JPS60502167A - 軟骨に生じる変化の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 軟骨に生じる変化の測定法 本発明は関節軟骨（骨格関節の軟骨）において生じる変化を臨床的に検知する方 法に関する。とくに、本発明は軟骨の進行性破壊に伴なう変化、す゛なわち、関 節軟骨破壊の増加状態を示す変化の検知に関する。

関節軟骨はその重要成分として、重要な機能的役割を果たす細胞外マトリックス を含み、その組成は比較的少数の細胞で制御されている。このマトリックスは（ ｉ）組織の高安定性にとって重要な線維網を形成するコラーゲン、（１１）さら に重要な成分として該組織がその弾性および圧迫に抗するその能力を得るための 相互に反発する電荷を多量に有するプロテオグリカンから構成されている。さら に、関節軟骨は一般的にはその機能が知られていない他の蛋白質をいくつか含む 。この例外としてプロテオグリカン集合体の、形成に関与し、これら集合体の安 定性に寄与することが知られているリンク（１ｉｎｋ　）蛋白質がある。プロテ オグリカンおよびその負電荷の基が組織に固定されるためにはかかる集合体形成 が予め必要であると思われる。

関節軟骨中に存在する他の蛋白質はその構造ならびに機能は知られていない。こ れらの例には見掛分子量が約６０ｋＤａの２つの蛋白質がある。さらに、はとん どのタイプの軟骨に存在する蛋白質も知られており、そのうちの１つは約３６ｋ Ｄａの分子量を有する。フィブロネクチンも検出されているが、その存在は実際 には他のタイプの結合組織および血しょう中の方により多量に見出される。

軟骨プロテオグリカンの構造については、今日、多くの特徴が知られている。分 子単位はいわゆるプロテオグリカンモノマーであって、該モノマーは中央蛋白核 および多量の負電荷を有する炭水化物側鎖を多量に含み、それらの一端は該核に 結合されている。中央蛋白核はその炭水化物側鎖およびそのアミノ酸配列に従い ３つの区域に分割されていると考えられる。側鎖は２つの主要なタイプ、すなわ ちコンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸側鎖からなる。これら２つのタイプの 側鎖は、各々蛋白核のある区域に集中しており、それによって該核の一端におい てコンドロイチン硫酸豊富域、および第１域と称せられる核酸と第３核域の間に 位置する小さなケラタン硫酸豊富域が形成されている。この第３域は前記したい ずれのタイプの炭水化物側鎖をも有しないヒアルロン酸結合域である。主要なプ ロテオグリカンは、各々１００個の負電荷を有する約１００個のコンドロイチン 硫酸鎖および各々約５個の負電荷を有する約５０個のケラタン硫酸鎖を有し、基 の電荷の合計は約１００００である。ヒアルロン酸結合域により、多数のプロテ オグリカンモノマーが長鎖多糖類からなるヒアルロン酸に結合している。

このようにして形成された集合体は１００Ｘ１０６Ｄａを越える分子量を有する 。組成全体のパターンは関節軟骨が抗原として異なる２つの群の集合プロテオグ リカン類（それらの側鎖の性質は相互にわずかに異なる）を含んでいるという事 実によってさらに複雑である。軟骨の生検法における免疫化学的方法により、少 量のプロテオグリカン類が特徴付けられている［バイオケミカル・ジャーナル（ Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）、１９７９年、３５〜４５頁およびバイオケミカル ・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）１８７（１８０）、６８７〜６９４ 頁参照］。

軟骨構造の崩壊は細胞外マトリックス全体に生じると考えられるが、軟骨疾患の 異なる段階では異なる部分が崩壊する。初期の段階では主としてプロテオグリカ ンは崩壊するが、コラーゲンはマトリックスに残存する。未公表の結果としてご く初期の段階では２つの炭水化物豊富域が崩壊して滑液に排泄され、一方ヒアル ロン酸結合域は細胞外マトリックスに長時間結合したままであることが判明した 。

本発明完成の以前には、早期の段階における変化の検知に採用できる方法は全く 存在せず、わずかに破壊過程の遅い段階において関節鏡を診断具として用いてい たにすぎない。プロテオグリカンとコラーゲンを含む双方が更に破壊される結果 として、内眼で見える多分非可逆的変化が生じているようである。末期の段階に おいてはほとんどすべてのプロテオグリカンが失われ、軟骨はそのプロテオグリ カン含量に関してむしろ静止的になる。

関節軟骨の組織破壊は典型的にすべての疾病に現われ、慢性的な関節組織の破壊 が生じろ。かかる炭中の例として、慢性関節リューマチ、乾癖性関節炎および骨 関節症をあげることかできる。また関節の急性炎症は、しばしば軟骨の破壊を伴 うが、はとんどの症例ではこれが慢性的な破壊的疾患に進行することはない。急 性炎症の関節が冶ゆに向うかまたは慢性過程に進行するかについて、いずれの因 子が決定的であるかは知られていない。急性関節炎症を含む疾患の例として、エ ルンニア関節炎、ピロホスフェート関節炎、痛風（尿酸塩関節炎）、敗血症性関 節炎および外傷の原因による種々の関節炎があげられろ。関節軟骨の破骨の破壊 を救済することができる有効な他の方法として、たとえばコルチゾンによる治療 を挙げろことができる。これは長い間、骨関節炎の退化的経過を促進するものと して知られていた。しかしながらきびしい関節の炎症を伴なう関節炎の症例にお いて、コルチゾンの注射はすへてに積極的効果を示すようなので、かかる症例に おける一般的な実際の病状はむしろより複雑な特徴を示すことに注目すべきであ る。

本発明の目的は、軟骨の退化過程の診断法を可能な限り改良すること、特に初期 の段階において取られた治療法の効果について検査またはモニターする手段を提 供することにある。

従来、関節の疾患は主として間接法によって診断されていた。たとえば炎症の経 過を、滑液試料中の白血球の量の増加を示すことによって検出していた。加えて 関節機能を試験し、また関節の苦痛感覚を調べていた。関節軟骨の生検法につい て、これは通常実際的な外科治療と共にごく末期的段階においてのみ採用ずろこ とができ、それ故に軟骨の組成の変化を検討することはこのような末期的段階に おいてのみ可能である。

このタイプの生検法に固有の問題点は、（１）変化が生した軟骨のまさにその部 分から試料を採取しなければならないこと、および（ｉ　ｉ）かかる生検法は、 はとんどの初期の変化がすでに鎮静したごく末期的段階においてしばしば採用さ れることである。

サンドノン（Ｓａｎｄｓｏｎ　）による基礎的な方法は１９６７年に公表されて いる［ザイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　）　１５５巻、１９６７年、８３９〜８ ４１頁参照］。サントノンは“新しい成分”を記載している。これは部分精製し た軟骨抽出物でウサギを免疫処理することによって得られた抗体調製物との交差 反応によって検出される。使用されたこのタイプの抗体調製物は、後に多数の異 なる蛋白質を含有することが証明された。このような調製物で得られた結果は一 般に変動する傾向があり、この理由のため現在までの長い間、軟骨の分野におい ては通常、種々の方法が採用されている。このような状況から現在、かかる抗体 調製物の成分に定義を勺えろのは不可能である。サントノンは、　“新しい成分 ”かある種の症状において量を増大ずろらしいことを見いだした。同時にサンド ノンはリューニス・アール（Ｊａｎｉｓ　Ｒ，）らと共に、滑脱の皮膜細胞（ｌ ｉｎｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　）が前記“新しい成分”と抗原的に関連を有する成分 を含むこ七を示した［ザイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　、１５８巻、１９６７ 年、１４６４〜６７頁参照］。サントノンおよびノエーニスは、この成分か滑脱 から滑液腔内を通過することを示唆した。これらの皮膜細胞か、関節軟骨に典型 的な種類のプロテオクリカッを含有することはわかっていない。したがって、ザ ンドソノの方法は、関節軟骨由来のプロテオグリカンモノマーを特定して測定す る方法を提供するものではない。

近年、同様の方法がギセン・ビイ　（Ｇｙｓｅｎ　Ｐ、　）らによって適用され た［アーティキュラ−・ノノヒアム・インド・ノンブト（ＡｒｔｉｃｕｌａｒＳ ｙｎｏｖｉｕｍ　Ｉ　ｎｔ、　Ｓｙｍｐ、　）　］　９８２年、＋２９−４１頁 参照］。ギセンは、慢性関節リューマチと骨関節症にかかつている小者から得た 滑液のプロテオグリカン含量を測定するために競合的同相免疫検定法（標識した プロテオグリカンと固相抗プロテオグリカン抗血清）を用いた。この研究におい て彼らは単に関節軟骨の部分以外のある種の細胞による強力な食作用に相関する 非常に低い値を見いたしｆコにすぎない。本発明に関連して得られた研究結果に 基つけば、前記のような低い値は、軟骨が破壊の非常に遅い（末期）段階のもの であるというように解釈されなければならない。

このようにギセン・ビイらおよびザントソンの両者は単に軟骨の破壊の末期段階 を試験したにすぎないのである。

したがって、関節軟骨に生しろ変化を特異的に測定する従来の方法は多くの欠点 を包含する。多くの点で本発明はこのような欠点を排除することができる。本発 明の関節軟弱に生しろ変化を測定する方法は、軟伺プロテオクリカンモノマーま たはその抗原フラグメントの濃度もしくは損を、当該関節軟骨に接した滑液腔か ら得られた滑液試料について特異的に測定すること、および得られた値を先の分 析から得られた基準値と比較することによって特徴付けられる。［プロテオグリ カンゴなる語は以下、抗原フラグメントおよびプロテオクリカンモノマーの同意 語として使用する。現在までわかっていることとして、濃度または量（レベル） の増大は軟骨が進行性破壊さらされていることを意味する。このような増大は健 康な軟骨を有する関節について得られた基準値と比較して判定される。同一の基 準値に対する相対的な濃度の減少は、プロテオグリカンが滑液中に移行する能力 の減退を示すことができる。優先期間での研究によ゛れば、量の減少（健康関節 の同一値に比較して）は軟骨のプロテオグリカンの全量が実質的に減少し、組織 が損傷するという事実を示すことができる。したがって、小量のプロテオグリカ ンしか破壊過程を受けるものとして存在しないことはプロテオグリカンに関して 言えばその破壊が末期点にあるか、または末期点に近いことを意味する。

このように本発明の一般的な態様によれば、関節軟骨から得られた特定のプロテ オグリカンを、公知の方法で滑液試料中で定量し、得られた値を、同じ関節に関 しまたは健康な関節から得られた平均値としてその先の分析から得られた基準値 と比較する。これらの値の差異は、前記試料に対応する関節軟骨に生じる変化を 反映する。本発明の種々の態様は添付の特許請求の範囲に記載した。

好ましい具体例において本発明は、プロテオグリカンモノマーまたはその抗原フ ラグメントの含量の測定が免疫学的検定法によって行なわれるという点で特徴付 けられる。このような本発明の具体例によれは、プロテオグリカンの抗原決定因 子に対し特異性を有する少なくとも１つの抗体（以下、抗プロテオグリカンと称 する）を、試料に加えて試料中に存在するプロテオグリカンと反応させ、公知の 方法で試料中のプロテオクリカンの量を測定する。使用する抗プロテオクリカン は、３つの区域を有するプロテオグリカンモノマーのうちの１．２または３つの 区域の構造に対して特異的に指向させることかできろ。本発明の好ましい具体例 の１つは、使用する抗プロテオグリカンの特異性に対応する区域の濃度または量 を決定することから成る。前記したように、破壊の初期の段階を測定しようとす るとき、プロテオグリカン核の炭水化物に富む２つの区域のいずれかに存在する １つもしくはそれ以上の決定因子に対し特異的な抗プロテオグリカンを使用する のが最も好ましい。

以上の説明から明らかなように、プロテオクリカンモノマーまたはフラグメント の含有量を決定するために本発明の好ましい具体例は抗原−抗体反応を利用し、 その処理方法は広い範囲の免疫検定法から選択した処理法を包含する。この範囲 に属する多くの異なる方法は、当業者によく知られた方法である。これらの方法 はすべて本発明で使用することができるが、そのうちのある種の方法は、たとえ ば具体的な方法において固有の特異性および高度の感受性または選択性を示すの で該方法は他の方法よりも著しく適している。これに関連する方法は、たとえば 標識した反応体（たとえば分析的に追跡することができる標識物質で標識された 抗原または抗体）を用いる方法であって、標識物質の例として、放射性アイソト ープ、酵素、酵素基質、酵素抑制剤、蛍光物質、化学発光物質、粒子、バクテリ オファージまたは他の公知標識物質があげられる。

本発明の関連において、プロテオグリカンまたは抗プロテオグリカンまたは抗プ ロテオグリカンと反応する抗体調製物のいずれかを標識し、本発明にしたがって 使用するのが好ましい。標識したプロテオグリカンを用いてプロテオグリカンフ ラグメントを測定する場合、測定すべきフラグメントを標識した形で用いるか、 またはかかるフラグメントと標識した分子に共通の抗原部位とだけに反応する抗 体を用いることが必要である。

前記のようなタイプの免疫検定法において、たとえば標識した抗原のような標識 した反応体を、免疫化学的反応体（たとえばその抗体）と反応させる。標識した 抗原および抗体を用いた場合、これらの間の反応により、標識した抗原−抗体複 合体が得られ、反応混合物中には標識した遊離抗原および遊離抗体が残存するこ ともしないこともある。本明細書において用いろ“遊離”なる語は抗原または抗 体がそれぞれ該複合体の一部を形成していないことを意味する。反応後、遊離の 標識した抗原または複合体中の分析的に追跡し得る物質を測定する。測定した値 が測定されるへき値の関数となるように標識した反応体およびその量を選択する 。

遊離標識反応体と複合体結合標識反応体の識別のためにこの２つの主要なタイプ の実際的な方法すなわち均−系の方法および不均一系の方法が採用される。

均−系の方法は、標識した物質が複合体に結合するかまたはしないかによって該 物質の活性が変わるという現象を利用する。したがって、相互に物理的に分離す る操作を行なうことなく、複合体結合したおよび／または遊離の標識反応体を検 定することができろ。

不拘−条の方法は、′Ｍ離の標識反応体から複合体結合の標識反応体を分離する 方法を包含４゛ろ。この分離は本質的につきのような２つの異なる方法によって 行なうことができろ。（１）第１の分離方法は、（ａ）複合体（標識反応体を゛ 含Ｃ）を選択的に沈殿または吸着上ろが、遊離の標識反応体を選択的に沈殿まｆ コは吸着しない（ｂ）遊離の標識反応体を選択的に沈殿または吸着するが、複合 体結合標識反応体を選択的に沈殿まｉｌは吸着シ、すいような可溶性または不溶 性試薬を用いることである。“選択的沈殿”おＪ−び“選択的吸着”なる語（」 、一方のらのを他方のものより大なる程度に沈殿または吸着ずろことを意味する 。沈殿剤としてポリエチレングリコールおよび標識していないある種の複合体成 分に対して指向されろ沈殿性抗血清が例示されろ。（２）他の方法は、非標識抗 原、非標識抗体または非標識抗−抗体か結合している不溶性または不溶化支持体 を利用することである。方法（１）と同様に２相を形成し、２相の一方は遊離の 標識反応体を多く含み、他方は複合体結合の標識反応体に富む。

一ついでこの２相を相互に分離した後、２相の少なくとも１相における分析的に 追跡可能な物質を測定する。

使用する支持体およびその使用法は常套の処理方法に嘱する。、疎水性プラスチ ック材、たとえは免疫化学的反応体を吸着または結合することができるポリ塩化 ビニルまたはポリスヂし・ンの表面を使用することかてさろ。池のタイプの支持 体は、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシルまｆ二はアミドを含Ｃ゛不溶性支持体 であ−・て、こイ１らに免疫学的方法カンか共有結合的に結合オろことができろ 。、５［）ろ場合に（よ、支持体に免疫化学的反応体を吸着させろことか有利で ある。

標識しｌ二反応体を使用する免疫検定法を分類ずろさらにもう−・つ別の方法に 従えば、このよう・−第１の部類：よ競合的方法、他の部類：ま非競合的方法で ある。「競合的−１なる語は、異なる一対の免疫化学的反応体が武者に共通の免 疫化学的反応体上の部位をめて競い合うことができろことを意味する。かかる反 応体の例は標識および非標識抗原である。これらを用いた競合的方法は、標識し １こ抗県と反応寸ろ抗体との間の反応を非標識抗原によって抑制することが泡含 されろ。このタイプの反応体のもう１つ別の例は可溶性および不溶性抗原である 。

標識した反応体を使用しない免疫学的方法として、種々の電気化学的方法、免疫 拡散法および電気泳動法を挙げることができる。これらのうち特に説明する価値 のある方法は、ローレルのロケッ）・法（Ｌ、　ａｕｒｅｊｌ’　５ｒｏｃｋｅ ｔ　ｍｅｔｈｏｄ　）［ローレル・ノイ・ビイ、アナリティカル・バイオケミス トリー　（Ｔ、ａｕｒｅｌｌ　Ｃ−Ｂ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、 １５巻（１９６６）４５頁以降参照］およびマンチニの拡散法（Ｍａｎｃｉｎｉ ’ｓ　ｄｉｆＴｕｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄ　）［マンヂニ・ンイら、イミュノケミ ストリイ　（Ｍａｎｃｉｎｉ　Ｇｅｔ、　ａｌ、Ｉ　ｍｘｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　）、２巻（１９６５年）２３５頁以降参照］である。他の例はいわゆる凝 集反応である。

これらの試験法において、ある場合には抗原−抗体親和力以外の生物特異的親和 力を等しく使用することができる。このような相互に他のタイプの親和力を有す る一組の化合物の例は蛋白質Ａ−４ｇＧ、炭水化物−レクチン、Ｃｑ−免疫複合 体、ＲＦファクター免疫複合体、ヒオチンーアヒジンなどである。

今日までに最も著名でかつ本発明の最も有利な具体的態様は、標識反応体および 競合的不均一系を使用することである。本発明のこの具体的態様において、抗プ ロテオグリカンの添加量に関して、支持体に結合させたプロテオグリカンを試料 のプロテオグリカンと競合させろ。この抗プロテオグリカンは試料中のプロテオ グリカン含量に反比例する量で支持体に結合する。このようにして摺られた支持 体結合抗プ［ｌチオクリカンを、抗プロテオグリカンに対して指向し分析的に追 跡しうる物質で標識した抗−抗体で検出し、定量オろ３、最ち良好な結果を得ろ ために（」、支持体−結合抗原（支持体−結合プロテオグリカン）を加える前に あらかしめ試料を抗プロテオグリカンと共にインギコヘートすることが好ましい 。

分割された細モノマーのサブボピュし−ンヨンおよびそれらの異なるペプチド域 に相当ずろプロテオグリカンを、公知の方法、たとえば塩化セシウム中での密度 勾配遠心分離法、帯状速度遠心分離法（Ｚｏｎａｌ　ｒａｔｅ　ｃｅｎｔｒｉｆ ｕｇａｔｉｏｎ　）、蛋白質分解酵素による切断を用い、つ０で遠心分離および ／またはケルクロマトグラフィーによって生成する。免疫化学的検定法を用いる 本発明の具体的態様においては、検定を行なう前にたとえばコンドロイチナーゼ 消化法によりプロテオグリカンのコンドロイヂン硫酸側鎖を解重合して抗体−結 合部位をアンマスキングすることが推奨される。これは試料および検定における 抗原−抗体反応に関与するプロテオグリカンの双方に適用される。

モノマーのペプチド域の１つに対して特異的に指向される抗血清および抗体の生 産についてもまた公知の方法で行なわれる。しかしながら、本発明のある種の態 様のためにはそのままのプロテオグリカンモノマ＝で免疫化することが有利であ ることが判明した。生産された抗血清は、プロテオグリカンの異なる決定因子に 特異的な抗体を含むことができる。

これは本発明の方法において一般的な反応体として使用することができる。プロ テオグリカンの基礎構造から由来し、プロテオグリカン上の異なる決定因子用の いわゆるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体調製物を使用することが 、おそらく有利な態様に導くであろう。プロテオグリカン核中の種々の区域のう ち、ヒアルロン酸結合域が最も高い免疫原性を有する。これは、他の２つの区域 から誘導されるプロテオグリカンフラグメントの測定用の良好な抗体調製物を得 るためにはこれら２つの区域の決定因子だけを含む抗原調製物を免疫化の目的に 使用すべきことを意味する。

滑液試料は、公知の方法たとえば滑液腔からの吸引により得られる。

滑液は高い粘性を有する液体であって取扱いが非常に困難である。それ故たとえ ばコンドロイチナーゼで処理することにより試料の粘度を低下させることが推奨 されるが、観察すべき重要な点は粘度の低下が定量の操作に悪影響を及はしては ならないことである。すなわち、免疫化学的方法を定量に用いる場合、プロテオ グリカン上の抗体−結合部位が破壊されないことが重要である。

次に実施例をあげて本発明の好ましい方法を具体的に説明する。

実施例１ 動物の関節軟骨の変化の測定 Ａ、抗原の調製 ウシの鼻軟骨またはイヌ股関節軟骨（ｈｉｐ　ａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｃａｒｔｉ ｌａｇｅ　）からプロテオグリカンを抽出する。抽出物を塩化グアニジニウム（ ４Ｍ水溶液）中、解離条件下に塩化セシウム密度勾配遠心分離法により精製する 。サブポピユレーションのコンドロイチン硫酸に富むプロテオグリカン（ＤＩ− ８ｌの呼称）とケラタン硫酸に富むプロテオグリカン（ＤＩ−８２と呼称）を別 々に調製する。ハイネガード・ディ　（Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ　Ｄ）らの記述［セ ミナーズ・アリス・レウム（Ｓｅｍｉｎａｒｓ　Ａｒｔｈｒ、　Ｒｈｅｕｍ、） ＩＩ　：　Ｉ　（１９８１年Ｘ５ｕｐｐ１．　］　）３１〜３３頁参照］により 前記調製物を確認する。免疫化に用いるプロテオクリカン調製物を前記と同様の 方法で調製し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｒ）　Ｇ　−２００［エビ クロロヒドリンで架橋処理したデキストラン（スエーデン国つプサラ、ファラマ シア中ファイン・ケミカル中エイ・ピ゛イ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆ　ｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ）　ｉ上、ゲルクＣｌマドグラフィーに付し、４Ｍ塩 化グアニジニウム［ワイランダ−・ジェイら、バイオケミカル・ジャーナル（Ｗ ｉｅｓｌａｎｄｅｒ　Ｊ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕ’ｒｎａｌ　） 　１７９巻（１９７９年）３５〜４５頁参照］で溶出することにより最終的に精 製する。調製物を本発明の検定における抗原として使用する前に、プロテオグリ カン中のコンドロイチン硫酸鎖を、コンドロイチナーゼＡＢＣ［米国マイルス・ ケミカル（Ｍｉｌｅｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）］で消化して除去する。この目 的のために調製物を０．０５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，５）中、１ｍｇ／ｍＣの 濃度に溶解し、３７℃で６時間消化させる。消化した試料の希釈液を、更に処理 することなく用いる。

Ｂ、滑液 イヌの左ひざ関節に骨関節症が進行するように外科手術を施した９匹のイヌそれ ぞれの左ひざ関節から、滑液試料を採取する。対照試料として右ひざ関節から同 様な試料を採取する。外科手術の日に両方のひざ関節から試料を採取した後、ヌ キ（Ｎｕｋｉ　）［マクデビットら、ジエイ・ボーン・ジヨイント・サージ・ビ ４’アール（Ｍｅ　Ｄｅｖｉｔｔ　ｅｔａｌ　ＳＪ　。

Ｂｏｎｅ　Ｊｏｉｎｔ　Ｓｕｒｇ、　Ｂｒ、　）第５８−Ｂ巻（１９７６）９４ −１０１頁参照コに従って左関節の後部十字靭帯を切り取る。３．６、ｌ０１１ ５．１９．２６および２９週間後、手術した左関節および対照試料として用いる 右関節の双方から、使用する滑液を吸い出すことにより試料を採取する。いくつ かの場合において、第１表および第２表中の欠落で示されるように試料採取の試 みが成功したかった。この試みが失敗した理由は、採取された滑液（特に対照用 関節の滑液）の量が非常に少量であったことにある。分析に先立ち、ヒアルロン 酸トを解重合しコンドロイチン硫酸側鎖を除く１１的のために本発明の一具体例 に従い試料をコンドロイチナーセで消化ずろ。消化操作はその第一工程として滑 液の粘度を低下させて取扱いを容易にするための部分的消化から成る操作である 。これは、１．２５Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ８，０）中コントロイヂナーゼＡＢ Ｃ０，０１（未補正）乍位を含有する水溶液２μρ（試料容量の１％）を加えろ ことにより達成される。３７℃で４時間後、消化処理液から試料５０μρを採取 し、０　、１　Ｍ　＋−リス−塩酸（ｐＨ８，０）およびコントロイヂナーセＡ ＢＣ０，０１単位を含む水溶液４００μρと混合する。３７°Ｃて更に４時間イ ンギコヘーンヨンしてコンドロイチン硫酸の消化を終了し、この試ト１を使用す るまで一３０’Ｃに凍結してその状態で保存する。

Ｃ９抗血清の調製 イヌの股関節軟骨からのプロテオグリカン（このプロテオグリカンは、コントロ イチナーゼ消化の操作を省き前記Ａ項と同様に処理して得られる）で免疫処理し たウサギ中で抗体を生成する。まずフロイント完全アジコバント中プロテオクリ カンモノマー１．５ｍｇを注入し、ついでフロインド不完全アジュバシト中プロ テオグリカンモノマー１．０ｍｇを２力月ごとに１回注入する。その後の抗体力 価は免疫検定で使用ずろのに１−分である。この血清は本発明で用いる前に精製 しない。

Ｄ　酵素免疫吸着剤法（ＥＬＩＳΔ） 用いたマイクロタイマープレートはポリ塩化ヒニルプレート　［ダイナチク（Ｄ 　ｙｎａｔｅｃｈ　（Ｍ　２９　）、Ａ　１ｅｘａｎｄｒｉａ　（米国ハーノニ ア州在）製］である。コンドロイチン硫酸に富むプロテオグリカン（２ｕｇ／ｍ Ｑ　；　Ｄ　１−８ｌ）またはケラタン硫酸に富むプロテオグリカン（０５μｇ ／ｍｆｉ；Ｄ１−６ｃ）に相当するプロテオクリカッ調製物［それぞれ前記Ａ項 （前記Ａ項記載のコントロイヂナーセ処理を任意に省略してもよい）に従って製 される］　２００μ夕で、ウェルを塗抹する（２４時間、室ｒＦＡ）。

プロテオグリカン調製物の保存溶液（０，０５１−リス−塩酸（ｐＨ８、０）中 の０．５ｍｇ／ｍの）をコンドロイチナーセＡＢＣ（０，０１単位／ｍｃ　）で 、４時間（３７°Ｃ）／１！ｉ化し、更に希釈（０，０５Ｍ＋−リス−塩酸（ｐ Ｈ８，０））してウェルの塗抹に使用する。塗抹しｆニマイクロタイタ−・プレ ートと、０１５Ｍ塩化ナトリウムおよび００５％ツイーン（Ｔ■’ｅｅｎＲ）２ ０（ポリオキンエチレンソルビタンモノラウレート）含有水溶液で、注意深く洗 浄して非特異性非結合性プロテオグリカンを除去する。

前記Ｂ項に従ってコントロイヂナーゼで消化した滑液試料５０μｇを、０１０Ｍ 塩化すトリウム、　００５Ｍリン酸ナトリウムおよび０．０５％（ｗ／ｖ）ツイ ーン２０含有水溶液（ｐＨ７，５）　７５０　μＱ、で希釈する。希釈した試１ １１１０μｅを、プロテオクリカンモノマーに特異的な前記０項で得られたウザ ギー抗（プロテオクリカン）の等容量希釈液（同じ緩衝液）と混合する。あらか しめ室温で２４時間インキュベートした後、混合物２００μρ　（同一物３部） をマイクロタイター・プレートのウェルに加える。室温で６０分インキコベート した後、該プレートを前記同様に洗浄する。ついで　０１０Ｍ塩化ナトリウム、 　０．０部Ｍリン酸す）・リウム、００５％ツイーン２０および２ｍｇ／ｍρウ ソ血清アルブミン含有水溶液（ｐＩ（７，５）中ブター抗ウサギＩｇＧ（アルカ リホスファターゼと結合）［オリオン・ダイアゴノスヂカ（Ｏｒｉｏｎ　Ｄ　ｉ ａｇｎｏｓｔｉｃａ）、フィンランド、ヘルノンギ）］の１．／１５０希釈液２ ００μρを加えろ。

室温でさらに６０分間放置し、ウェルを再び洗浄し、これに　Ｉｍｇ／ｍＱｐ− ニトロフゴニルホスフゴート、ＩＭノエタノールアミンおよび　０５Ｍ塩化マグ ネシウム含有酵素基質溶液（ｐＨ９，８）２００μ夕を加える。出発時点および 室温で６０分後、４０５　ｎｍにお（づる吸収を測定した。

吸収量の増加を計算の基礎として用いる。標準曲線は、既知量のイヌプロテオグ リカンモノマー（コンドロイチン硫酸ＡＢＣで消化）を含む試料を用い、同様な 処理を行なうことにより得られる。これらの標準試料を各マイクロタイター・プ レート中に含ませる。す−・ての試料は３回分析し、ついてスプライン（５ｐｌ ｉｎｅ　）の機能で行なう計算に得られた平均値を用いる。

結果を第１表および第２表に示す。

実施例２ マイクロタイター・プレートの代りにポリスヂレンキュベットに塗抹ずろ以外は 実施例１と同様の方法によって試験を行なった。本発明に上る同相としてキ、ベ ツ）・を使用する。結果は実施例１で得られた結果よりやや犬なる変動係数を示 す。

実施例３ 同種の抗原の組合わせ、すなわち塗抹用のイヌプロテオグリカン、イヌからの試 料および免疫化用のイヌプロテオグリカンを用い、実施例１と同様の試験を行な った。実施例１と同様の結果を得た。

実施例４ ヒト関節軟骨の変化の測定 多くの患者からの滑液を実施例１と同様の方法で分析した。診断記録を関節鏡お よび／または臨床的に確認した。結果を第３表に示す。結果は、関節破壊を含む 病的症状については非常に増大した値を示す。

実施例５ コルチゾンで処置する間の変化の検出 ウマの正を椎（ｎｏｒｍａｌ　ｖｅｒｔｅｂｒａｌ　）関節に、コルチゾン［セ レストナ（Ｃｅ１ｅｓｔｏｎａ　Ｒｂ１ｐｈａｓｅ　（ドイツ連邦共和国ベルリ ンＳｃｈｅｒｉｎｇ　ＡＧ製）；およびデポメトロン（Ｄ　ｅｐｏｍｅｄｒｏｎ 　Ｒ’　（米国ミシガン州キャラマヅー在Ｔｈｅ　Ｕｐｊｏｈｎ、　Ｃｏｍｐａ ｎｙ製））］を注射する。セレストナ（ｂｉｐｈａｓｅ　）注射の場合、投与出 は４ｍρ／注射液（６ｍｇ／ｍρ）で、デポメトロン注射の場合、投与１１２ｍ ρ／注射液（４ｍｇ／ｍｌｌりである。他の関節にそれぞれコルチゾンを注射し 、他の関節にそれぞれ生理的食塩水のみを注射する。３週間の間、１周間に１回 注射液を投与し、同時に滑液試料を採取する。実施例ＩＤ項と同様の方法でプロ テオグリカン抗原の含量を測定するが、使用する抗原は、ウマの関節軟骨から単 離したプロテオグリカンモノマーである。使用される抗プロテオグリカン類は、 実施例ＩＡと同様の方法で調製されたウシ鼻軟骨由来のプロテオグリカン類の混 合物に対して指向されろ。得られた値を第４表に示す。これらは、健康な関節へ のコルチゾン注射がプロテオグリカンの滑液中への放出を実質的に増大させて関 節軟骨を進行的に破壊することを示す。同様な方法で関節軟骨におけるプロテオ グリカン破壊の防止のために行った処置をモニターすることができる。

第　３　表 第　４　表 プロテオグリカン濃度　（μｇ／ｍｆｆ）国際調査報告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．関節から得られた骨液試料中のプロテオグリカンモノマーまたはその抗原フ ラグメントを定量し、先の分析から得た基準値と比較して増加した値を関節軟骨 の進行性破壊と関連させることを特徴とする関節の関節軟骨に生じろ変化を測定 する方法。 ２　該定量に免疫化学的検定法を用いろ前記第１項の方法。 ３　該免疫学的検定法がプロテオグリカンモノマ＝の３つのペプチド域のうち、 少なくとも１つの区域に対し指向された抗体調製物を用いて行なわれる前記第２ 項の方法。 ４　プロテオグリカン−抗プロテオグリカン反応を促進するために、プロテオグ リカンモノマーまたはその抗原フラグメントの抗体結合部位をアンマスギングす る前記第２項または第３項の方法。 ６　不溶性支持体に結合させたプロテオグリカンモノマーまたはその抗原フラグ メントを抗プロテオクリカンについてプロテオグリカン試料と競合させ、このよ うにして得られた不溶化抗プロテオグリカンを、該抗プロテオグリカンに対し指 向された標識抗体で定ｉする前記第５項の方法。