KR20200006625A - 골관절염의 예방을 위한 저분자량 생물공학적 콘드로이틴 6-설페이트 - Google Patents

골관절염의 예방을 위한 저분자량 생물공학적 콘드로이틴 6-설페이트 Download PDF

Info

Publication number
KR20200006625A
KR20200006625A KR1020207000570A KR20207000570A KR20200006625A KR 20200006625 A KR20200006625 A KR 20200006625A KR 1020207000570 A KR1020207000570 A KR 1020207000570A KR 20207000570 A KR20207000570 A KR 20207000570A KR 20200006625 A KR20200006625 A KR 20200006625A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chondroitin sulfate
chondroitin
molecular weight
polysaccharide
sulfate
Prior art date
Application number
KR1020207000570A
Other languages
English (en)
Inventor
니콜로 미라글리아
데이비드 비안치
에르만노 발로티
안토넬라 트렌틴
안토니오 트릴리
임마콜라타 부시엘로
마르코 아고스티네토
파올라 바자
마르코 발레티
Original Assignee
그노시스 에스.피.에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 그노시스 에스.피.에이. filed Critical 그노시스 에스.피.에이.
Publication of KR20200006625A publication Critical patent/KR20200006625A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/375—Ascorbic acid, i.e. vitamin C; Salts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y10S514/925—

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

생물공학적 기법으로 수득된 비-설페이트화 콘드로이틴 골격의 화학적 설페이션 및 뒤이은 탈중합화에 의해 생산된 저분자량(1000 내지 5000 달톤) 콘드로이틴 설페이트 (CS)가 개시된다. 개시된 CS는 주로 6번 위치에서 실질적으로 모노설페이트화되고, 4-번 위치에서의 설페이션은 거의 없고, 천연 CS와 유사한 모노/디설페이트화 이당류 비율 및 전하 밀도를 갖는다. 상기 생물공학적 콘드로이틴 6-설페이트 (C6S)는 골관절염의 치료 및 예방 및 급성 및 만성 염증성 과정에서 유용하다.

Description

골관절염의 예방을 위한 저분자량 생물공학적 콘드로이틴 6-설페이트{Low-molecular-weight biotechnological chondroitin 6-sulphate for prevention of osteoarthritis}
본 발명은 생물공학적 기법으로 수득된 비-설페이트화(non-sulphated) 콘드로이틴 골격(chondroitin backbone)의 화학적 설페이션(sulphation) 및 뒤이은 탈중합화에 의해 생산되거나, 또는 본래 저분자량을 특징으로 하는 생물공학적 기원의 다당류의 설페이션에 의해 생산된, 극단적으로 저분자량(1000 내지 5000 달톤(dalton))을 갖는 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate) (CS) 및 상기 CS의 골관절염 및 급성 및 만성 염증 과정(process)의 치료 및 예방에서의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 주로 6번 위치에서 실질적으로 모노설페이트화(monosulphated)되고, 4-설페이트를 거의 또는 전혀 갖지 않으며, 모노/디설페이트화(disulphated) 이당류 비율, 트리-설페이트화(tri-sulphated) 및 폴리설페이트화(polysulphated) 이당류의 부재, 전하 밀도 및 나타나는 생물학적 활성의 측면에서 천연 CS와 동일한 생물공학적 CS에 관한 것이다. 본 발명에 따른 콘드로이틴 6-설페이트 (C6S)는 14,000 내지 26,000 달톤의 분자량 값을 특징으로 하는 육생 기원(소, 돼지, 및 조류) 및 모두 50,000 달톤 초과의 분자량을 갖는 해양 기원(상어, 오징어, 홍어 및 경골어류)의 동물 조직으로부터 추출된 콘드로이틴 설페이트 보다 더 낮은 분자량(1000 내지 5000 달톤)을 나타낸다. 본 발명에 따른 C6S는 또한 공지된 종류의 저분자량 CS 보다 훨씬 더 낮은 분자량을 갖는다. 이러한 특징은 본 발명에 따른 콘드로이틴 6-설페이트에 더 우수한 생체이용률 및 그로 인한 보다 큰 효율성을 부여한다.
골관절염의 치료 및 예방에서의 저분자량 생물공학적 콘드로이틴 6-설페이트 (C6S)의 용도는 관절염 및 관련된 증상의 연구를 위해 통상적으로 사용되는 공지의 동물 모델에서의 그의 항 염증 활성의 실험적 검증에 의해 지지된다. 개시된 저분자량 생물공학적 C6S는 또한 의약품의 OECD 가이드라인(guideline)에 따라 수행된 독성 실험에서 증명된 좋은 내성을 나타낸다.
콘드로이틴 설페이트 (CS)는 현재 임상 시험에서의 다수의 임상적 발견 및 다양한 메타 분석(meta analysis)을 기초로, 무릎(Jordan KM et al., Ann. Rheum. Dis. 62, 1145, 2003), 고관절(hip)(Jordan KM et al. Ann. Rheum. Dis. 62, 1145, 2003) 및 손(Zhang W et al., Ann. Rheum. Dis. 66, 377, 2007)의 골관절염의 치료에서 골관절염 지효성 증상 개선제(symptomatic slow-acting drug for osteoarthritis) (SYSADOA)로서 EULAR(the European League against Rheumatism)에 의해 권장된다. 최근의 임상 시험은 또한 CS가 인간 연골 조직의 세포외 구조를 변형시킨다는 것을 증명하였다(Reginster JY, Heraud F, Zegels B, Bruyere O. Mini Rev Med Chem 7, 1051, 2007. Kahan A, Uebelhart D, De Vathaire F, Delmas PD, Reginster JY. Arthritis Rheum 60, 524, 2009). CS는 또한 단독으로 또는 기타 성분과의 조합으로, 기능성 식품(nutraceutical)으로서 광범위하게 사용된다(McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N et al., Separation Sc 1, 22, 2009).
콘드로이틴 설페이트 (CS)는 상이한 위치에서 설페이트화되고 베타 1-3 결합에 의해 결합된 글루쿠론산 (GlcA)과 N-아세틸-D-갈락토사민 (GalNAc)의 교대하는 잔기의 의해 형성된 이당류 서열로 구성되는, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) (GAG) 분류(class)에 속하는 천연 다당류이고, 척추 동물 및 무척추동물 모두에 존재한다.
CS는 구조적 및 생리적 기능을 위해 동물 조직에서 존재한다. CS는 그의 기원에 따라 서로 다른 퍼센트로 존재하는, 주로 GalNAc의 4번 위치 또는 6번 위치에서 모노설페이트화된 두 종류의 이당류 단위(각각 이당류 A 및 C로 명명됨)로 구성된다. 또한, CS 골격은 통상적으로 비-설페이트화 이당류를 소량으로 포함한다. GlcA의 2번 위치 및 GalNAc의 6번 위치(이당류 D), GlcA의 2번 위치 및 GalNAc의 4번 위치, 또는 GalNAc의 4번 및 6번 위치(이당류 E)와 같이, 다양한 위치에서 산소 원자를 통해 결합된 두 개의 설페이트기를 갖는 디설페이트화 이당류는, 특정 동물 기원(animal source)에 따라, 다양한 퍼센트로 CS 골격 내에 존재할 수 있다(Volpi N. J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009. Volpi N. J Pharm Sci 96, 3168, 2007. Volpi N. Curr Pharm Des 12, 639, 2006). GlcA의 3번 위치에서 설페이션의 존재는 가능하지만 극히 소량이다; 상기 존재는 육생 기원의 CS에서는 드물고, 해양 기원의 고도의 설페이트화(highly sulphated) 종류에서는 더 가능성이 있다(Fongmoon D et al. J Biol Chem 282, 36895, 2007).
CS의 반복 이당류 단위의 화학식은 다음과 같다:
Figure pat00001
식중 R2, R4 및 R6는 독립적으로 H 또는 SO3 -이다.
반복 이당류 단위의 카복실레이트기 및 설페이트기의 음전하는 통상적으로 나트륨 이온에 의해 중화된다.
다양하게 설페이트화된 이당류를 식별하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 약자의 의미가 하기에 기재된다:
디(Di)-0S (R2=H; R4=H; R6=H)
디-6S (C) (R2=H; R4=H; R6= SO3-)
디-4S (A) (R2=H; R4= SO3-; R6=H)
디-4,6디S (E) (R2=H; R4= SO3-; R6= SO3-)
디-2,6디S (D) (R2= SO3-; R4=H; R6= SO3-)
디-2,4디S (B) (R2= SO3-; R4= SO3-; R6=H)
디-2,4,6트리S (R2= SO3-; R4= SO3-; R6= SO3-)
또한, 상이한 동물 기원으로부터 유래된 CS 시료는 상이한 분자량 및 전하 밀도를 특징으로 하고, 후자의 파라미터는 특정 설페이트기와 직접 상관된다.
표 1은 여러 동물 종의 연골로부터 추출된 천연 CS에서 발견되는 주요 이당류를 나타낸다:
파라미터 소 CS 돼지 CS 닭 CS 상어 CS 홍어 CS 오징어 CS
Mn (kDa) 12-17 9-14 8-13 25-40 27-34 60-80
Mw (kDa) 20-26 14-20 16-21 50-70 50-70 80-120
다분산 지수 1.8-2.2 1.4-1.8 1.6-2.0 1.0-2.0 1.2-2.5 0.8-1.3
디-0S 6 6 8 3 3 13
디-6S 33 14 20 44 39 15
디-4S 61 80 72 32 43 50
디-2,6디S ND ND ND 18 13 0
디-4,6디S ND ND ND 2 1 22
디-2,4디S ND ND ND 1 1 0
전하 밀도 0.90-0.96 0.92-0.96 0.90-0.94 1.15-1.25 1.08-1.20 1.00-1.20
4S/6S
비율		 1.50-2.00 4.50-7.00 3.00-4.00 0.45-0.90 1.00-1.40 2.50-4.00
표 1 - Mn = 수치 평균 분자량; Mw = 중량 평균 분자량; 다분산 지수(polydispersity index) = Mw/Mn; 전하 밀도는 이당류 단위당 설페이트기의 개수이다; ND = 확인되지 않음.육생 동물로부터 유래된 다양한 종류의 CS는 유사한 분자 질량 파라미터 (Mn 및 Mw)를 갖는 반면, 이는 보다 큰 분자 질량 값을 갖는, 해양 종으로부터 유래된 CS와는 상이하다. 육생 기원의 CS는 14 내지 26 kDa의 평균 분자량 (Mw)를 갖는 반면, 오징어, 연골 어류 및 경골 어류로부터 수득된, 해양 기원의 CS는 50 kDa를 초과하는 분자량 (Mw)를 갖는다. 또한, 육생 CS 시료는 1.0 미만의 전하 밀도 (CD) 값을 특징으로 하는 반면, 해양 CS 시료는 항상 1.0을 초과하는 CD 값을 갖는다.
디설페이트화 이당류는 통상적으로 육생 CS에서 미량으로 존재하고, 해양 기원의 CS에서 더 풍부하다. 또한, 천연 CS에서는 유의적 양의 폴리설페이트화 이당류 (트리- 및 테트라-설페이트)가 관찰되지 않는다.
표 2에 나타난 바와 같이, 천연 CS는 또한 동일 종에서도 서로 다른 기관 및 조직 간에 차이를 보인다.
파라미터 소 연골 소 대동맥 철갑상어
골		 토끼 회장, 신장, 폐 및 골수 인간
혈소판		 인간
혈장
Mn (kDa) 12-17 ND 25-30 ND ND ND
Mw (kDa) 20-26 ND 35-40 ND ND ~ 15
다분산 지수 1.8-2.2 ND 1.05-1.5 ND ND ND
디-0S 6 0 7 ND 0 40-60
디-6S 33 95-100 55 ~ 100 미량
(Traces)		 1-5
디-4S 61 0-5 38 미량
(Traces)		 > 98 60-40
디-2,6디S ND 0 0 0 0 0
디-4,6디S ND 0 0 0 0 0
디-2,4디S ND 0 0 0 0 0
전하 밀도 0.90-0.96 0.98-1.02 0.90-0.95 0.98-1.02 0.98-1.02 0.40-0.60
4S/6S
비율		 1.50-2.00 < 0.1 0.40-0.90 < 0.1 > 45 10-50
표 2 - Mn = 수치 평균 분자량; Mw = 중량 평균 분자량; 다분산 지수 = Mw/Mn; 전하 밀도는 이당류 단위당 설페이트기의 개수이다; ND = 확인되지 않음.100% 6-설페이트 또는 4-설페이이트 이당류를 갖는 다당류 또는 올리고당류 CS의 사슬의 존재는 문헌에서 다양한 조직 및 기관에 대해 보고되었다(Sampaio L.O. et al. Biol. Chem. 256, 9205, 1981; Okayama E. et al. Blood 72,745, 1988; Ambrosius M. et al. J. Chrom. A 1201, 54, 2008; Volpi N. et al. Clin. Chim. Acta 370, 196, 2006).
분자량 및 전하 밀도의 측면에서 이러한 모든 특성은 천연 CS의 극단적 이질성(heterogeneity)을 보여준다; 그러나, CS가 "천연-유사"로 정의될 수 있는 파라미터가 식별될 수 있다. 해양 기원 CS의 전하 밀도와 유사한 전하 밀도를 갖고, 비정상적인 설페이션 패턴의 부재를 특징으로 하는 콘드로이틴 6-설페이트는 천연 글리코사미노글리칸과 구조적으로 유사하게 존재한다. 이것의 입증된 인 비보(in vivo) 항염증 활성은 천연-유사 CS의 정의에 대한 추가적인 뒷받침을 제공하고, 관절염 질환과 관련된 증상의 치료에서의 그의 용도를 뒷받침한다.
천연 종류와 유사한 CS를 생산하기 위해, CS의 구조와 부분적으로 유사한 구조를 갖는 다당류 전구체의 공급원으로 미생물을 사용하고, 그 후 화학적 설페이션을 사용하는, CS를 생산하는 생물공학적 방법을 찾기 위한 많은 시도가 이루어졌다.
일부 박테리아는 글리코사미노글리칸과 유사한 구조를 갖는 협막 다당류를 생산한다; 예를 들면, 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida)는 비-설페이트화 콘드로이틴과 동일한 다당류를 생산한다(De Angelis P.L., Carbohydrate Res., 337 (17), 1547, 2002). 그러나 O5:K4:H4 혈청형을 갖는 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli) 균주는 GlcA 단위의 3번 위치에 결합된 β-과당 잔기를 지닌 콘드로이틴 골격을 갖는 협막 다당류(다당류 K4)를 생산한다.
E. coli O5:K4:H4 유래의 협막 다당류 K4로 시작하여 생물공학적 CS를 생산하는 일례가 EP 1304338에 기술되어 있으며, 이 특허는 액체 배양으로 생산된 다당류 K4를 추출하고 정제한 후, 재용해시키고, 산 가수분해를 수행하여, 중합체의 GlcA 잔기에 결합된 과당 잔기를 제거하는 것인 방법을 개시한다. 그 후, CS의 비-설페이트화 골격(CH)과 동일한 탈과당화(defructosylated) 중합체는, 분자량 6 내지 25 kDa를 갖는 CS를 생산하기 위해, 다양한 화학적 합성 방법에 따라 GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에서 설페이트화된다. 그러나, EP 1304338에 개시된 생물공학적 CS는 그의 항염증 및 항관절염 활성이 전혀 평가되지 않았고, 관절염 및/또는 골 관절염의 치료에서의 그의 용도는 단지 가설로 남아있다. 이것은 EP 1304338에 개시된 다당류의 70%만이 명확하게 천연 콘드로이틴 설페이트 구조를 갖고, 나머지 30%는 주로 비-설페이트화 콘드로이틴 (CH)이라는 점에서 특히 중요하다. 또한, 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 올리고당류는 고려되지 않는다.
최근 문헌 (Bedini E et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2011)은, 생산된 다당류 K4를 동일 사슬 내 GalNAc 잔기의 4번 위치 및/또는 6번 위치에서 설페이트화하는 것인 방법을 기술한다. 또 다시, 기술된 생물공학적 CS는 항염증 또는 항관절염 활성이 평가되지 않았고, 관절염 및/또는 골관절염에서의 치료 및 예방, 및 관련된 염증 과정에서의 그의 용도에 대해서는 평가되지 않았다. 동일한 저자는 합성 과정 중 히드록실기의 낮은 보호에 기인한 GlcA의 C3에서 히드록실기의 비정상적인 설페이션을 생산하는 것인, 이들의 합성 방법에서 유래된 생물공학적 CS의 사슬에 대한 구조적 변형의 존재를 가정한다. 이러한 이상(anomaly)은 GlcA 중 상기 CS 3-설페이트화가 오염물로서 존재하는 헤파린의 정맥 내 투여 후에 인간에서 심각한 독성을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이러한 독성이 CS의 경구 투여와 관련하여 관찰된 적은 없지만, 이러한 종류의 비정상적인 설페이션으로 인한 독성 효과의 위험은 남아있다; 이것은 또한 동일한 저자의 또 다른 최근 문헌에서도 나타난다(Bedini E. et al. Chem. J. 2012 [발간 전 인터넷 공개]).
또한 Bedini 등 (Angew Chem Int Ed Engl. 2011) 에 의해 기술된 생물공학적 CS는 약 17 kDa의 분자량을 가지므로, 잠재적으로 추출 기원 천연 산물의 낮은 생체이용률을 보인다. 모든 이러한 이유로, Bedini 등에 의해 기술된 생물공학적 CS는 관절염 및/또는 골관절염의 치료 및 예방에 사용될 가능성이 낮다.
관절염의 치료에 사용되기 위한 CS의 저분자량 종류의 예는 존재하지만 (Cho SY et al. Biol. Pharm. Bull. 27, 47, 2004, Das A. et al. Osteoart. Cartil. 8, 343, 2000), 이들은 모두 동물 기원 CS의 탈중합화에 의해 수득된 것이고, 이것은 바이러스, 프리온 및 그외 전염되는 감염원(infectious agent)의 존재를 배제할 수 없다는 것을 의미한다.
생물공학적 기법에 의해 수득된 비-설페이트화 콘드로이틴 골격의 화학적 설페이션 및 뒤이은 탈중합화에 의해 생산된, 1000 내지 5000 달톤, 또는 바람직하게는 2000 내지 4000 달톤의 저분자량을 갖는 콘드로이틴 설페이트 (CS)가 천연 CS의 항염증 활성과 유사한 항염증 활성, 개선된 생체이용률 및 선호되는 안전성 프로파일(profile)을 갖는다는 것이 이제 밝혀졌다. 개시된 CS는 주로 6번 위치에서 실질적으로 모노설페이트화되고, 4번 위치에서의 설페이션은 거의 없고, 천연 CS와 유사한 모노/디설페이트화 이당류 비율 및 전하 밀도를 갖는다.
본 발명에 따른 CS는 천연 CS, 보다 구체적으로, 해양 기원의 CS의 모든 특징을 나타낸다. 이것은 유사한 모노- 및 디- 설페이트화 이당류의 상대적 퍼센트, 유사한 디설페이트화 이당류의 분포 및 그의 결과로 낮은 4-설페이트/6-설페이트 비율과 관련된 유사한 전하 밀도 (CD)를 갖는다.
본 발명에 따른 생물공학적 CS는 또한 다음의 특별한 특징을 갖는다: 매우 낮은 분자량(1000 내지 5000 달톤, 바람직하게는 2000 내지 4000 달톤); 특히 6-설페이트화 이당류의 높은 퍼센트; 트리-설페이트화 이당류의 거의 완전한 부재; GlcA 잔기의 3번 위치에서의 설페이션의 실질적인 부재. 특히, GlcA의 3번 위치에서의 트리-설페이트화 이당류 및 설페이트화 이당류의 존재는 공지된 종류의 합성 CS의 특징이고, 종종 이들의 치료적 적용에서 부작용을 일으킨다.
표 3은 본 발명에 따른 생물공학적 콘드로이틴 6-설페이트의 생리화학적 특징을 나타낸다.
생물공학적 CS의 생리학적 특성
분자 질량(MWw) 1000 - 5000 Da
이당류:
△디-0S < 15%
△디-6S ≥ 65%
△디-4S < 1%
△디-2,6디S < 20%
△디-4,6디S < 5%
△디-2,4디S < 1%
전하 밀도 1 - 1.25
4S/6S 비율 < 0.1
본 발명의 특정 측면에 따라서, C6S는 공지된 기법(Rodriguez and Jann, Eur.J.Biochem. 117, 117-124, FEBS 1988)에 따른 열산 가수분해(thermoacid hydrolysis)에 의해 미리 탈과당화된, E.coli 균주 O5:K4:H4 (WO 01/02597)로부터 자연적으로 생산된 협막 다당류 K4 또는 비-설페이트화 콘드로이틴의 구조를 갖는 다른 다당류에 적용된 PCT/EP2011/058297에 개시되어 있는 화학적 합성 방법에 의해 수득된 것일 수 있다. 대안적으로, 출발 물질 비-설페이트 콘드로이틴 (CH)은 K4의 과당화(fructosylation)를 일으키는 KfoE 유전자에 유도된 돌연변이에 의해 천연 비-설페이트 CH와 동일한 다당류를 생산하는, WO 2012004063에 개시된 E. coli 균주 DSM23644의 배양으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라서, 다당류에 화학적 설페이션이 수행되고, 바람직하게는 PCT/EP2011/058297에 개시된 방법에 따라 수행된다. 요약하면, 이당류 단위의 설페이션을 일으키는 합성 방법은 다음과 같다:
a) 다당류 K4의 탈과당화로 수득된, 암모늄염, 또는 알칼리 금속염, 및 특히 나트륨염, 또는 칼륨염, 또는 리튬염으로서 분리된 비설페이트화 콘드로이틴을 양이온-교환 레진(resin) 상에서 탈염화시키고, pH 7 내지 7.5까지 화학량적인(stoichiometric) 양으로 첨가된 알킬암모늄 수산화(hydroxide)기, 바람직하게는 테트라부틸암모늄 수산화물로 재염화시키고, 및 동결-건조 또는 분무-건조로 건조시킨다.
b) 단계 a)에 개시된 테트라부틸암모늄 CH 염을 교반하에서 극성 비양자성 용매(polar aprotic solvent), 바람직하게는 디메틸포름아마이드(dimethylformamide) (DMF)로 구성된 용액에 첨가하고, 0 내지 30℃ 온도에서 유지시킨다; 이후, 설페이트화 복합체(sulphating complex)를 CH에 2 내지 5의 몰 비율로 첨가하고, 일정한 온도에서 유지하고 교반한다.
c) 마지막으로, 용매를 증발시키기 위해 65℃로 온도를 증가시키는 동시에, 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)을 화학량적인 몰 비율로 또는 과량으로, 설페이트화제(sulphating agent)에 첨가한다. 이후, 물을 첨가한 다음에 재증류한다. 최종 용액을 한외여과시키고 투석한다. 마지막으로, CS 나트륨염을 여과시키고 10% 미만의 잔류 습도(residual humidity)까지 진공하에서 건조시킨다.
이후, 수득된 CS의 분자 치수(molecular dimension)를 요구되는 분자량 분포를 수득하기 위해 탈중합화 과정을 제어하는, 공지의 라디칼 탈중합화(Volpi N. et al., Carb. Res., 279, 193-200, 1995) 또는 산 탈중합화 기법에 따라서 수행된 탈중합화 과정에 의해 감소시킨다.
산 탈중합화는 물 중 CS를 재현탁(resuspending)하고, 1M 농도까지의 염산의 첨가로 용액을 산성화하고, 및 60℃로 가열함으로써 수행한다.
탈중합화에 의해 생성된 올리고당류의 분자량은 짧은 간격으로 용액의 샘플을 채취하고, 연속적으로 각각 300 Å 및 150 Å의 두 개의 5㎛ 아질런트 바이오 시리즈 SECⓒ-5(Agilent Bio Series SECⓒ-5) (친수성 중성 폴리머 단일층) (hydrophilic neutral polymeric monolayer)에서 수행된 SEC-HPLC 분석으로 올리고당류의 분자량을 결정하여 계산한다. 반응은 원하는 분자 질량 값에 도달하였을 때, pH를 6 내지 8로 조정하기 위하여 NaOH 또는 중탄산나트륨으로 중화시키는 것에 의해 중단시킨다.
대안적으로, 탈중합화는 상기 개시된 바와 같이 결과적으로 수득되는 올리고당의 최종 분자량을 제어하는, 라디칼 가수분해에 의해 수득될 수 있다.
CS를 물 중 재현탁되고, CS 용액의 산성화 또는 염기화가 필요한지 여부에 따라, 10% 염산 또는 수산화나트륨 용액을 첨가함으로써 pH를 7.5로 교정시킨다. 9% 과산화수소(H2O2)를 60℃로 유지하고, 용액에 첨가한다. 원하는 분자량에 도달하였는지 여부를 확인하기 위해 SEC-HPLC를 상기 개시된 바와 같이 수행한다. 반응은 상온(20 내지 25℃)으로 용액을 냉각시키고, pH를 6.0으로 낮춤으로써 중단시킨다.
표 4는 탈중합화의 종료까지 반응 단계 동안 SEC-HPLC로 분석된 올리고당류의 전형적인 분자량 값을 나타낸다.
시간
(분)		 MWw (kDa) 다분산
지수		 상대적인 MWw
(초기 값의 %)
0 77.3 0.2 100.0
60 73.6 0.2 95.3
120 81.9 0.2 106.0
180 76.3 0.3 98.7
330 45.7 0.4 59.1
390 39.7 0.4 51.4
510 28.6 0.5 37.0
660 25.5 0.6 33.0
780 20.5 0.6 26.5
840 18.7 0.6 24.2
900 18.1 0.6 23.4
1020 14.0 0.6 18.1
1200 10.2 0.6 13.2
1440 3.7 0.6 9.96
본 발명에 따른 C6S는 또한 E . coli 균주 O5:K4:H4의 발효로부터 유래한 다당류 K4의 저분자량 분획물을 기질로써 사용하는, 전술된 절차에 따른 화학적 설페이션에 의해 수득될 수 있다. 이 경우에, 배양액(culture broth)을 발효의 종료시에 미생물을 불활성화시키기 위해 60분 동안 80℃로 가열함으로써 처리하고, 그 후 EP 1304338에서와 같이 원심분리하고 한외여과시킨다; 그 후 결과적으로 수득된 상등액을 겔-여과 컬럼에 적재하고, 및 분획물을 수집하며, 공지의 기법으로 각각의 우론 산 함량을 확인한다. 우론산 테스트에 대해 양성으로 테스트되는 분획물을 조합함으로써, 두 개의 개별적인 풀(pool)을 분리할 수 있다: 공지된 다당류와 일치하는, 고분자량 K4 (40 내지 70 kDA)을 함유하고 양적으로 총 당류의 80%에 해당하는 제1 풀, 및 용리 부피(elution volume)에 기초하여 제1 풀과 명백하게 분리되고, 약 1500 내지 6000 달톤의 평균 값의 저분산을 갖는 저분자량 K4를 함유하는 제2 풀. K4를 갖는 상기 제2 저분자량 풀에 함유된 올리고당류의 실체(identity)는 우론산 어세이 및 이당류 단위의 출현을 수반한, 콘드로이티나아제(chondroitinase) ABC에 의한 소화성(digestibility)에 대한 동시 양성 반응으로 증명된다. 그 후, 양적으로 20%의 총 당류를 나타내는 상기 올리고당류 K4의 분획물에 1000 내지 5000 달톤 범위의 최종 분자량을 갖는 CS가 수득될 때까지, PCT/EP2011/058297에 개시된 탈과당화 및 화학적 설페이션 과정을 수행한다.
대안적으로, 저분자량 생물공학적 C6S는, WO 2012004063에 개시된 E. coli 균주 DSM23644의 발효로부터 회수된 자연적으로 탈과당화된 올리고당류 K4-d의 저분자량 분획물의 설페이션을 포함하는, 전술된 것과 유사한 방법으로 수득될 수 있다.
그에 의해 수득된 저분자량 C6S를 랫트의 실험 동물 관절염 모델(아쥬반트 관절염 : AA)에서 효능에 대해 평가하였고, 얻어진 결과를 매일 900 mg/kg으로 경구 처리 후에, 동일한 실험 모델(Bauerova K. et al., Osteoarthritis Cartilage 19, 1373, 2011)에서 사용된 추출 기원(extractive origin)의 약학적 등급의 천연 CS에 관한 것과 비교하였다.
AA는 불완전한 프로인드 아쥬반트(Freund's adjuvant) 중 마이코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)의 단일 피내 주사로 유도되었다. 실험은 하나의 건강한 동물군(HC), 하나의 미처리 관절염 동물군(AC) 및 두 개의 상이한 요법으로 처리된 두 개의 관절염 동물군을 포함하였다. 제1 치료 요법은 관절염이 유도되기 전에 14일 동안, 연속하여 AA 유도 후에 28일 동안 1일 1회 900 mg/kg의 생물공학적 C6S의 투여로 구성된 전 처리를 포함하였다(PT). 제2 치료 요법은 AA 유도 후에 28일 동안만 1일 1회 900 mg/kg의 생물공학적 C6S의 투여를 포함하였다(T).
미처리 관절염 동물 (AC)에서 랫트 체중의 생리학적 증가는 매우 낮아서 실험의 종료시 건강한 대조군의 체중 증가의 약 40%에 해당했다. 생물공학적 C6S의 전처리(PT 군)는 이러한 감소를 제한시켰다: 체중 증가는 건강한 대조군의 체중 증가의 약 73%에 해당했다. 또한, 처리 단독(T)은 비록 더 낮은 정도(건강한 대조군과 비교하여 약 54%의 증가)라 하더라도 체중 회복에 효과적인 것으로 입증되었다(도 1). 이것은 전신적 수준에서의 저분자량 생물공학적 C6S의 항염증 역할에 기인한다. 이러한 동물의 체중의 증가에 대한 효과는 동일한 용량으로 소 유래의 고분자량 CS로 수행된, Bauerova 등 (Bauerova K. Et al., Osteoarthritis Cartilage 19, 1373, 2011)에 의한 실험에서 발견된 것보다 더 큰 것이다. 이러한 발견은 본 발명에 따른 생물공학적 C6S의 더 큰 장 흡수를 확인한다.
관절염의 중증도는 발의 종창(부종)의 증가 수준에 기초하여 정량화하였다; 뒷 발바닥에 발생된 부종은 전처리 동물(PT)에서 유의적으로 감소하였다(도 2). 생물공학적 C6S에 의한 전처리는 미처리 대조군과 비교하여 실험 내내 유의적으로 부종을 감소시켰다(도 3).
전처리는 또한 관절주위 홍반, 발생된 부종 및 꼬리 끝부분의 아쥬반트 주입 부위에서의 가피의 직경을 포함하는 임상적 요소의 세트를 고려하는 파라미터인 총 관절염 점수(total arthritis score)의 감소에 효과적임이 입증되었다. 관절염 평가 스케일(scale)은 6 내지 31의 점수를 할당한다; 정상 대조군(HC)에서의 12 대비, 관절염 대조군(AC)은 23의 값을 얻은 반면, PT군은 19의 값에 도달하였다(도 4). 또한, 전처리는 AA 유도 후의 1일차부터 28일차인, 아급성기(subacute phase) 내내 효과적인 것으로 입증되었다(도 5). 처리 단독군(T)은 실험 기간 동안 관절염 점수에 유의적으로 영향을 주지 않았다.
본 발명에 따른 C6S는 또한 세포 수준에서 그의 잠재적인 유전 독성(genotoxicity) 및 랫트에서 급성 경구 독성을 평가하기 위해 설계된 다양한 프로토콜에 따라 동물 및 세 포 배양물에서 그의 독성학적 안전성에 대해 시험되었다. 모든 사용된 시험은 의약품에 대한 OECD 가이드라인에 따라서 검증되고 수행되었다.
생물공학적 C6S에 대해 E. coli 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 영양요구성 균주에서의 역 돌연변이체 (reverse mutant)의 출현을 유도하는 물질의 능력을 시험하는, 세균 세포(세균 역 돌연변이체, Ref. OECD 471)에서의 돌연변이 유발성 시험(mutagenesis test)을 수행하였다.
생물공학적 C6S의 유전 독성을 또한 진핵 세포 배양물에 대한 다른 두 개의 시험, 즉, 중국 햄스터 난소 세포(OECD Ref. 473)에서의 인 비트로(in vitro) 염색체 이상(chromosome aberration) 시험 및 마우스 림프종 세포(L5178Y TK+/+ 에서 변이된 마우스 림프종 세포, Prot. OECD 476)에 대한 돌연변이 유발성 시험(mutagenicity test)으로 조사하였다. 두 실험에서 사용된 가장 높은 C6S 농도(각각 5000 ㎍/plate 및 5000 ㎍/ml)까지 유전적 독성의 유의적인 증가가 발견되지 않았다.
마지막으로, 경구 투여 후의 급성 독성은 체중 kg 당 2000 mg의 용량까지 스프래그-다우리 랫트(Sprague-Dawley rat)에서 조사하였다. 투여 후 14일 동안 지속적인 관찰 후에, 랫트는 어떠한 고통의 임상적 징후를 나타내지 않았고, 폐사도 발생하지 않았다. 또한, 실험의 마지막에 수행된 부검에서 검진된 조직 및 기관에서 어떠한 독성의 징후도 나타나지 않았다.
제안된 치료적 또는 건강 용도에 있어서, 본 발명에 따른 C6S는 아마도 글루코사민 염산염(glucosamine hydrochloride), 글루코사민 설페이트, N-아세틸-글루코사민, 히알루론산, 아미노산, 콜라겐, 가수분해된 콜라겐, 다가불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid), 케라틴(keratin), 데르마틴(dermatin), 메틸-설포닐메탄(methyl-sulphonylmethane) (MSM), 엽산염, 환원된 엽산염(reduced folate), 비타민, 비타민 B 그룹, S-아데노실메티오닌(S-adenosylmethionine) (SAM), 아스코르브산 또는 아스코르브산 망간염과 같은 다른 활성 성분과 조합되어, 의약, 식이 보충제(diet supplement) 또는 식품 첨가제의 활성 성분으로 이용될 것이다.
본 발명에 따른 제형의 예는 캡슐, 연질 겔 캡슐, 정제, 액체 형태의 드링크제, 또는 재구성될(reconsituted) 분말 드링크제의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 C6S의 용량은 100 내지 3000 mg/일, 바람직하게는 1000 내지 2000 mg/일, 더욱 바람직하게는 1250 내지 1750 mg/일일 것이다.
도 1: 아쥬반트 관절염(Adjuvant Arthritis) (AA)을 앓는 랫트의 저분자량 생물공학적 C6S 처리 후 체중 증가. 기호 설명: HC, 건강한 대조군; AC, 관절염 대조군; T, C6S 처리군(0 내지 28일); PT, C6S 전처리군(-14 내지 28일). 값은 g±SEM으로 표현됨.
도 2: 아쥬반트 관절염을 앓는 랫트의 뒷발에서 저분자량 생물공학적 C6S 처리 후 부종의 평가. 기호 설명: HC, 건강한 대조군; AC, 관절염 대조군; T, C6S 처리군(0 내지 28일); PT, C6S 전처리군(-14 내지 28일). 퍼센트 증가: 부피(ml) 증가에 따른 결과 측정, 퍼센트의 계산:[(Dayn/Day0) X 100] - 100. 값은 %±SEM으로 표현됨.
도 3: 아쥬반트 관절염을 앓는 랫트에서 저분자량 생물공학적 C6S 처리 후 실험 동안 부종성 상태의 경과. 기호 설명: HC, 건강한 대조군; AC, 관절염 대조군; T, C6S 처리군(0 내지 28일); PT, C6S 전처리군(-14 내지 28일). AA 유도 후의 0, 7, 14, 21 및 28일째 부피 증가 퍼센트. 값은 %로 표현됨.
도 4: 아쥬반트 관절염을 앓는 랫트에서 저분자량 생물공학적 C6S 처리 후 관절염 점수. 기호 설명: HC, 건강한 대조군; AC, 관절염 대조군; T, C6S 처리군(0 내지 28일); PT, C6S 전처리군(-14 내지 28일). 점수: 관절 주위 종창 및 앞 발바닥의 홍반 (1 - 5), 관절 주위 종창 및 뒷 발바닥의 홍반 (1 - 8), 꼬리 끝부분(base of tail) 가피(scab)의 직경 (1 - 5). 값은 단위(unit)±SEM으로 표현됨.
도 5: 아쥬반트 관절염을 앓는 랫트에서 저분자량 생물공학적 C6S 처리 후 실험 중 관절염 점수의 경과. 기호 설명: HC, 건강한 대조군; AC, 관절염 대조군; T, C6S 처리군(0 내지 28일); PT, C6S 전처리군(-14 내지 28일). AA 유도 후 0, 7, 14, 21 및 28일차 점수 평가. 값은 단위(unit)로 표현됨.
본 발명은 이제 하기의 실시예에 의해 더욱 자세히 설명될 것이다.
실시예 1: 랫트에서의 관절염( 아쥬반트 관절염, AA)의 유도 및 저분자량 생물공학적 C6S에 의한 처리
150 내지 190 g의 체중을 갖는 40 마리의 수컷 루이스 랫트(Lewis rat)를 무작위로 10마리씩 4개의 군으로 나누고, 22 ± 2℃의 온도로 유지된 환경에서 폴리프로필렌 케이지에 수용하고, 물에 대해 제한되지 않은 접근과 함께 표준 실험 식이를 급여하였다.
실험군은 다음과 같다:
1) 미처리 건강한 대조군(HC).
2) 아쥬반트-유도된 관절염을 갖는 미처리 대조군(AC).
3) AA의 유도 후에 28일 동안(실험의 0 내지 28일차) 체중 kg 당 900 mg/일의 용량으로 생물공학적 C6S로 경구로 처리된 관절염 랫트 군(T).
4) AA의 유도 전에 14일 동안 및 AA의 유도 후에 28일 동안(실험의 -14 내지 28일차) 체중 kg 당 900 mg/일의 용량으로 생물공학적 C6S로 경구로 전처리된 군(PT).
관절염은 불완전한 프로인드 아쥬반트 중 열에 의해 불활성화된 마이코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)으로 구성된 1 ml의 혼합물의 꼬리 끝부분에의 단일 피내 주사로 0일차에 유도하였다.
본 발명의 C6S를 20 mg/ml의 농도로 증류수에 용해하고, 위관영양법(gavage)으로 단일 일일 용량으로 경구 투여하였다.
실시예 2: 체중의 모니터링에 의한, 생물공학적 C6S가 랫트 AA의 평가에 미치는 효과
랫트의 체중을 AA 유도 전(0 일차), 7, 14, 및 21 일차, 및 처리의 종료시(28일차)에 측정하였다. 이 파라미터에 대한 처리의 효과는 처리기간 동안 서로 상이한군의 체중 증가를 비교함으로써 평가하였다.
확인된 값이 표 5에 보고된다:
체중 변화: △ ( day n - day 0 )
일 ( day n ) 0 7 14 21 28
건강한 대조군 (HC) 0.0 98.19 120.93 135.37 148.33
SEM 0.0 1.76 2.01 1.99 2.47
관절염 대조군 (AC) 0.0 74.73 76.77 51.93 57.57
SEM 0.0 4.06 7.02 6.05 5.71
저분자량-C6S 처리군 (T) 0.0 85.19 89.19 68.39 79.78
SEM 0.0 3.03 5.63 7.52 8.86
저분자량-C6S 전처리군(PT) 0.0 92.96 107.26 93.39 108.63
SEM 0.0 2.94 6.48 8.65 8.29
SEM: 평균의 표준 오차 실시예 3: 발생된 부종의 모니터링에 의한, 생물공학적 C6S가 랫트 AA의 평가에 미치는 효과
관절염의 결과로 발생된 부종을 측정에 적합한 캘리퍼(caliper)로 뒷 발바닥의 부피의 증가를 관찰함으로써 측정하였다. 측정은 AA 유도 전(0 일차), 실험의 7, 14, 및 21 일차에 수행하였다.
데이터는 다음의 식으로 계산된 부종의 퍼센트 증가로 표현하였다:[(Dayn/Day0) X 100] - 100, Day0은 최초 일에 측정된 값, Dayn은 해당일에 측정된 값.
확인된 값이 표 6에 보고된다:
뒷 발바닥 종창 변화: [( Day n / Day 0 ) × 100] - 100 ( % )
일 ( day n ) 0 7 14 21 28
건강한 대조군 (HC) 0.0 17.6 19.3 24.8 29.1
SEM 0.0 1.5 1.4 1.8 2.0
관절염 대조군 (AC) 0.0 8.6 31.0 56.7 59.3
SEM 0.0 1.2 4.6 6.5 6.1
저분자량-C6S 처리군 (T) 0.0 13.1 34.5 62.8 61.4
SEM 0.0 1.0 6.4 8.1 7.1
저분자량-C6S 전처리군 (PT) 0.0 15.4 26.7 46.5 49.7
SEM 0.0 1.5 4.9 6.9 7.1
SEM: 평균의 표준 오차 실시예 4: 관절염 점수의 모니터링에 의한, 생물공학적 C6S가 랫트 AA의 평가에 미치는 효과
관절염 점수는 발 관절 종창(부종)의 관찰, 관절 주위 홍반의 정도 및 꼬리 끝부분의 아쥬반트 주사 부위에서의 가피의 직경에 대한 점수를 할당함으로써 평가하였다. 관절염 점수 및 관절 조영(arthrogram)은 부종(ml, 1 내지 8 점)과 앞 발바닥의 직경(mm, 최대 1 내지 5 점) 및 척추와 평행하게 측정된 마이크로박테리움 부티리쿰의 적용 부위에서의 가피의 직경(mm, 최대 1 내지 5 점)의 총 합으로 각각의 동물에 대해 측정하였다.
확인된 값이 표 7에 보고된다:
관절염 점수
일 ( day n ) 0 7 14 21 28
건강한 대조군 (HC) 10.0 10.0 10.2 11.4 12.0
SEM 0.0 0.0 0.1 0.3 0.0
관절염 대조군 (AC) 10.0 11.0 16.9 22.4 23.2
SEM 0.0 0.4 1.2 1.4 1.3
저분자량-C6S 처리군 (T) 10.0 10.0 18.1 22.7 23.0
SEM 0.0 0.0 1.7 1.9 1.3
저분자량-C6S 전처리군 (PT) 10.0 10.1 13.1 15.8 19.0
SEM 0.0 0.1 0.8 1.3 1.7
SEM: 평균의 표준 오차

Claims (18)

  1. 65% 이상의 6-모노설페이트 이당류 (6-monosulphate disaccharide);
    1% 미만의 4-모노설페이트 이당류;
    20% 이하의 2,6-디설페이트 이당류;
    5% 미만의 4,6-디설페이트 이당류;
    1% 미만의 2,4-디설페이트 이당류;
    1% 미만의 트리설페이트화 이당류;
    15% 미만의 비-설페이트화(non-sulphated) 이당류;
    1 내지 1.25 범위의 전하 밀도(charge density) 값; 및
    1.1 내지 1.3 범위의 다분산 지수를 포함하는, 생물공학적 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate).
  2. 청구항 1에 있어서, 분자량 (Mw)이 1000 내지 5000 달톤의 범위인 것인 콘드로이틴 설페이트.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 콘드로이틴 설페이트가 저분자량 콘드로이틴 또는 발효로부터 획득되는 협막 다당류 K4-d의 화학적 설페이션(sulfation)에 의해 얻어지는 것인 콘드로이틴 설페이트.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 콘드로이틴은 가수 분해에 의한 E. coli의 다당류 K4의 과당 잔기의 제거에 의해 수득되는 것인 콘드로이틴 설페이트.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 저분자량 콘드로이틴은 다당류 K4의 산 또는 라디칼 탈중합화에 의해 수득되는 것인 콘드로이틴 설페이트.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 저분자량 콘드로이틴은 다당류 K4-d의 산 또는 라디칼 탈중합화에 의해 수득되는 것인 콘드로이틴 설페이트.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 콘드로이틴 설페이트는 E. coli 균주 DSM23644로부터 생산되는, 본래 과당 잔기가 없는 협막 다당류(K4-d)의 산 또는 라디칼 탈중합화에 의해 수득되는 것인 콘드로이틴 설페이트.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 콘드로이틴 설페이트는 E. coli 균주 DSM23644로부터 생산되는, 본래 과당 잔기가 없는 협막 다당류(K4-d)의 저분자량 분획의 화학적 설페이션에 의해 수득되는 것인 콘드로이틴 설페이트.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 다당류 K4-d로부터 과당의 제거 및 탈중합화는 단일 원팟 단계로 얻어지는 것인 콘드로이틴 설페이트.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 다당류 K4-d로부터 과당의 제거 및 탈중합화는 단일 원팟 단계로 얻어지는 것인 콘드로이틴 설페이트.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 다당류 K4-d로부터 과당의 제거 및 탈중합화는 단일 원팟 단계로 얻어지는 것인 콘드로이틴 설페이트.
  12. 청구항 5에 있어서, 상기 다당류 K4-d로부터 과당의 제거 및 탈중합화는 단일 원팟 단계로 얻어지는 것인 콘드로이틴 설페이트.
  13. 청구항 4에 있어서, 상기 다당류 K4-d로부터 과당의 제거 및 탈중합화는 단일 원팟 단계로 얻어지는 것인 콘드로이틴 설페이트.
  14. 청구항 1의 콘드로이틴 설페이트, 및 약학적으로 또는 기능성 식품으로(nutraceutically) 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 급성 또는 만성 염증성 상태의 예방 또는 치료용인 것인 약학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 염증성 상태는 골관절염인 것인 약학적 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 콘드로이틴 설페이트는 150 mg 내지 600 mg의 일일 투여량으로 투여되는 것인 약학적 조성물.
  18. 청구항 14에 있어서, 근골격 건강의 보존을 위한 것인 약학적 조성물.
KR1020207000570A 2012-05-22 2013-05-22 골관절염의 예방을 위한 저분자량 생물공학적 콘드로이틴 6-설페이트 KR20200006625A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT000880A ITMI20120880A1 (it) 2012-05-22 2012-05-22 Condroitin 6-solfato biotecnologico a basso peso molecolare dotato di attivita' antiinfiammatoria e antiartritica e suo uso nel trattamento e nella prevenzione dell'osteoartrite
ITMI2012A000880 2012-05-22
PCT/EP2013/060471 WO2013174847A1 (en) 2012-05-22 2013-05-22 Low -molecular -weight biotechnological chondroitin 6 - sulphate for prevention of osteoarthritis

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147032617A Division KR20150013565A (ko) 2012-05-22 2013-05-22 골관절염의 예방을 위한 저분자량 생물공학적 콘드로이틴 6-설페이트

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200006625A true KR20200006625A (ko) 2020-01-20

Family

ID=46582917

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207000570A KR20200006625A (ko) 2012-05-22 2013-05-22 골관절염의 예방을 위한 저분자량 생물공학적 콘드로이틴 6-설페이트
KR1020147032617A KR20150013565A (ko) 2012-05-22 2013-05-22 골관절염의 예방을 위한 저분자량 생물공학적 콘드로이틴 6-설페이트

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147032617A KR20150013565A (ko) 2012-05-22 2013-05-22 골관절염의 예방을 위한 저분자량 생물공학적 콘드로이틴 6-설페이트

Country Status (25)

Country Link
US (2) US20150152198A1 (ko)
EP (1) EP2852437B1 (ko)
JP (1) JP6273264B2 (ko)
KR (2) KR20200006625A (ko)
CN (1) CN104411363B (ko)
AU (1) AU2013265350B2 (ko)
BR (1) BR112014028904B1 (ko)
CA (1) CA2874216C (ko)
CY (1) CY1117636T1 (ko)
DK (1) DK2852437T3 (ko)
EA (1) EA032748B8 (ko)
ES (1) ES2571583T3 (ko)
GE (1) GEP201606585B (ko)
HR (1) HRP20160773T1 (ko)
HU (1) HUE030224T2 (ko)
IL (1) IL235803B (ko)
IN (1) IN2014DN09832A (ko)
IT (1) ITMI20120880A1 (ko)
MX (1) MX368965B (ko)
PH (1) PH12014502444B1 (ko)
PL (1) PL2852437T3 (ko)
SI (1) SI2852437T1 (ko)
UA (1) UA113005C2 (ko)
WO (1) WO2013174847A1 (ko)
ZA (1) ZA201408536B (ko)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITMI20130117A1 (it) 2013-01-25 2014-07-26 Gnosis Spa Composizioni comprendenti condroitin solfato, enzimi proteolitici e composti sulfidrilati capaci di migliorare la biodisponibilita' del condroitin solfato
JP2016138062A (ja) * 2015-01-28 2016-08-04 一丸ファルコス株式会社 特定分子結合単位が分子内の末端部位に存在する高分子糖鎖化合物とその利用
JP2016138061A (ja) * 2015-01-28 2016-08-04 一丸ファルコス株式会社 特定分子結合単位が分子内の末端部位に存在する高分子糖鎖化合物とその利用
KR102231289B1 (ko) 2018-12-26 2021-03-23 (주)휴온스 고함량 콘드로이틴설페이트 약학 제제 및 이의 제조방법
WO2020219497A1 (en) * 2019-04-25 2020-10-29 The University Of Massachusetts Compositions and methods for treatment of angiogenesis related diseases
WO2021179319A1 (zh) * 2020-03-13 2021-09-16 南京汉欣医药科技有限公司 一种含水解硫酸软骨素的用于防治骨关节病的组合物
KR20220091552A (ko) * 2019-11-01 2022-06-30 난징 레탑 바이오테크놀로지 컴퍼니, 리미티드 저분자량 콘드로이틴 술페이트, 이를 함유하는 조성물, 및 이의 제조 방법 및 이의 용도
CN111234048A (zh) * 2020-03-09 2020-06-05 河北农业大学 鳐鱼硫酸软骨素的降解产物及其降解方法
IT202000013633A1 (it) 2020-06-08 2021-12-08 Vivatis Pharma Gmbh Processo di estrazione di una condroitina solfato da un fungo, una condroitina solfato di origine vegetale e suo uso
IT202000013618A1 (it) 2020-06-08 2021-12-08 Vivatis Pharma Gmbh Processo di estrazione di un acido ialuronico da un fungo, un acido ialuronico di origine vegetale e suo uso
IT202100030935A1 (it) 2021-12-09 2023-06-09 Fidia Farm Spa Compresse comprendenti condroitin solfato, glucosamina cloridrato e vitamina c per il trattamento di danni cartilaginei, tendinei, ossei
CN115895987B (zh) * 2022-08-02 2024-02-13 衢州益康园生物科技有限公司 一种提高果糖软骨素产量的重组菌株及其构建方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITMI991465A1 (it) 1999-07-02 2001-01-02 Inalco Spa Processo per la preparazione dei polisaccaridi k4 e k5 da escherichiacoli
ITMI20012200A1 (it) * 2001-10-22 2003-04-22 Ibsa Inst Biochimique Sa Processo per la preparazione di condroitin solfati dal polisaccaride k4 e prodotti ottenuti
WO2005110438A2 (en) * 2004-04-15 2005-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to the intracellular delivery of polysaccharides
KR100706294B1 (ko) * 2005-03-18 2007-04-11 한국식품연구원 연골어류의 연골로부터 얻은 저분자 콘드로이틴 황산 및 이의 제조방법
WO2009044765A1 (ja) * 2007-10-01 2009-04-09 Seikagaku Corporation 新規な低分子化コンドロイチン硫酸およびその用途
US9109243B2 (en) * 2008-06-04 2015-08-18 Amano Enzyme Usa, Ltd. Microbial-derived chondroitin sulfate
AU2011275996B2 (en) * 2010-07-09 2015-03-26 Gnosis S.P.A. Biotechnological production of chondroitin
US8664196B2 (en) * 2011-05-20 2014-03-04 Gnosis S.P.A. Shark-like chondroitin sulphate and process for the preparation thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CY1117636T1 (el) 2017-04-26
CN104411363B (zh) 2017-09-08
ES2571583T3 (es) 2016-05-26
MX2014014115A (es) 2015-02-24
HUE030224T2 (en) 2017-04-28
IL235803B (en) 2019-11-28
HRP20160773T1 (hr) 2016-09-23
BR112014028904B1 (pt) 2022-09-20
WO2013174847A1 (en) 2013-11-28
EA032748B1 (ru) 2019-07-31
ITMI20120880A1 (it) 2013-11-23
PH12014502444A1 (en) 2015-01-12
AU2013265350A1 (en) 2014-12-11
KR20150013565A (ko) 2015-02-05
EA201491919A1 (ru) 2015-05-29
GEP201606585B (en) 2016-12-12
IN2014DN09832A (ko) 2015-08-07
SI2852437T1 (sl) 2016-06-30
CA2874216C (en) 2020-09-01
PL2852437T3 (pl) 2016-10-31
EA032748B8 (ru) 2019-09-30
BR112014028904A2 (pt) 2017-06-27
JP2015517602A (ja) 2015-06-22
US20160074429A1 (en) 2016-03-17
ZA201408536B (en) 2016-08-31
CA2874216A1 (en) 2013-11-28
CN104411363A (zh) 2015-03-11
MX368965B (es) 2019-10-23
JP6273264B2 (ja) 2018-01-31
DK2852437T3 (en) 2016-06-06
EP2852437B1 (en) 2016-04-06
IL235803A0 (en) 2015-01-29
EP2852437A1 (en) 2015-04-01
PH12014502444B1 (en) 2015-01-12
AU2013265350B2 (en) 2017-05-04
UA113005C2 (uk) 2016-11-25
US20150152198A1 (en) 2015-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2874216C (en) Low-molecular-weight biotechnological chondroitin 6-sulphate for prevention of osteoarthritis
Lauder Chondroitin sulphate: a complex molecule with potential impacts on a wide range of biological systems
US10632144B2 (en) Low polydispersity, low molecular weight biotechnological chondroitin sulfate with anti-inflammatory and antiarthritis activity and use thereof in the prevention of osteoarthritis
US8664196B2 (en) Shark-like chondroitin sulphate and process for the preparation thereof
EP2707396B1 (en) Biotechnological sulphated chondroitin sulphate at position 4 or 6 on the same polysaccharide chain, and process for the preparation thereof
EP2710043B1 (en) Shark-like chondroitin sulphate and process for the preparation thereof
NZ617564B2 (en) &#34;biotechnological sulphated chondroitin sulphate at position 4 or 6 on the same polysaccharide chain, and process for the preparation thereof&#34;

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application