EA032748B1 - Низкомолекулярный биотехнологический хондроитин 6-сульфат для предупреждения остеоартрита - Google Patents

Низкомолекулярный биотехнологический хондроитин 6-сульфат для предупреждения остеоартрита Download PDF

Info

Publication number
EA032748B1
EA032748B1 EA201491919A EA201491919A EA032748B1 EA 032748 B1 EA032748 B1 EA 032748B1 EA 201491919 A EA201491919 A EA 201491919A EA 201491919 A EA201491919 A EA 201491919A EA 032748 B1 EA032748 B1 EA 032748B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
molecular weight
disaccharide
chondroitin sulfate
percentage
arthritis
Prior art date
Application number
EA201491919A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491919A1 (ru
EA032748B8 (ru
Inventor
Никколо Миралья
Давиде Бьянки
Эрманно Валоти
Антонелла Трентин
Антонио Трилли
Иммаколата Бузиелло
Марко Агостинетто
Паола Бацца
Марко Валетти
Original Assignee
Гносис С.п.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Гносис С.п.А. filed Critical Гносис С.п.А.
Publication of EA201491919A1 publication Critical patent/EA201491919A1/ru
Publication of EA032748B1 publication Critical patent/EA032748B1/ru
Publication of EA032748B8 publication Critical patent/EA032748B8/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/375—Ascorbic acid, i.e. vitamin C; Salts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Раскрыт низкомолекулярный (1000-5000 Да) хондроитинсульфат (CS), полученный путем химического сульфатирования и последующей деполимеризации несульфатированного хондроитинового каркаса, полученного с использованием биотехнологических методик. Описанный CS является, по существу, моносульфатированным, главным образом по положению 6, с очень небольшим сульфатированием по положению 4 и с соотношением моно/дисульфатированный дисахарид и плотностью заряда, аналогичными таковым у природного CS. Указанный биотехнологический хондроитин-6-сульфат (C6S) полезен в лечении и предупреждении остеоартрита и острых и хронических воспалительных процессов.

Description

Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к хондроитинсульфату (CS) с чрезвычайно низкой молекулярной массой (1000-5000 Да), полученному путем химического сульфатирования и последующей деполимеризации несульфатированного хондроитинового каркаса, полученного с использованием биотехнологических методик, или полученному путем сульфатирования полисахарида биотехнологического происхождения, изначально характеризующегося низкой молекулярной массой, и к применению указанного CS в лечении и предупреждении остеоартрита и острых и хронических воспалительных процессов. В частности, изобретение относится к биотехнологическому CS, который является, по существу, моносульфатированным, главным образом по положению 6, имеет небольшое количество или не имеет 4-сульфата и идентичен природному CS по соотношению моно/дисульфатированный дисахарид, отсутствию трисульфатированных и полисульфатированных дисахаридов, плотности заряда и проявляемой биологической активности. Хондроитин-6-сульфат (C6S) согласно изобретению имеет более низкую молекулярную массу (1000-5000 Да) по сравнению с хондроитинсульфатами, экстрагированными из животных тканей наземного происхождения (бычьи, свиные и птичьи), характеризующимися значениями молекулярной массы 14000-26000 Да, и морского происхождения (из акулы, кальмара, ската и костистых рыб), имеющих молекулярную массу более 50000 Да. C6S согласно изобретению кроме того имеет молекулярную массу, еще более низкую по сравнению с известными типами низкомолекулярного CS. Эта характеристика обеспечивает хондроитин-6-сульфату по изобретению лучшую биодоступность и соответственно более высокую эффективность.
Применение низкомолекулярного биотехнологического хондроитин-6-сульфата (C6S) в лечении и предупреждении остеоартрита подтверждено экспериментальной верификацией его противовоспалительной активности в хорошо известной животной модели, обычно используемой для исследования артрита и ассоциированных с ним симптомов. Описанный низкомолекулярный биотехнологический C6S также проявляет хорошую переносимость, как продемонстрировано в токсикологических исследованиях, осуществленных в соответствии с руководством OECD для фармацевтических продуктов.
Предшествующий уровень техники
Хондроитинсульфат (CS) в настоящее время рекомендован EULAR (Европейская Антиревматическая Лига) в качестве симптоматического лекарственного средства длительного действия при остеоартрите (SYSADOA) в лечении остеоартрита коленного сустава (Jordan KM et al., Ann. Rheum. Dis. 62, 1145, 2003), бедренного сустава (Jordan KM et al. Ann. Rheum. Dis. 62, 1145, 2003) и руки (Zhang W et al., Ann. Rheum. Dis. 66, 377, 2007) на основе многочисленных клинических обнаружений и разнообразных метаанализов клинических испытаний. Последние клинические испытания также продемонстрировали, что CS модифицирует внеклеточные структуры человеческой хрящевой ткани (Reginster JY, Heraud F, Zegels B, Bruyere О. Mini Rev Med Chem 7, 1051, 2007. Kahan A, Uebelhart D, De Vathaire F, Delmas PD, Reginster JY. Arthritis Rheum 60, 524, 2009). CS также широко используют в качестве нутрицевтика, в отдельности или в комбинации с другими ингредиентами (McAlindon ТЕ et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N et al., Separation Sc 1, 22, 2009).
Хондроитинсульфат (CS) представляет собой природный полисахарид, относящийся к классу гликозаминогликанов (GAG), присутствующих как у позвоночных, так и у беспозвоночных, который состоит из дисахаридных последовательностей, образованных чередующимися остатками глюкуроновой кислоты (GlcA) и ^ацетил^-галактозамина (GalNAc), связанных друг с другом бета-1-3-связями и сульфатированных в разных положениях.
CS присутствует в животных тканях со структурными и физиологическими функциями. Он состоит главным образом из двух типов дисахаридной единицы, моносульфатированной по 4- или 6-положению GalNAc (называемых дисахаридами А и С, соответственно), присутствующей в разных процентных соотношениях в зависимости от ее происхождения. CS каркас также содержит несульфатированный дисахарид, обычно в небольших количествах. Дисульфатированные дисахариды, имеющие две сульфатные группы, связанные через атом кислорода в разных положениях, таких как 2-положение GlcA и 6положение GalNAc (дисахарид D), 2-положение GlcA и 4-положение GalNac, или 4- и 6-положения GalNAc (дисахарид Е), могут быть представлены в CS каркасе в переменных процентных соотношениях в зависимости от конкретных животных источников (Volpi N. J. Pharm. Pharmacol. 61, 1271, 2009. Volpi N. J. Pharm. Sci. 96, 3168, 2007. Volpi N. Curr. Pharm. Des. 12, 639, 2006). Присутствие сульфатирования по 3-положению GlcA возможно, но в чрезвычайно малых количествах, причем указанное присутствие редко встречается в CS наземного происхождения и более вероятно в высокосульфатированных типах морского происхождения (Fongmoon D et al. J Biol Chem 282, 36895, 2007).
Формула повторяющейся дисахаридной единицы CS является следующей:
где R2, R4 и R независимо представляют собой Н или SO3 -.
- 1 032748
Отрицательные заряды карбоксилатных и сульфатных групп в этой повторяющейся дисахаридной единице обычно нейтрализованы ионами натрия.
Значения аббревиатур, наиболее часто используемых для идентификации по-разному сульфатированных дисахаридов, приведены ниже:
Di-OS (R2=H; R4=H: R6=H)
Di-6S (С) (R2=H; R4=H; R6=SO3-)
Di-4S (А) (R2=H; R4=SO3-; R6=H)
Di-4,6diS (Е) (R2-H: R4-SO3-; R6-SO3-)
Di-2,6diS (D) (R2=SO3-; R4=H; R6=SO3-)
Di-2,4diS (В) (R2=SO3-: R4=SO3-: R6=H)
Di-2,4,6triS (R2=SO3-: R4=SO3-: R6=SO3-)
Образцы CS, происходящие из различных животных источников, также характеризуются разными молекулярными массами и плотностями зарядов, причем последний параметр непосредственно коррелирует с конкретными сульфатированными группами.
В табл. 1 показаны основные дисахариды, обнаруженные в природном CS, экстрагированном из хряща разных животных видов:
Таблица 1. Mn равно среднечисловой молекулярной массе; Mw равно средневесовой молекулярной массе; индекс полидисперсности равен Mw/Mn; плотность заряда представляет собой число сульфатных групп на дисахаридную единицу; ND - не идентифицировано ,
Параметры Бычий CS Свиной CS Куриный CS CS акулы CS CS кальмара
Mn (кДа) 12-17 9-14 8-13 25-40 27-34 60-80
Mw (кДа) 20-26 14-20 16-21 50-70 50-70 80-120
Индекс полидисперсности 1,8-2,2 1,4-1,8 1,6-2,0 1,0-2,0 1,2-2,5 0,8-1,3
Di-OS 6 6 8 3 3 13
Di-6S 33 14 20 44 39 15
Di-4S 61 80 72 32 43 50
Di-2,6diS ND ND ND 18 13 0
Di-4,6diS ND ND ND 2 1 22
Di-2,4diS ND ND ND 1 1 0
Плотность заряда 0,90- 0,96 0,92- 0,96 0,90-0,94 1,15- 1,25 1,08- 1,20 1,00-1,20
Соотношение 4S/6S 1,50- 2,00 4,50- 7,00 3,004,00 0,45- 0,90 1,00- 1,40 2,50-4,00
Различные типы CS, имеющих происхождение из наземных животных, имеют сходные параметры молекулярных масс (Mn и Mw), в то время как они отличаются от таковых у морских видов, которые имеют более высокие значения молекулярных масс. CS наземного происхождения имеет среднюю молекулярную массу (Mw) от 14 до 26 кДа, в то время как CS морского происхождения, полученный из кальмара, хрящевых рыб и костистых рыб, имеет молекулярную массу (Mw) выше 50 кДа. Образцы CS наземного происхождения также характеризуются значениями плотности заряда (CD) ниже 1,0, в то время как образцы CS морского происхождения всегда имеют значения CD выше 1,0.
Дисульфатированные дисахариды обычно присутствуют в следовых количествах в CS наземного происхождения и более избыточны в CS морского происхождения. Более того, значительных количеств полисульфатированных дисахаридов (три- и тетра-сульфатов) не наблюдается в природном CS.
Природные CS также представляют различия между разными органами и тканями, даже в одних и тех же видах, как показано в табл. 2.
Таблица 2. Mn равно среднечисловой молекулярной массе; Mw равно средневесовой молекулярной массе; индекс полидисперсности равен Mw/Mn; плотность заряда представляет собой число сульфатных групп на дисахаридную единицу; ND - не идентифицировано __________
Параметры Бычий хрящ Бычья аорта Кости осетра Подвздошная кишка, почки, легкое и костный мозг кролика Тромбоциты человека Плазма человека
Mn (кДа) 12-17 ND 25-30 ND ND ND
Mw (кДа) 20-26 ND 35-40 ND ND около 15
Индекс полидисперсности 1,8- 2,2 ND 1,05- 1,5 ND ND ND
Di-OS 6 0 7 ND 0 40-60
Di-6S 33 95- 100 55 около 100 Следы 1-5
Di-4S 61 0-5 38 Следы более 98 60-40
Di-2,6diS ND 0 0 0 0 0
Di-4,6diS ND 0 0 0 0 0
Di-2,4diS ND 0 0 0 0 0
Плотность заряда 0,90- 0,96 0,98- 1,02 0,90- 0,95 0,98-1,02 0,98-1,02 0,40-0,60
Соотношение 4S/6S 1,50- 2,00 менее 0,1 0,40- 0,90 менее 0,1 более 45 10-50
О существовании цепей полисахарида или олигосахарида CS со 100% 6-сульфатных или 4
- 2 032748 сульфатных дисахаридов сообщалось в литературе в отношении различных тканей и органов (Sampaio L.O. et al. Biol. Chem. 256, 9205, 1981; Okayama E. et al. Blood 72,745, 1988; Ambrosius M. et al. J. Chrom. A 1201, 54, 2008; Volpi N. et al. Clin. Chim. Acta 370, 196, 2006).
Все эти характеристики демонстрируют экстремальную гетерогенность природного CS в смысле как молекулярной массы, так и плотности заряда; однако, могут быть идентифицированы параметры, согласно которым CS можно охарактеризовать как природоподобный. Хондроитин-6-сульфат, который имеет плотность заряда, сравнимую с таковой для CS морского происхождения, и характеризуется отсутствием аномальных картин сульфатирования, представляется как структурно подобный природному гликозаминогликану. Его доказанная противовоспалительная активность in vivo обеспечивает дополнительное подтверждение для определения природоподобного CS и подтверждает его использование в лечении симптомов, ассоциированных с артритными заболеваниями.
Много попыток было предпринято для разработки биотехнологического способа продуцирования CS с использованием микроорганизмов в качестве источника предшественников полисахаридов, имеющего структуру, частично сходную с таковой для CS, и последующего использования химического сульфатирования для продуцирования CS, подобного природному типу.
Некоторые бактерии продуцируют капсульные полисахариды со структурой, подобной гликозаминогликанам; например, Pasteurella multocida продуцирует полисахарид, идентичный несульфатированному хондроитину (De Angelis P.L., Carbohydrate Res., 337 (17), 1547, 2002). Однако штамм Escherichia coli серотипа O5:K4:H4 продуцирует капсульный полисахарид с хондроитиновым каркасом, несущим βфруктозный остаток, присоединенный по 3-положению GlcA единицы (полисахарид K4).
Пример продуцирования биотехнологического CS, начиная с капсульного полисахарида K4 из Е. coli O5:K4:H4, описан в ЕР 1304338, в котором раскрыт процесс, где полисахарид K4, продуцированный в жидких культурах, экстрагируют и очищают, а затем снова растворяют и подвергают кислотному гидролизу для удаления остатков фруктозы, связанных с GlcA остатками полимера. Дефруктозилированный полимер, идентичный несульфатированному каркасу CS (CH), затем сульфатируют по 4- или 6положению GalNAc остатка, согласно различным методикам химического синтеза, с получением CS с молекулярной массой от 6 до 25 кДа. Однако этот биотехнологический CS, описанный в ЕР 1304338, вообще не был оценен в отношении его противовоспалительной и противоартритной активности, и его использование в лечении артрита и/или остеоартрита остается лишь гипотезой. Это особенно важно, так как только 70% полисахарида, описанного в ЕР 1304338, определенно имеет структуру природного хондроитинсульфата, причем оставшиеся 30% представляют главным образом несульфатированный хондроитин (СН). Более того, олигосахариды с молекулярной массой менее 5 кДа вообще не рассматриваются.
В последней публикации (Bedini E. et al. Angew Chem. Int. Ed Engl. 2011) описан процесс, при котором продуцированный полисахарид K4 сульфатируют по 4-положению и/или 6-положению GalNAc остатка в той же цепи. Опять же, этот биотехнологический CS не оценивали в отношении противовоспалительной или противоартритной активности, и его применение в лечении артрита и/или остеоартрита и ассоциированные воспалительные процессы не изучались. Те же авторы выдвинули гипотезу о наличии структурных модификаций в цепи биотехнологического CS, получаемого этими процессами синтеза, которые дают аномальное сульфатирование гидроксильной группы в C3 GlcA из-за низкой защиты этой группы во время процесса синтеза. Эта аномалия, как известно, вызывает тяжелую токсичность у людей после внутривенного введения гепарина, где указанный CS, 3-сульфатированный в GlcA, присутствовал в качестве примеси. Хотя эта токсичность никогда не наблюдалась применительно к пероральному введению CS, риск токсичных эффектов из-за этого типа аномального сульфатирования сохраняется; на этот факт также указывают те же авторы в другой публикации (Bedini E. et al. Chem. J. 2012 [электронная публикация перед печатью]).
Более того, биотехнологический CS, описанный Bedini et al. (Angew Chem Int Ed Engl. 2011), имеет молекулярную массу около 17 кДа, и таким образом, потенциально проявляет низкую биодоступность природных продуктов экстракционного происхождения. По всем этим причинам биотехнологический CS, описанный Bedini et al., вероятно не может быть использован в лечении и предупреждении артрита и/или остеоартрита.
Примеры низкомолекулярных типов CS для применения в лечении артрита действительно существуют (Cho SY et al. Biol. Pharm. Bull. 27, 47, 2004, Das A. et al. Osteoart. Cartil. 8, 343, 2000), но все они получены путем деполимеризации CS животного происхождения, что означает, что присутствие вирусов, прионов и других переносимых инфекционных агентов, не может быть исключено.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1: Увеличение массы тела у крыс, страдающих адъювантным артритом (АА), вследствие лечения низкомолекулярным биотехнологическим C6S. Ключ: НС, здоровый контроль; АС, контроль артрита; Т, группа лечения C6S (сутки от 0 до 28); РТ, группа предварительной обработки C6S (сутки от -14 до 28). Показатели выражены в г ± SEM (стандартная ошибка среднего).
Фиг. 2: Оценка отека задних конечностей у крыс, страдающих адъювантным артритом (АА), вслед- 3 032748 ствие лечения низкомолекулярным биотехнологическим C6S. Ключ: НС, здоровый контроль; АС, контроль артрита; Т, группа лечения C6S (сутки 0-28); РТ, группа предварительной обработки C6S (сутки от -14 до 28). Процентное увеличение: измерение, отмеченное как увеличение в объеме (мл), расчет процента: [(Суткии/Сутки0) х 100] - 100. Показатели выражены в виде % ± SEM.
Фиг. 3: Прогрессирование отечного состояния во время исследования у крыс, страдающих адъювантным артритом (АА), вследствие лечения низкомолекулярным биотехнологическим C6S. Ключ: НС, здоровый контроль; АС, контроль артрита; Т, группа лечения C6S (сутки 0-28); РТ, группа предварительной обработки C6S (сутки от -14 до 28). Оценка процентного увеличения в объеме на сутки 0, 7, 14, 21 и 28 после индуцирования АА. Показатели выражены в %.
Фиг. 4: Шкала оценки артрита у крыс, страдающих адъювантным артритом (АА), вследствие лечения низкомолекулярным биотехнологическим C6S. Ключ: НС, здоровый контроль; АС, контроль артрита; Т, группа лечения C6S (сутки 0-28); РТ, группа предварительной обработки C6S (сутки от -14 до 28). Шкала: околосуставная припухлость и эритема передних лап (1-5), околосуставная припухлость и эритема задних лап (1-8), диаметр корки у основания хвоста (1-5). Показатели выражены в единицах ± SEM.
Фиг. 5: Прогрессирование артрита по шкале артрита во время исследования у крыс, страдающих адъювантным артритом (АА), вследствие лечения низкомолекулярным биотехнологическим C6S. Ключ: НС, здоровый контроль; АС, контроль артрита; Т, группа лечения C6S (сутки 0-28); РТ, группа предварительной обработки C6S (сутки от -14 до 28). Оценка шкалы на сутки 0, 7, 14, 21 и 28 после индуцирования АА. Оценки выражены в единицах.
Описание изобретения
В настоящее время обнаружено, что хондроитинсульфат (CS) с низкой молекулярной массой от 1000 до 5000 Да или предпочтительно от 2000 до 4000 Да, получаемый путем химического сульфатирования и последующей деполимеризации несульфатированного хондроитинового каркаса, полученного биотехнологическими методиками, обладает противовоспалительной активностью, сравнимой с таковой для природного CS, улучшенной биодоступностью и благоприятным профилем безопасности. Описанный CS является по существу моносульфатированным, главным образом по 6-положению, с очень малым сульфатированием по 4-положению, и имеет соотношение моно/дисульфированный дисахарид и плотность заряда, подобные таковым для природного CS.
CS по изобретению представляет все характеристики природного CS и более конкретно CS морского происхождения. Он имеет сходные относительные проценты моно- и дисульфатированных дисахаридов, сходное распределение дисульфатированных дисахаридов и, соответственно, сходную плотность заряда (CD), ассоциированную с низким соотношением 4-сульфат/6-сульфат.
Биотехнологический CS по изобретению также имеет следующие особые характеристики: очень малая молекулярная масса (от 1000 до 5000 Да или предпочтительно от 2000 до 4000 Да); особенно высокий процент 6-сульфатированных дисахаридов; почти полное отсутствие три-сульфатированных дисахаридов; существенное отсутствие сульфатирования по 3-положению GlcA остатка. В частности, присутствие три-сульфатированных дисахаридов и дисахаридов, сульфатированных по 3-положению GlcA, характеризует известные типы синтетического CS и часто вызывает неблагоприятные эффекты при их терапевтическом применении.
В табл. 3 показаны физико-химические характеристики биотехнологического хондроитин-6сульфата по изобретению.
Таблица 3
Физико-химические характеристики биотехнологического CS
Молекулярная масса (MWw) 1000-5000 Да
Дисахариды:
Δ Di-OS менее 15%
Δ Di-6S не менее 65%
Δ Di-4S менее 1 %
Δ Di-2,6diS менее 20%
Δ Di-4,6diS менее 5%
Δ Di-2,4diS менее 1 %
Плотность заряда 1-1,25
Соотношение 4S / 6S менее 0,1
Согласно конкретному аспекту изобретения C6S может быть получен путем химического синтеза, описанного в РСТ/ЕР2011/058297, применительно к капсульному полисахариду K4, продуцируемому естественным путем штаммом Е. coli O5:K4:H4 (WO 01/02597), предварительно дефруктозилированному посредством термокислотного гидролиза в соответствии с известными методиками (Rodriguez and Jann, Eur.J.Biochem. 117, 117-124, FEBS 1988), либо к любому другому полисахариду со структурой несульфатированного хондроитина. Альтернативно, исходный несульфатированный хондроитин (СН) может быть
- 4 032748 получен из культур штамма Е. coli DSM23644, описанного в WO 2012004063, который вследствие мутации, индуцированной в гене KfoE, ответственном за фруктозилирование K4, продуцирует полисахарид, идентичный природному несульфатированному СН. Согласно этому аспекту изобретения полисахарид подвергают химическому сульфатированию, предпочтительно в соответствии со способом, описанным в РСТ/ЕР2011/058297.
Вкратце, процесс синтеза, который приводит к сульфатированию дисахаридных единиц, заключается в следующем:
a) Несульфатированный хондроитин, выделенный в виде соли аммония или в виде любой из солей щелочных металлов и, в частности, в виде натриевой соли, или в виде калиевой соли, или литиевой соли, полученной в результате дефруктозилирования полисахарида K4, обессоливают на катионнообменной смоле и снова подвергают солеобразованию с алкиламмонийной гидроксидной группой, предпочтительно с гидроксидом тетрабутиламмония, добавленном в стехиометрическом количестве вплоть до рН 7-7,5, и сушат посредством лиофильной сушки или распылительной сушки.
b) Тетрабутиламмонийную соль СН, описанную на стадии (а), добавляют при перемешивании к раствору, состоящему из полярного апротонного растворителя, предпочтительно диметилформамида (DMF), поддерживаемого при температуре от 0 до 30°C; сульфатирующий комплекс затем добавляют в молярном соотношении от 2 до 5 к СН, поддерживаемому при постоянной температуре и перемешивании.
c) Наконец, некоторое количество бикарбоната натрия добавляют в стехиометрическом молярном соотношении к сульфатирующему агенту или в избытке, в то же время увеличивая температуру до 65°C для выпаривания растворителя. Затем добавляют воду с последующей повторной дистилляцией. Конечный раствор подвергают ультрафильтрации и диализу. Наконец, натриевую соль CS отфильтровывают и сушат под вакуумом до остаточной влажности ниже 10%.
Молекулярные размеры полученного CS затем снижают процессом деполимеризации, осуществляемым согласно известным методикам радикальной деполимеризации (Volpi N. et al., Carb. Res., 279, 193-200, 1995) или кислотной деполимеризации, контролируя процесс таким образом, чтобы получить необходимое распределение по молекулярным массам.
Кислотную деполимеризацию осуществляют путем ресуспендирования CS в воде, подкисления раствора добавлением HCl до концентрации 1 М и нагревания до 60°C.
Молекулярную массу олигосахаридов, образованных при деполимеризации, рассчитывают путем взятия образцов раствора через короткие интервалы времени, определения молекулярной массы олигосахаридов посредством анализа SEC-HPLC (эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография), осуществляемого на двух колонках 5 мкм Agilent Bio Series SEC©-5 (гидрофильный нейтральный полимерный монослой) 300 и 150 А, соответственно, в партиях. Реакцию прерывают путем нейтрализации NaOH или бикарбонатом натрия, так чтобы довести значение рН до 6-8, где были достигнуты желаемые значения молекулярных масс.
Альтернативно, деполимеризация может быть достигнута путем радикального гидролиза, контролируя конечную молекулярную массу получаемых олигосахаридов как описано выше.
CS повторно суспендируют в воде и значение рН доводят до 7,5 добавлением 10%-ной соляной кислоты или раствора гидроксида натрия, в зависимости от того требуется ли данный раствор CS подкислять или подщелачивать. 9%-ный раствор пероксида водорода (Н2О2) добавляют к этому раствору, поддерживаемому при 60°C. SEC-HPLC осуществляют, как описано выше для проверки того, достигнута ли желаемая молекулярная масса. Реакцию прерывают путем охлаждения раствора до комнатной температуры (20-25°C) и снижения значения рН до 6,0.
В табл. 4 показаны значения молекулярных масс типичного олигосахарида, проанализированного посредством SEC-HPLC во время реакционных стадий до окончания деполимеризации.
- 5 032748
Таблица 4
Время (минуты) MWw (кДа) Индекс полидисперсности Относительная MWw (% от исходного значения)
0 77,3 0,2 100,0
60 73,6 0,2 95,3
120 81,9 0,2 106,0
180 76,3 0,3 98,7
330 45,7 0,4 59,1
390 39,7 0,4 51,4
510 28,6 0,5 37,0
660 25,5 0,6 33,0
780 20,5 0,6 26,5
840 18,7 0,6 24,2
900 18,1 0,6 23,4
1020 14,0 0,6 18,1
1200 10,2 0,6 13,2
1440 3,7 0,6 9,96
C6S по изобретению также может быть получен путем химического сульфатирования в соответствии с описанными выше методиками, используя в качестве субстрата низкомолекулярную фракцию полисахарида K4, получаемого в результате ферментации штамма Е. coli O5:K4:H4. В этом случае культуральный бульон обрабатывают в конце ферментации путем нагревания при 80°C в течение 60 мин для дезактивации микроорганизма и затем подвергают центрифугированию и ультрафильтрации как в ЕР 1304338; полученный супернатант затем загружают на колонку для гель-фильтрации и фракции собирают, проверяя содержание уроновой кислоты в каждом из них известными методиками. Путем объединения фракций, которые тестированы положительно в тесте на уроновую кислоту, может быть выделено два отдельных пула: первый пул, содержащий высокомолекулярный K4 (40-70 кДа), соответствующий известному полисахариду и количественно составляющий 80% от общего содержания сахаридов, и второй пул, четко отделенный от первого, исходя из объема элюции, и содержащий низкомолекулярный K4, с низким распределением около среднего значения, от 1500 до 6000 Да. Идентичность олигосахаридов, содержащихся в указанном втором низкомолекулярном K4, демонстрируют по одновременному положительному ответу в анализе на уроновую кислоту и на переваривание хондроитиназой ABC, сопровождающееся появлением дисахаридных единиц.
Указанную фракцию олигосахарида K4, который количественно составляет 20% от общего содержания сахаридов, затем подвергают процессу дефруктозилирования и химического сульфатирования, раскрытому в РСТ/ЕР2011/058297, до получения CS с конечной молекулярной массой в диапазоне 10005000 Да.
Альтернативно, низкомолекулярный биотехнологический C6S может быть получен процессом, аналогичным описанному ранее, включающим сульфатирование низкомолекулярной фракции природно дефруктозилированного олигосахарида K4-d, выделенного в результате ферментации штамма Е. coli DSM23644, описанного в WO 2012004063.
Полученный таким образом низкомолекулярный C6S оценивали на эффективность в экспериментальной животной модели артрита (адъювантный артрит: АА) у крыс, и полученные результаты сравнивали с результатами, относящимися к природному CS фармацевтической степени чистоты экстракционного происхождения, используемому в той же самой экспериментальной модели (Bauerova K. et al., Osteoarthritis Cartilage 19, 1373, 2011) после ежедневного перорального приема в дозе 900 мг/кг.
АА индуцировали путем однократной внутрикожной инъекции Mycobacterium butyricum в неполном адъюванте Фрейнда. Это исследование включало одну группу здоровых животных (НС), одну группу животных с артритом без лечения (АС) и две группы животных с артритом, которых лечили двумя разными схемами лечения. Первая схема лечения включала предварительную обработку, состоящую из введения 900 мг/кг биотехнологического C6S в сутки в течение 14 суток до индуцирования артрита, продолжая в течение 28 суток после индуцирования АА (РТ). Вторая схема лечения включала введение 900 мг/кг биотехнологического C6S в сутки только в течение 28 суток после индуцирования АА (Т).
Физиологическое увеличение массы тела у крыс было очень низким у животных с артритом без лечения (АС), насчитывая примерно 40% от значения для здоровых контролей в конце исследования. Предварительная обработка биотехнологическим C6S (группа РТ) ограничивала это снижение: увеличение массы тела составляло до 73% от значения для здоровых контролей. Группа только лечения (Т) также была эффективной в сохранении массы тела, хотя и в меньшей степени (увеличение 54% по сравнению с здоровыми контролями) (фиг. 1). Это вносит вклад в противовоспалительную роль низкомолекулярного биотехнологического C6S на системном уровне. Этот эффект в отношении увеличения массы тела животных выше чем тот, который обнаружен в исследовании Bauerova et al., проведенном на высо
- 6 032748 комолекулярном CS бычьего происхождения в той же самой дозе (Bauerova K. Et al., Osteoarthritis Cartilage 19, 1373, 2011). Это обнаружение подтверждает более высокое кишечное всасывание биотехнологического C6S по изобретению.
Тяжесть артрита оценивали на основе увеличивающихся уровней припухлости конечностей (отек); отек, который развивался в задней конечности, был значительно меньше в группе предварительно обработанных животных (РТ) (фиг. 2). Предварительная обработка биотехнологическим C6S значительно снижала отек на протяжении всего исследования по сравнению с контролями без лечения (фиг. 3).
Предварительная обработка также была эффективной в снижении общих баллов шкалы артрита, параметр, который учитывает ряд клинических факторов, включающих околосуставную эритему, развившийся отек и диаметр корки в месте адъювантной инъекции у основания хвоста. Шкала оценки артрита устанавливает баллы от 6 до 31; контрольная группа артрита (АС) получила оценку 23, в то время как группа РТ достигла оценки 19 против 12 для здоровых контролей (НС) (фиг. 4). Более того, предварительная обработка была эффективной на протяжении всей подострой фазы, от суток 1 до суток 28 после индуцирования АА (фиг. 5). Группа только лечения (Т) не оказывала значительного влияния на шкалу артрита во время периода исследования.
C6S по изобретению также тестировали на его токсикологическую безопасность у животных и на клеточных культурах в соответствии с различными протоколами, разработанными для оценки их потенциальной генотоксичности на клеточном уровне и острой пероральной токсичности у крыс. Все использованные тесты одобрены и применяются согласно руководствам OECD для фармацевтических продуктов.
Биотехнологический C6S подвергали тестам на мутагенез в бактериальных клетках (бактериальная обратная мутация, Ref. OECD 471), которые тестировали на способность продукта индуцировать появление обратных мутантов в ауксотрофных штаммах Е. coli и Salmonella typhimurium. Никакого значительного увеличения бактериальной мутагенности не обнаружено.
Генотоксичность биотехнологического C6S также проверяли в двух других тестах на эукариотических клеточных культурах, а именно тесте на хромосомные аберрации в клетках яичников китайского хомячка in vitro, OECD Ref. 473) и тесте мутагенности на мышиных клетках лимфомы (Мутация в L5178Y TK+/+ мышиных клетках лимфомы, Prot. OECD 476). Никакого значимого увеличения генетической токсичности не было обнаружено в этих двух исследованиях, проводимых вплоть до наивысшей используемой концентрации C6S (5000 мкг/планшет и 5000 мкг/мл, соответственно).
Наконец, острую токсичность после перорального введения проверяли на крысах линии SpragueDawley вплоть до дозы 2000 мг/кг массы тела. После наблюдения продолжительностью 14 суток после введения крысы не проявили никаких клинических признаков болезни, и не возникло ни одного случая смертельного исхода. Более того, аутопсия, проведенная в конце исследования, не показала никаких признаков токсичности в проверенных тканях и органах.
Для предназначенного терапевтического использования или для использования с целью сохранения здоровья C6S по изобретению будут использовать в качестве активного ингредиента лекарственных средств, питательных добавок или пищевых добавок, возможно объединенного с другими активными ингредиентами, такими как глюкозамина гидрохлорид, глюкозамина сульфат, N-ацетилглюкозамин, гиалуроновая кислота, аминокислоты, коллаген, гидролизованный коллаген, полиненасыщенные жирные кислоты, кератин, дерматин, метилсульфонилметан (MSM), фолаты, восстановленные фолаты, витамины, витамины группы В, S-аденозилметионин (SAMe), аскорбиновая кислота или аскорбат марганца.
Примеры препаратов по изобретению включают капсулы, мягкие желатиновые капсулы, таблетки, напитки в жидкой форме и порошковые напитки для разведения перед использованием.
Дозы C6S по изобретению будут составлять от 100 до 3000 мг/сутки, предпочтительно от 1000 до 2000 мг/сутки и более предпочтительно от 1250 до 1750 мг/сутки.
Изобретение далее будет описано более подробно в следующих примерах.
Пример 1. индуцирование артрита (адъювантный артрит, АА) у крыс и лечение низкомолекулярным биотехнологическим C6S самцов крыс линии Lewis массой от 150 до 190 г разделяли случайным образом на четыре группы по 10 животных в каждой, содержали в полипропиленовых клетках в среде, поддерживаемой при температуре 22±2°C, и кормили по стандартной лабораторной диете с неограниченным доступом к воде.
Экспериментальные группы были следующими:
1) Контрольная здоровая группа без лечения (НС).
2) Контрольная группа с адъювантным индуцированным артритом без лечения (АС).
3) Группа крыс с артритом, которым перорально вводили биотехнологический C6S в дозе 900 мг/сутки на кг массы тела в течение 28 суток после индуцирования АА (сутки 0-28 эксперимента) (Т).
4) Группа, которой перорально предварительно вводили биотехнологический C6S в дозе 900 мг/сутки на кг массы тела в течение 14 суток перед индуцированием АА и в течение 28 суток после индуцирования АА (сутки от -14 до 28 эксперимента) (РТ).
Артрит был экспериментально индуцирован у крыс на сутки 0 путем однократной внутрикожной инъекции у основания хвоста 1 мл смеси, состоящей из Mycobacterium butyricum, инактивированной на
- 7 032748 греванием, в неполном адъюванте Фрейнда.
C6S по изобретению растворяли в дистиллированной воде в концентрации 20 мг/мл и вводили перорально в виде однократной ежесуточной дозы посредством зонда.
Пример 2. Эффекты биотехнологического C6S по оценке АА у крыс посредством мониторинга массы тела
Массу тела крыс измеряли перед индуцированием АА (сутки 0), на сутки 7, 14 и 21 и в конце лечения (сутки 28). Влияние лечения на этот параметр оценивали путем сравнения увеличения массы в различных группах во время периода лечения.
Найденные показатели сведены в табл. 5.
Таблица 5
Изменение массы тела: А (суткип - сутки0)
Сутки (суткип) 0 7 14 21 28
Здоровый контроль (НС) 0,0 98,19 120,93 135,37 148,33
SEM 0,0 1,76 2,01 1,99 2,47
Контроль артрита (АС) 0,0 74,73 76,77 51,93 57,57
SEM 0,0 4,06 7,02 6,05 5,71
Лечение LMW-C6S (Т) 0,0 85,19 89,19 68,39 79,78
SEM 0,0 3,03 5,63 7,52 8,86
Предварительная обработка LMW-C6S (РТ) 0,0 92,96 107,26 93,39 108,63
SEM 0,0 2,94 6,48 8,65 8,29
SEM: Стандартная ошибка среднего
Пример 3. Эффекты биотехнологического C6S по оценке АА у крыс посредством мониторинга развившегося отека
Отек, который развился как следствие артрита, измеряли путем наблюдения увеличения объема задней конечности с использованием штангенциркуля, подходящего для этого измерения. Измерения осуществляли перед индуцированием АА (сутки 0) и на сутки 7, 14, 21 и 28 исследования.
Данные выражали в виде процентного увеличения отека, рассчитанного с использованием следующей формулы: [(Суткин/Сутки0) х 100] -100, где Сутки0 представляет собой измерение на исходные сутки и Суткии представляет собой измерение на рассматриваемые сутки.
Найденные показатели сведены в табл. 6.
Таблица 6
Сутки (суТКИп) Изменение припухлости задней конечности:
0 [(Суткип/Суткио) х 100] -100 (%)
7 14 21 28
Здоровый контроль (НС) 0,0 17,6 19,3 24,8 29,1
SEM 0,0 1,5 1,4 1,8 2,0
Контроль артрита (АС) 0,0 8,6 31,0 56,7 59,3
SEM 0,0 1,2 4,6 6,5 6,7
Лечение LMW-C6S (Т) 0,0 13,1 34,5 62,8 61,4
SEM 0,0 1,0 6,4 8,7 7,1
Предварительная обработка LMW-C6S (РТ) 0,0 15,4 26,7 46,5 49,7
SEM 0,0 1,5 4,9 6,9 7,1
SEM: Стандартная ошибка среднего
Пример 4. Эффекты биотехнологического C6S по оценке АА у крыс посредством мониторинга баллов по шкале артрита
Баллы по шкале артрита присваивали за измерение припухлости сустава конечности (отек), степень околосуставной эритемы и диаметра корки в месте адъювантной инъекции у основания хвоста. Баллы по шкале артрита или артрограмму измеряли в виде общей суммы отека (в мл, баллы от 1 до 8), плюс диаметр передней конечности (в мм, максимальный балл от 1 до 5), плюс диаметр корки в месте введения Mycobacterium butyricum, измеренный параллельно позвоночному столбу (в мм, максимальный балл от 1 до 5), для каждого животного.
Найденные показатели сведены в табл. 7.
- 8 032748
Таблица 7
Сутки (суткип) Баллы артрита
0 7 14 21 28
Здоровый контроль (НС) 10,0 10,0 10,2 11,4 12,0
SEM 0,0 0,0 0,1 0,3 0,0
Контроль артрита (АС) 10,0 11,0 16,9 22,4 23,2
SEM 0,0 0,4 1,2 1,4 1,3
Лечение LMW-C6S (Т) 10,0 10,0 18,1 22,7 23,0
SEM 0,0 0,0 1,7 1,9 1,3
Предварительная обработка LMW-C6S (РТ) 10,0 10,1 13,1 15,8 19,0
SEM 0,0 0,1 0,8 1,3 1,7
SEM: Стандартная ошибка среднего

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Хондроитинсульфат, имеющий молекулярную массу в интервале от 1000 до 5000 Да, обладающий противовоспалительной и противоартритной биологической активностью, характеризующийся процентным содержанием дисахарид-6-моносульфата не менее 65%, процентным содержанием дисахарид-4моносульфата менее 1%, процентным содержанием дисахарид-2,6-дисульфата не более 20%, процентным содержанием дисахарид-4,6-дисульфата менее 5%, процентным содержанием дисахарид-2,4дисульфата менее 1%, процентным содержанием несульфатированного дисахарида менее 15% и значением плотности заряда в интервале от 1 до 1,25.
  2. 2. Хондроитинсульфат по п.1, полученный путем химического сульфатирования и последующей кислотной или радикальной деполимеризации капсульного полисахарида K4 из Е. coli после удаления остатков фруктозы посредством гидролиза.
  3. 3. Хондроитинсульфат по п.1, полученный путем химического сульфатирования низкомолекулярной природной фракции капсульного полисахарида K4 из Е. coli, осуществляемого после удаления остатков фруктозы посредством гидролиза.
  4. 4. Хондроитинсульфат по п.1, полученный путем химического сульфатирования и последующей кислотной или радикальной деполимеризации капсульного полисахарида, по своей природе свободного от остатков фруктозы (K4-d), продуцируемого штаммом Е. coli DSM23644.
  5. 5. Хондроитинсульфат по п.1, полученный путем химического сульфатирования низкомолекулярной фракции капсульного полисахарида, по своей природе свободного от остатков фруктозы (K4-d), продуцируемого штаммом Е. coli DSM23644.
  6. 6. Применение хондроитинсульфата по любому из пп.1-5 для предупреждения и лечения острых или хронических воспалительных состояний и/или для сохранения скелетно-мышечного здоровья у людей и животных.
  7. 7. Применение по п.6, где воспалительное состояние представляет собой остеоартрит.
  8. 8. Композиция, обладающая противовоспалительной и противоартритной активностью, содержащая хондроитинсульфат по любому из пп.1-5 в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически и нутрицевтически приемлемыми эксципиентами.
  9. 9. Композиция по п.8, содержащая дополнительные активные ингредиенты.
  10. 10. Композиция по п.9, где дополнительные активные ингредиенты выбраны из глюкозамина гидрохлорида, глюкозамина сульфата, N-ацетилглюкозамина, гиалуроновой кислоты, аминокислот, коллагена, гидролизованного коллагена, полиненасыщенных жирных кислот, кератина, дерматина, метилсульфонилметана (MSM), фолатов, восстановленных фолатов, витаминов, витаминов группы В, Sаденозилметионина (SAMe), аскорбиновой кислоты или аскорбата марганца.
  11. 11. Композиция по любому из пп.8-10 в форме капсул, мягких желатиновых капсул, таблеток, напитков в жидкой форме или порошковых напитков для разведения перед использованием.
    - 9 032748
    Фиг. 1
    Фиг. 2
    Фиг. 3
EA201491919A 2012-05-22 2013-05-22 Низкомолекулярный биотехнологический хондроитин 6-сульфат для предупреждения остеоартрита EA032748B8 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT000880A ITMI20120880A1 (it) 2012-05-22 2012-05-22 Condroitin 6-solfato biotecnologico a basso peso molecolare dotato di attivita' antiinfiammatoria e antiartritica e suo uso nel trattamento e nella prevenzione dell'osteoartrite
PCT/EP2013/060471 WO2013174847A1 (en) 2012-05-22 2013-05-22 Low -molecular -weight biotechnological chondroitin 6 - sulphate for prevention of osteoarthritis

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201491919A1 EA201491919A1 (ru) 2015-05-29
EA032748B1 true EA032748B1 (ru) 2019-07-31
EA032748B8 EA032748B8 (ru) 2019-09-30

Family

ID=46582917

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491919A EA032748B8 (ru) 2012-05-22 2013-05-22 Низкомолекулярный биотехнологический хондроитин 6-сульфат для предупреждения остеоартрита

Country Status (25)

Country Link
US (2) US20150152198A1 (ru)
EP (1) EP2852437B1 (ru)
JP (1) JP6273264B2 (ru)
KR (2) KR20150013565A (ru)
CN (1) CN104411363B (ru)
AU (1) AU2013265350B2 (ru)
BR (1) BR112014028904B1 (ru)
CA (1) CA2874216C (ru)
CY (1) CY1117636T1 (ru)
DK (1) DK2852437T3 (ru)
EA (1) EA032748B8 (ru)
ES (1) ES2571583T3 (ru)
GE (1) GEP201606585B (ru)
HR (1) HRP20160773T1 (ru)
HU (1) HUE030224T2 (ru)
IL (1) IL235803B (ru)
IN (1) IN2014DN09832A (ru)
IT (1) ITMI20120880A1 (ru)
MX (1) MX368965B (ru)
PH (1) PH12014502444B1 (ru)
PL (1) PL2852437T3 (ru)
SI (1) SI2852437T1 (ru)
UA (1) UA113005C2 (ru)
WO (1) WO2013174847A1 (ru)
ZA (1) ZA201408536B (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITMI20130117A1 (it) 2013-01-25 2014-07-26 Gnosis Spa Composizioni comprendenti condroitin solfato, enzimi proteolitici e composti sulfidrilati capaci di migliorare la biodisponibilita' del condroitin solfato
JP2016138062A (ja) * 2015-01-28 2016-08-04 一丸ファルコス株式会社 特定分子結合単位が分子内の末端部位に存在する高分子糖鎖化合物とその利用
JP2016138061A (ja) * 2015-01-28 2016-08-04 一丸ファルコス株式会社 特定分子結合単位が分子内の末端部位に存在する高分子糖鎖化合物とその利用
KR102231289B1 (ko) 2018-12-26 2021-03-23 (주)휴온스 고함량 콘드로이틴설페이트 약학 제제 및 이의 제조방법
US20220227855A1 (en) * 2019-04-25 2022-07-21 The University Of Massachusetts Compositions and methods for treatment of angiogenesis related diseases
WO2021179319A1 (zh) * 2020-03-13 2021-09-16 南京汉欣医药科技有限公司 一种含水解硫酸软骨素的用于防治骨关节病的组合物
CN114846147A (zh) 2019-11-01 2022-08-02 南京乐韬生物科技有限公司 低分子量硫酸软骨素、包含其的组合物、其制备方法以及其用途
CN111234048A (zh) * 2020-03-09 2020-06-05 河北农业大学 鳐鱼硫酸软骨素的降解产物及其降解方法
IT202000013618A1 (it) 2020-06-08 2021-12-08 Vivatis Pharma Gmbh Processo di estrazione di un acido ialuronico da un fungo, un acido ialuronico di origine vegetale e suo uso
IT202000013633A1 (it) 2020-06-08 2021-12-08 Vivatis Pharma Gmbh Processo di estrazione di una condroitina solfato da un fungo, una condroitina solfato di origine vegetale e suo uso
IT202100030935A1 (it) 2021-12-09 2023-06-09 Fidia Farm Spa Compresse comprendenti condroitin solfato, glucosamina cloridrato e vitamina c per il trattamento di danni cartilaginei, tendinei, ossei
CN115895987B (zh) * 2022-08-02 2024-02-13 衢州益康园生物科技有限公司 一种提高果糖软骨素产量的重组菌株及其构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005110438A2 (en) * 2004-04-15 2005-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to the intracellular delivery of polysaccharides

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITMI991465A1 (it) 1999-07-02 2001-01-02 Inalco Spa Processo per la preparazione dei polisaccaridi k4 e k5 da escherichiacoli
ITMI20012200A1 (it) * 2001-10-22 2003-04-22 Ibsa Inst Biochimique Sa Processo per la preparazione di condroitin solfati dal polisaccaride k4 e prodotti ottenuti
KR100706294B1 (ko) * 2005-03-18 2007-04-11 한국식품연구원 연골어류의 연골로부터 얻은 저분자 콘드로이틴 황산 및 이의 제조방법
JP5320296B2 (ja) * 2007-10-01 2013-10-23 生化学工業株式会社 新規な低分子化コンドロイチン硫酸およびその用途
US9109243B2 (en) * 2008-06-04 2015-08-18 Amano Enzyme Usa, Ltd. Microbial-derived chondroitin sulfate
GEP201706720B (en) 2010-07-09 2017-08-25 Gnosis Spa Biotechnological production of chondroitin
US8664196B2 (en) * 2011-05-20 2014-03-04 Gnosis S.P.A. Shark-like chondroitin sulphate and process for the preparation thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005110438A2 (en) * 2004-04-15 2005-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to the intracellular delivery of polysaccharides

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHO SO YEAN; SIM JOON-SOO; JEONG CHOON SIK; CHANG SEUNG YEUP; CHOI DON WOONG; TOIDA TOSHIHIKO; KIM YEONG SHIK: "Effects of low molecular weight chondroitin sulfate on type II collagen-induced arthritis in DBA/1J mice.", BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN (OF JAPAN), PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, TOKYO., JP, vol. 27, no. 1, 1 January 2004 (2004-01-01), JP, pages 47 - 51, XP008159629, ISSN: 0918-6158, DOI: 10.1248/bpb.27.47 *
RODRIGUEZ M.L., J ANN B., JANN K.: "STRUCTURE AND SEROLOGICAL CHARACTERISTICS OF THE CAPSULAR K4 ANTIGEN OF ESCHERICHIA COLI O5:K4:H4, A FRUCTOSE-CONTAINING POLYSACCAHRIDE WITH A CHONDROITIN BACKBONE.", EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD., GB, vol. 177., no. 01., 1 January 1988 (1988-01-01), GB, pages 117 - 124., XP000886039, ISSN: 0014-2956, DOI: 10.1111/j.1432-1033.1988.tb14351.x *
TSUTSUMI, K. SHIMAKAWA, H. KITAGAWA, H. SUGAHARA, K.: "Functional expression and genomic structure of human chondroitin 6-sulfotransferase", FEBS LETTERS., ELSEVIER, AMSTERDAM., NL, vol. 441, no. 2, 18 December 1998 (1998-12-18), NL, pages 235 - 241, XP004258907, ISSN: 0014-5793, DOI: 10.1016/S0014-5793(98)01532-4 *
VOLPI, N.: "Influence of charge density, sulfate group position and molecular mass on adsorption of chondroitin sulfate onto coral", BIOMATERIALS., ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS BV., BARKING., GB, vol. 23, no. 14, 1 July 2002 (2002-07-01), GB, pages 3015 - 3022, XP004353901, ISSN: 0142-9612, DOI: 10.1016/S0142-9612(02)00060-1 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200006625A (ko) 2020-01-20
PL2852437T3 (pl) 2016-10-31
DK2852437T3 (en) 2016-06-06
CN104411363A (zh) 2015-03-11
US20160074429A1 (en) 2016-03-17
US20150152198A1 (en) 2015-06-04
EP2852437A1 (en) 2015-04-01
IN2014DN09832A (ru) 2015-08-07
JP6273264B2 (ja) 2018-01-31
AU2013265350A1 (en) 2014-12-11
PH12014502444A1 (en) 2015-01-12
ITMI20120880A1 (it) 2013-11-23
SI2852437T1 (sl) 2016-06-30
UA113005C2 (uk) 2016-11-25
GEP201606585B (en) 2016-12-12
ES2571583T3 (es) 2016-05-26
MX2014014115A (es) 2015-02-24
EA201491919A1 (ru) 2015-05-29
BR112014028904A2 (pt) 2017-06-27
JP2015517602A (ja) 2015-06-22
EA032748B8 (ru) 2019-09-30
WO2013174847A1 (en) 2013-11-28
MX368965B (es) 2019-10-23
BR112014028904B1 (pt) 2022-09-20
CA2874216C (en) 2020-09-01
AU2013265350B2 (en) 2017-05-04
ZA201408536B (en) 2016-08-31
HRP20160773T1 (hr) 2016-09-23
IL235803B (en) 2019-11-28
HUE030224T2 (en) 2017-04-28
KR20150013565A (ko) 2015-02-05
PH12014502444B1 (en) 2015-01-12
EP2852437B1 (en) 2016-04-06
CN104411363B (zh) 2017-09-08
CY1117636T1 (el) 2017-04-26
CA2874216A1 (en) 2013-11-28
IL235803A0 (en) 2015-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2874216C (en) Low-molecular-weight biotechnological chondroitin 6-sulphate for prevention of osteoarthritis
US10632144B2 (en) Low polydispersity, low molecular weight biotechnological chondroitin sulfate with anti-inflammatory and antiarthritis activity and use thereof in the prevention of osteoarthritis
EP2707396B1 (en) Biotechnological sulphated chondroitin sulphate at position 4 or 6 on the same polysaccharide chain, and process for the preparation thereof
US8664196B2 (en) Shark-like chondroitin sulphate and process for the preparation thereof
JP5770367B2 (ja) サメに類似するコンドロイチン硫酸およびこの調製のための方法
JPH11269077A (ja) ホスホリパーゼａ２阻害用医薬組成物
CA2489870A1 (en) Low molecular weight oversulfated polysaccharide
ZA200410358B (en) Low molecular weight oversulfated polysaccharide.
NZ617564B2 (en) "biotechnological sulphated chondroitin sulphate at position 4 or 6 on the same polysaccharide chain, and process for the preparation thereof"

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG TJ TM