WO2023145898A1 - 慢性腎臓病の尿検査方法 - Google Patents

Abstract

被検者から採取された尿検体について、尿中にアルブミンより偏って排出される、ＡＭＢＰ等のタンパク質の量を検出する工程と、検出したタンパク質量を各タンパク質の基準量と比較する工程と、当該比較の結果、前記被検者におけるタンパク質が基準量よりも高い場合、前記被検者は慢性腎臓病に罹患している又は罹患のおそれがあると判定する工程とを含む、慢性腎臓病を検査する方法。

Description

慢性腎臓病の尿検査方法

　本発明は、慢性腎臓病の尿検査方法及び当該尿検査を行うための薬剤に関する。また、本発明は慢性腎臓病マーカーに関する。

　腎臓は、血液中の老廃物や余分な水分を濾過し、尿として排泄することで、体液の恒常性を維持することを主な役割とする臓器である。腎臓は、糖尿病、高血圧、免疫系の異常、薬剤、出血、急激な血圧低下、感染症等により障害を受け、腎機能が低下する。腎障害により腎機能が約６０％以下に低下した場合に腎不全と呼び、腎機能低下の進行速度の違いにより、急性腎障害（Ａｃｕｔｅ　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｊｕｒｙ：ＡＫＩ）と慢性腎臓病（Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＫＤ）とに大別される。

　慢性腎臓病（ＣＫＤ）は、糸球体濾過量（ＧＦＲ）で表される腎機能の低下又は腎臓の障害を示唆する所見が慢性的に（３ヶ月以上）持続する状態をいい、特に糖尿病を要因とするものは糖尿病性腎臓病（Ｄｉａｂｅｔｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ：ＤＫＤ）と称される。慢性腎臓病に有効な治療法はなく、慢性腎臓病が進行して腎機能低下が進むと末期腎不全（尿毒症）の危険があり、人工透析や腎移植が必要となる。腎不全による透析治療患者は全世界で２１０万人を超え、今後も指数的に増加する見込みである。さらに、末期腎不全に至る前の慢性腎臓病患者は全世界で約７億人存在し（２０１７年）、医療経済上も大きな負担となっている。

　慢性腎臓病は、自覚症状がないまま病状が進行するが、その進行には生活習慣病（糖尿病、高血圧等）が深く関連するため、当該疾患の早期発見による生活習慣の改善や疾患の治癒及び進行抑制が必要である。そのためには、非侵襲で慢性腎臓病を早期発見できる腎障害のマーカー（指標）による診断法の開発が重要である。現在、臨床現場において、慢性腎臓病の治療・薬効の指標となる検査項目（尿蛋白、尿アルブミン／クレアチニン比（ｕＡＣＲ）、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）等）はあるが、いずれも感度、精度は高くなく、早期診断等に適用可能な信頼できるマーカーとその検出方法、試薬は未だない。このため容易に非侵襲で検査できる有力な尿マーカーを同定し、その検査法を開発することが出来れば、慢性腎臓病をより早期に診断でき、病状の変化の把握が可能となり、ひいては、生活習慣の改善や早期医療介入によって、腎機能の悪化防止も可能となる。かかる観点から、糖尿病性腎臓病等の慢性腎臓病に関し、様々なマーカーについての報告はあるものの（例えば、特許文献１及び２）、未だ実用化はなされていない。

特開２０１８－７２２１２号公報 国際公開２０１２／０３７６０３号

　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、腎障害に関連する尿マーカー分子を同定し、当該分子の量を指標とする慢性腎臓病の尿検査方法又はその検査薬を提供することを目的とする。

　アルブミンは、肝臓で作られ、血液中のタンパク質の６０％を占めているが、通常、尿ではほとんど検出されない。しかし、腎臓の機能が低下、特に、腎糸球体でのろ過障害が生じると、アルブミン、さらには他の血漿タンパク質も尿中に排泄されることになる。そのため、尿中のアルブミン、タンパク質量を測定することで腎臓障害の状態を把握することが出来る（所謂、アルブミン尿、タンパク尿）。しかし、腎障害のごく初期では、ごくわずかしかアルブミンは尿中に排泄されないため、そのわずかのアルブミンでも検出できる「尿中アルブミン」の検査が、臨床現場において現在、早期腎障害の検出のために行われている。一方、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）は採血が必要で、精度は早期腎障害の検出には十分とは言えない。

　また、腎糸球体から漏出したアルブミンは、尿細管で約７０％が再吸収され、その再吸収能には予備能がある。このため、慢性腎臓病の早期でアルブミンが糸球体で血液から尿中に漏出しても尿中での増加は顕著ではなく、尿中でアルブミン増加（微量アルブミン尿）が検出される状態では、かなり大量のアルブミンが糸球体から漏出している状態であり、早期といえども、既に腎障害がある程度進んでいることになる。

　本発明者らは、アルブミンについてのかかる知見も考慮し、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、糸球体で漏出したアルブミンは尿細管で再吸収されやすいが、アルブミンとともに尿中に漏出する血漿タンパク質の中には、アルブミンよりも再吸収されにくい血漿タンパク質が存在しているのではと考えた。そして、このようなアルブミンより尿中に偏って排出されやすい血漿タンパク質は、腎障害のより早期の検出において有効なマーカー分子になるのではと考えた。

　そこで、本発明者らは先ず、健常人の血中及び尿中にて検出されるタンパク質を、質量分析にて網羅的に解析した。そして、血中と尿中双方に存在するタンパク質を抽出し、アルブミンとの相対比で、血中より尿中の比率の高い血漿タンパク質を選定した。その結果、尿中にアルブミンより偏って排泄されやすい血漿タンパク質３５種を同定することに至った。

　そして、このようにして同定されたタンパク質のうちの３種のタンパク質（ＡＭＢＰ、ＺＡＧ、ＰＬＧ）に関し、微量アルブミン尿（３０mg/gクレアチニン以上）が検出された（早期腎障害が検出された）糖尿病患者の尿で、その検出時点から遡って、より早期に腎障害を検出できるかどうかを解析した。その結果、これらタンパク質の尿中排泄量は、アルブミンとともに、早期から亢進していること等が明らかになった。したがって、尿中にアルブミンより偏って排出される指標として選抜された、ＡＭＢＰ、ＺＡＧ、ＰＬＧ等のタンパク質は、アルブミンよりも早期に腎障害を検出し得ることを明らかにし、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は、慢性腎臓病の検査方法等に関し、より具体的には以下に関する。

　＜１＞　下記（ａ）～（ｃ）の工程を含む、慢性腎臓病を検査する方法
（ａ）被検者から採取された尿検体について、下記タンパク質群から選択される少なくとも１のタンパク質の量を検出する工程、
（ｂ）工程（ａ）で検出したタンパク質量を各タンパク質の基準量と比較する工程、
（ｃ）工程（ｂ）における比較の結果、前記被検者におけるタンパク質が基準量よりも高い場合、前記被検者は慢性腎臓病に罹患している又は罹患のおそれがあると判定する工程
タンパク質群（下記にて、これらタンパク質群を各々コードする遺伝子名にて表記する）：
ＡＭＢＰ、ＺＡＧ、ＰＬＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＢＴＤ、ＣＰＮ２、ＳＥＲＰＩＮＡ６、ＬＵＭ、Ｆ２、ＬＲＧ１、ＫＮＧ１、ＩＴＩＨ４、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＨ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＡＨＳＧ、ＣＰ、ＣＦＢ、ＣＬＵ、Ａ１ＢＧ、Ｃ４Ａ、ＴＴＲ、ＩＴＩＨ１、ＨＰＸ、ＡＰＯＥ、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＲＢＰ４、ＡＰＯＡ４、ＶＴＮ、ＧＣ、Ｃ３、ＡＰＯＤ、ＴＦ及びＣＦＨ。

　＜２＞　工程（ａ）で検出する前記タンパク質が、ＡＭＢＰ、ＺＡＧ及びＰＬＧからなる群から選択される少なくとも１のタンパク質である、＜１＞に記載の方法。

　＜３＞　前記被検者が糖尿病患者であり、前記慢性腎臓病が糖尿病性腎臓病又は糖尿病性腎症である、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。

　＜４＞　前記タンパク質量は、免疫学的方法、質量分析方法及びラマン分光法からなる群から選択される少なくとも１の方法によって検出される、＜１＞～＜３＞のうちのいずれか1項に記載の方法。

　＜５＞　＜１＞～＜３＞のうちのいずれか1項に記載の方法により、慢性腎臓病を検査するための薬剤であって、工程（ａ）で検出する前記タンパク質に結合する少なくとも１の抗体を含む薬剤。

　＜６＞　下記タンパク質群から選択される少なくとも１のタンパク質である、慢性腎臓病マーカータンパク質群（下記にて、これらタンパク質群を各々コードする遺伝子名にて表記する）：
ＡＭＢＰ、ＺＡＧ、ＰＬＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＢＴＤ、ＣＰＮ２、ＳＥＲＰＩＮＡ６、ＬＵＭ、Ｆ２、ＬＲＧ１、ＫＮＧ１、ＩＴＩＨ４、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＨ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＡＨＳＧ、ＣＰ、ＣＦＢ、ＣＬＵ、Ａ１ＢＧ、Ｃ４Ａ、ＴＴＲ、ＩＴＩＨ１、ＨＰＸ、ＡＰＯＥ、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＲＢＰ４、ＡＰＯＡ４、ＶＴＮ、ＧＣ、Ｃ３、ＡＰＯＤ、ＴＦ及びＣＦＨ。

　本発明によれば、早期からの慢性腎臓病の尿検査が可能となる。特に、本発明によれば、現状臨床にて早期腎障害の指標として用いられる微量アルブミン尿よりも、早期に腎障害を感度よく検出することが可能となる。さらに、本発明の方法が対象とする検体は尿であるため、血液等の他の検体よりも、侵襲性低く得ることが出来、頻回に検査しても被検者の負担も少なくて済む。

糖尿病患者等の尿中ＡＭＢＰタンパク質量を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）にて解析した結果を示す、箱ひげ図である。図中、「糖尿病」は、腎障害を伴わない糖尿病患者の尿を解析した結果であることを示し、「健常者」は、健常者の尿を解析した結果であることを示す。また「ＤＮ」は、早期腎障害が微量アルブミン尿として認められた糖尿病患者のその時点の尿を解析した結果であることを示し、「４ヵ月」～「２０ヵ月」は、その患者で微量アルブミン尿が認められる４ヵ月前～２０ヵ月前の時点の尿を解析した結果であることを各々示す。有意差の記述には、Ｗｅｌｃｈ’ｓのｔ検定値に基づく。 質量分析において検出された、尿中ＡＭＢＰ由来のトリプシン消化断片ペプチドを、ＡＭＢＰの２０～２０３位のアミノ酸からなる領域（α１－マイクログロブリン（ａ１－ＭＧ））にマッピングした結果を示す、図である。 質量分析において検出された、尿中ＡＭＢＰ由来のトリプシン消化断片ペプチドの平均相対強度を示すグラフである。図中のα１－マイクログロブリン断片番号　♯１～１１は、図２に示す番号に対応する。 メタノール／クロロホルム沈殿法によって処理し、中間層のタンパク質と水層の短い断片（ペプチド）を質量分析対象とする、ＡＭＢＰ由来ペプチド分析の概要を示す、図である。 糖尿病患者由来の尿検体をメタノール／クロロホルム沈殿法によって処理し、水層に分離された短い断片ペプチドを、質量分析に供してＡＭＢＰ断片ペプチドと同定されたペプチドを、ＡＭＢＰの２０～２０３位のアミノ酸からなる領域（ａ１－ＭＧ）にマッピングした結果を示す、図である。図中、アミノ酸配列に併記している横棒は、同定されたペプチドを各々示す。中でも、黒の横棒は、糖尿病患者群と健常者群とを有意に区別可能なペプチド断片であることを示す。 糖尿病患者由来の尿検体をメタノール／クロロホルム沈殿法によって処理し、水層に分離された短い断片ペプチドを、質量分析に供してＡＭＢＰ断片ペプチドと同定されたペプチドを、ＡＭＢＰの２０４～３５２位のアミノ酸からなる領域（ビクニンを含む領域）にマッピングした結果を示す、図である。 健常者由来の尿検体をメタノール／クロロホルム沈殿法によって処理し、水層に分離された短い断片ペプチドを、質量分析に供してＡＭＢＰ断片ペプチドと同定されたペプチドを、ＡＭＢＰの２０～２０３位のアミノ酸からなる領域（ａ１－ＭＧ）にマッピングした結果を示す、図である。図中、アミノ酸配列に併記している横棒は、同定されたペプチドを各々示す。中でも、黒の横棒は、糖尿病患者群と健常者群とを有意に区別可能なペプチド断片であることを示す。 健常者由来の尿検体をメタノール／クロロホルム沈殿法によって処理し、水層に分離された短い断片ペプチドを、質量分析に供してＡＭＢＰ断片ペプチドと同定されたペプチドを、ＡＭＢＰの２０４～３５２位のアミノ酸からなる領域（ビクニンを含む領域）にマッピングした結果を示す、図である。図中、アミノ酸配列に併記している横棒は、同定されたペプチドを各々示す。 図５～８において検出された全てのＡＭＢＰペプチド断片について、それらＮ末端のアミノ酸位置をプロットした結果（図中、上部）、及び、その集計値に基づき前記アミノ酸位置毎のＲＯＣ解析を行った結果を示す、図である。なお、矢印が付されたペプチドは、図５に示す黒の横棒にて表されるペプチド断片に対応する。 図５～８において検出された全てのペプチド断片について、それらＣ末端のアミノ酸位置をプロットした結果（図中、上部）、及び、その集計値に基づき前記アミノ酸位置毎のＲＯＣ解析を行った結果を示す、図である。なお、矢印が付されたペプチドは、図５に示す黒の横棒にて表されるペプチド断片に対応する。 糖尿病患者群で特徴的に検出されたＡＭＢＰペプチドＡ～Ｄについて、健常者群及び患者群における質量分析測定値（ペプチド同定数）に対し、群間比較（ウェルチのt検定）を実施した結果を示す、箱ひげ図である。 抗ＡＭＢＰ抗体（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＭＡＢ７７２４）の認識部位をＥＬＩＳＡ法によって解析するために合成したペプチド１～５の、ＡＭＢＰにおける位置関係を示す、概略図である。 図１２及び表７に示すペプチド１～５（図中「ビオチン化抗原」）及び前記抗ＡＭＢＰ抗体を用いた、前記ＥＬＩＳＡ法の概要を示す、図である。 前記ＥＬＩＳＡ法によって解析した結果を示す、グラフである。

　＜慢性腎臓病の尿検査方法＞
　後述の実施例に示すとおり、本発明者らによって、早期腎障害のマーカーであるアルブミンより尿中に偏って排出されるタンパク質は、微量アルブミン尿よりもより早期に腎障害を検出する上で有用であることが明らかになった。

　すなわち、本発明は、かかる知見に基づき完成されたものであり、下記（ａ）～（ｃ）の工程を含む、慢性腎臓病を検査する方法を提供する。

　下記（ａ）～（ｃ）の工程を含む、慢性腎臓病を検査する方法
（ａ）被検者から採取された尿検体について、下記タンパク質群から選択される少なくとも１のタンパク質の量を検出する工程、
（ｂ）工程（ａ）で検出したタンパク質量を各タンパク質の基準量と比較する工程、
（ｃ）工程（ｂ）における比較の結果、前記被検者におけるタンパク質が基準量よりも高い場合、前記被検者は慢性腎臓病に罹患している又は罹患のおそれがあると判定する工程
タンパク質群：（下記にて、これらタンパク質群を各々コードする遺伝子名にて表記する）
ＡＭＢＰ、ＺＡＧ、ＰＬＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＢＴＤ、ＣＰＮ２、ＳＥＲＰＩＮＡ６、ＬＵＭ、Ｆ２、ＬＲＧ１、ＫＮＧ１、ＩＴＩＨ４、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＨ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＡＨＳＧ、ＣＰ、ＣＦＢ、ＣＬＵ、Ａ１ＢＧ、Ｃ４Ａ、ＴＴＲ、ＩＴＩＨ１、ＨＰＸ、ＡＰＯＥ、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＲＢＰ４、ＡＰＯＡ４、ＶＴＮ、ＧＣ、Ｃ３、ＡＰＯＤ、ＴＦ及びＣＦＨ。

　本発明の検出対象である「慢性腎臓病」は、Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＫＤとも称され、以下のいずれかの状態が３ヶ月以上持続する場合に該当すると定義されている。
（１）尿所見異常等の腎疾患・腎障害の存在を示す所見がある
（２）中等度以上の腎機能低下（糸球体濾過量（ＧＦＲ）　６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２未満）を認める。

　また「慢性腎臓病」は通常、その進行度によって、ＧＦＲを指標として、ステージ１～５に分類することができるが、本発明においてはいずれのステージも検出対象となり、またステージ１（ＧＦＲは正常範囲であるが、尿中の微量アルブミン尿が検出される状態）よりも前の状態も検出することが可能となる。

　本発明において「慢性腎臓病」としては例えば、臨床及び病理学的に、糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）、糖尿病性腎症（ＤＮ）、慢性腎炎、ネフローゼ症候群、腎硬化症、ＩｇＡ腎症、又は膠原病に伴う腎症と診断される疾患が挙げられるが、これら疾患、特に糖尿病性腎臓病、糖尿病性腎症の早期発見において、本発明は好適に用いられ得る。

　「糖尿病性腎臓病」は通常、（１）アルブミン尿の上昇及びＧＦＲの低下を伴う、典型的（古典的）ＤＫＤ、（２）顕性アルブミン尿を呈する以前からＧＦＲが低下する臨床経過を伴うＤＫＤ（ｅａｒｌｙ　ｄｅｃｌｉｎｅｒ）、（３）正常アルブミン尿のままＧＦＲが低下する臨床経過を伴うＤＫＤ（ＮＡＤＫＤ）、（４）顕性アルブミン尿を呈してもＧＦＲがさほど低下しない臨床経過を伴う、ＧＦＲ安定型ＤＫＤの４パターンに分けられる。なお「顕性アルブミン尿」とは、尿アルブミン／クレアチニン比（ｍｇ／ｇＣｒ）の数値が３００以上の尿のことである。本発明においてはいずれのパターンのＤＫＤも本発明の好適な検査対象となる。

　「糖尿病性腎症」は通常、ステージ１～５に分類することができるが、本発明においてはいずれのステージも検出対象となり、特にステージ１（尿中アルブミン量が正常（３０ｍｇ／ｇＣｒ未満）である、腎症前期）及びその前の状態を検出することが可能となる。

　本発明において「被検者」は、ヒトであれば特に制限はなく、例えば、腎機能の低下を感じている者、腎機能が低下するおそれがある者、慢性腎臓病を罹患するおそれがある者（例えば、糖尿病患者）、他の検査方法において慢性腎臓病を罹患していると判断されている者が挙げられるが、後述の実施例に示すとおり、本発明にかかる被検者は、好ましくは糖尿病患者である。ここで「糖尿病患者」は、糖尿病を罹患している者（糖尿病罹患者）であり、より具体的には、空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上であるか、又は、経口ブドウ糖負荷試験後２時間後の血糖値が２００ｍｇ／ｄＬ以上である者を意味する。

　かかる被検者から採取（分離）される「尿検体（尿試料）」としては、例えば、排尿（放尿）、又は尿管へのカテーテルの挿入による収集によって得ることができるが、低侵襲性の観点から、排尿により得ることが好ましい。尿検体は、尿を含む試料又は尿に由来する試料であればよく、後述の本発明にかかるタンパク質量の検出前に、予備的な処理に供されている尿であってもよい。かかる予備的な処理としては、特に制限はないが、例えば、処理液（例えば、緩衝液、更には、キレート剤、界面活性剤等を添加した溶液）の添加、遠心処理、ろ過、攪拌、タンパク質の分画、タンパク質の抽出、タンパク質の沈殿、タンパク質の分解（ペプチドへの断片化）、加熱、凍結、冷蔵が挙げられる。また、かかる処理は複数組み合わせて尿に施してもよい。

　本発明において、腎障害の尿中マーカーとして検出されるタンパク質（本発明にかかるタンパク質）は、後述の実施例に示すとおり、アルブミンより尿中に偏って排出される血漿タンパク質であり、より具体的には、下記表１及び２に示す３５種のタンパク質が挙げられる。各タンパク質のアミノ酸配列情報は、下記表に付記したＵｎｉｐｒｏｔ．Ｎｏ．（アクセッション番号）を基に、データベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）で検索することにより得ることができる。

　なお、タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。したがって、本発明において検出対象となる腎障害のマーカーは、前記典型的なアミノ酸配列に特定されることなく、それらアミノ酸配列の天然の変異体も含まれる。また、本発明において検出対象となる腎障害のマーカーは、全長のアミノ酸配列からなるもののみならず、生体内で断片化された部分ポリペプチド（断片ペプチド）も含まれる。

　かかる部分ポリペプチドとしては、例えば、後述の実施例に示すとおり、ＡＭＢＰにおいては、２０～２０３位のアミノ酸（配列番号：２に記載のアミノ酸配列）を含むペプチド、１８３～２０２位のアミノ酸（配列番号：３に記載のアミノ酸配列）を含むペプチド、１８３～２０３位のアミノ酸（配列番号：４に記載のアミノ酸配列）を含むペプチド、１８４～２０２位のアミノ酸（配列番号：５に記載のアミノ酸配列）を含むペプチド、１８４～２０３位のアミノ酸（配列番号：６に記載のアミノ酸配列）を含むペプチド、１７５～２０３位のアミノ酸（配列番号：１１に記載のアミノ酸配列）を含むペプチド、６３～８５位のアミノ酸（配列番号：７に記載のアミノ酸配列）を含むペプチドが挙げられる。なお、本願発明において、ＡＭＢＰにおける何位とは、当該タンパク質のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ０２７６０（配列番号：１）に記載のアミノ酸配列）において、最初のメチオニンを１位とした際の順番を意味する。

　本発明において、腎障害の尿中マーカーとして検出するタンパク質の種類としては、少なくとも１種であれば良いが、より慢性腎臓病の検査の精度を高めるという観点から、複数種のタンパク質量を検出してもよい。複数種としては、特に制限はなく、例えば、２種以上（２種、３種、４種等）、５種以上（５種、６種、７種、８種、９種等）、１０種以上（１０種、１２種、１５種、１８種等）、２０種以上（２０種、２２種、２５種、２８種等）、３０種以上（３０種、３１種、３２種、３３種、３４種、３５種）が挙げられる。また、本発明においては、比較的尿中濃度が高いという観点から、ＡＭＢＰ、ＺＡＧ及びＰＬＧからなる群から選択される少なくとも１のタンパク質が好ましく、ＡＭＢＰがより好ましい。

　本発明において検出する腎障害のマーカーの「タンパク質の量」とは、絶対量のみならず、相対量であってもよい。相対量としては、例えば、尿中の総タンパク質（ポリペプチド）量に対する割合が挙げられる。また、相対量としては、検出に用いる測定方法又は測定装置に基づくタンパク質（ポリペプチド）量の比（所謂、任意単位（ＡＵ）で表される数値）が挙げられる。相対量としてはまた、例えば、参照分子の量を基準として算出した値を用いてもよい。本発明にかかる「参照分子」は、尿検体において安定して存在しており、また異なる尿検体間において、その1日総排泄量の差が小さい分子であればよく、例えば、内在性コントロール（内部標準）分子が挙げられ、より具体的には、クレアチニン（Ｃｒ）が挙げられる。なお、尿中クレアチニン濃度は、クレアチニンの産生が筋肉の量に依存することから、一個体に対して、その1日総排泄量はほぼ一定であると考えられている。尿中成分の検査においては、尿の濃淡誤差を回避するため、クレアチニン１ｇ当りの量により、目的とする尿中成分の1日総排泄量を推定する手法が一般的に用いられており、これによりクレアチニン単位グラム当たりの尿中成分を比較することが可能になる。

　「タンパク質量の検出」は、当業者であれば、適宜公知の手法を採用して実施することができる。かかる公知の手法としては、例えば、抗体を用いて検出する方法（免疫学的方法）、質量分析法、ラマン分光法が挙げられる。

　「免疫学的方法」では、本発明にかかるタンパク質を認識する抗体が使用され、当該抗体を各々の抗体が結合するタンパク質（標的タンパク質）に接触させ、当該抗体の各タンパク質への結合性を指標として、各タンパク質量が検出される。

　免疫学的方法としては、例えば、イムノクロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、ラテックス凝集法、マルチプレックスアッセイ、抗体アレイ等のサンドイッチ法、イムノブロッティング、イムノアフィニティークロマトグラフィー、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫組織化学的染色法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）が挙げられる。

　より具体的に、イムノクロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ法等のサンドイッチ法においては、先ず、プレート、繊維状物質、粒子等の固相に固定した、標的タンパク質を認識する抗体（捕獲用抗体）に、前記尿検体中の標的タンパク質を接触させることにより、当該抗体が認識する標的タンパク質は捕獲される。次いで、捕獲された標的タンパク質に対して、後述の標識がなされた標的タンパク質を認識する抗体（検出用抗体）を作用させ、当該標識を化学的に又は光学的に検出することにより、本発明にかかるタンパク質の量を検出することができる。

　なお、「捕獲用抗体」と「検出用抗体」とは、本発明にかかるタンパク質を認識する限り、同一の抗体であってもよく、異なる抗体であってもよいが、本発明にかかるタンパク質を非競合的に捕獲、検出することができるという観点から、異なる抗体であることが好ましい。異なる抗体としては、例えば、捕獲用抗体が本発明にかかるタンパク質に対するポリクローナル抗体であり、検出用抗体が同標的タンパク質に対するモノクローナル抗体であるという組み合わせ、捕獲用抗体が本発明にかかるタンパク質に対するモノクローナル抗体であり、検出用抗体が同標的タンパク質に対するポリクローナル抗体であるという組み合わせ、または捕獲用抗体が本発明にかかるタンパク質に対するモノクローナル抗体であり、検出用抗体が当該捕獲用抗体の認識する部位（エピトープ）とは異なる部位を認識する同標的タンパク質に対するモノクローナル抗体であるという組み合わせである。

　また、標識物質を結合させた検出用抗体を用いて本発明にかかるタンパク質に結合した抗体量を直接測定する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法や二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法等の間接的検出方法を利用することもできる。ここで「二次抗体」とは、本発明にかかる抗体に特異的な結合性を示す抗体である。また、二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡ等を用いることも可能である。

　また、免疫学的方法としてより具体的に、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いる場合には、抗体は捕獲用抗体１種類だけが使われる。捕獲用抗体をセンサーチップ（ＧＬＭ）に固定し、その後、尿検体中の標的タンパク質を接触させることにより、当該抗体が認識する標的タンパク質は捕獲される。その結果、センサー表面に入射する光がタンパク質の結合により、表面近傍の屈折率が変化し、光の反射強度が最小となる角度が変化する。この角度の変化（レゾナンスユニット、ＲＵ）は結合したタンパク質の量に比例することを利用した定量法である。

　「質量分析法」とは、タンパク質をトリプシン消化したペプチド試料を、イオン源を用いてイオン化し、質量分析計の分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化したペプチドを質量電荷比に応じて分離、検出し、ペプチドのイオン量の総和からタンパク質量を測定する方法のことをいう。なお、ここでの「ペプチド試料」は、本発明においては、尿検体に相当し、尿タンパク質をトリプシン分解することにより調製される。イオン源を用いてイオン化する方法としては、ＥＩ法、ＣＩ法、ＦＤ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法等の方法を適宜選択することができる。また、分析部において、イオン化したペプチド試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型等分離方法を適宜選択することができる。また、２種類以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。特に、トリプル四重極型質量分析計による選択反応モニタリング（ＳＲＭ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）又は多重反応モニタリング（ＭＲＭ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）によって、１回の測定で１種類又は多種のマーカー分子を同時に測定することができる。また、質量分析計は単独で用いられてもよいし、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を組み合わせることにより、対象タンパク質を構成するペプチドを分離・精製してサンプルとすることができる。

　「ラマン分光法」とは、ラマン散乱光を用いて物質の分析を行う分光法であり、通常、光源、分光器及び検出器から構成されるラマン分光装置を用いて行われる。ラマン散乱光とは、物質に光を照射した際に生じる、入射光と異なる波長を有し、振動数の変化した散乱光である。単色光を照射した場合、その振動数成分の集まり（ラマンスペクトル）は物質に固有のものとなる。このため、かかるラマン散乱光の特性を利用し、レーザー光を使用したラマン分光法によって、本発明が対象とする尿中の特定タンパク質のような、生体微量物質であっても定量的に分析することが可能となる。かかる生体微量物質の定量分析が可能なラマン分光法としては特に制限はないが、例えば、共鳴ラマン分光法、共鳴ラマンラベル法、表面増強共鳴ラマン（ＳＥＲＲＳ）等の高感度定量分析法、マルチチャンネルラマン分光による多項目同時分析、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）分光法等が、好適な方法として挙げられる。なお、ラマン分光法によって生体物質を検出できることは公知である（例えば、特許第６４７０７７９号、特開２００７－１７５２４２号公報、科学研究費助成事業（科学研究費補助金）研究報告書　ＣＡＲＳによる非侵襲血糖計測技術の研究（研究代表者　戸井田昌宏）、加納英明ら、「ナノ秒白色レーザーを用いたコヒーレント・ラマン分光イメージング」、日本光学会会誌　光学、２０１１年、第４０巻、第８号、第４２１（３５）～４２９（４３）ページ等　参照）。

　本発明の検査方法においては、このようにして検出された本発明にかかるタンパク質の量と、同タンパク質の基準量とを比較する。比較対象となる「本発明にかかるタンパク質の基準量」としては特に制限はなく、当業者であれば上記検出方法及び統計学的解析方法に合わせ、それを基準とすることにより、慢性腎臓病を罹患していない者と慢性腎臓病患者とを判別することのできる、所謂カットオフ値として設定することができる。

　慢性腎臓病の罹患の有無を判別するための基準量としては、例えば、慢性腎臓病を罹患していない個体群（例えば、腎障害を伴わない糖尿病患者群、少なくとも１年間腎障害を発症していない糖尿病患者群、健康診断を受診し、異常が検出されなかった健常者群）において検出された本発明にかかるタンパク質量の中央値又は平均値が挙げられる。また、慢性腎臓病を罹患していない個体群と慢性腎臓病を罹患している個体群とにおいて、本発明にかかるタンパク質の量を比較することにより決定される値（例えば、慢性腎臓病を罹患していない個体群の本発明にかかるタンパク質の量と、慢性腎臓病に罹患している個体群の同タンパク質の量との、間の値）であってもよい。さらに、後述の実施例に示すとおり、腎障害の進行に伴い、本発明にかかるタンパク質の尿中の量は増加し得る。そのため、本発明にかかる基準量として、被検者自体の過去の本発明にかかるタンパク質の量も挙げられる。

　かかる基準量の設定は、当業者であれば、上記検出方法に合った統計学的解析方法を適宜選択して行うことができる。統計学的解析方法としては、例えば、ｔ検定（Ｗｅｌｃｈ’ｓ　ｔ検定等）、非等分散性のパラメトリック検定、Ｓｔｅｅｌの多重検定、マン・ホイットニーのＵ検定、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、クラスカル・ウォリス検定、ウィルコクソン検定、オッズ比、ハザード比、フィッシャーの正確検定、受信者動作特性解析（ＲＯＣ解析）、分類木と決定木解析（ＣＡＲＴ解析）が挙げられる。また、比較の際には、正規化された又は標準化かつ正規化されたデータを用いることもできる。

　かかる基準量として、後述の実施例（表６）に示すように、本発明において腎障害のマーカーとしてＡＭＢＰタンパク質の尿中量をＳＰＲ法にて検出した場合、より具体的な例としては、好ましくは１５であり、より好ましくは１８であり、さらに好ましくは２０であり、より好ましくは３０であり、さらに好ましくは３５である。なお、ここでの数値は、ＳＰＲ法にておいて検出されるレゾナンスユニット（ＲＵ）値を表す。

　「前記被検者におけるタンパク質量が基準量よりも高い」とは、当業者であれば適宜判断することができる。例えば、検出されたタンパク質量が基準量より高く、好ましくはその差が統計的に有意と認められること（例えば、Ｐ＜０．０５）が挙げられる。また、例えば、検出されたタンパク質量が対応する基準量の２倍以上（好ましくは、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上）であることも挙げられる。そして、本発明の検査方法において、前記被検者におけるタンパク質量が基準量よりも高い場合、前記被検者は慢性腎臓病を罹患している又は罹患するおそれがある（発症するおそれがある）と判定される。

　また、慢性腎臓病の検査は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む）によって行われるが、上述のタンパク質量等に関するデータは、医師による治療のタイミング等の判断も含めた診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断のために上述のタンパク質に関するデータを収集する方法、当該データを医師に提示する方法、上述のタンパク質と基準量とを比較し分析する方法、医師による診断を補助するための方法とも表現し得る。

　さらに、本発明の検査方法は、他の慢性腎臓病の検査方法と組み合わせて行ってもよい。かかる他の検査方法としては、特に制限はないが、例えば、尿検査（尿中アルブミン量の検出、尿中アルブミン／Ｃｒ比の検出、尿中タンパク量の検出、尿中タンパク／Ｃｒ比の検出等）、血液検査（血清クレアチニン値の検出等）、画像診断（超音波検査、腹部ＣＴ等）、腎生検が挙げられる。

　以上の通り、本発明によれば、慢性腎臓病を早期発見できる、あるいは、病状の病態の変化を検査することができる。そして、かかる評価の結果により、慢性腎臓病罹患者における、食塩制限、運動、禁煙等の生活習慣の改善といった医療介入、血糖や血圧のコントロール等を目的とした薬物等による治療を行うか否かを判断することもできる。したがって、本発明は、本発明の検査方法により慢性腎臓病を罹患していると判定された被検者に、慢性腎臓病の医療介入、治療を施す工程を含む、慢性腎臓病に医療介入する方法、又は慢性腎臓病を治療する方法を提供することもできる。

　かかる慢性腎臓病の医療介入、治療としては特に制限はないが、血糖値管理、生活習慣改善、食事指導、血圧管理、貧血管理、電解質管理、尿毒素管理、免疫管理、脂質管理のための指導又は投薬が挙げられる。

　糖尿病患者では血糖値は、Ｈｂａ１ｃ　６．９％未満になるように管理され、場合により血糖降下薬が投与される。血糖降下薬として、ＳＧＬＴ２阻害薬（イプラグリフロジン、ダパグリフロジン、ルセオグリフロジン、トホグリフロジン、カナグリフロジン、エンパグリフロジン等）、ＤＰＰ４阻害薬（シタグリプチンリン酸、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、アログリプチン、リナグリプチン、テネリグリプチン、トレラグリプチン、アナグリプチン、オマリグリプチン等）、スルホニル尿素薬（トルブタミド、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、グリクロピラミド、グリベンクラミド、グリクラジド、グリメピリド等）、チアゾリジン薬（ピオグリタゾン等）、ビグアナイド薬（メトホルミン、ブホルミン等）、α－グルコシダーゼ阻害薬（アカルボース、ボグリボース、ミグリトール等）、グリニド薬（ナテグリニド、ミチグリニド、レパグリニド等）インスリン製剤、ＮＲＦ２活性化剤（バルドキソロンメチル等）等が用いられる。

　生活習慣改善としては、禁煙及びＢＭＩ値の２５未満への減量等が推奨される。食事指導としては、減塩及びタンパク質制限が行われる。

　血圧管理としては、１３０／８０ｍｍＨｇ以下となるように、管理され、場合により高血圧治療薬が投与されうる。高血圧治療薬としては、利尿薬（サイアザイド系利尿薬、例えばトリクロルメチアジド、ベンチルヒドロクロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、サイアザイド系類似利尿薬、例えばメチクラン、インダバミド、トリバミド、メフルシド、ループ利尿薬、例えばフロセミド、カリウム保持性利尿薬・アルドステロン拮抗薬、例えばトリアムテレン、スピロノラクトン、エプレレノン等）、カルシウム拮抗薬（ジヒドロピリジン系、例えばニフェジピン、アムロジピン、エホニジピン、シルニジピン、ニカルジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニルバジピン、バルニジピン、フェロジピン、ベニジピン、マニジピン、アゼルニジピン、アラニジピン、ベンゾチアゼピン系、ジルチアゼム等）、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（カプトプリル、エナラプリル、アセラプリル、デラプリル、シラザプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、テモカプリル、キナプリル、トランドラプリル、ベリンドプリルエルブミン等）、アンジオテンシン受容体拮抗薬（アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、例えばロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、オルメサルタン、イルベサルタン、アジルサルタン等）、交感神経遮断薬（β遮断薬、例えばアテノロール、ビソプロロール、ベタキソロール、メトプロロール、アセプトロール、セリプロロール、プロプラノロール、ナドロール、カルテオロール、ピンドロール、ニプラジロール、アモスラロール、アロチノロール、カルベジロール、ラベタロール、ベバントロール、ウラピジル、テラゾシン、ブラゾシン、ドキサゾシン、ブナゾシン等）等が用いられうる。

　貧血治療薬としてはエリスロポエチン製剤、鉄剤、ＨＩＦ－１阻害剤等が用いられる。電解質調整薬としてカルシウム受容体作動薬（シナカルセト、エテルカルセチド等）、リン吸着剤が用いられる。尿毒素吸着剤として活性炭等が用いられる。

　免疫管理としては、免疫抑制剤（ステロイド類、タクロリムス、抗ＣＤ２０抗体、シクロヘキサミド、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）等）が用いられる。

　脂質管理では、ＬＤＬ－Ｃ１２０ｍｇ／ｄＬ未満となるよう管理され、場合により脂質異常症治療薬、例えばスタチン系薬剤（ロスバスタチン、ピタバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン等）、フィブラート系薬剤（クロフィブラート、ベザフィブラート、フェノフィブラート、クリノフィブラート等）、ニコチン酸誘導体（ニコチン酸トコレロール、ニコモール、ニセリトロール等）、コレステロールトランスポーター阻害剤（エゼチミブ等）、ＰＣＳＫ９阻害剤（エボロクマブ等）、ＥＰＡ製剤等が用いられる。

　腎機能の低下が著しく生命予後に危険が及ぶ場合は、腹膜透析、血液透析、持続的血液濾過透析、血液アフェレーシス（血漿交換、血漿吸着等）や腎移植のような腎代替療法が施される。

　また、本発明によれば、かかる治療薬の用法（投与対象、投与時期）が特定される。したがって、本発明は、本発明の方法により慢性腎臓病に罹患していると判定された被検者に投与される、上述の血糖降下薬等の薬剤を有効成分とする、慢性腎臓病の治療薬をも提供する。

　＜慢性腎臓病を検査するための薬剤＞
　上述の通り、本発明の方法においては、上述のタンパク質量を、当該タンパク質を認識する抗体を用いて検出することにより、慢性腎臓病罹患又はそのおそれの有無を判定することができる。

　したがって、本発明は、上述の方法により、慢性腎臓病を検査するための薬剤であって、本発明にかかるタンパク質を認識する抗体を含む薬剤を提供する。

　本発明の薬剤に含まれる「抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、抗体の機能的断片であってもよい。「抗体」には、免疫グロブリンの全てのクラス及びサブクラスが含まれる。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、標的タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。

　本発明にかかる抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（本発明にかかるタンパク質、部分ペプチド又はこれを発現する細胞等）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、精製して取得することができる。

　また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。組換えＤＮＡ法は、上記本発明に係る抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明に係る抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７　ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ａ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５（１９９０））。

　本発明にかかる抗体はまた、イムノクロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴法等に用いるべく、固相化された形態で提供されてもよい。固相としては、例えば、プラスチックプレート等のプレート、ニトロセルロース等の繊維状物質、磁性粒子やラテックス粒子等の粒子を用いることができる。また、上記検出方法に合わせ、抗体は標識用物質で標識されていてもよい。標識用物質としては、例えば、ＨＲＰ、β－Ｄ－グルコシダ―ゼ、ルシフェラーゼ等の酵素、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＤＥＡＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５等の蛍光物質、金属コロイド（金コロイド、白金コロイド等）、ラテックス（例えば、赤色及び青色等の顔料で着色されたポリスチレンラテックス等の合成ラテックス、天然ゴムラテックス）等の呈色物質、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質が挙げられる。

　本発明の薬剤は、前記抗体の他、組成物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、薬理学上許容される担体又は希釈剤（滅菌水、生理食塩水、植物油、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤等）が挙げられる。賦形剤としては、乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。

　また、上記本発明にかかる抗体又は薬剤の他、標識の検出に必要な基質、試料（尿検体等）のタンパク質を溶解するための溶液（タンパク質溶解用試薬）、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液（希釈液、洗浄液）、標識の検出反応を停止するための試薬（反応停止薬）、陽性対照（例えば、本発明に係るタンパク質各種、標品、慢性腎臓病罹患者に由来する尿検体）、陰性対照（例えば、慢性腎臓病を罹患していない者に由来する尿検体）、本発明にかかる抗体に対するアイソタイプコントロール抗体等を組み合わせることができ、慢性腎臓病を検査するためのキットとすることもできる。かかるキットとしては、例えば、少なくとも１の発明に係るタンパク質を認識する抗体と、前記抗体に対するアイソタイプコントロール抗体、陽性対照及び陰性対照から選択される少なくとも１の物品とを含む慢性腎臓病を検査するためのキットが挙げられる。また、標識されていない抗体を抗体標品とした場合には、当該抗体に結合する物質（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ等）を標識化したものを組み合わせることができる。さらに、かかるキットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。

　＜慢性腎臓病を検査するための装置＞
　本発明が対象とする尿は、医療行為等を伴わずとも排尿によって容易に採取することができ、また日常的に分析することで健康管理（例えば、糖尿病患者の疾患管理）を行うことも可能である。よって、かかる観点から、便器等に備える、慢性腎臓病を検査するための以下のような装置も提供することが可能である。

　本発明の検査方法によって慢性腎臓病を検査するための装置であって、
　被検者の尿を採取するための採尿器と、採尿器内の尿検体における本発明にかかるタンパク質を検出するための系と、当該系で検出された前記タンパク質量を対応するタンパク質の基準量と比較し、前記被検者の慢性腎臓病の罹患又はそのおそれの有無を判定するためのデータ処理部と、当該判定結果を出力するデータ出力部とを備えた装置。

　本発明において、採尿器は、例えば、便器本体内で放尿を受ける位置の設けられる器（サンプルポート等）が挙げられる。本発明にかかるタンパク質を検出するための系としては、当該タンパク質を検出できる装置等であればよく、例えば、ラマン分光装置、免疫学的検出装置（自動イムノクロマトグラフィーアッセイ装置、自動ＥＬＩＳＡ装置等）、質量分析計が挙げられる。データ出力部は、データ送信部を更に備えるものであってもよく、無線ＬＡＮ、赤外線通信等によって、前記判定結果を、被検者又はその健康状態を管理する者（医師等）等が有する情報端末（携帯電話、スマートフォン、タブレット、携帯情報端末、コンピュータ、携帯用コンピュータ、ウェラブルコンピューター等）に送信することも可能となる。

　また、本発明の装置において、採尿器及びタンパク質検出系と、データ処理部及びデータ出力部とは分離していてもよい。かかる場合、タンパク質検出系はデータ送信部を備え、データ処理部はデータ受信部を備えることにより、分離した装置間において、検出したタンパク質に関するデータの送受信が可能となる。

　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

　（実施例１）
　微量アルブミン尿より早期に糸球体障害を尿検査で検出できるようにする尿バイオマーカーの探索に際し、軽度の糸球体障害でアルブミンとともに尿中に排泄され、アルブミンより近位尿細管で再吸収され難い低分子血漿タンパク質が存在すると仮定した。そして、かかるタンパク質であれば、尿中のアルブミンを指標とするよりも、より早期に腎障害を反映するマーカーとして利用し得るのではないかと考え、以下の方法にて、当該タンパク質の探索を行った。

　健常者３名から得た血漿タンパク質及び尿タンパク質を、質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＨＩＴＡＣＨＩ　ＮａｎｏＦｒｏｎｔｉｅｒ　ＬＤ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いたプロテオーム解析に供し、これら試料中に存在するタンパク質を同定、定量した。

　なお、血漿タンパク質は、健常者から採取した血漿を、トリス塩酸バッファーでタンパク質濃度を４０ｍｇ／ｍｌになるよう希釈した後、分子篩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｚｅｂ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎ、ＭＷＣＯ　７Ｋ）で血漿タンパク質を抽出することにより調製した。なお、その後、ゲル電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ社製、ＯＦＦＧＥＬ）によって、２４に分画し、それぞれの分画タンパク質をトリプシン分解処理し、前記質量分析に供した。

　尿タンパク質は、健常者から採取した尿をメタノール／クロロフォルム沈澱法によって処理することにより調製し、トリプシン分解して、前記質量分析に供した。

　その結果、前記質量分析によって、血漿においては約４００種類のタンパク質が、尿においては約１，２００種類が同定され、さらに、３名の検体で共通して検出されたタンパク質で両者を比較した結果、尿中に排泄される血漿タンパク質４８種類を抽出することが出来た。

　そして、それらのタンパク質量を、質量分析の結果に基づき定量し（ＳＩＮ；ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｓｐｅｃｔｒａｌ　ｉｎｄｅｘ）、さらに、両試料に含まれるアルブミン（ＡＬＢ）値を基準に、同定タンパク質の尿中分率を算出した。

　この結果、下記表３及び４に示すとおり、アルブミンと比較し、尿中に偏って高い（＝近位尿細管でアルブミンより再吸収されにくい）血漿タンパク質を、微量アルブミン尿より早期に糸球体障害を検出できるバイオマーカー候補（３５種）として選抜することが出来た。

　なお、表中の表記については以下のとおりである。
Ｘｐ：血漿タンパク中の各同定したタンパク質の量
Ｘｕ：尿タンパク中の各同定したタンパク質の量
Ａｌｂｐ：血漿タンパク中のアルブミン量
Ａｌｂｕ：尿中タンパク中のアルブミン量
尿中分率＝（Ｘｕ／Ａｌｂｕ）／（Ｘｐ／Ａｌｂｐ）。

　（実施例２）
　次に、上記マーカー候補が、実際に、アルブミンを指標とする場合よりも早期に腎障害を検出できるかにつき、腎障害が認められた糖尿病患者の尿検体の時系列データを用い、評価した。なお、上記マーカー候補から、比較的尿中濃度が高いという観点から、ＡＭＢＰ、ＺＡＧ、ＰＬＧを、以下の評価に供した。

　解析対象に関し、インフォームドコンセントを得た糖尿病患者約６０００人から、来院の都度行われる通常の尿検査後、不要になった尿検体を冷凍保存し、使用した。この中から、糖尿病にのみ罹患している外来患者であって、その後再来院時に微量アルブミン尿が検出され、早期腎障害を発症したと考えられる患者４３名を特定した。さらに、これら患者の過去来院時の尿検体を抽出し、過去４ヶ月毎に区切ってグループ化し、マーカー候補評価時に使用した。

　尿中の各タンパク質量の測定は、各タンパク質を特異的に認識する抗体を用い、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法、装置名：ＢｉｏＲａｄ　ＰｒｏｔｅＯｎ　ＸＰＲ３６）によって行った。具体的には、ＰｒｏｔｅＯｎ　ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ）でセンサーチップ（ＧＬＭ）の６ラインを５０％グリセロールでイニシャライズし、アクチベータ（ＥＤＣとＳｕｌｆｏ‐ＮＨＳとの１：１混合液）でライン表面を活性化した後、捕獲用抗体（４種類）、コントロール（正常マウスＩｇＧ等）（１０ｍＭ　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）にて１０μｇ／ｍＬになるよう希釈）をそれぞれ１ラインずつに固定し、１Ｍ　Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－ＨＣｌでデアクチベートした。その後、抗体及びコントロール固定ラインに直交する１～６ラインに尿検体セット（６検体）を２分間、５０μＬ／分で反応させ、それぞれの最大ピークのＲＵ値を求めた。捕獲用抗体への結合量は、捕獲用抗体で得られたＲＵ値からコントロールで得られたＲＵ値を差し引いた値とした。その反応後、リジェネレーター（１０ｍＭ　グリシン‐ＨＣ緩衝液‐１０％　Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ２．５）を用い、１分、１００μＬ／分で６ラインを洗い、抗体に結合したタンパク質を解離させ、１０％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ７．５）を用い、１６分、２５μＬ／分でラインを平衡化した後、次の尿検体セット（６検体）を反応させ、そのＲＵ値を得た。これを繰り返すことで、多検体の尿中の各タンパク質、４種類を定量した。

　また、比較対象として尿中のアルブミン量も測定した。加えて、尿中成分の量比等の比較時にクレアチニン補正を実施することが一般的であるため、ＳＰＲ測定値をクレアチニン測定値で割ったクレアチン補正値も算出し、比較解析も行った。

　なお、尿検体は、凍結保存していたものを、３７℃で１０分間温め、１０％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ７．５）で１０倍に希釈して、本ＳＰＲ法に供した。また、本ＳＰＲ法において捕獲用抗体として用いた各抗体は以下のとおりである。
抗ＡＭＢＰ抗体…Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品名：Ｈｕｍａｎ　ａｌｐｈａ　１－Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｌｏｎｅ＃７８４９１７、カタログ番号：ＭＡＢ７７２４、
抗ＺＡＧ抗体…Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品名：Ｈｕｍａｎ　ＺＡＧ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｌｏｎｅ＃８４２０２５、カタログ番号：ＭＡＢ４７６４、
抗ＰＬＧ抗体…Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品名：Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ／Ｐｌａｓｍｉｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｌｏｎｅ＃２７０４１２、カタログ番号：ＭＡＢ２５９６、
抗アルブミン抗体…ＰＡＲ社製、Ａｌｂｕｍｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｌｏｎｅ＃ＢＩ２０２５Ａ。

　また、尿検体は、凍結保存していたものを、３７℃で１０分間インキュベートすることにより解凍した後、ＰＢＳ－Ｔ緩衝液にて１０倍に希釈したものの、上清を前記ＳＰＲ法に供した。

　そして、このようにして得られた各ＳＰＲ測定値を、クレアチン補正有／無にて、早期腎障害を発症したと考えられる糖尿病患者の尿及びその過去来院時の尿と、少なくとも１年間は腎障害を発症していない糖尿病患者の尿とで比較した。また、当該糖尿病患者の尿と健常者の尿とも比較した。これら２群間の比較はＷｅｌｃｈ’ｓ　ｔ検定にて行った。得られたＡＭＢＰに関する結果を下記表に示す。なお、当該表において、「日数」は、微量アルブミン尿が検出された時点、すなわち早期腎障害の発症時点から遡っての日数を示す。また、この日数以外の数値は、前記ｔ検定によって得られた各Ｐ値であり、０．０５未満を有意であると判断した。

　表５に示した結果から明らかなように、尿中のＡＭＢＰは、クレアチニン補正の有無に関わらず、早期腎障害の発症より４８０～５９９日前から、有意に増加していることが明らかになった。すなわち、ＡＭＢＰを指標とすることによって、微量アルブミン尿と比較して、１年半程度早く腎障害の傾向を検出できることが明らかになった。さらに、その有意性（検出感度）は、クレアチニン補正を行うことによって、より向上することも明らかになった。

　また、図表には示していないが、ＺＡＧに関するＳＰＲ測定値（クレアチン補正有）においても、早期腎障害の発症より２４０～３５９日前の時点で有意な増加が認められ、ＰＬＧに関するＳＰＲ測定値（クレアチン補正無）においても、早期腎障害の発症より２４０～３５９日前の時点で有意な増加が認められた。

　さらに、少なくとも１年間は腎障害を発症していない糖尿病患者の尿と健常者の尿とで比較した結果、いずれのマーカーにおいても有意差が認められた（アルブミンのＰ値：０．０１５９１７、ＡＭＢＰのＰ値：０．０４２５４７、ＺＡＧのＰ値：０．０００５１０、ＰＬＧのＰ値：０．０２２９０５）。

　以上の結果から、尿中にアルブミンより偏って排出されることを指標として選抜された、ＡＭＢＰ、ＺＡＧ、ＰＬＧ等の上記マーカー候補は、実際にアルブミンよりも早期に腎障害を検出し得ることが明らかになった。

　（実施例３）
　次に、実施例２にて統計解析に供したＡＭＢＰに関するデータの分布を確認するために、箱ひげ図を作成した。なお、有意差の記述には、Ｗｅｌｃｈ’ｓの検定値を使用した。得られた結果を、図１に示す。

　図１に示すとおり、データ分布において、特に大きな差があるわけではなく、Ｄａｙ０時点（図中「ＤＮ」、糖尿病患者にて、微量アルブミン尿が検出され、早期腎障害が認められた時点）の分布と、１６ヶ月前あたりまでの分布は同様であることが確認された。

　（実施例４）
　次に、ＡＭＢＰによる腎障害の検出に関し、各種統計値及び臨床評価値（ＲＯＣ曲線を用いたＡＵＣ値評価）を算出した。得られた結果を下記表に示す。なお、表中の項目については以下のとおりである。
ＤＭ標本数：糖尿病外来に来院し、糖尿病のみ罹患している患者尿
ＤＮ標本数：経過観察時に早期腎障害を発症した患者を４３名と、その発症前の検体尿
平均：ＳＰＲ測定値の平均値
ＳＤ：ＳＰＲ測定の標準偏差値
Ｗｅｌｃｈ’ｓ：比較群のｎ数が少ない場合、等分散性の過程が成り立たない可能性があり、非等分散性のパラメトリック検定も行い、Ｐ値を算出
Ｓｔｅｅｌ検定：各データ分布が、正規性が無い場合も鑑み、ノンパラメトリック検定の多重検定法であるＳｔｅｅｌの多重検定を行った場合のＰ値
ＡＵＣ：ＲＯＣ解析において、ＲＯＣ曲線の下部面積値で１が最大
感度：疾患を持った人のうち、その所見がある人の割合（真陽性率）
特異度：疾患を持たない人で、その所見がない人の割合（真陰性率）
カットオフ：ＲＯＣ曲線に対して、左上の隅の点からの距離が最小となる点を算出し、その際の測定値。

　表６に示すとおり、ＲＯＣ解析の結果、ＡＵＣ値は統計的に有意な期間で、０．８を超えており、ＡＭＢＰは、腎障害の検出マーカーとして、十分な判定性能を有していると考えられる。

　ＡＭＢＰは、α１－マイクログロブリン／ビクニン前駆体と称される、血漿中に分泌される糖タンパク質であり、ヒト由来であれば、３５２アミノ酸からなる（配列番号：１）。また、その名が示すとおり、タンパク質分解によって、α１－マイクログロブリン（ａ１－ＭＧ、ＡＭＢＰの２０～２０３位のアミノ酸からなるペプチド、配列番号：２）と、ビクニン（ＡＭＢＰの２０６～３５２位のアミノ酸からなるペプチド）とが生成される。

　（実施例５）　尿中ＡＭＢＰのトリプシン断片ペプチドの質量分析による定量
　糖尿病患者の尿タンパク質を、質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、Ｂｒｕｋｅｒ社製　ｔｉｍｓ　ＴＯＦ　ｐｒｏ）を用いた定量プロテオミクス（Ｄａｔａ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ，ＤＩＡ）に供し、検出されたＡＭＢＰ由来のペプチドを定量（ｐｐｍ）し、前記尿タンパク質中に存在するタンパク質を同定した。前記糖尿病患者は、微量アルブミン尿陰性の糖尿病患者及び微量アルブミン尿陽性（腎障害あり）の糖尿病患者であり、これらから採取した尿をメタノール／クロロフォルム沈澱法によって処理することによって得られたタンパク質分画１２５検体を、トリプシン分解して、前記質量分析に供した。

　その結果、図２に示すとおり、ＡＭＢＰの２０～２０３位のアミノ酸からなる領域（ａ１－ＭＧ）において、＃１～＃１１で示す各々の領域からなる、トリプシン消化され生成されたＡＭＢＰ由来のペプチドが、糖尿病患者由来の尿から検出された。さらに、前記質量分析で同定、定量されたペプチド＃１～＃１１の各断片毎に、相対量（ｐｐｍ）の平均値を解析した結果、図３に示すとおり、＃６～＃８のペプチドは、ほとんど検出されなかった。このことから、尿中にはＡＭＢＰあるいはａ１－ＭＧの全長ではなく、断片化されたポリペプチドとして存在している可能性が示唆された。なお、＃１よりＮ末端側のペプチドと＃７と＃８の間のペプチドには糖鎖が結合していて検出されなかった可能性がある。

　（実施例６）　尿中ＡＭＢＰ由来ポリペプチドの同定
　図４に示すとおり、尿をメタノール／クロロフォルムによって処理すると、タンパク質は沈殿するが、その上清（水層）には、沈殿しなかった比較的小さなタンパク質や、ペプチドが存在する。そこで、実施例５で予測されたＡＭＢＰタンパク質の断片化ペプチドが水層に存在するか、確認を行った。

　具体的には、質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、Ｂｒｕｋｅｒ社製　ｔｉｍｓ　ＴＯＦ　ｐｒｏ）を用いて水層中のペプチド配列の同定を行った。さらに、同定されたＡＭＢＰペプチドをａ１－ＭＧとビクニンの全長にマッピングを行った。微量アルブミン尿陰性の糖尿病患者（２８名）由来の検体で同定されたペプチドのマッピング結果を、図５及び６に示す。健常者（４５名）由来の検体で同定されたペプチドのマッピング結果を、図７及び８に示す。

　また、前記にて検出された全てのペプチド断片について、それらＮ末端のアミノ酸位置をプロットした。さらに、このプロット数を、糖尿病患者と健常者でそれぞれのアミノ酸位置で集計し、この集計値を使用して、ＲＯＣ解析を行った。その結果、図９に示すとおり、矢印で示しているＮ末端アミノ酸を有するペプチド断片を指標とすることによって、糖尿病患者を有意に健常者と区別できることが明らかとなった。

　また、前記にて検出された全てのペプチド断片について、それらＣ末端アミノ酸位置をプロットした。さらに、このプロット数を、糖尿病患者と健常者でそれぞれのアミノ酸位置で集計し、この集計値を使用して、ＲＯＣ解析を行った。その結果、図１０に示すとおり、矢印で示しているＣ末端アミノ酸を有するペプチド断片を指標とすることによって、糖尿病患者を有意に健常者と区別できることが明らかとなった。

　以上の結果から、糖尿病患者群で特徴的に検出された５種類のペプチド断片（ペプチドＡ：ＡＭＢＰの１８３～２０２位のアミノ酸（配列番号：３）、ペプチドＢ：ＡＭＢＰの１８３～２０３位のアミノ酸（配列番号：４）、ペプチドＣ：ＡＭＢＰの１８４～２０２位のアミノ酸（配列番号：５）、ペプチドＤ：ＡＭＢＰの１８４～２０３位のアミノ酸（配列番号：６）、ペプチドＥ：ＡＭＢＰの６３～８５位のアミノ酸（配列番号：７））を指標とすることによって、患者と健常者とを有意に区別できることが明らかとなった。特に、ａ１－ＭＧ（ＡＭＢＰの２０～２０３位のアミノ酸（配列番号：２））のＣ末端領域に位置する４種類のペプチド断片（ペプチドＡ～ペプチドＤ）は、ＡＵＣ値が０．９を超える特に高い患者検出能を有することが示された。

　さらに、これら４種のペプチドについて、健常者群及び糖尿病患者群の質量分析によるペプチド同定数を用いて、群間比較（ウエルチのｔ検定）を実施した。その結果、図１１に示すとおり、４種のペプチドは有意差　ｐ＜０．０１で患者群と健常者群を識別可能であることが示された。

　（実施例７）　ａ１－ＭＧのＣ末端領域についての解析
　実施例６に示した結果から、ａ１－ＭＧのＣ末端領域に位置するペプチドは、糖尿病患者識別において有用であることが示唆された。そこで、実施例２において、糖尿病患者における腎障害の検出能を評価（臨床評価）に使用した抗ＡＭＢＰ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＭＡＢ７７２４）が、前記領域を認識していたかどうかを解析した。

　具体的には、図１２及び下記表７に示すとおり、ａ１－ＭＧのＣ末端領域（ＡＭＢＰの１００～２０３位のアミノ酸からなる領域）において、アミノ酸数２１～３０からなるペプチドを５種類、常法に従って化学的に合成した。なお、ペプチド５は、実施例６におけるペプチドＡ～Ｄのうち、最も鎖長の長いものであるペプチドＢである。

　次に、これら合成ペプチド及び臨床評価に使用した前記抗ＡＭＢＰ抗体を用いたＥＬＩＳＡによって、前記抗体が認識する部位を評価した。具体的には、先ず、抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ抗体（アブカム社製、カタログ番号：ａｂ９８７０９）をＰＢＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号：２００１２－０２７）で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０μＬ添加し、冷蔵にて一日静置した。続いて、１×ＴＢＳ（ＴＢＳ（タカラバイオ社製、カタログ番号：Ｔ９１４１）を１タブレットあたり精製水１０００ｍＬで希釈し調製）を１ウェルあたり３００μＬ用いて３回洗浄した。洗浄後、ブロッキングバッファー（３％　ＢＳＡ（富士フイルム和光純薬社製、カタログ番号：０１１－２７０５５）、０．１％　ＰｒｏＣｌｉｎ３００（シグマアルドリッチ社製、カタログ番号：４８９１２－Ｕ）、１×ＴＢＳ（タカラバイオ社製、カタログ番号：Ｔ９１４１））を１ウェルあたり３００μＬ添加し、冷蔵にて三日静置した。続いて、１×ＴＢＳを１ウェルあたり３００μＬ用いて３回洗浄した。洗浄後、抗ＡＭＢＰ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号：ＭＡＢ７７２４）を希釈用バッファー（１％　ＢＳＡ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０（バイオラッド社製、カタログ番号：１６１－０７８１）、０．１％　ＰｒｏＣｌｉｎ３００、１×ＴＢＳ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温にて２時間静置した。続いて、１×洗浄液（洗浄液（ＡＩＡ－パックＣＬ用）（東ソー社製、カタログ番号：００２９７０３）を１５０ｍＬあたり精製水２８５０ｍＬで希釈し調製）を１ウェルあたり３００μＬ用いて３回洗浄した。洗浄後、ビオチン化合成ペプチド１～５又はビオチン化α１－ＭＧの希釈系列サンプルを調製した。希釈系列サンプルは、まず各ビオチン化ペプチドを、希釈用バッファー及びＤＭＳＯ（富士フイルム和光純薬社製、カタログ番号：０４０－３２８１５）を用いて、２５０００ｎｇ／ｍＬ（ＤＭＳＯ濃度：０．１２５％）になるよう調製した。さらに、これを希釈用バッファーで１０倍希釈したものを最高濃度（２５００　ｎｇ／ｍＬ）として、以降、希釈用バッファーで４倍希釈し調製した。本希釈系列サンプルを１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温にて２時間静置した。続いて、１×洗浄液を１ウェルあたり３００μＬ用いて３回洗浄した。洗浄後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（シグマアルドリッチ社製、カタログ番号：Ｓ２８９０－１ＭＧ）を希釈用バッファーで０．１μｇ／ｍＬに希釈し、１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温にて２時間静置した。続いて、１×洗浄液を１ウェルあたり３００μＬ用いて３回洗浄した。洗浄後、基質溶液（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」II基質セット（東ソー社製、カタログ番号：００２０９６８）中の、Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」II基質に、Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」II基質溶解液１００　ｍＬを添加し混和したものを、基質希釈バッファー（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍＭ　ＭｇＣｌ_２）で１０倍希釈し調製）を１ウェルあたり５０μＬ添加し、プレートリーダーで蛍光測定を実施した。得られた前記抗ＡＭＢＰ抗体の反応性評価結果を図１４に示す。

　図１４に示した結果から明らかなように、前記抗ＡＭＢＰ抗体は、ペプチド４及び５にのみに反応し、オーバーラップしているペプチド５の配列を認識していることが強く示唆された。また、前記抗体は、ａ１－ＭＧ全長よりもペプチド４及び５に対してより強く反応することが示唆された。

　以上の結果から、尿中にてＡＭＢＰは断片化しても存在していることが示されており、実施例２においては、ＡＭＢＰの１８３～２０３位のアミノ酸を含むペプチドを対象として、臨床的評価が行えていたことが明らかとなった。すなわち、ＡＭＢＰのの１８３～２０３位のアミノ酸を含むペプチドを指標とすることによって、糖尿病のみならず、それにおいて発症し得る腎障害を検出できることが、明らかとなり、前記ペプチドは、慢性腎臓病の検査において有用であることが示された。

　以上説明したように、本発明によれば、慢性腎臓病の検査が可能となる。特に、本発明によれば、現状臨床にて早期腎障害の指標として用いられる微量アルブミンよりも、早期に腎障害を感度よく検出することが可能となる。さらに、本発明の方法が対象とする検体は尿であるため、血液等の他の検体よりも、侵襲性低く得ることが出来、被検者の負担も少なくて済む。したがって、本発明は、慢性腎臓病に関する医療分野において有用である。

Claims (6)

1. 　下記（ａ）～（ｃ）の工程を含む、慢性腎臓病を検査する方法
   （ａ）被検者から採取された尿検体について、下記タンパク質群から選択される少なくとも１のタンパク質の量を検出する工程、
   （ｂ）工程（ａ）で検出したタンパク質量を各タンパク質の基準量と比較する工程、
   （ｃ）工程（ｂ）における比較の結果、前記被検者におけるタンパク質が基準量よりも高い場合、前記被検者は慢性腎臓病に罹患している又は罹患のおそれがあると判定する工程
   タンパク質群：
   ＡＭＢＰ、ＺＡＧ、ＰＬＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＢＴＤ、ＣＰＮ２、ＳＥＲＰＩＮＡ６、ＬＵＭ、Ｆ２、ＬＲＧ１、ＫＮＧ１、ＩＴＩＨ４、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＨ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＡＨＳＧ、ＣＰ、ＣＦＢ、ＣＬＵ、Ａ１ＢＧ、Ｃ４Ａ、ＴＴＲ、ＩＴＩＨ１、ＨＰＸ、ＡＰＯＥ、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＲＢＰ４、ＡＰＯＡ４、ＶＴＮ、ＧＣ、Ｃ３、ＡＰＯＤ、ＴＦ及びＣＦＨ。
2. 　工程（ａ）で検出する前記タンパク質が、ＡＭＢＰ、ＺＡＧ及びＰＬＧからなる群から選択される少なくとも１のタンパク質である、請求項１に記載の方法。
3. 　前記被検者が糖尿病患者であり、前記慢性腎臓病が糖尿病性腎臓病又は糖尿病性腎症である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 　前記タンパク質量は、免疫学的方法、質量分析方法及びラマン分光法からなる群から選択される少なくとも１の方法によって検出される、請求項１～３のうちのいずれか1項に記載の方法。
5. 　請求項１～３のうちのいずれか1項に記載の方法により、慢性腎臓病を検査するための薬剤であって、工程（ａ）で検出する前記タンパク質に結合する少なくとも１の抗体を含む薬剤。
6. 　下記タンパク質群から選択される少なくとも１のタンパク質を含む、慢性腎臓病マーカー
   タンパク質群：
   ＡＭＢＰ、ＺＡＧ、ＰＬＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＢＴＤ、ＣＰＮ２、ＳＥＲＰＩＮＡ６、ＬＵＭ、Ｆ２、ＬＲＧ１、ＫＮＧ１、ＩＴＩＨ４、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＨ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＡＨＳＧ、ＣＰ、ＣＦＢ、ＣＬＵ、Ａ１ＢＧ、Ｃ４Ａ、ＴＴＲ、ＩＴＩＨ１、ＨＰＸ、ＡＰＯＥ、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＲＢＰ４、ＡＰＯＡ４、ＶＴＮ、ＧＣ、Ｃ３、ＡＰＯＤ、ＴＦ及びＣＦＨ。