物，其允许在没有显示任何异常白蛋白尿的糖尿病患者体内预测DN的发病。
一些先前的实验方法旨在鉴定DN预测的标志物：
Otu等人(《糖尿病护理》，第30卷，第3期，2007年3月)研究了10年内被随访的糖尿病患者的回顾性队列。在随访期间取自保持正常白蛋白尿的糖尿病正常白蛋白尿患者的尿样本中的蛋白质组与取自后来患上DN的正常白蛋白尿患者的样本中的蛋白质组进行比较。对应于几种肽的峰值被鉴定为在两组中被差异表达，并且12个峰值的子集被定义为预测性峰值特征，允许DN的预测。然而，根据本发明人的知识，相应的蛋白质没有被进一步表征，并且确实没有鉴定出预测标志物。
最近，一种使用毛细管电泳质谱(CE-MS)的方法突出显示了273个低分子量肽在尿液中的特异性谱，用于糖尿病性肾病的早期诊断(Zürbig等，《糖尿病》，2012)。使用先前产生的慢性肾脏疾病(CKD)生物标志物分类器(CKD273分类器)检查取自1型和2型糖尿病患者的纵向队列的尿样本，以评估所收集尿液中肽的DN病征。在患有大量白蛋白尿之前长达5年将CKD273分类器应用于正常白蛋白尿受试者的样本，与常规用于确定诊断的尿白蛋白相比，能够更早检测到向大量白蛋白尿的随后进展。虽然文章建议CDK273分类器“作为一个整体”可以允许鉴定将患上DN的正常白蛋白尿患者，但没有提示关于分类器的每个单独组分的潜在预测价值(如果有的话)。
从上文可以看出，对于糖尿病患者，尤其是正常白蛋白尿糖尿病患者体内的用于DN早期预测的单个标志物，仍然存在非常少的数据。
发明人能够在O'Brien等人1995年所描述测试的基础上，在认为有患上糖尿病性肾病风险的正常白蛋白尿糖尿病患者体内，鉴定出新的DN预测生物标志物。本发明确实依赖于令人惊讶的发现，即根据O'Brien测试被确定为有患上DN风险的患者和根据O'Brien测试被确定为没有患上DN风险的患者之间可以检测出某些蛋白质的差异表达，并且这种变化与患上糖尿病性肾病的风险相关。
因此，本发明涉及一种用于体外检测患有糖尿病且是正常白蛋白尿的受试者患糖尿病性肾病风险的方法，所述方法包括以下步骤：
(a1)测量取自受试者的生物样本中至少一种选自下组的蛋白质的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型，抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白，以及
(b)由步骤(a1)测得的水平确定所述受试者患糖尿病性肾病的风险是否增加。
本发明的另一方面涉及一种用于体外鉴定糖尿病性肾病预测标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)确定取自患有糖尿病的受试者的生物样本中蛋白质的水平，所述受试者已经被确定有患糖尿病性肾病的风险，所述生物样本在所述受试者进行体育锻炼后取得；
(b)确定取自患有糖尿病的受试者的生物样本中蛋白质的水平，所述受试者已经被确定没有患糖尿病性肾病的风险，所述生物样本在所述受试者进行体育锻炼后取得；
(c)将步骤(b)确定的水平与步骤(a)确定的水平进行比较，以及
(d)如果在步骤(c)中进行比较的各水平不同，则鉴定所述蛋白质是糖尿病性肾病的预测标志物。
本发明的另一个目的是一种试剂盒，其在单独的容器中或在同一容器中，包括用于检测至少两种选自下组的蛋白质的工具：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白。
发明内容
定义
本文中的“受试者”是指任何动物，例如脊椎动物或哺乳动物，优选为非人类或人类哺乳动物。脊椎动物的实施例包括鸟类和家禽，具体地鸡。非人类哺乳动物的实施例包括啮齿动物、马、猪和灵长类动物。最优选地，受试者是人类。
根据本发明的“受试者”是患有糖尿病的个体，即已经在所述个体中诊断出糖尿病。
“糖尿病(Diabetes mellitus)”或“糖尿病(diabetes)”是指特征在于血液中异常高水平的葡萄糖的代谢性疾病，或者是因为胰腺不产生足够的胰岛素，或者是因为细胞不对产生的胰岛素产生反应。有两种主要类型的糖尿病。
1型糖尿病由胰岛的胰脏β细胞的破坏引起，导致不能产生胰岛素，并且其通常导致绝对胰岛素缺乏。它通常需要受试者注射胰岛素或佩戴胰岛素泵。这种形式也被称为“胰岛素依赖性糖尿病”(IDDM)或“青少年糖尿病”。
2型糖尿病的特征在于异常胰岛素抗性，是一种病征，其中细胞未能正确使用胰岛素，有时与绝对胰岛素缺乏相结合存在。这种形式也被称为“非胰岛素依赖性糖尿病”(NIDDM)或“成人发病型糖尿病”。
根据本发明的“受试者”可能患有1型或2型糖尿病。优选地，根据本发明的受试者患有1型糖尿病。
“糖尿病性肾病”(DN)是影响糖尿病患者的一种肾小球病变。DN影响约25-40％的1型或2型糖尿病患者，并且是这些患者终末期肾病(ESRD)的主要原因。糖尿病性肾病的特征在于肾小球滤过率的改变和尿中蛋白质的逐渐异常增加。
早期DN的第一个临床症状是“微量白蛋白尿”，这个术语是指尿中异常量白蛋白的出现。微量白蛋白尿的检测通常用作诊断DN的标准测试。正常白蛋白尿通常被定义为低于30毫克/24小时的尿白蛋白排泄率(UAER)，而微量白蛋白尿被定义为尿白蛋白排泄率在30毫克/24小时至300毫克/24小时。微量白蛋白尿阶段可在患者体内持续约10年。然后，并发症可能发展到“大量白蛋白尿”阶段，被定义为尿白蛋白排泄率超过300毫克/24小时。大量白蛋白尿通常表明明显的DN和ESRD增加的风险。与正常、微量和大量白蛋白尿相关的尿白蛋白排泄率和尿白蛋白肌酐比(UACR)汇总在表1中。
表1：与正常、微量和大量白蛋白尿相关的尿白蛋白排泄率(UAER)和尿白蛋白肌酐比(UACR)。
根据本发明的受试者是正常白蛋白尿，即可以在他/她的尿中检测到正常量的白蛋白。例如，在所述受试者的尿中检测到的尿白蛋白排泄率(UAER)低于20微克/分钟，或低于30毫克/24小时。可选的，如果受试者是女性，则在所述受试者的尿中检测到的尿白蛋白肌酐比(UACR)低于2.5毫克/毫摩尔，或者如果受试者是男性，则检测到的尿白蛋白肌酐比(UACR)低于3.5毫克/毫摩尔，或者低于30毫克/克。
测定受试者体内UAER或UACR的方法是本领域技术人员公知的。
因此，本发明的方法允许在不呈现糖尿病性肾病的任何症状，特别是不显示微量白蛋白尿的任何症状的受试者体内早期预测糖尿病性肾病的风险。
本发明的方法是基于根据本发明的受试者的生物样本中特定蛋白质的检测。
术语“生物样本”是指任何类型的生物样本。例如，生物样本可以是尿样本、血样本、血清样本或血浆样本。最优选地，生物样本为尿样本。生物样本可以任选地经过处理以允许进一步分析，例如磷酸化蛋白质，并且这种处理可以包括使用磷酸酶抑制剂(例如用1mM原钒酸钠、10mM氟化钠、20mM甘油2-磷酸二钠和/或蛋白酶抑制剂)。此外，生物样本可任选地被浓缩和/或冷冻直至使用。具体地，可以如实施例1.4所示制备生物样本。
根据一个优选的实施方案，生物样本取自在样本收集之前进行过“体育锻炼”的受试者。如本文所使用的，“体育锻炼”或“体育活动”被定义为需要能量消耗的骨骼肌产生的任何身体锻炼。例如，受试者可以在脚踏车测力计上进行锻炼测试。为了个性化锻炼测试期间锻炼强度的增量，可以从理论最大有氧功率(Wmax)(即，对应于理论最大氧消耗(VO2max)的功率)计算每一步的工作量。因此，受试者可以进行具有相同相对增量工作量的测试，并且可以在其Wmax的相同百分比下进行比较。该测试可以包括在20％、40％、60％和80％的Wmax下六分钟稳态工作量。锻炼的持续时间通常约为24分钟。然后受试者可以在样本收集之前休息、喝水。具体地，受试者可以进行如实施例1.2或O'Brien，Watts等人，1995中所述的锻炼测试。
生物标志物
发明人惊奇地发现，可以在一子组在体育锻炼测试后被确定具有患上糖尿病性肾病风险的正常白蛋白尿糖尿病患者的生物样本中检测到某些特定蛋白质的差异表达，并且还发现，该变化与发生糖尿病性肾病的风险增加相关。
这些特定蛋白质可用作生物标志物，用于体外检测糖尿病性肾病风险的方法中，选自下组：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白。
碳酸酐酶1通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P00915的蛋白质。作为非限制性实施例，碳酸酐酶1的替代名称包括碳酸脱水酶I、碳酸酐酶B、CAB、碳酸酐酶I，CA-I或CA1(其在本文中指由基因CA1编码的蛋白质)。通常，碳酸酐酶1是催化二氧化碳水合和碳酸氢盐脱水的酶。
CD59糖蛋白通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P13987的蛋白质。作为非限制性实施例，CD59糖蛋白的替代名称包括1F5抗原、20kDa同源限制性因子、HRF20、MAC-抑制性蛋白、MAC-IP、MEM43抗原、膜攻击复合物抑制因子、MACIF、反应性裂解的膜抑制剂、MIRL、保护素或CD59(其在本文中指由基因CD59编码的蛋白质)。通常，CD59糖蛋白是补体膜攻击复合物(MAC)作用的抑制剂。其结合了组装MAC的C8和/或C9互补体。CD59由内皮细胞表达，包括肾小球和肾小管内皮细胞。
四连接素通常是指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P05452的蛋白质。作为非限制性实施例，四连接素的替代名称包括TN、C型凝集素结构域族3成员B、纤溶酶原三环结构域4结合蛋白或CLEC3B(其在本文中指由基因CLEC3B编码的蛋白质)。通常，四连接素是具有C型凝集素结构域的蛋白质，其最初被分离为纤溶酶原结合蛋白，该纤溶酶原结合蛋白可以在组织纤溶酶原激活物的存在下增强纤溶酶原激活。
胶原蛋白α-1(I)链通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P02452的蛋白质。作为非限制性实施例，胶原蛋白α-1(I)链的替代名称包括α-1I型胶原蛋白或(其在本文中指由基因COL1A1编码的蛋白)。通常，胶原蛋白α-1(I)链是I组胶原蛋白(纤维形成胶原蛋白)的成员。被称为胶原纤维的胶原丝束是支持大多数组织并从外部给予细胞结构的细胞外基质的主要组分，但是胶原蛋白也在某些细胞内部发现。
凝血酶原通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P00734的蛋白质。作为非限制性实施例，凝血酶原的替代名称包括凝血因子II或F2(其在本文中指由基因F2编码的蛋白质)。通常，凝血酶(F2a)是血液凝固的关键酶，并且它由凝血酶原(F2)通过蛋白酶解激活而得到。实际上，凝血酶原被裂解成以下4条链：活化肽片段1、活化肽片段2、凝血酶轻链和凝血酶重链。术语“凝血酶原或其片段”用于指凝血酶原、活化片段1、活化片段2、凝血酶轻链或凝血酶重链。
硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白通常是指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P98160的蛋白质。作为非限制性实施例，硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白的替代名称包括基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白、基底膜蛋白多糖、LC或HSPG2(其在本文中是指由基因HSPG2编码的蛋白质)。通常，硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白是结合了许多细胞外基质(ECM)组分和细胞表面分子的大型多结构域蛋白多糖。其由血管内皮和平滑肌细胞合成并沉积在细胞外基质中。HSPG2被裂解成以下2条链：血管生成抑制剂(78kDa)和LG3肽(22kDa)。下文中，术语“硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段”用于表示硫酸肝素蛋白多糖核心蛋白、血管生成抑制剂或LG3。
甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为O00187的蛋白质。作为非限制性实施例，甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2的替代名称包括MBL相关丝氨酸蛋白酶2、甘露糖结合蛋白相关丝氨酸蛋白酶2或MASP2(其在本文中指由基因MASP2编码的蛋白质)。MASP2的替代剪接产物是由185个氨基酸组成的且分子量为20.62kDa的名为MAp19或sMAP(小MBL相关蛋白)的蛋白质。通常，甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2是一种血清蛋白酶，其在经由甘露糖结合凝集素的补体系统激活中起重要作用。在通过自身催化裂解活化后，其裂解C2和C4，导致它们活化和形成C3转化酶。MASP2被裂解成以下2条链：甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2A链和甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2B链。在本说明书中，术语“甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2”一般地表示MASP2或Map19。
α-1-抗胰蛋白酶通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P01009的蛋白质。作为非限制性实施例，α-1-抗胰蛋白酶的替代名称包括α-1蛋白酶抑制剂、α-1-抗蛋白酶或Serpin A1(其在本文中表示由基因Serpin A1编码的蛋白质)。通常，α-1-抗胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶的抑制剂，其主要靶标是中性粒细胞弹性蛋白酶，但其对纤溶酶和凝血酶也具有中度亲和力。其是FXIa和激肽释放酶的主要血浆抑制剂。
血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂通常是指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P05154的蛋白质。作为非限制性实施例，血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂的替代名称包括顶体丝氨酸蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂3、PAI-3、蛋白C抑制剂，PCI或Serpin A5(其在本文中指由基因Serpin A5编码的蛋白质)。通常，血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂是蛋白酶抑制剂的丝氨酸蛋白酶抑制剂族的成员。在人体中，其在肝脏中产生并分泌到血液中。其抑制包含蛋白质C抗凝血剂途径、活化蛋白质C和凝血酶-血栓调节蛋白复合物的蛋白酶。
抗凝血酶-III通常是指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P01008的蛋白质。作为非限制性实施例，抗凝血酶-III的替代名称包括ATIII或Serpin C1(其在本文中是指由基因Serpin C1编码的蛋白质)。通常，抗凝血酶-III是血浆中重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其调节血凝级联。其抑制凝血酶以及因子IXa和Xa。
α-烯醇酶通常指2013年1月28日在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P06733的蛋白质。作为非限制性实施例，α-烯醇酶的替代名称包括2-磷酸-D-甘油酸水裂解酶、C-myc启动子结合蛋白质、烯醇酶1、MBP-1、MPB-1、非神经烯醇酶、NNE、磷酸丙酮酸水合酶、纤溶酶原结合蛋白质或ENO1(其在本文中是指由基因ENO1编码的蛋白质)。ENO1的替代剪接产物是由341个氨基酸组成的分子量为36.92kDa的名为MPB-1的蛋白质。在本说明书中，术语“α-烯醇酶”一般地表示ENO1和/或MPB-1。
组蛋白H2B 1-O型通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P23527的蛋白质。作为非限制性实施例，组蛋白H2B 1-O型的替代名称包括组蛋白H2B.2，组蛋白H2B.n，H2B/n或HIST1H2BO(其在本文中是指由基因HIST1H2BO编码的蛋白质)。
谷氨酰胺酰基肽环转移酶通常是指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为Q16769的蛋白质。作为非限制性实施例，谷氨酰胺酰基肽环转移酶的替代性名称包括谷氨酰胺酰基环化酶、QC、sQC、谷氨酰胺酰基-tRNA环转移酶、谷氨酰基环化酶、EC或QPCT(其在本文中是指由基因QPCT编码的蛋白质)。QPCT的替代剪接产物是由312个氨基酸组成的且分子量为35.42kDa的名为QPCT亚型2的蛋白质。在本说明书中，术语“谷氨酰胺酰基肽环转移酶”一般表示上文定义的QPCT蛋白和/或QPCT亚型2。
蛋白质AMBP通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P02760的蛋白质。作为非限制性实施例，蛋白质AMBP的替代名称包括AMBP(其在本文中是指由基因AMBP编码的蛋白质)。蛋白质AMBP被裂解成以下3条链：α-1-微球蛋白(替代名称：蛋白质HC、α-1微糖蛋白或复合成形的糖蛋白异质电荷)、间-α-胰蛋白酶抑制剂轻链(替代名称：ITI-LC、双库尼茨抑制剂、EDC1、HI-30或富含糖醛酸蛋白质)和胰蛋白酶抑制剂。在下文中，术语“蛋白质AMBP”一般表示蛋白质AMBP、α-1-微球蛋白、间-α-胰蛋白酶抑制剂轻链和/或胰蛋白酶抑制剂。
锌-α-2-糖蛋白通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被标引为P25311的蛋白质。作为非限制性实施例，锌-α-2-糖蛋白的替代名称包括Zn-α-2-GP，Zn-α-2-糖蛋白或AZGP1(其在本文中是指由基因AZGP1编码的蛋白质)。
应当理解，在本发明的方法中给定蛋白质的测量包括相关生物样本中天然存在的蛋白质的测量，这意味着其包括具有任何可能出现的潜在转译后修饰(例如糖基化、磷酸化等)的相同蛋白质的测量。
体外检测糖尿病性肾病风险增加的方法
本发明涉及一种用于体外检测患有糖尿病且是正常白蛋白尿的受试者患糖尿病性肾病风险的方法，所述方法包括以下步骤：
(a1)测量取自受试者的生物样本中至少一种选自下组的蛋白质的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型，抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白，以及
(b)由步骤(a1)测得的水平确定所述受试者患糖尿病性肾病的风险是否增加。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
(a1)测量取自受试者的生物样本中至少一种选自下组的蛋白质的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型，以及
(b)由步骤(a1)测得的水平确定所述受试者患糖尿病性肾病的风险是否增加。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
(a1)测量取自受试者的生物样本中至少一种选自下组的蛋白质的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂和甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型，并测量取自受试者的生物样本中至少一种选自下组的蛋白质的水平：抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白，以及
(b)由步骤(a1)测得的各水平确定所述受试者患糖尿病性肾病的风险是否增加。
糖尿病性肾病(DN)是一种影响约25-40％的糖尿病患者的肾小球病变。因此，在糖尿病患者群体中，统计学上约25-40％的受试者会患上糖尿病性肾病，而剩余的60-75％的受试者将不会患上糖尿病性肾病。为了能够预防可能患上糖尿病性肾病的患者的发病，期望尽早评价糖尿病患者患上糖尿病性肾病的风险，即在糖尿病性肾病的第一症状出现之前，例如当糖尿病患者仍然是正常白蛋白尿时，就预测糖尿病患者出现糖尿病性肾病的可能性。
“检测患有糖尿病的受试者患糖尿病性肾病的风险增加”是指预测所述患者中糖尿病性肾病的出现或发病或评估所述患者患有糖尿病性肾病的可能性。“检测患有糖尿病的受试者患糖尿病性肾病的风险增加”还指确定所述患者是否可能患上糖尿病性肾病。
“测量至少一种蛋白质的水平”是指“测量至少一种蛋白质的表达水平”。该步骤可以使用本领域熟知的任何方法进行。例如，一种或多种蛋白质的表达水平可以通过凝胶电泳，例如2D凝胶电泳来确定。电泳可以与质谱，例如LC/MS-MS联用。一种或多种蛋白质的表达水平也可以通过质谱直接测定，例如靶向质谱。一种或多种蛋白质的表达水平也可以通过免疫印迹测定法测定，例如蛋白质印迹。可选的，一种或多种蛋白质的表达水平可以通过ELISA、多路复用或抗体阵列等免疫测定法进行测量。具体地，一种或多种蛋白质的表达水平可以如实施例1.5、1.10和1.11中所述进行测量。
根据一个实施方案，可以在检测糖尿病性肾病风险增加的方法的步骤a1)中测量几种蛋白质的水平。因此，该方法的步骤a1)可以包括：测量至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种选自下组的蛋白质的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白，优选地选自下组：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白。各种蛋白质的水平可以同时或依次地测量。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法还包括步骤(a2)：将步骤(a1)中测得的水平(一个或多个)与至少一个预定值进行比较，而步骤(b)包括：基于步骤(a2)的比较，确定受试者存在患糖尿病性肾病的风险增加。
术语“预定值”优选地是指在取自患有糖尿病且被确定为不具有患糖尿病性肾病风险的正常白蛋白尿受试者的生物样本中测得的所述至少一种蛋白质的平均水平。
在本发明的上下文中，“正常白蛋白尿受试者”是指UAER或UACR如表1所示的受试者。
在本发明的上下文中，如果在至少2年的监测期之后，在受试者体内没有临床发现糖尿病性肾病，则这样的受试者“被确定为没有患糖尿病性肾病的风险”。
可选的，被确定没有患糖尿病性肾病风险的受试者是那些在体育锻炼后保持正常白蛋白尿的正常白蛋白受试者，如O'Brien，Watts等人，1995(《糖尿病护理》，第18卷，第12期，1995年12月)所述。使用体育锻炼来确定没有患糖尿病性肾病的风险在以下情况下是特别有利的，即对照受试者在至少2年的时期内难以(或不能)被监测。
在根据本发明方法的另一个具体实施方案中，其中测定了至少两种蛋白质的水平，从如上所述的所述至少两种蛋白质的水平获得的虚拟标志物的水平可与至少一个预定值进行比较。例如，在专利申请US2013/0210661(Bio-Rad Innovations&CNRS)和US2014004538(Bio-Rad Innovations，CHRU Lille，Universitéde Lille 2)中描述了用于组合至少两种蛋白质结果的虚拟标志物的使用。
预定值可以是阈值，例如中值或平均值，或者数值的范围，例如置信区间。
具体地，预定值可以对应于已知没有患糖尿病性肾病风险的一组糖尿病个体中蛋白质的平均水平。预定值还可以对应于已知没有患糖尿病性肾病风险的一组糖尿病个体中最多观察到的蛋白质水平的数值范围。
预定值还可以对应于在步骤a1)测量所述至少一种蛋白质所用生物样本的取样时间之前取自所述受试者的生物样本中测量的至少一种蛋白质的水平。例如，预定值可以是在时间t0取自受试者的样本中的所述至少一种蛋白质的水平，而在步骤a1)中测定的蛋白质水平是在时间tx取自同一受试者的生物样本中测量的，其中t0和tx不同，并且tx在t0之后。tx和t0(A＝tx-t0)之间的时期A的数量级优选为数月(优选24个月，还优选20个月，还优选18个月，还优选16个月，还优选14个月，还优选12个月，还优选11个月，还优选10个月，还优选9个月，还优选8个月，还优选7个月，还优选6个月，还优选5个月，还优选4个月，还优选3个月，还优选2个月，还优选1个月)。更优选地，A的数量级为数周(优选6周，更优选5周，还优选4周，还优选3周，还优选2周，还优选1周)。还优选地，A的数量级为数天(优选45天，更优选30天，还优选25天，还优选20天，还优选18天，还优选15天，还优选12天，还优选10天，还优选8天，还优选6天，还优选5天，还优选4天，还优选3天，还优选2天，还优选1天)。还优选地，A的数量级为数小时(优选72小时，更优选60小时，还优选48小时，还优选36小时，还优选24小时，还优选18小时，还优选12小时，还优选10小时，还优选8小时，还优选6小时，还优选4小时，还优选3小时，还优选2小时，还优选1小时)。还优选地，A为90分钟，更优选为60分钟，还优选为45分钟，还优选为30分钟。优选地，t0对应于患者入院时的取样时间。
如技术人员所知，预定值取决于生物样本类型和用于测量生物样本中蛋白质水平的方法。因此，预定值优选地通过使用与测量受试者的蛋白质水平相同的测定技术来提供，以避免标准化中的任何误差。
具体地，本发明的方法还可以包括步骤a2)：确定步骤a1)测量的水平(一个或多个)是否高于或低于如上所定义的至少一个预定值。
在本发明的上下文中，蛋白质的水平高于或低于预定值，优选地是指在统计学观点上一个水平显著高于或低于所述预定值。
在一个实施方案中，所述受试者体内至少一种选自下组的蛋白质的水平下降，即表示患糖尿病性肾病的风险增加：凝血酶原或其片段(具体地活化肽片段1)、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、Map19、LG3、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP、α-烯醇酶和组蛋白H2B 1-O型。优选地，至少一种选自下组的蛋白质的水平比预定值低至少10％，即表示患糖尿病性肾病的风险增加：凝血酶原或其片段(具体地为活化肽片段1)、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、Map19、LG3、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP、α-烯醇酶和组蛋白H2B 1-O型，或者根据越来越优选的实施方案，比预定值低至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，表示患糖尿病性肾病的风险增加。更优选地，如果在适当的统计学测试中P值小于0.05，则与预定值相比，至少一种选自下组的蛋白质的水平统计学上显著降低：凝血酶原或其片段(具体地活化肽片段1)、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、Map19、LG3、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP、α-烯醇酶和组蛋白H2B 1-O型。
在另一个实施方案中，所述受试者体内至少一种选自下组的蛋白质的水平增加，即表示患糖尿病性肾病的风险增加：血管生成抑制剂、碳酸酐酶1、胶原蛋白α-1(I)链、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶-III和锌-α-2-糖蛋白。优选地，至少一种选自下组的蛋白质的水平比预定值高至少10％，即表示患糖尿病性肾病的风险增加：血管生成抑制剂、碳酸酐酶1、胶原蛋白α-1(I)链、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶-III和锌-α-2-糖蛋白，或者根据越来越优选的实施方案，比预定值高至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，表示患糖尿病性肾病的风险增加。更优选地，如果在适当的统计学测试中P值小于0.05，则与预定值相比，至少一种选自下组的蛋白质的水平统计学上显著增加：血管生成抑制剂、碳酸酐酶1、胶原蛋白α-1(I)链、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶-III和锌-α-2-糖蛋白。
本发明的另一个目的涉及一种预防患有糖尿病且是正常白蛋白尿的受试者患糖尿病性肾病的方法，所述方法包括以下步骤：
(a1)测量取自受试者的生物样本中至少一种选自下组的蛋白质的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型，抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白，
(a2)任选地，将步骤(a1)中测得的水平与至少一个预定值进行比较，
(b)由步骤(a1)测得的水平或步骤(a2)的比较，确定所述受试者患糖尿病性肾病的风险是否增加，以及
(c)如果受试者在步骤(b)中已被确定为患糖尿病性肾病的风险增加，则对所述受试者施用针对糖尿病性肾病的预防性治疗。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的一种预防糖尿病性肾病的方法，包括以下步骤：
(a1)测量取自受试者的生物样本中至少一种选自下组的蛋白质的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型，以及
(a2)任选地，将步骤(a1)中测得的水平与至少一个预定值进行比较，
(b)由步骤(a1)测得的水平或步骤(a2)的比较，确定所述受试者患糖尿病性肾病的风险是否增加，以及
(c)如果受试者在步骤(b)中已被确定为患糖尿病性肾病的风险增加，则对所述受试者施用针对糖尿病性肾病的预防性治疗。
在另一个实施方案中，根据本发明的一种预防糖尿病性肾病的方法，包括以下步骤：
(a1)测量取自受试者的生物样本中至少一种选自下组的蛋白质的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂和甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型，并测量取自受试者的生物样本中至少一种选自下组的蛋白质的水平：抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白，以及
(a2)任选地，将步骤(a1)中测得的各水平与至少一个预定值进行比较，
(b)由步骤(a1)测得的各水平或步骤(a2)的比较，确定所述受试者患糖尿病性肾病的风险是否增加，以及
(c)如果受试者在步骤(b)中已被确定为患糖尿病性肾病的风险增加，则对所述受试者施用针对糖尿病性肾病的预防性治疗。
在本发明的上下文中，术语“针对糖尿病性肾病的预防性治疗”主要是指用降低血压的药物，通过使用抗高血压药物例如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张素II受体阻断剂(ARB)进行的治疗。
用于体外鉴定糖尿病性肾病预测标志物的方法
本发明的另一个方面涉及一种用于体外鉴定糖尿病性肾病预测标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)测量取自患有糖尿病的受试者的生物样本中蛋白质的水平，该受试者已经被确定有患糖尿病性肾病的风险，所述生物样本在所述受试者进行如上面定义的体育锻炼后取得；
(b)测量取自患有糖尿病的受试者的生物样本中蛋白质的水平，该受试者已经被确定没有患糖尿病性肾病的风险，所述生物样本在所述受试者进行如上面定义的体育锻炼后取得；
(c)将步骤(b)确定的水平与步骤(a)确定的水平进行比较，以及
(d)如果在步骤(c)中进行比较的各水平不同，则鉴定所述蛋白质是糖尿病性肾病的预测标志物。
根据本发明的“体外鉴定标志物的方法”可以是，例如体外筛选标志物的方法。
如本文所使用的，在取自受试者的生物样本中检测的“用于预测疾病的标志物”是指一种生物分子，其表达水平指示所述疾病可能在所述受试者中出现、发病或进展。优选地，用于预测的标志物是蛋白质。优选地，用于预测疾病的标志物是早期标志物，即所述标志物允许在未出现糖尿病性肾病的任何症状(包括微量白蛋白尿)的受试者体内，尽早预测受试者患糖尿病性肾病的风险。
优选地，测量蛋白质水平的步骤a)和b)可以如上文“用于体外检测糖尿病性肾病风险增加的方法”部分所述进行。
根据本发明的鉴定标志物方法的步骤(a)和(b)中的生物样本是在所述受试者进行体育锻炼之后从受试者取得的，如上所述。
在本方法的步骤(a)中提到的受试者已经确定为有患糖尿病性肾病的风险，并且本方法的步骤(b)中提到的受试者已被确定为没有患糖尿病性肾病的风险。
“确定受试者是否有患糖尿病性肾病的风险，或者相对地没有患糖尿病性肾病的 风险”可以通过本领域技术人员熟知的任何方法进行。优选地，这可以通过使所述受试者进行如上所述的体育锻炼来进行。具体地，如果受试者在如上面定义的体育锻炼后呈现尿白蛋白水平增加、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿，则可以确定受试者有患糖尿病性肾病的风险。相反，在如上面定义的体育锻炼后未呈现尿白蛋白水平增加的受试者，即保持正常白蛋白的受试者可以被确定为没有患糖尿病性肾病的风险。
根据本发明的鉴定标志物的方法的步骤c)包括：将步骤(b)中测定的水平与步骤(a)中测定的水平进行比较，换句话说，确定步骤(b)中测定的水平与步骤(a)中测定的水平是否是不同的。优选地，如果它们之间的差异是统计学上显著性的，则在步骤(b)测定的水平和在步骤(a)测定的水平被认为是不同的。根据适当的统计学测试，例如统计学上的显著差异可以对应于低于0.05的P值。
如果在步骤(c)比较的各水平不同，优选为显著不同，则在生物样本中进行水平测量的蛋白质被鉴定为用于预测糖尿病性肾病的标志物。
试剂盒
本发明的另一个目的关于一种试剂盒，其在单独的容器中或在同一容器中，包括用于检测至少两种选自下组的蛋白质的工具：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白。
如本文所使用的，术语“用于检测至少一种蛋白质的工具”是指本领域技术人员公知的，能够检测一份生物样本中(具体地尿样本中)蛋白质或肽的任何工具。例如，用于检测至少一种蛋白质的工具可以是一种或多种抗体，优选为单克隆抗体。
此类工具，具体地用于检测硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型和/或锌-α-2-糖蛋白的抗体的非限制性实施例在表4中给出(参见实施例1.11)。例如，用于检测CD59糖蛋白、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶-III和碳酸酐酶1、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP、组蛋白H2B 1-O型和锌-α-2-糖蛋白的工具可以分别是由SigmaTM以标号HPA026494、SAB1401534、HPA001292、HPA001816、HPA006558、HPA008406、HPA001497、HPA043013和HPA012582提供的抗体，用于检测四连接素、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂和硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白的工具可以分别是由R&D SystemsTM以标号AF5170、AF1266和AF2364提供的抗体，以及用于检测凝血酶原、胶原蛋白α-1(I)链和α-烯醇酶的工具可以分别是由Santa Cruz BiotechnologyTM以标号sc-33769、sc-28657和sc-15343提供的抗体。
本发明的试剂盒还可以包括与酶或荧光染料偶联的一种或多种二抗。可选的，其还可包括酶、代谢物和比色或荧光底物的相关组合。
优选地，本发明的试剂盒包括用于检测如“生物标志物”部分中定义的各种生物标志物的组合的工具。例如，试剂盒可以包括用于检测至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种选自下组的蛋白质的工具：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白。
本发明的试剂盒还可以包括适于实施某些允许检测一种或多种蛋白质的技术的其他成分，例如(作为非限制性实施例)免疫印迹技术、免疫染色技术、ELISA技术、多路复用技术、定量质谱或抗体阵列。
附图说明
图1：糖尿病患者的四组尿样本的定义。
图2：通过分散树方法进行的一系列2D-GE实验的质量评估。
图3：对有患糖尿病性肾病风险的患者(G4)和“对照”患者(G2)的天然尿样本中的生物标志物分析后获得的蛋白质印迹信号的定量。
图4：对健康受试者和患有肾病的糖尿病患者的尿样本中的生物标志物分析后获得的蛋白质印迹信号的定量。
图5：针对G1对G3和G2对G4之间比较的CA1+CD59组合(mROC方法)的ROC曲线。
实施例
实施例1：材料与方法
1.1.患者招募
在蒙彼利埃的拉佩罗尼医院从AMTIM的患者中招募具有良好血糖控制(都配备有胰岛素泵)的二十六名1型糖尿病患者。入选标准如下：1型糖尿病患者，平均糖尿病持续时间大于5年，无MA(定义为白蛋白/肌酐比(ACR)<30毫克/克)。所有患者都给出书面知情同意书以参与研究。这项研究得到了监管当局的批准(地中海保护人权委员会的批准，N°2006-A00162-49)。
1.2.锻炼测试与尿样本采集
患者被指引到法国蒙彼利埃拉佩罗尼医院代谢探索单位(CERAMM)临床生理学中心服务处。当他们到达时(主要在上午)，在锻炼测试前1小时开始，每20分钟令患者饮用200毫升的水。在即将开始测试之前收集每名患者的早晨清洁中段尿样本。然后，所有参与者在脚踏车测力计上进行锻炼测试。为了个性化体育测试期间锻炼强度的增量，从理论最大有氧功率(Wmax)，即对应于理论最大氧消耗(VO2max)的功率开始计算每一步的工作量。因此，受试者接受具有相同相对增量工作量的测试，并在其Wmax的相同百分比下进行比较。测试包括在20％、40％、60％和80％的Wmax下六分钟稳态工作量。在24分钟的锻炼结束时，所有患者休息1小时并喝水。在该休息阶段之后，收集每名患者的尿样本。将所有尿样本收集在含有1mM原钒酸钠、10mM氟化钠、20mM甘油2-磷酸二钠(密苏里州圣路易斯市Sigma Aldrich公司)和蛋白酶抑制剂(法国梅兰Roche Diagnostics公司)的无菌杯中，-80℃储存，直至使用。尿样本的收集以可重现的方式、在同一时期进行。
1.3.研究设计
在锻炼测试前后测定所有样本尿白蛋白/肌酐比(UACR)。根据锻炼测试后收集的样本中的UACR，将患者分为两个队列：1)由14名患者组成的对照队列，这些患者在锻炼测试后其尿微量白蛋白尿(MA-)保持阴性(UACR<30毫克/克)，以及2)由12名患者组成的被认为有患DN风险的队列，这些患者在锻炼测试后变为微量白蛋白尿(MA+)阳性(30<UACR<300毫克/克)。患者的临床特征如表2所示。
表2：1型糖尿病患者的临床特征。数值被表示为平均值±S.D。(a)与对照队列相比P<0.05；(b)与锻炼测试后的同一队列相比P<0.05。
因此，定义了4个不同组的尿样本(图1)：
-在锻炼测试之前，G1组对应于从对照队列收集的样本，而G3组对应于从有风险队列收集的样本；
-在锻炼测试之后，G2组对应于从对照队列收集的样本，而G4组对应于从有风险队列收集的样本。
1.4.尿样本制备
在4℃下将尿液在11000×g下离心30分钟，并将上清液在4℃下用18MΩ.cm的水透析48小时。然后，使用5000Da截止离心管(马萨诸塞州贝德福德Millipore公司)在4℃下将样本浓缩至约初始体积的1/40。将浓缩的尿液冻干，然后在室温下在旋转轮上的含有8M(摩尔)尿素、2M硫代尿素、4％w/v CHAPS、65mM DTE、40mM三羟甲基氨基甲烷和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中溶解2小时。使用RCDC蛋白测定试剂盒(加利福尼亚州赫拉克勒斯Bio-Rad公司)估计蛋白质的量。
1.5.2D-GE
具有非线性固定的pH 3-10梯度的18厘米长预制IPG条，在含有8M尿素、2M硫代尿素、4％w/v CHAPS、65mM DTE、0.0025％v/v溴酚蓝和1％v/v IPG缓冲液(3-10)的溶液中与170微克蛋白质样本再水合过夜。在EttanTM IPGphorTM等电聚焦系统上在20℃下进行等电聚焦至总量为50kVh。第一维度运行后，蛋白质被还原(6M尿素、50mM Tris-HCl，pH8.8，30％v/v甘油、2％w/v SDS、0.001v/v溴酚蓝和65mM DTT)并在含有135mM碘乙酰胺代替DTT的相同缓冲液中烷基化10分钟。然后，在自制的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上使用ISO-DALT电泳单元在120伏的恒定电压下在10℃下在第二维中过夜分离蛋白质。凝胶用Sypro Ruby荧光染料(加利福尼亚州赫拉克勒斯Bio-Rad公司)染色。
1.6.图像分析
使用Typhoon 9200TM扫描仪(瑞典乌普萨拉市GE Healthcare公司)以50微米的分辨率单独地对凝胶图像进行数字化，其中光电倍增管(PTM)电压针对最大范围而没有信号饱和进行调节。使用Progenesis SameSpot软件v3.0(英国达勒姆Nonlinear Dynamics公司)分析凝胶图像。凝胶被扭曲以对准图像，且可自动检测蛋白质点。该软件基于递归凝胶匹配的概念，这意味着匹配集合的每个凝胶在匹配过程中作为“参考凝胶”被递归地使用一次。在每种情况下严格评价自动匹配的质量，并且如果需要，手动进行校正。
1.7.数据质量分析
使用Phylopuce方法(Copois，Bibeau等人，2007)来估计2D-GE实验的均匀性，以便确定最终质量差的那些。简言之，每个凝胶由维度n的表达载体表示(n是点的数目)。计算载体之间的欧几里德距离(表示所有实验和它们的归一化点强度)。使用所得到的距离矩阵，利用“Kitsch算法”构建系统树。为了可视化所获得的树，使用“Drawtree算法”，其给出无根树的图形表示。这种基于二维凝胶之间距离的分类方法建立了凝胶之间的总体均匀性，并且最终精确定位样本的实验偏差或特定行为。
1.8.统计分析
所有统计值用“R/Bioconductor”统计开源软件(Gentleman，Carey等人，2004)计算。使用以下不同的统计测试分析组间蛋白质点的差异强度水平：Wilcoxon测试(Multtest程序包)、Welch测试(Multtest程序包)、VarMixt方法(VarMixt程序包)和SAM方法(siggenes程序包)。对于多种测试方法来说，重要的是调整各个蛋白质点的P值以控制假发现率(FDR)。Benjamini和Hochberg方法(Benjamini 1995)被应用于所有统计测试，并且小于0.05的经调整P值被认为是统计学显著的。还使用ROC程序包计算AUC(曲线下面积)ROC(受试者工作特征)，并且大于0.75的AUC ROC值被认为是显著的。
对于带有所用一个统计测试的两个患者组之间的每个显著差异点，根据表3将一个值分配给该点。因此，所有点具有0.5至5的所有统计测试的总分。只有那些分数大于或等于2的点被包括在差异分析中。
表3：分配给每个统计测试的值和点的总分
1.9.胶内酶解
使用Propic机器人(马萨诸塞州韦尔斯利Perkin-Elmer公司)从凝胶切除点。使用Multiprobe II机器人(马萨诸塞州韦尔斯利Perkin-Elmer公司)自动进行所有后续步骤。首先用300微升水洗涤点，然后用300微升的25mM NH4HCO3洗涤。在25mM NH4HCO3中300微升50％乙腈的存在下进行两次脱色。然后将凝胶片用300微升100％CH3CN脱水两次，最后在37℃下干燥1小时。将8微升胰蛋白酶溶液(美国麦迪逊普洛麦格公司，测序级改性胰蛋白酶)在25mM NH4HCO3中以0.0125微克/微升的浓度加入每个点，样本首先在冰上保持15分钟，然后保持在室温。在37℃下消化过夜，并通过加入2微升的2％甲酸停止消化。将消化物在超声波浴中超声处理10分钟，并将上清液转移到HPLC聚丙烯管中。
1.10.质谱
使用与纳米HPLC芯片-立方体系统(美国圣克拉拉安捷伦科技公司)连接的高容量离子阱质谱仪(Esquire HCT；德国不来梅布鲁克·道尔顿公司)分析蛋白质消化物。芯片包含前柱和柱(Zorbax 300SB-C18；美国圣克拉拉安捷伦科技公司)。首先将样本以4微升/分钟的流速使用0.1％甲酸加载到4毫米富集盒上。预浓缩后，使用0.1％甲酸中3％至80％乙腈的15分钟线性梯度，以0.3微升/分钟的流速在柱(直径75微米，长度43毫米)上分离肽，并进行洗脱进入质谱仪。以正离子模式的1.8-2.1千伏的毛细管电压与在250℃下4.5升/分钟的干气流速一起使用。在310m/z(质荷比)至1800m/z范围内测量第一次全扫描质谱，随后以较高分辨率进行第二次扫描，以精确测量前一次扫描中三种主要离子的质量。最后，进行第三次扫描以获得所选离子的碰撞诱导的MS/MS光谱。使用数据分析软件(德国不来梅布鲁克·道尔顿公司)分析MS/MS原始数据以产生峰值列表。使用Mascot搜索引擎(v.2.2.04；英国伦敦基质科学公司)并使用以下参数在本地查询NCBI非冗余数据库(NCBInr，版本20101018)：分类为智人，酶为胰蛋白酶，允许1个漏掉的裂解，固定修饰为半胱氨酸的脲甲基化，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，在MS和MS/MS中质量精度均为0.6Da。在这些条件下，得分高于40的个体离子表示同一性或广泛同源性(p<0.05)，而蛋白质一旦显示超过该阈值的至少一个肽，就进行验证。
1.11.通过蛋白质印迹验证
对于蛋白质印迹，使用SE260迷你垂直电泳装置(瑞典乌普萨拉GE医疗公司)，利用SDS-PAGE在160伏下，将取自G1，G2，G3和G4组(每组n＝4)的各30微克尿样分解约2小时。然后，蛋白质被转移到硝酸纤维素膜上，利用0.1％PBS-Tween中的5％(w/v)脱脂乳在4℃下过夜限制非特异性结合。然后用合适的初级抗体(表4)将膜在室温下孵育2小时。洗涤后，用偶联有辣根过氧化物酶的合适二级抗体抗全分子IgG(表4)将膜在室温下进一步孵育1小时。通过增强化学发光(ECL)(瑞典乌普萨拉GE医疗公司)使用放射自显影检测反应性蛋白条。
表4：用于蛋白质印迹的初级抗体和二次抗体的列表
实施例2：糖尿病患者的临床特征和蛋白质组学数据质量
基于锻炼测试后微量白蛋白尿的出现预示10年后持续性MA会发病的假设(O'Brien、Watts等人，1995)，发明人使用受控的锻炼测试在两个队列中对1型糖尿病患者进行分类：对照患者队列(14名在锻炼后保持MA阴性)和有患DN风险的患者队列(12名在锻炼后变为MA呈阳性的患者)。对于每个队列，在锻炼测试(图1)之前(G1和G3)和之后(G2和G4)收集尿样本。
两个1型糖尿病患者队列的临床特征：表2中描述了对照队列和有患DN风险的队列。在年龄、糖尿病持续时间、锻炼测试前的收缩压和舒张压、肌氨酸尿和HbA1c方面在两个队列的患者中并未观察到显著的差异。与糖尿病对照者相比，有患DN风险的糖尿病患者在锻炼测试后有更高水平的白蛋白尿和UACR。两个队列锻炼后的平均收缩压水平都显著高于锻炼前的平均收缩压水平。
每个尿样本的蛋白质谱通过2D-GE进行研究。在图像分析之后，在每个凝胶上显示768个蛋白质点，并测定了蛋白质点的相对丰度。还评估了实验间重现性(平均CV＝19％)。
为了评估2D-GE数据的全局质量，使用Phylopuce方法来分析实验的分散度。这允许以无根树的形式(图2)图形地表示该系列实验。理想地，穿过树的所有分支的一个圆将反映2D凝胶的完美同质性。对Phylopuce的第一个结果的分析显示，一些凝胶远离剩余的其他凝胶(数据未显示)。通过探索这些远距离凝胶的图像，我们注意到由于带有扭曲的蛋白质不良迁移和/或蛋白质条纹的存在而引起的低质量。对应于这些凝胶的样本在2D凝胶中再次迁移，产生了质量令人满意的2D凝胶。图2中得到的无根树显示了可接受的凝胶分散度。然而，其中三个行为略有不同，可能是由于这些样本的特定固有性质而不是实验问题，因为这些凝胶的检查显示它们不存在明显的缺陷。决定在进一步的差异分析中使用所有凝胶。
实施例3：蛋白质表达的比较分析
从两个队列的所有患者在锻炼测试之前和之后收集尿样本：对照组(锻炼测试前后均为MA阴性)和风险组(测试前为MA阴性，锻炼测试后为MA阳性)，产生四组尿液，如上所述。
每组尿样本(G1-G4)与特别关注的蛋白质组匹配(表5)，其可以通过差异分析揭示。因此，G1组(在锻炼测试之前收集的对照糖尿病患者的尿样本)的蛋白质组图谱包含对照1型糖尿病患者之间共享的所有蛋白质。G2组(锻炼测试后收集的对照糖尿病患者的尿样本)的蛋白质组图谱反映了对照患者体育锻炼影响下尿液排泄增加或减少的所有蛋白质。通过将锻炼测试前收集的对照患者的尿样本(G1组)与锻炼后收集的相同患者的尿样本(G2组)的蛋白质图谱进行比较，即G1G2比较，揭示了一组被称为“对照患者的锻炼蛋白质组”的蛋白。
G3组(在锻炼测试之前收集的有风险糖尿病患者的尿样本)可以包括通过没有任何身体活动揭示出的用于早期诊断DN的候选生物标志物。这些生物标志物可以通过比较来自对照患者(G1组)和来自有风险患者(G3组)的锻炼测试之前收集的尿样本的蛋白质图谱，即G1G3比较来鉴定。
G4组(在锻炼测试后收集的有患DN风险的糖尿病患者的尿样本)反映在锻炼测试之前没有差异但在锻炼测试后优差异的生物标志物。通过比较锻炼测试后从对照患者(G2组)和有风险患者(G4组)收集的尿样本的蛋白质图谱，即G2G4比较，揭示这些生物标志物。G2G4与G1G3比较的交集反映了DN早期诊断的候选生物标志物，其在锻炼前后有差异。
此外，由于在锻炼测试后收集，G4组反映了“风险患者的锻炼蛋白质组”。通过比较从锻炼测试前的风险患者(G3组)收集的尿样本与锻炼后相同患者(G4组)收集的尿样本的蛋白质图谱，即G3G4比较，突出显示该蛋白质组。
表5：每组尿样本(G1-G4)和它们之间的比较反映特定蛋白质组并显示DN的生物标志物
进行G1G3，G2G4，G1G2和G3G4四个比较以选择蛋白质表达中潜在的信息差异。施加几个严格的标准以选择用于进一步分析的蛋白质点。首先，如果对于每个蛋白质点(代表7个统计测试的贡献)计算的总分数大于或等于2，则认为蛋白质表达的差异是统计学显著的(参见材料与方法部分中的统计分析)。第二，差异蛋白质点应当存在于来自一组与另一组相比至少50％的凝胶中。第三，消除了对应于白蛋白的蛋白质点(在G2G4和G3G4比较中)。
这些分析导致总共177个显示不同强度的蛋白质点。这些蛋白质点源自如下的不同比较：
通过比较对照队列与有风险队列来检测早期DN生物标志物：
-在锻炼测试之前，即G1G3比较：14个点，包括G3中8个上调点和6个下调点
-锻炼测试后，即G2G4比较：156个点，包括G4中104个上调点和52个下调点。
通过比较来自同一队列在锻炼测试前后的样本，鉴定对照和有风险的糖尿病患者的锻炼蛋白质组：
-在对照队列中，即G1G2比较：5个点，包括G2中2个上调点和3个下调点
-在有风险队列中，即G3G4比较：101个点，包括G4中72个上调点和29个下调点。
总之，对照队列与有风险队列组之间在锻炼测试之后(G2G4比较)的差异蛋白质点的数目，高于锻炼测试之前(G1G3比较)的，表明锻炼对有患DN风险的糖尿病患者的蛋白质尿排泄有不同的影响。G1G3比较显示正常白蛋白尿患者之间不进行锻炼测试的早期候选生物标志物DN。只有三个蛋白质点在G1G3比较中呈特异性，其他的在G2G4、G3G4和G1G2比较中也有发现。对照患者的锻炼蛋白质组较小(G1G2比较)，只有5个蛋白质点差异表达。相反，有风险患者的锻炼蛋白质组较大，101个差异点被表达(G3G4比较)。
在不同比较之间存在重叠的一些点。引起更多注意的四组差异点是：
-在G1G3和G2G4比较之间共享的12个点集合。因此，这些点在对照患者和有风险患者队列之间在锻炼之前和之后差异表达；
-对于G2G4比较来说特定的一组58个点；它们在锻炼测试后在对照患者和有风险患者之间差异表达；
-对于G3G4比较来说特定的一组38个点；它们在锻炼测试前后有风险患者锻炼采集的尿样本之间差异表达。
这些点组在其不同比较中的统计AUC ROC值的图表显示大多数点具有大于0.75的AUC。有趣的是，两个蛋白质点对G1G3比较来说是特异性的，因为两个蛋白质点对G1G2比较来说特异性的。在G1G3、G2G4和G3G4比较之间共享的另外两个点。作为该组80个点的这些点是候选生物标志物以及有风险患者的锻炼蛋白质组的一部分，这解释了它们的潜在诊断利益。
实施例4：差异表达蛋白质的鉴定
在所有比较中显著差异的大多数点是从凝胶中提取的，用胰蛋白酶消化，并准备用于质谱(MS)分析。这些点通过Nano LC-MS/MS鉴定。被鉴定蛋白质的总数为73。所有这些蛋白质存在于由本发明人构建的DUP数据库中(http://www.sysdiag.cnrs.fr//index.php？page＝dup)，并且其含有在19个出版物(版本20110210)中的人正常尿的蛋白质组分析中描述的超过3000种非冗余尿蛋白。
从统计和功能分析，选择38个蛋白质点，其对应于通过质谱法鉴定的24种不同蛋白质。这24种蛋白质在2D-GE上的表达水平(上调或下调)和分子量总结在表6中。所有蛋白质在有风险患者(G4组)和对照患者(G2组)锻炼后的尿液中差异表达。碳酸酐酶-1(CA1)、血浆蛋白酶C1抑制剂(SERPING1)、谷氨酰胺酰基肽环转移酶(QPCT)、蛋白质AMBP、锌-α-2-糖蛋白(AZGP1)和CD59糖蛋白(CD59)在锻炼前的尿液(G1G3比较)中也是差异表达。内皮蛋白质C受体(EPCR)是在有风险患者(G3组)和对照患者(G1组)的锻炼前的尿液中差异表达的唯一蛋白质(表6)。
表6：对照患者和有风险患者在2D-GE比较中差异表达的蛋白质。从对应于蛋白质片段或全长并且在一个或多个比较中是差异性的一个或几个点中鉴定各蛋白质。
实施例6：通过在经处理、浓缩的尿液上进行的蛋白质印迹实验对蛋白质组分析的 确认
为了验证通过2D-GE方法获得的结果并验证从LC-MS/MS分析的结果推导出的蛋白质特性，通过蛋白质印迹分析19个潜在DN标志物的表达水平。
与G2组相比，蛋白C抑制剂(SerpinA5)、CD59糖蛋白(CD59)、四连接素(CLEC3B)在G4组减少，证实了蛋白质组数据。具有70kDa分子量的凝血酶原或凝血因子II(F2)通过蛋白水解裂解被活化，使得形成活化肽片段1和2(F1.2)(31kDa)和活性凝血酶(F2a)(37kDa)。F1.2是体内凝血酶生成指数，随着每个凝血酶分子的生成而释放一个分子的F1.2。使用的抗体针对靠近F1.2的N末端映射的氨基酸。与G2相比，G4组中70kDa的凝血酶原增加，与在相同比较中降低的31kDa的裂解的F1.2不同。这表明G4组中活性凝血酶减少。G4组中的α-1-抗胰蛋白酶(SerpinA1)、抗凝血酶-III(SerpinC1)，碳酸酐酶(CA1)和胶原蛋白α-1(I)链(COL1A1)的蛋白丰度比G2相高。已经被鉴定为G1和G3组之间有差异的CA1未被蛋白质印迹证实，因为其仅在G3组4个样本的2个中被发现。MASP2和HSPG2后来被验证。与G2相比，G4组中约20kDa的MASP2片段减少。HSPG2被裂解成2条链：血管生成抑制剂和LG3肽。G4组中的血管生成抑制剂高于G2组，与G3组相比，G4组中LG3肽减少。
实施例7：通过在天然尿液上进行蛋白质印迹实验对蛋白质组分析进行确认
在2D-GE上的蛋白质组学研究之后，10个生物标志物分析(Western-Blot)在经浓缩、处理的尿液上进行验证。
本发明人研究了天然尿样本中这些生物标志物的存在(即没有经过先前处理和未浓缩的尿样本)。
首先，分析20微升的每个尿样本(样本的总蛋白浓度是可变的(47.86至450.89微克/毫升))。
在关注的10种生物标志物中，在天然尿液的蛋白质印迹中仅检测到蛋白质HSPG2(硫酸乙酰肝素蛋白多糖2)、Col1A1(胶原蛋白，I型，α1)、Serpin C1和F2(凝血酶原)。
在相同样本上进行这四种生物标志物的相对定量。将相同量的总蛋白(1.6微克)加载到SDS-PAGE凝胶上。获得与在经处理尿液中观察到的相同差异(图3)。与“对照”患者(G2)相比(图3)，四种蛋白质在有患糖尿病性肾病风险的患者(G4)中过表达。
实施例8：通过在取自健康受试者和患有糖尿病性肾病的患者的尿样本上进行的蛋白质印迹实验来确认蛋白质组分析
这十种生物标志物被选择为肾病特异性而不是糖尿病特异性。为了验证这一点，对两个其他受试者群体进行十个生物标志物的分析验证：i)像“对照”队列(G1，G2)一样表现的健康受试者，和ii)像“有风险”队列(G3，G4)一样表现的患有肾病的糖尿病患者。
对取自这些不同组的患者的尿液进行蛋白质印迹检测。
蛋白质CD59、CLEC3B、Serpin A5和MASP2在有患肾病风险的糖尿病患者和患有肾病的糖尿病患者(微量白蛋白尿和大白蛋白尿患者)的尿液中低表达(图4)。此外，在患有肾病的糖尿病患者的尿液中未检测到蛋白质MASP2(图4)。对于某些生物标志物，对于同组的患者获得的信号不是同质的。实际上，关于蛋白质Serpin A5和MASP2，一名健康受试者(在两种情况下不同)似乎具有比其他被研究的健康受试者更低量的被分析生物标志物。
蛋白质HSPG2和F2在有患糖尿病性肾病风险的糖尿病患者和患有肾病的糖尿病患者的尿液中过表达(图4)。从一名患有肾病的糖尿病患者获得的信号低于相同组的其他患者。
在另外两队列患者中验证了六种生物标志物：CD59、CLEC3B、Serpin A5、MASP2、HSPG2和F2。
蛋白质表达的变化在健康受试者与“对照”队列的患者之间，以及在“有风险”队列的患者和患有肾病的糖尿病患者之间是可比的，表明这六种生物标志物对肾病具有特异性而对糖尿病无特异性。
实施例9：单一标志物或两种标志物组合的诊断性能
使用受试者工作特征(ROC)分析来评估根据本发明的选定蛋白质在体育锻炼前的对照患者和有患糖尿病性肾病风险患者(G1与G3)之间的2D-GE比较中的诊断性能(表7)。ROC曲线是对于各种数值测试的灵敏性(Se)和特异性(Sp)之间的倒数关系的图形可视化。
标志物 AUC ROC 阈值 Sp(％) Se(％) VPP(％) VPN(％) CI 95％
CA1 0.875 10933795 83.3 91.7 84.6 90.9 [0.713；1.000]
CD59 0.792 -138077543 91.7 75.0 90.0 78.6 [0.583；1.000]
AMBP 0.771 -14365141 91.7 66.7 88.9 73.3 [0.567；0.975]
QPCT 0.764 -5589612 83.3 75.0 81.8 76.9 [0.560；0.968]
表7：G1与G3比较中单个标志物的诊断性能的实施例。AUC ROC：ROC曲线下面积；阈值：表示为2D-GE相对强度，由Youden指数选择；Se：灵敏性；Sp：特异性；PPV：阳性预测值(测量被正确诊断的阳性测试结果的受试者的比例)；NPV：阴性预测值(测量被正确诊断的阴性测试结果的受试者的比例)；CI 95％：95％置信区间。
当比较体育锻炼前对照患者与有患糖尿病性肾病风险的患者时，mROC方法的多变量分析显著改善了AUC。例如关联CA1至CD59、CA1至AMBP、CA1至QPCT、CD59至QPCT、CD59至AMPBP等的标志物组合，如表8所报告的较高的敏感性和特异性，具有患糖尿病性肾病较高风险的预测值。结合两个标志物的统计分析产生了一系列决策规则；如表9和图5所示，计算每个组合的新的虚拟标志物(Z)。基于两个标志物的组合，虚拟标志物将来自多变量条件的标志物转换为单变量设置，利用p-值<0.01显著地区分体育锻炼之前的对照患者与有患糖尿病性肾病风险的患者。
标志物组合 AUC ROC 阈值 Sp(％) Se(％) VPP(％) VPN(％) CI 95％
CA1+CD59 0.882 -0.2256 83.3 83.3 83.3 83.3 [0.738；1.000]
CA1+AMBP 0.931 0.9028 100.0 75.0 100.0 80.0 [0.835；1.000]
CA1+QPCT 0.917 -0.4629 75.0 100.0 80.0 100.0 [0.807；1.000]
CD59+QPCT 0.847 -3.5075 83.3 75.0 81.8 76.9 [0.691；1.000]
CD59+AMBP 0.833 -2.7376 66.7 100.0 75.0 100.0 [0.663；1.000]
表8：G1与G3比较中两种标志物组合的诊断性能(mROC方法)的实施例。AUC ROC：ROC曲线下面积；阈值：表示为2D-GE相对强度，由Youden指数选择；Se：灵敏性；Sp：特异性；PPV：阳性预测值(测量被正确诊断的阳性测试结果的受试者的比例)；NPV：阴性预测值(测量被正确诊断的阴性测试结果的受试者的比例)；CI 95％：95％置信区间。
标志物组合 Z＝a1x[标志物1]+a2x[标志物2]
CA1+CD59 Z＝+(1,56361513356411e-07)x[CA1]-(1,01677256583679e-08)x[CD59]
CA1+AMBP Z＝+(1,35230449215072e-07)x[CA1]-(4,18637841481153e-08)x[AMBP]
CA1+QPCT Z＝+(1,24848530852367e-07)x[CA1]-(9,75979899375066e-07)x[QPCT]
CD59+QPCT Z＝-(1,36301781949143e-08)x[CD59]-(1,14127754739464e-06)x[QPCT]
CD59+AMBP Z＝-(1,0745556660865e-08)x[CD59]-(3,39944153133327e-08)x[AMBP]
表9：用于两种标志物组合(mROC方法)的ROC曲线的AUC最大化的a1和a2系数的实施例。
使用受试者工作特征(ROC)分析来评估根据本发明的选定蛋白质在体育锻炼后的对照患者和有患糖尿病性肾病风险患者(G2与G4)之间的2D-GE比较中的诊断性能(表10)。ROC曲线是对于各种数值测试的灵敏性(Se)和特异性(Sp)之间的倒数关系的图形可视化。
表10：G2与G4比较中单个标志物的诊断性能的实施例。AUC ROC：ROC曲线下面积；阈值：表示为2D-GE相对强度，由Youden指数选择；Se：灵敏性；Sp：特异性；PPV：阳性预测值(测量被正确诊断的阳性测试结果的受试者的比例)；NPV：阴性预测值(测量被正确诊断的阴性测试结果的受试者的比例)；CI 95％：95％置信区间。
当比较体育锻炼后对照患者与有患糖尿病性肾病风险的患者时，mROC方法的多变量分析显著改善了AUC。例如关联CLE3B至ENO1、SERPINA5至AZGP1,SERPINA5至SERPINA1,CLEC3B至CD59的标志物组合，如表11所报告的较高的敏感性和特异性，具有患糖尿病性肾病较高风险的预测值。结合两个标志物的统计分析产生了一系列决策规则；如表12和图5所示，计算每个组合的新的虚拟标志物(Z)。基于两个标志物的组合，虚拟标志物将来自多变量条件的标志物转换为单变量设置，利用p-值<0.001显著地区别体育锻炼之后的对照患者与有患糖尿病性肾病风险的患者。
表11：G2与G4比较中两种标志物组合的诊断性能(mROC方法)的实施例。AUC ROC：ROC曲线下面积；阈值：表示为2D-GE相对强度，由Youden指数选择；Se：灵敏性；Sp：特异性；PPV：阳性预测值(测量被正确诊断的阳性测试结果的受试者的比例)；NPV：阴性预测值(测量被正确诊断的阴性测试结果的受试者的比例)；CI 95％：95％置信区间。
表12：两种标志物组合的决策规则(mROC方法)的实施例。
实施例10：讨论
为了在尿样本中搜索早期DN生物标志物候选物，进行了2D-GE分析，其是一种用于分析对照患者和有风险患者的尿蛋白质组之间的差异的精确的半定量比较方法，。在锻炼测试前后，分别观察到差异表达的14个和156个蛋白质点。通过比较每个队列中的锻炼前和锻炼后测试尿样本(分别为G1G2和G3G4之间的比较)获得对照患者和有风险的糖尿病患者的锻炼蛋白质组。在锻炼后，有风险患者(101个不同点)排泄的尿蛋白比对照患者(5个差异点)排泄的尿蛋白存在更大的变异性。
在被鉴定为潜在DN标志物的蛋白质中，10种通过蛋白质印迹验证。G2G4比较中的许多差异点具有等于5的统计学总分，这意味着它们在蛋白质表达中的差异在统计学上非常显著(在7个统计学测试中)。因此这些蛋白质具有潜在的临床诊断价值。

Claims (12)

1.一种用于体外检测患有糖尿病且是正常白蛋白尿的受试者患糖尿病性肾病风险的方法，所述方法包括以下步骤：
(a1)测量取自受试者的生物样本中至少一种选自下组的蛋白质的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型，以及
(b)由步骤(a1)测得的水平确定所述受试者患糖尿病性肾病的风险是否增加。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤(a1)中测量至少一种选自下组的蛋白质的水平：抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括步骤(a2)：将步骤(a1)中测得的水平与至少一个预定值进行比较。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述受试者体内至少一种选自下组的蛋白质的水平下降，即表示患糖尿病性肾病的风险增加：凝血酶原或活化肽片段1、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、Map19、LG3、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP、α-烯醇酶和组蛋白H2B 1-O型。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述受试者体内至少一种选自下组的蛋白质的水平增加，即表示患糖尿病性肾病的风险增加：血管生成抑制剂、碳酸酐酶1、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链和锌-α-2-糖蛋白。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述预定值是在来自被确定为不具有患糖尿病性肾病风险的正常白蛋白尿受试者的生物样本中测得的所述至少一种蛋白质的水平。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型的水平，在步骤(a1)中测量。
8.一种用于体外鉴定糖尿病性肾病预测标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)测量取自患有糖尿病的受试者的生物样本中蛋白质的水平，所述受试者已经被确定有患糖尿病性肾病的风险，所述生物样本在所述受试者进行体育锻炼后取得；
(b)测量取自患有糖尿病的受试者的生物样本中所述蛋白质的水平，所述受试者已经被确定没有患糖尿病性肾病的风险，所述生物样本在所述受试者进行体育锻炼后取得；,
(c)将步骤(b)确定的水平与步骤(a)确定的水平进行比较，以及
(d)如果在步骤(c)中进行比较的各水平不同，则鉴定所述蛋白质是糖尿病性肾病的预测标志物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中已被确定有患糖尿病性肾病风险的所述受试者在体育锻炼后尿白蛋白的水平增加。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述糖尿病是1型或2型糖尿病。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述生物样本选自下组：尿样本、血样本、血清样本和血浆样本。
12.一种试剂盒，其在单独的容器中或在同一容器中，包括用于检测至少两种选自下组的蛋白质的工具：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四连接素、CD59糖蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2或其亚型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、胶原蛋白α-1(I)链、α-烯醇酶、组蛋白H2B 1-O型、谷氨酰胺酰基肽环转移酶、蛋白质AMBP和锌-α-2-糖蛋白。
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