ES2962132T3

ES2962132T3 - Método para la sulfurilación enzimática de alcoholes y aminas que utiliza una bacteria de la familia Enterobacteriaceae

Info

Publication number: ES2962132T3
Application number: ES19753204T
Authority: ES
Inventors: Sergey Vasilievich Smirnov; Irina Lvovna Tokmakova
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2018-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2039-07-11
Also published as: EP3821025B1; HRP20231510T1; CN112384629B; JP7424320B2; US20210115484A1; CN112384629A; EP3821025A1; EP3821025C0; TW202020147A; JP2021529511A; HUE064469T2; WO2020013346A1

Abstract

Se proporciona un método para la sulfurilación enzimática de un sustrato que incluye las etapas de hacer reaccionar el sustrato con 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS) en un medio que contiene una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae para producir un derivado sulfatado del sustrato. y recoger el derivado sulfatado del medio, en el que la bacteria ha sido modificada para producir, al menos, una proteína que tiene actividad sulfotransferasa, y para atenuar la expresión de un gen aphA, un gen cysQ o un gen cpdB, o una combinación de estos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la sulfuración enzimática de alcoholes y aminas que utiliza una bacteria de la familiaEnterobacteriaceae

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la industria microbiológica y específicamente a un método para la sulfurilación enzimática de alcoholes y aminas en un medio que contiene una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceaepara la producción de derivados O-sulfatados y N-sulfatados de los alcoholes y aminas. El método puede utilizarse para producir, por ejemplo, heparina y heparán sulfato.

Descripción de la técnica relacionada

Son conocidas las moléculas inorgánicas y orgánicas que contienen uno o más grupos sulfato. Entre ellas, se conoce la existencia de biomoléculas que contienen uno o más grupos sulfato y que desempeñan un papel importante en procesos biológicos, y entre ellas se incluyen, por ejemplo, heparina, heparán sulfato, condroitín sulfato, colina sulfato y dermatán sulfato. La heparina y el heparán sulfato son de particular interés ya que pueden utilizarse en la industria farmacéutica para, por ejemplo, tratamientos terapéuticos.

La heparina y el heparán sulfato (abreviados como “HS”) son polisacáridos lineales que presentan unidades disacáridas repetitivas de sulfatación variable. La heparina es producida principalmente por los mastocitos de los animales, mientras que el HS es producido por prácticamente todos los tipos de células. La heparina y el HS pueden interactuar con numerosas proteínas y regulan diversos procesos biológicos, tales como, por ejemplo, ciclo celular, crecimiento celular, diferenciación celular, adhesión celular, motilidad, metabolismo de los lípidos, angiogénesis, coagulación sanguínea, anulación de la actividad de adhesión por Grb (granzima B) y metástasis tumoral. La utilización de la heparina para tratar y prevenir la trombosis venosa profunda, el embolismo pulmonar y el tromboembolismo arterial es conocida. La heparina asimismo se utiliza en el tratamiento de los ataques cardíacos y la angina de pecho.

La estructura química, es decir, el tipo y número de componentes polisacárido básicos que constituyen las moléculas de heparina y HS puede variar según el tejido y el estadio de desarrollo. Por lo tanto, no existen estructuras comunes de la heparina y el HS. Sin embargo, los motivos estructurales principales (-4GlcA1p-4GlcNAca-1) y (-4)-a-L-IdoA2S-(1-4)-D-GlcNS6S-(1-) de unidades disacáridas repetitivas están presentes en el esqueleto glucosilaminoglicano de la heparina y del HS (Kuberan B. et al., Chemoenzymatic synthesis of classical and non-classical anticoagulant heparan sulfate polysaccharides, J. Biol. Chem., 2003, 278(52):52613-52621; Mulloy B. et al., Pharmacology of heparin and related drus, Pharmacol. Rev., 2016, 68(1):76-141). Las diferencias básicas de estructura molecular entre la heparina y el HS son conocidas, y entre ellas se incluyen el peso molecular, la proporción de sulfatación y el contenido de residuos de ácido idurónico (abreviado como “ IdoA”) (ver, por ejemplo, Gallagher J.T. y Walker A., Analysis of sulphation patterns indicates that heparan sulphate and heparin are separate families of N-sulphated polysaccharides, Biochem. J., 1985, 230(3):665-674; Shriver Z. et al., Heparin and heparan sulfate: analyzing structure and microheterogeneity, Handb. Exp. Pharmacol., 2012, 207:159-176). Además, la actividad anticoagulante de la heparina es aproximadamente 100 veces superior a esta misma actividad en el HS.

La biosíntesis de la heparina y del heparán sulfato a partir de ácido glucurónico (abreviado como “GlcA”) y glucosa N-acetilada (abreviada como “GlcNAc”) ha sido estudiada en detalle (ver, por ejemplo, Mulloy B. et al., 2016; Sugahara K. y Kitagawa H., Heparin and heparan sulfate biosynthesis, Iu Bm B Life, 2002, 54(4):163-175). En particular, se han descrito los sucesos biosintéticos para modificar el esqueleto glucosilaminoglicano (denominado “heparosano”) para producir la heparina y el HS. La biosíntesis de la heparina y del HS incluye las etapas siguientes: i) N-desacetilación y N-sulfatación de los residuos GlcNAc catalizadas por HS/Heparina GlcNAc N-desacetilasa/N-sulfotransferasa (abreviadas como “NDNST”), ii) la glucuronil C5-epimerización catalizada por heparosán-N-sulfato-glucuronato C5-epimerasa (abreviado como “HNSG-5epi” o “C5-epi”), que convierte los residuos de ácido glucurónico (abreviado como “GlcA”) en residuos de IdoA, iii) la O-sulfatación consecutiva de grupos hidroxilo situados en la posición C2 de los residuos de IdoA, y las posiciones C6 y C3 de los residuos de N-sulfoglucosamina (abreviada como“GlNS”) catalizada por heparán sulfato 2-O-sulfotransferasa (abreviado como “HS 2-OST”), heparán sulfato 6-O-sulfotransferasa (abreviado como “HS 6-OST”) y heparán sulfato 3-O-sulfotransferasa (abreviado como “HS 3-OST”), respectivamente. La N-sulfatación y la O-sulfatación ocurren en presencia del donante de grupos sulfo 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato (abreviada como “PAPS”). La proporción de sulfatación puede depender de la posición y el tipo de grupo funcional que debe sulfatarse (figura 1). Además, los sucesos biosintéticos entre el heparosano y la heparina y el HS no son uniformes y pueden resultar en un diverso abanico de estructuras químicas. Un ejemplo de una estructura química de la heparina se muestra en la figura 2A (PubChem CID: 772, base de datos PubChem., National Center for Biotechnology Information (NCBI), https://pubcem.ncbi.nlm.nih.gov) y se muestra un ejemplo de una estructura química del HS en la figura 2B (PubChem CID. 53477714).

Los métodos para fabricar heparina y HS son conocidos y entre ellos se incluyen, por ejemplo, el aislamiento y la purificación de la heparina a partir de fuentes de mamífero y de no mamífero, y las técnicas químicas, químicoenzimáticas y biotecnológicas. Un procedimiento industrial para el aislamiento de la heparina a partir de animales se inició en 1922 y todavía se considera el método principal para producir heparina. El origen de la heparina puede ser porcino, bovino, canino y de oveja (ovino) (van der Meer J.-Y. et al., From farm to pharma: an overview of industrial heparin manufacturing methods, Molecules, 2017, 22(6):1025). Sin embargo, existen aspectos religiosos y sanitarios problemáticos asociados al uso de una fuente de mamífero para el aislamiento de la heparina. Estos problemas se resuelven en cierto modo mediante la utilización del dromedario(Camelus dromedaries)como fuente de la heparina. A pesar de que la heparina aislada de fuentes animales presenta efectos secundarios no deseables, tales como, por ejemplo, sangrado y trombocitopenia inducida por la heparina (TIH) con trombosis arterial, todavía se utiliza para la terapia combinada en el tratamiento en el ser humano de ictus y ataques cardíacos.

Los métodos para producir heparina mediante su aislamiento a partir de aves de corral, tales como, por ejemplo, pollos y pavos; peces, tales como, por ejemplo, el salmón(Salmo salar)y otras fuentes, asimismo son conocidos (van der Meer J.-Y. et al., 2017, y las referencias en la misma). Los documentos de patente que dan a conocer los métodos para la producción de heparina a partir de fuentes animales y marinas están publicados. Por ejemplo, es conocido un procedimiento simplificado para la extracción de heparina a partir de tejidos mucosales animales mediante el uso de una etapa de hidrólisis enzimática de la materia prima a temperatura ambiente (documento US6232093 B1). En otro método, se ha aislado una heparina de muy bajo peso molecular (abreviada como “VLMWH”) a partir de fuentes de pescado mediante el uso de técnicas cromatográficas (documento WO2006/120425 A1).

Debido a que la heparina y el heparán sulfato (HS) al nivel de bioseguridad son de importancia terapéutica, existe una demanda de métodos de producción comercial económica y a gran escala de dichas sustancias a partir de fuentes no animales. Por lo tanto, se han desarrollado métodos alternativos para producir heparina y HS. Por ejemplo, se ha demostrado que el HS puede sintetizarse rápida y fácilmente utilizando un juego de enzimas clonados que participa en la biosíntesis del HS (Kuberan B. et al., 2003). Sin embargo, dicho método resulta laborioso y caro, ya que requiere glucuronil C5-epimerasa humana purificada y heparán sulfato 2-, 3- y 6-O-sulfotransferasas, y PAPS como un donante de grupo sulfo. En otro ejemplo, se ha obtenido heparina de bioingeniería a partir de heparosa utilizando un enfoque quimioenzimático que incluye las etapas de tratamiento del heparosano con i) solución acuosa de álcali para conseguir una despolimerización parcial en una sola etapa del heparosano y la N-desacetilación de los grupos amino, ii) complejo trimetilamina-trióxido de azufre para llevar a cabo la N-sulfatación selectiva, iii) una mezcla de C5-epimerasa y 2-O-sulfotransferasa para conseguir la isomerización del grupo carboxilo en el átomo C5 de los residuos de GlcA y la 2-O-sulfatación de los residuos de IdoA, iv) una mezcla de 6-O-sulfotransferasas para conseguir la 6-O-sulfatación de los residuos de GlcNS, y v) una 3-O-sulfotransferasa para conseguir la 3-O-sulfatación de los residuos de GlcNS(6S) (documento WO2012/116048 A1). La heparina de bioingeniería producida mediante el método era sustancialmente equivalente a la heparina farmacéutica en referencia al contenido de N-acetilglucosamina y N-sulfoglucosamina, peso molecular medio en número (M<n>), peso molecular medio en peso (Mw) e índice de polidispersidad (IDP). En el método descrito, se utilizó un sistema de regeneración para restaurar un donante de grupo sulfo (PAPS) debido a su muy alto coste (Zhang Z. et al., Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(39):12998-13007).

Sin embargo, no se conoce ningún método para la sulfurilación enzimática de un sustrato para producir su derivado sulfatado mediante la reacción del sustrato con un donante de grupo sulfato en un medio que contiene una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceae,que ha sido modificada para producir, por lo menos, una proteína con actividad de sulfotransferasa y atenuada la expresión del genaphA,el gencysQo el gencpdB,o una combinación de los mismos.

El documento WO 2004/017910 A2 da a conocer un método para la sulfurilación enzimática de un sustrato que comprende hacer reaccionar el sustrato con 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato en un medio que contiene una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceaepara producir un derivado sulfatado de dicho sustrato, recoger el derivado sulfatado a partir del medio, en el que la bacteria ha sido modificada para producir, por lo menos, una proteína con actividad de sulfotransferasa, y la utilización de dicho método para producir un derivado sulfatado de un sustrato.

Breve sumario de la invención

Según el objeto divulgado en la presente memoria, se proporciona en la presente memoria un nuevo método para la sulfurilación enzimática de un sustrato que presenta, por lo menos, un grupo hidroxilo o, por lo menos, un grupo amino, para producir un derivado sulfatado del mismo, tal como un derivado O-sulfatado o un derivado N-sulfatado del sustrato, respectivamente. En una forma de realización ejemplificativa del método tal como se describe en la presente memoria, puede sulfurilarse un heparosán N-sulfato para producir un derivado O-sulfatado del mismo, tal como, por ejemplo, heparina y heparán sulfato, que presenten, por lo menos, un grupo O-sulfo adicional en comparación con el heparosán N-sulfato inicial. Por lo tanto, según el objeto divulgado en la presente memoria, pueden producirse derivados O-sulfatados de heparosán N-sulfato sin utilizar fuentes animales.

El método tal como se describe en la presente memoria puede incluir las etapas de hacer reaccionar un sustrato con un donante de grupo sulfo que puede ser, por ejemplo, 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato (PAPS) en un medio que contiene una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceae,que ha sido modificado para producir, por lo menos, una proteína con actividad de sulfotransferasa y para atenuar la expresión de un genaphA,un gencysQy un gencpdB,o una combinación de ellos. Una ventaja del método es que un lisado en bruto de células de la bacteria contiene una proteína que presenta la actividad deseada, tal como, por ejemplo, una proteína con actividad de sulfotransferasa, y por lo tanto, el lisado en bruto puede utilizarse satisfactoriamente en el método tal como se describe en la presente memoria. Es decir, en el método tal como se describe en la presente memoria, pueden utilizare una o más proteínas con las actividades deseadas sin aislamiento y/o purificación previos. Por lo tanto, puede simplificarse el procedimiento para la sulfurilación de alcoholes y aminas y puede reducirse el coste del procedimiento en el caso de que se utilice el método tal como se describe en la presente memoria.

El método puede mejorarse adicionalmente mediante la modificación de la bacteria que puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria, de manera que la bacteria pueda producir además una proteína con actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotrnasferasa, de manera que el PAPS, que es costoso e inestable, pueda regenerarse fácilmente y reutilizarse en el método. Alternativamente, el método puede mejorarse adicionalmente mediante la utilización del medio que puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria, de manera que el medio contenga la bacteria indicada en la presente memoria y una proteína con actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa, de manera que pueda regenerarse el PAPS en el medio. Por lo tanto, según el objeto actualmente dado a conocer, pueden producirse derivados O sulfatados y N-sulfatados del sustrato con alto rendimiento y a un precio mucho más bajo.

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

A continuación, se describe con mayor detalle la invención de la presente solicitud haciendo referencia a las formas de realización ejemplificativas, que se proporcionan únicamente a título de ejemplo, y haciendo referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa la proporción de sulfatación de los grupos hidroxilo y el grupo amino de una unidad glucosaminoglicano que presenta la estructura (-4GlcAc1p-4GlcNAca1-) utilizando N-sulfotransferasas y O-sulfotransferasas. La proporción de sulfatación (en%) se muestra entre paréntesis y cada una de las posiciones de los grupos hidroxilo susceptibles de sulfatación se señala rodeada con un círculo. La isomerización del grupo carboxilo en la posición C5 del residuo de ácido glucurónico (GlcA) se muestra mediante una flecha curvada.

La figura 2A representa la estructura química ejemplificativa de una heparina.

La figura 2B representa la estructura química ejemplificativa de un heparán sulfato.

Las figuras 3A y 3B representan los resultados del análisis de SDS-PAGE de fracciones solubles e insolubles de lisados celulares en bruto de cepas A2-5 que alojan los plásmidos pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356) y pSUMO-dreGlce(G70-N585). Panel A: fracción soluble; panel B: fracción insoluble; carriles: M - marcadores de los pesos moleculares indicados, 1 y 2: cepa A2, 3 y 4: cepa A3; 5 y 6: cepa A4; 7 y 8: cepa A5; HS 2-OST: heparán sulfato 2-O-sulfotransferasa fusionada con MPB* etiqueta N, HNSG-5epi: heparosán-N-sulfatoglucuronato 5-epimerasa fusionada con SUMO N-etiqueta.

La figura 4 representa las curvas cinéticas de acumulación de pNP en mezclas de reacción tras la sulfurilación de PAP mediante la utilización de lisados celulares en bruto de las cepas A2-A5/pST1A1 y pNPS como donante de grupo sulfo.

Descripción detallada de la invención

1. Bacteria

La bacteria que puede utilizarse en el método descrito en la presente memoria puede ser una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceaeque ha sido modificada para producir, por lo menos, una proteína con actividad de sulfotransferasa. La bacteria puede modificarse adicionalmente para producir una proteína con actividad de heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa y/o una proteína con actividad 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulato-sulfotransferasa. La bacteria que puede utilizarse en el método descrito en la presente memoria asimismo ha sido modificada para atenuar la expresión del genaphA,del gencysQo del gencpdB,o una combinación de los mismos.

En el método tal como se describe en la presente memoria, una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceaepuede ser de los génerosEnterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, SalmonellayYersinia,con la condición de que la bacteria pueda producir, por lo menos, una proteína con actividad de sulfotransferasa, y puede modificarse para atenuar la expresión de, por lo menos, un gen seleccionado de entre los genesaphA, cysQycpdB,o una combinación de ellos. Específicamente, pueden utilizarse los clasificados en la familiaEnterobacteriaceaesegún la taxonomía utilizada en la base de datos del NCBI (National Centerfor Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/www.tax.cgi ?id=543). Entre los ejemplos de cepas de la familia Enterobacteriaceae que pueden modificarse se incluye una bacteria del géneroEscherichia, Enterobactero Pantoea.

Las cepas de la bacteriaEscherichiaque pueden modificarse para obtener bacterias deEscherichiade acuerdo con el objeto actualmente dado a conocer no se encuentran limitadas, y específicamente, pueden utilizarse las indicadas en la publicación de Neidhardt et al. (Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives ofEscherichia coliK-12, páginas 2460 a 2488, en: F.C. Neidhardt et al. (ed.),Escherichia coliandSalmonellacellular and molecular biology, 2a ed., ASM Press, Washington, D.C., 1996). La especieEscherichia coli (E. coli)es un ejemplo particular. Entre los ejemplos específicos deE. colise incluyenE. coliW3110 (ATCC n° 27325) yE. coliMG1655 (At CC n° 47076), que derivan de la cepa de tipo salvaje prototípica, la cepaE. coliK-12. Estas cepas se encuentran disponibles en, por ejemplo, la American Type Culture Collection (ATCC; dirección: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos). Es decir, los números de registro se asignan a las cepas respectivas, y las cepas pueden ordenarse mediante la utilización de dichos números de registro (ver http://www.atcc.org/). Los números de registro de las cepas se enumeran en el catálogo de la American Type Culture Collection.

Entre los ejemplos de bacteriasEnterobacterse incluyenEnterobacter agglomeransyEnterobacter aerogenes.Entre los ejemplos de bacterias Pantoea se incluyenPantoea ananatis (P. ananatis).Algunas cepas deEnterobacter agglomeransse han reclasificado recientemente enPantoea agglomerans, Pantoea ananatisoPantoea stewartiibasándose en el análisis de la secuencia de nucleótidos del ARNr 16S, etc. Puede utilizarse una bacteria perteneciente al géneroEnterobactero al géneroPantoeacon la condición de que sea una bacteria clasificada en la familiaEnterobacteriaceae.Al cultivar una cepa deP. ananatismediante técnicas de ingeniería genética, puede utilizarseP. ananatiscepa AJ13355 (FERM n° BP-6614), la cepa AJ13356 (FERM n° BP-6615), la cepa AJ13601 (FERM n° BP-7207) y derivados de las mismas. Estas cepas fueron identificadas comoEnterobacter agglomeranscuando fueron aisladas y se han depositado comoEnterobacter agglomerans. Sin embargo, recientemente se han clasificado comoP. ananatisbasándose en la secuenciación de los nucleótidos del ARNr 16S, tal como se ha indicado anteriormente.

La bacteria que puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria se refiere a una bacteria en la que puede determinarse la actividad de una proteína que presenta la actividad deseada. Por ejemplo, una bacteria que puede modificarse para producir una proteína que presenta actividad de sulfotransferasa puede referirse a la bacteria en la que puede determinarse la actividad de la proteína que presenta actividad de sulfotransferasa. Las explicaciones proporcionadas en la presente memoria referidas a “una bacteria que puede modificarse para producir una proteína con actividad de sulfotransferasa” asimismo pueden aplicarse,mutatis mutandis,a cualquier bacteria que pueda utilizarse en los métodos descritos en la presente memoria, en particular, a una bacteria que pueda modificarse para producir una proteína que presenta la actividad deseada, tal como, por ejemplo, “una bacteria que puede modificarse para producir una proteína con actividad de heparosán-N-sulfatoglucuronato 5-epimerasa” y “una bacteria que puede modificarse para producir una proteína con actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa”.

La expresión “una proteína con actividad de sulfotransferasa” puede referirse a la proteína que causa la catálisis de la reacción de transferencia de un grupo sulfo (-SO<3>H) de una molécula donante (asimismo denominada donante de grupo sulfo) a un sustrato, que puede ser un alcohol, una amina o un aminoalcohol, en un procedimiento enominado sulfurilación que asimismo puede denominarse sulfatación o sulfonación (número de la comisión enzimática (EC): 2.8.2; Chapman E. et al., Sulfotransferases: structure, mechanism, biological activity, inhibition, and synthetic utility; Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2004, 43(27):3526-3548). Una proteína con actividad de sulfotransferasa puede denominarse sulfotransferasa (abreviada como “ST”). Debido a que la sulfotransferasa que puede utilizarse en el método descrito en la presente memoria puede ser una O-sulfotransferasa o una N-sulfotransferasa, tal como se explica posteriormente, la expresión “una proteína con actividad de sulfotransferasa” puede incluir las expresiones “una proteína con actividad de O-sulfotransferasa” y “una proteína con actividad de O-sulfotransferasa” y “una proteína con actividad de N-sulfotransferasa”. Por lo tanto, la expresión “una proteína con actividad de O-sulfotransferasa” puede referirse a una proteína que causa la catálisis de la reacción de transferencia de un grupo sulfo de una molécula donante a un sustrato, que puede ser un alcohol o un aminoalcohol, en el procedimiento de O-sulfurilación, y la expresión “una proteína con actividad de N-sulfotransferasa” puede referirse a una proteína que causa la catálisis de la reacción de transferencia de un grupo sulfo desde una molécula donante hasta un sustrato, que puede ser una amina o un aminoalcohol, en el procedimiento de N-sulfurilación. La O-sulfurilación y N-sulfurilación en referencia a un procedimiento pueden denominarse colectivamente como procedimiento de sulfurilación.

Las sulfotransferasas que son capaces de sulfurilar grupos hidroxilo de los sustratos para producir derivados sulfatados de los mismos pueden denominarse colectivamente como O-sulfotransferasas (abreviadas como “O-ST” o “OST”). Específicamente, las O-sulfotransferasas son enzimas que pueden causar la catálisis de la reacción de transferencia de grupo sulfo a un grupo hidroxilo (-OH) del sustrato para producir un derivado sulfatado del mismo, que asimismo se denomina sulfato, con la fórmula química R-OSO<3>H o R-OSO<3>-, en el que “R” puede referirse a un grupo químico, tal como, por ejemplo, un grupo orgánico que es bien conocido por el experto ordinario en la materia. Las sulfotransferasas que son capaces de sulfurilar los grupos amino de los sustratos para producir derivados sulfatados de los mismos pueden denominarse colectivamente “N-sulfotransferasas” (abreviadas como “N-ST” o “NST”). Específicamente, las N-sulfotransferasas son enzimas que pueden causar la catálisis de la reacción de transferencia de grupo sulfo a un grupo amino primario y/o secundario (-NH<2>, -NHR') del sustrato para producir un derivado sulfatado del mismo, que asimismo se denomina sulfamato, con la formula química R-NH-SO<3>H o R-NH-SO<3>-, y/o R-NR'-SO<3>H o R-n R'-SO<3>-, en las que R y R' se refieren al grupo químico R tal como se ha indicado anteriormente y en las que R y R' pueden referirse a grupos químicos del mismo tipo o de tipos diferentes.

Se conocen OST y NST de diversos tipos y entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, arilsulfotransferasa (EC 2.8.2.1), alcohol sulfotransferasa (EC 2.8.2.2), amina sulfotransferasa (EC 2.8.2.3), [heparán sulfato]-glucosamina N-sulfotransferasa (EC 2.8.2.8, abreviada como “N-HSST”), condroitín 6-sulfotransferasa (EC 2.8.2.17), queratán sulfotransferasa (2.8.2.21) y [heparán sulfato]-glucosamina 3- sulfotransferasa isoformas 1, 2 y 3 (EC 2.8.2.23, 2.8.2.29 y 2.8.2.30, respectivamente; abreviadas como “3-OST-1”, “3-OST-2” y “3-OST-3”), que se clasifican, por ejemplo, en la base de datos UniProtKB (https://enzyme.expasy.org/EC/2.8.2.-).

Son conocidas sulfotransferasas nativas respecto a diversos organismos, tales como, por ejemplo, mamíferos, incluyendo seres humanos, peces, insectos y gusanos, y estas pueden utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria.

Entre los ejemplos específicos de OST se incluyen, aunque sin limitación, heparán sulfato 2-O-sulfotransferasa (HS 2-OST), heparán sulfato 3-O-sulfotransferasa (HS 3-OST) y heparán sulfato 6-O-sulfotransferasas (HS 3-OST) que son capaces de O-sulfurilar (alternativamente, O-sulfatar, O-sulfonatar) grupos hidroxilo situados en la posición C2 de los residuos de ácido hexurónico (particularmente, los residuos de ácido L-idurónico (IdoA)) y las posiciones C3 y C6 de los residuos de N-sulfoglucosamina (GlcNS), respectivamente, en el heparán N-sulfato.

Por ejemplo, HS 2-OST nativo al ser humano(Homo sapiens;base de datos UniProtKB, entrada n° Q7LGA3), al ratón(Mus musculus,entrada n° Q8R3H7), al pollo(Gallus gallus;entrada n° Q76KB1), a la rana (por ejemplo,Xenopus laevis,entrada n° O93336), al pez cebra(Danio rerio,entrada n° A1L1P8), a ascárides (por ejemplo,Trichinella pseudospiralis,entrada n° A0A0V1JLD7) y a insectos (por ejemplo,Lygus hesperus,entrada n° A0A146LU86).

En otro ejemplo, puede utilizarse H 3-OST nativo al ser humano(Homo sapiens;base de datos UniProtKB, entrada n° Q9Y663), al ratón(Mus musculus,entrada n° O35310), a la rata(Rattus norvegicus,entrada n° Q80W66), a la mosca de la fruta(Drosophila melanogaster,entrada n° Q9VWJ7), a la hidra(Hydra vulgaris, Hydra attenuate,entrada n° T2MJ19) y a nematodos (por ejemplo,Trichinella murrelli,entrada n° A0A0V0UDE4).

En otro ejemplo, puede utilizarse HS 6-OST nativo al ser humano(Homo sapiens,base de datos UniProtKB, entrada n°<o>6<o>243), al ratón(Mus musculus,entrada n° Q9QYK5), al pollo(Gallus gallus,entrada n° Q76KB2), bovino(Bos taurus,entrada n° 1BNW3), a monos (por ejemplo, el macaco rhesus(Macaca mulatta),entrada n° F7DP42), a murciélagos(Myotis lucifugus,entrada n°G1PY33), a moscas de la fruta(Drosophila persimilis,entrada n° B4GL90) y a nematodos (por ejemplo,Caenorhabditis briggsae,entrada n° A8XKD5).

Entre los ejemplos específicos de NST se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, amina sulfotransferasas y arilamina sulfotransferasas que son capaces de N-sulfurilar (alternativamente, N-sulfatar o N-sulfonatar) grupos de amino primario y secundario de sustratos que contienen grupos amino, tales como, por ejemplo, anilina, fenilamina, bencenamina, arilamina y 2-naftilamina. Por ejemplo, puede utilizarse NST nativa aDaphnia magna(base de datos UniProtKB, entrada n° A0A0P5VC43), una mosca de la fruta (por ejemplo,Zeugodacus cucurbitae,entrada n° A0A0A1X0U6) y los enumerados en, por ejemplo, la base de datos KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:2.8.2.3).

Es conocido que una proteína con actividad de N-sulfotransferasa puede presentar, además de dicha propiedad, actividad de N-desacetilación. Por lo tanto, en casos particulares, puede hacerse referencia a una proteína con actividad de N-sulfotransferasa como proteína que presenta actividad de N-desacetilasa/N-sulfotransferasa, y asimismo puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria. La expresión “una proteína con actividad de N-desacetilasa/N-sulfotransferasa” puede referirse a la proteína que causa la catálisis de la reacción de N-desacetilación y la N-sulfatación de los residuos de glucosamina (GlcNAc) del glucosaminoglicano en el heparán sulfato (heparán sulfato N-desacetilasa, EC 3.-.-.-; heparán sulfato N-sulfotransferasa, EC 2.8.2.-). La proteína con actividad de N-desacetilasa/N-sulfotransferasa puede denominarse N-desacetilasa/N-sulfotransferasa bifuncional (abreviada como "NDST").

Entre los ejemplos específicos de NDST se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la NDST nativa al ser humano(Homo sapiens,base de datos UniProtKB, entrada n° P52848), al ratón(Mus musculus,entrada n° Q3UHN9), al cerdo(Sus scrofa,entrada n° F6XY50), a la oveja(Ovis aries,entrada n° UPI00072F9665), al caballo(Equus caballus,entrada n° F6SHQ3) y a un ave (por ejemplo, la garza del sol(Eurypyga helias),entrada n° UPI0005288C4A) y estas proteínas pueden utilizarse en el método indicado en la presente memoria.

Puede determinarse la actividad de una proteína que presenta actividad de sulfotransferasa mediante un método radioisotópico, utilizando [35S] 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato y el recuento de centelleo (Habuchi H. et al., Biosynthesis of heparan sulphate with diverse structures and functions: two alternatively spliced forms of human heparan sulphate 6-O-sulphotransferase-2 having different expression patterns and properties, Biochem. J., 20023, 371(Pt. 1):131-142) o un ensayo colorimétrico bienzimático acoplado, mediante la utilización de una arilsulfotransferasa y p-nitrofenilsulfato (abreviado como, “pNPS”) como donante de grupos sulfo (Sterner E. et al., Assays for determining heparan sulfate and heparin O-sulfotransferase activity and specificity, Anal. Bioanal. Chem., 2014, 406(2):525-536). La concentración de proteína puede determinarse mediante el ensayo de proteínas de Bradford o el método de Lowry utilizando albúmina de suero bovino (BSA) como patrón y un pigmento de Coomassie (Bradford M.M., Anal. Biochem., 1976, 72:248-254; Lowry O.H. et al., J. Biol. Chem., 1951, 193:265-275).

El sustrato que puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria puede ser cualquier sustrato (es decir, cualquier molécula) que presente, por lo menos, un grupo hidroxilo o, por lo menos, un grupo amino, o una combinación de los mismos, con la condición de que el sustrato pueda sulfurilarse mediante la utilización de una OST o una NST, o una combinación de los mismos, para producir un derivado sulfatado del sustrato. Asimismo resulta aceptable que el sustrato pueda presentar, solo o además de uno o más grupos hidroxilo y/o uno o más grupos amino, por lo menos, un grupo amino que esté N-acetilado, con la condición de que el sustrato pueda sulfurilarse mediante la utilización de una NDST. Los sustratos pueden ser, aunque sin limitación, los indicados en, por ejemplo, Chapman et al., 2004, y entre ellos se incluyen fenoles, incluyendo 4-nitrofenol (asimismo conocido como p-nitrofenol, abreviado como “pNP”), catecolaminas, arilhidroxilaminas, hidroxiesteroides, dopamina, tiramina, minoxidol, pregnenolona, deshidroepiandrosterona (abreviada como “DHEA”), un oligosacárido tal como, por ejemplo, un heparosano, un derivado sulfatado de heparosano, tal como, por ejemplo, un heparán sulfato que presenta residuos de glucosamina N-acetilada (GlcNAc), un glucosaminoglicano de heparán sulfato (abreviado como “HSGAG”), heparosano N-sulfatado (abreviado como “NS-heparosano”) y queratán sulfato. El heparosano es un ejemplo particular de sustrato del que se conocen los métodos para su producción (ver, por ejemplo, el documento US 2016201103 A1).

Como donante de grupo sulfo que puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria, puede utilizarse cualquier molécula con la condición de que la molécula pueda donar grupos sulfo a una sulfotransferasa de manera que pueda determinarse la actividad de sulfotransferasa de la sulfotransferasa. Puede utilizarse virtualmente cualquier molécula que pueda donar un grupo sulfo a una O-sulfotransferasa, N-sulfotransferasa y/o N-desacetilasa/N-sulfotransferasa de manera que dicha sulfotransferasa o sulfotransferasas pueden ser la proteína o proteínas que poseen actividad de sulfotransferasa. Por ejemplo, la 3'-fosfoadenosín 5'-fosfosulfato (PAPS, PubChem CID: 10214), asimismo conocida como 3'-fosfo-5'-adenililsulfato, o una sal del mismo, tal como, por ejemplo, una sal de sodio o de litio, puede servir como un donante de grupo sulfo (ver, por ejemplo, el esquema 1 en Chapman E. et al., 2004). El PAPS puede utilizarse exógenamente, es decir, puede añadirse a un medio que contenga la bacteria que pueda utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria, y/o puede utilizarse en una forma endógena unida nativamente a la sulfotransferasa, ya que es conocido que existen enzimas (ATP sulfurilasa y la adenosín 5'-fosfosulfato cinasa) que catalizan la formación de PAPS en organismos, que después es reclutado y se une a la sulfotransferasa como un cofactor. Debido a que PAPS es un compuesto químico caro e inestable, resulta preferido utilizar PAPS que se sintetice endógenamente por el organismo y que, de esta manera, esté nativamente unido a la sulfotransferasa. De esta manera, se ha desarrollado un sistema para regenerar o reciclar PAPS en el medio en el que tiene lugar la sulfurilación (ver, por ejemplo, la figura 1 en Sterner E. et al., 2014; Gregory J.D. y Lipmann F., The transfer of sulfate among phenolic compounds with 3',5'-diphosphoadenosine as coenzyme, J. Biol. Chem., 1957, 229(2):1081-1090). En el sistema, una sulfotransferasa convierte PAPS en 3'-fosfoadenosín-5'-fosfato (abreviado como “PAP”) y sulfurila un sustrato. A continuación, se recicla PAP en PAPS mediante la utilización de una proteína con actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa que puede utilizar el p-nitrofenilsulfato (pNPS) como el donante de grupo sulfo para el PAP.

La expresión “una proteína con actividad de heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa” puede referirse a la proteína que causa la catálisis de la reacción de conversión de residuos de ácido D-glucurónico (GlcA) contiguos a los residuos de N-sulfato-azúcar en el heparosano N-sulfato en residuos de ácido idurónico (IdoA) (EC 5.1.3.17; Mochizuki H. et al., Heparosan-glucuronate 5-epimerase: Molecular cloning and characterization of a novel enzyme, Glycobiology, 2015, 25(7):735-7744). Puede determinarse la actividad de la proteína con actividad de heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa mediante métodos radioisotópicos utilizando [5-3H]heparosano como el sustrato (Mochizuki H. et al., 2015).

La proteína que presenta actividad de heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa puede denominarse heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa (HNSG-5epi). Entre los ejemplos específicos de HNSG-5epi se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la HNSG-5epi nativa al ser humano(Homo sapiens,base de datos UniProtKB, entrada n° O94923), al ratón(Mus musculus,entrada n° Q9EPS3), bovina (Bostaurus,entrada n° O18756), pez cebra(Danio rerio,entrada n° Q6TS33), un hámster (por ejemplo,Cricetulus griseus,n° de entrada A0A061I8R4), oveja(Ovis aries,entrada n° W5QB79) y un elefante (por ejemplo,Loxodonta africana,n° de entrada G3T4X0) y estas proteínas pueden utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria.

Debido a que pNPS puede utilizarse como donante de grupos sulfo en el sistema para la regeneración de PAPS, la expresión “una proteína con actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato” en referencia a una proteína que presenta dicha actividad que puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria puede referirse, en un sentido más amplio, a un proteína con actividad de arilsulfotransferasa (EC 2.8.2.1), que es un ejemplo de una proteína con actividad de O-sulfotransferasa (EC 2.8.2-). Por lo tanto, resultará evidente para el experto ordinario en la materia que las explicaciones proporcionadas en la presente memoria de una proteína con actividad de O-sulfotransferasa asimismo pueden aplicarse,mutatis mutandis,a una proteína con actividad de arilsulfotransferasa, que, a su vez, puede aplicarse,mutatis mutandis,a una proteína con actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa. Ahora resulta evidente que la actividad de una proteína con actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa puede determinarse utilizando los métodos que pueden utilizarse para la determinación de la actividad de una proteína con actividad de sulfotransferasa, y entre estos métodos se incluye, por ejemplo, el método en el que se utiliza PAP como sustrato y pNPS como donante de grupos sulfo (Sterner E. et al., 2014).

Una proteína con actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa puede denominarse 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa (abreviada como “PAPS ST”) y puede significar, en un sentido más amplio, arilsulfotransferasa. Entre los ejemplos específicos de arilsulfotransferasa que pueden utilizarse para la regeneración de PAPS se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la arilsulfotransferasa nativa al ser humano (Homo sapiens, ST1A3, base de datos UniProtKB n° de entrada P0DMM9), a la rata(Rattus norvegicus,ST1A1, entrada n° P17988, entrada génica del NCBI (The National Center for Biotechnology Information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov) n° NP_114022.1) y al ratón (Mus musculus, ST1A1, entrada n° P52840).

Es conocido que puede existir una OST, NST, NDST, HNSG-5epi y PAPS ST, en diferentes isoformas proteicas, las cuales son un resultado del procesamiento alternativo de los genes codificantes de OST, NST, NDST, HNSG-5epi y PAPS ST, y estas isoformas proteicas asimismo pueden utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria con la condición de que puedan ser proteínas con las actividades deseadas según el método explicado en la presente memoria.

La expresión “nativo a” en referencia a una proteína o un ácido nucleico nativo a una especie particular, tal como, por ejemplo, una especie bacteriana o de mamífero, puede referirse a una proteína o a un ácido nucleico que es nativo a esa especie. Es decir, una proteína o un ácido nucleico nativo a una especie particular puede referirse a la proteína o al ácido nucleico, respectivamente, que existe naturalmente en la especie y que puede aislarse a partir de esta especie y secuenciarse utilizando medios conocidos por el experto ordinario en la materia.

Además, debido a que la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos de una proteína o ácido nucleico, respectivamente, aislada a partir de la especie en la que existe la proteína o ácido nucleico, puede determinarse con facilidad, la expresión “nativo a” en referencia a una proteína o un ácido nucleico asimismo puede referirse a una proteína o a un ácido nucleico que puede obtenerse utilizando, por ejemplo, una técnica de ingeniería genética, incluyendo la tecnología de ADN recombinante, o un método de síntesis química, con la condición de que la secuencia de aminoácidos de la proteína o la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico obtenido de esta manera sea idéntico, por lo tanto, a la secuencia de aminoácidos de la proteína o la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico que existe naturalmente en la especie. Entre los ejemplos de secuencias de aminoácidos nativas a especies particulares se incluyen, aunque sin limitación, péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, incluyendo proteínas, específicamente enzimas. Entre los ejemplos de secuencias de nucleótidos nativos a especies particulares se incluyen el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN), y estos no se encuentran limitados a secuencias reguladoras, incluyendo promotores, atenuadores y terminadores, genes, secuencias intergénicas, secuencias codificantes de péptido de señal, profracciones de proteínas y secuencias de aminoácidos artificiales. Se indican en la presente memoria ejemplos de secuencias de aminoácidos y de secuencias de nucleótidos, y homólogos de los mismos nativos a diversas especies, y entre estos ejemplos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, heparán sulfato 2-O-sulfotransferasa (HS 2-OST) nativa al hámster enano de cola larga(Cricetulus longicaudatus,UniProtKB, n° de acceso O0889.1) y codificado por el ARNm correspondiente (GeneBank, n° de acceso D88811.1), heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa (HNSG-5epi) nativa al pez cebra(Danio rerio;secuencia de referencia del NCBI, n° de acceso NP_998014.1) y codificada por el ARNm correspondiente (secuencia de referencia del NCBI, n° de acceso NM_212849.1), arilsulfotransferasa 1A1 con la secuencia de aminoácidos nativa a la rata(Rattus norvegicus,secuencia de referencia del NCBI NP_114022.1) y codificada por el ARNm correspondiente (secuencia de referencia del NCBI, n° de acceso NM_031834.1).

Las explicaciones proporcionadas posteriormente de una proteína con actividad de sulfotransferasa en referencia a los métodos de modificación de una bacteria con dicha proteína, en las que la bacteria puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria, asimismo pueden aplicarse,mutatis mutandis,a cualquier proteína con la actividad deseada y que pueda utilizarse en el método. Entre los ejemplos de una proteína con la actividad deseada se incluyen, aunque sin limitación, una proteína con actividad de heparosán-N-sulfatoglucuronato 5-epimerasa y una proteína con actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa, ya que la bacteria puede poseer otras propiedades aparte de las indicadas en la presente memoria.

La bacteria que puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria ha sido modificada para producir una proteína con actividad de sulfotransferasa. Debido a que las proteínas están codificadas por genes, resultará evidente para el experto ordinario en la materia que la bacteria puede modificarse para expresar un gen que codifica una proteína que presenta actividad de sulfotransferasa.

La expresión “una bacteria modificada para expresar un gen que codifica una proteína con actividad de sulfotransferasa” puede referirse a que la bacteria que nativa o naturalmente no posee un gen que codifica una proteína con actividad de sulfotransferasa ha sido modificada de manera que la bacteria contenga el gen que codifica una proteína con actividad de sulfotransferasa (denominada “bacteria anfitriona”), en la que el gen está presente nativa o naturalmente o es nativa a un organismo que es diferente de la bacteria anfitriona (denominada organismo donante). El gen que es nativo a un organismo donante y que se introduce en una bacteria anfitriona puede denominarse gen heterólogo en referencia a la bacteria anfitriona, para la que dicho gen no es nativo o natural.

La expresión "una bacteria modificada para expresar un gen que codifica una proteína con actividad de sulfotransferasa" asimismo puede referirse a que la bacteria anfitriona que se ha introducido con el gen que codifica una proteína con actividad de sulfotransferasa ha adquirido la capacidad de producir la proteína con actividad de sulfotransferasa como consecuencia de dicha modificación.

La bacteria que ha sido modificada para producir una proteína con actividad de sulfotransferasa puede conseguirse mediante la introducción de un gen que codifica una proteína con actividad de sulfotransferasa. Los métodos para introducir un ADN recombinante en una bacteria receptora pueden ser los métodos convencionales de los que se han informado y que son bien conocidos por el experto ordinario en la materia. Entre dichos métodos se incluyen, por ejemplo, la transformación, transfección, infección, conjugación y movilización. La transformación, transfección, infección, conjugación o movilización de una bacteria con el ADN recombinante que contiene un gen que codifica una proteína con actividad de sulfotransferasa pueden proporcionar a la bacteria una capacidad de expresar el gen y sintetizar la proteína codificada por el gen. Por ejemplo, se ha informado de un método de tratamiento de célula receptoras con cloruro de calcio para incrementar la permeabilidad de las células deEscherichia coliK-12 al ADN para la transformación y transfección eficientes de ADN (Mandel M. e Higa A., Calcium-dependent bacteriophage DNA infection, J. Mol. Biol., 1970, 53:159-162). Se describen métodos de transducción especializada y/o generalizada (Morse M.L. et al., Transduction inEscherichia coliK-12, Genetics, 1956, 41(1):142-156; Miller J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972). Pueden aplicarse otros métodos para la integración aleatoria y/o dirigida de ADN en el genoma de un organismo receptor, tales como, por ejemplo, la “integración/amplificación controlada por Mu” (ver, por ejemplo, Akhverdyan V.Z. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871), la “integración controlada por Red/ET” o la “integración mediada por ARed/ET” (Datsenko K.A. y Wanner B.L., Proc. Natl. ACad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y., et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128). Además, para múltiples inserciones de genes deseados además de la transposición replicativa controlada por Mu (Akhverdyan V.Z. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871) y la evolución cromosómica inducible químicamente basada en la recombinación homóloga dependiente derecAque resulta en la amplificación de los genes deseados (Tyo K.E.J. et al., Nature Biotechnol., 2009, 27:760-765), pueden utilizarse otros métodos que utilizan diferentes combinaciones de transposición, recombinaciones específicas de sitio y/o homólogas mediadas por Red/ET, y/o transducción generalizada mediada por P1 (ver, por ejemplo, Minaeva N.I. et al., BMC Biotechnol., 2008, 8:63; Koma D. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, 93(2):815-829).

La expresión de un gen en una bacteria anfitriona puede mejorarse mediante la sustitución de codones raros (denominados codones de bajo uso en referencia a la bacteria anfitriona) para codones sinónimos de uso intermedio o alto, en donde el uso de los codones puede definirse como la frecuencia de traducción de un codón por unidad de tiempo en una célula de una bacteria anfitriona o la frecuencia media de codones de los marcos de lectura codificantes de proteína secuenciados de una bacteria anfitriona (Zhang S.P. et al., Low-usage codons inEscherichia coli,yeast, fruit fly and primates, Gene, 1991, 105(1):61-72). El uso de los codones por organismo puede encontrarse en la base de datos de uso de codones, que es una versión ampliada en internet del CUTG (Codon Usage Tabulated from GenBank, http://www.kazusa.or.jp/codon/; Nakamura Y. et al., Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000; Nucleic Acids Res., 2000, 28(1):292). EnEscherichia colidichas mutaciones pueden incluir, aunque sin limitación, la sustitución de los codones raros de Arg AGA, AGG, CGG, CGA por CGT o CGC; el codón raro de Ile ATA por ATC o ATT; el codón raro de Leu CTA por CTG, CTC, CTT, TTA o TTG; el codón raro de Pro CCC por CCG o CCA; el codón raro de Ser TCG por TCT, TCA, TCC, AGC o AGT, y los codones raros de Gly GGA, GGG por GGT o GGC. Las sustituciones de codones de poco uso por codones sinónimos de uso elevado pueden resultar preferidas. La sustitución de codones de uso raro y/o bajo por codones sinónimos de uso intermedio o alto puede combinarse con la coexpresión de los genes que codifican ARNt que reconozcan codones raros. Los codones pueden sustituirse mediante la utilización, por ejemplo, de un método de mutación específica de sitio para la introducción de una mutación objetivo en un sitio objetivo del ADN. Entre los ejemplos del método de mutación específica de sitio se incluyen el método de utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Higuchi R., Using PCR to engineer DNA, 61-70, en: PCR Technology, Erlich H.A. (ed.), Stockton Press, New York (1989); Carter, P., Methods Enzymol., 1987, 154:382-403), y el método que utiliza un fago (Kramer W. y Frits H.J., Methods Enzymol., 1987, 154:350-367; Kunkel T.A. et al., Methods Enzymol., 1987, 154:367-382).

En el caso de que se introduzca un gen en una bacteria anfitriona, puede resultar suficiente que el gen sea alojado por la bacteria modificada de manera que se exprese el gen en la bacteria. Específicamente, puede resultar suficiente que se introduzca el gen de manera que se exprese bajo el control de una secuencia de promotor (asimismo denominada promotor) que funcione en la bacteria anfitriona. El promotor puede ser un promotor nativo a la bacteria anfitriona, o un promotor heterogéneo nativo al organismo donante o incluso a otro organismo. El promotor puede ser el promotor nativo del gen que debe introducirse, o un promotor de otro gen. Como promotor, por ejemplo, asimismo puede utilizarse un promotor fuerte, tal como se explica en la presente memoria.

Una secuencia de terminador (asimismo denominada terminador) para la terminación de una transcripción de un gen puede estar situada cadena abajo del gen. El terminador no se encuentra particularmente limitado con la condición de que funcione en la bacteria anfitriona. El terminador puede ser un terminador nativo a la bacteria anfitriona o un terminador heterogéneo nativo al organismo donante o incluso a otro organismo. El terminador puede ser el terminador nativo del gen que debe introducirse o un terminador de otro gen.

Además, en el caso de que se introduzcan dos o más copias del gen, resulta suficiente que cada gen sea alojado por la bacteria modificada de manera que puedan expresarse los genes en la bacteria. Por ejemplo, todos los genes que deben introducirse pueden estar presentes en un único vector de expresión, o estar presentes en el cromosoma. Alternativamente, los genes pueden estar presentes en dos o más vectores de expresión, o pueden estar separadamente presentes en uno o más vectores de expresión y en el cromosoma. En el caso de que los genes estén presentes en diferentes moléculas de ácido nucleico o estén presentes en una única molécula de ácido nucleico, los genes pueden estar presentes en la molécula o moléculas de ácido nucleico de manera que pueda conseguirse la expresión de todos los genes que se introduzcan. Puede seleccionarse virtualmente cualquier modo de introducir un gen en una bacteria anfitriona con la condición de que pueda conseguirse la expresión del gen en la bacteria. La expresión “puede conseguirse la expresión” puede referirse a cuando tiene lugar la transcripción a partir del ADN, de manera que pueda sintetizarse el ARN del ADN complementario que actúa de molde y pueda ocurrir la traducción a partir del ARN de manera que pueda producirse un péptido tal como, por ejemplo, una proteína con una actividad deseada, de manera que pueda determinarse la actividad de la misma.

Los vectores, promotores y terminadores nativos a diversos organismos se dan a conocer en detalle en “Fundamental Microbiology, vol. 8, Genetic Engineering”, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd. (1987), y los citados pueden utilizarse.

Preferentemente, se introduce un gen en una bacteria anfitriona de manera que se exprese bajo el control de un promotor fuerte que funcione en la bacteria, en el que el promotor es más fuerte que el promotor nativo del gen o es un promotor que es nativo a la bacteria anfitriona. Pueden utilizare promotores fuertes que proporcionen un nivel elevado de expresión génica en una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceae.Entre los ejemplos de promotores fuertes que pueden utilizarse en las bacteriasEnterobacteriaceaese incluyen el promotorlac,el promotortrp,el promotortrc,el promotortacy los promotores P<r>y P<l>del fago lambda. Además, como el promotor fuerte, asimismo puede obtenerse un tipo altamente activo de un promotor existente, mediante la utilización de diversos genes informadores. Por ejemplo, mediante la aproximación de las regiones -35 y -10 en una región de promotor a la secuencia de consenso, puede potenciarse la actividad del promotor (documento WO00718935). Entre los ejemplos de promotor de tipo altamente activo se incluyen diversos promotores de tipo tac (Katashkina J.I. et al., solicitud de patente de la Federación Rusa 2006134574 A). Se han descrito métodos para evaluar la fuerza de los promotores y ejemplos de promotores fuertes (Goldstein M.A. y Doi R.H., Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1:105-128).

La eficiencia de transcripción de un gen puede mejorarse adicionalmente. Lo anterior puede conseguirse mediante, por ejemplo, la introducción de una mutación en la región del promotor del gen con el fin de obtener una función del promotor más fuerte, resultando de esta manera en un nivel de transcripción incrementado del gen situado cadena abajo del promotor. Además, es conocido que la sustitución de varios nucleótidos en la secuencia de Shine-Dalgarno (SD) y/o en una región espaciadora entre la secuencia SD y el codón de inicio, y/o en una secuencia inmediatamente cadena arriba y/o cadena abajo del codón de inicio en el sitio de unión ribosómica afecta considerablemente a la eficiencia de traducción del ARNm. Por ejemplo, se ha observado un rango de 20 veces en los niveles de expresión según la naturaleza de los tres nucleótidos que preceden al codón de inicio (Gold L. et al., Annu. Rev. Microbiol., 1981, 35:365-403; Hui A. et al., EMBO J., 1984, 3:623-629).

Además, la eficiencia de traducción de un gen puede mejorarse adicionalmente. Lo anterior puede conseguirse mediante, por ejemplo, la sustitución del sitio de unión ribosómica (RBS) para el gen en el cromosoma con un RBS más fuerte. La expresión “un RBS más fuerte” puede referirse a un RBS que proporciona una traducción mejorada del ARNm en comparación con el RBS nativo, de tipo salvaje, del gen. A título de ejemplo de un RBS más fuerte, puede utilizarse el RBS del gen 10 del fago T7 (Olins P.O. et al., Gene, 1988, 73:227-235).

Como vector, puede utilizar un vector de replicación autónoma en la célula de la bacteria anfitriona. El vector es preferentemente un vector multicopia y, preferentemente, presenta un gen marcador, tal como, por ejemplo, un gen de resistencia a antibiótico para la selección de los transformantes deseados. Además, el vector puede presentar un promotor y/o un terminador para expresar el gen introducido. El vector puede ser, por ejemplo, un vector derivado de un plásmido bacteriano, un vector derivado de un plásmido de levadura, un vector derivado de un bacteriófago, cósmido o fagémido. Entre los ejemplos de vectores adecuados para transformar una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriacease incluyen, aunque sin limitarse a ellos, plásmidos de amplio rango de anfitriones, tales como pMW118/119, pBR322 y pUC19.

Además, pueden introducirse múltiples copias del gen en el ADN cromosómico de una bacteria mediante, por ejemplo, recombinación homóloga o integración controlada por Mu. La recombinación homóloga puede llevarse a cabo mediante la utilización de una secuencia con múltiples copias en el ADN cromosómico. Entre las secuencias con múltiples copias en el ADN cromosómico se incluyen, aunque sin limitación, el ADN repetitivo o las repeticiones invertidas presentes en el extremo de un elemento transponible. Además, resulta posible introducir el gen en un trasposón y permitir que se transfiera para introducir múltiples copias del gen en el ADN cromosómico. Mediante la utilización de la integración controlada por Mu, pueden introducirse más de 3 copias del gen en el ADN cromosómico en un solo acto (Akhverdyan V.Z. et al., Biotechnol. (en ruso), 2007, 3:3-20).

La introducción de un gen puede confirmarse mediante la confirmación de la presencia de la secuencia de nucleótidos de una parte o de la totalidad del gen que debe introducirse. La presencia de una secuencia de nucleótidos puede determinarse mediante, por ejemplo, PCR (Sambrook J. et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, EE. UU. (2001)). La introducción de un gen asimismo puede confirmarse mediante la confirmación de la presencia de expresión del gen que debe introducirse. La presencia de expresión de un gen puede confirmarse mediante la confirmación de la presencia de una cantidad de transcripción del gen, o mediante la confirmación de la presencia de la proteína codificada por el gen. La presencia de una cantidad de transcripción de un gen puede confirmarse mediante la confirmación de la presencia del ARNm transcrito a partir del gen. Entre los ejemplos del método para confirmar la presencia de ARNm se incluyen la hibridación northern y la RT-PCR (Sambrook J. et al.: “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, EE. UU. (2001)). La presencia de una proteína puede determinarse mediante, por ejemplo, transferencia western utilizando anticuerpos (Sambrook J. et al.: “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, EE. UU. (2001)).

El número de copia, o la presencia o ausencia de un gen, pueden medirse, por ejemplo, mediante el corte del ADN cromosómico seguido de la transferencia southern con una sonda basada en la secuencia génica e hibridaciónin situde fluorescencia (FISH). El nivel de expresión génica puede determinarse mediante la medición de la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen utilizando diversos métodos bien conocidos, incluyendo la transferencia northern y la RT-PCR cuantitativa. La cantidad de la proteína codificada por el gen puede medirse mediante métodos conocidos, incluyendo SDS-PAGE, seguido de ensayo de inmunotransferencia (análisis de transferencia western) o análisis de espectrometría de masas de las muestras de proteína.

Los métodos de manipulación de moléculas recombinantes de ADN y la clonación molecular, tal como la preparación de ADN plasmídico, la digestión, ligación y transformación de ADN, la selección de un oligonucleótido como cebador y la incorporación de mutaciones pueden ser métodos ordinarios bien conocidos por el experto ordinario en la materia. Estos métodos se describen en, por ejemplo, Sambrook J., Fritsch E.F. y Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) o Green M.R. y Sambrook J.R., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012); Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak y Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA”, 4a ed., Washington, DC, ASM Press (2009).

La bacteria que puede utilizarse en el método descrito en la presente memoria asimismo puede modificarse para atenuar la expresión de, por lo menos, un gen que codifica una fosfatasa (EC 3.1.3.-), ejemplos de la cual se enumeran en, por ejemplo, la base de datos UniProtKB (http://enzyme.expasy.org/EC/3.1.3.-). Según el método, la bacteria puede modificarse para atenuar la expresión de uno o más de entre un genaphA,un gencysQy un gencpdB.En un ejemplo, la bacteria puede modificarse para atenuar la expresión de un genaphA.La bacteria que presenta el genaphA,la expresión del cual es atenuada, puede modificarse adicionalmente para atenuar la expresión del gencysQy/o del gencpdB.En otro ejemplo, la bacteria puede modificarse para atenuar la expresión del gencysQ.La bacteria que presenta el gen cysQ, la expresión del cual ha sido atenuada, puede modificarse adicionalmente para atenuar la expresión del genaphAy/o y el gencpdB.

Las explicaciones proporcionadas posteriormente sobre la atenuación de la expresión del genaphAasimismo pueden aplicarse,mutatis mutandis,a cualquier gen que presente la expresión atenuada en la bacteria que pueda utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria. Entre los ejemplos de dichos genes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los genescysQycpdB.

La expresión “una bacteria que ha sido modificada para atenuar la expresión de un genaphA’’puede referirse a que la bacteria ha sido modificada de manera que, en la bacteriana modificada la expresión del genaphAha sido atenuada. A título de ejemplo, la expresión del genaphApuede atenuarse debido a la inactivación del genaphA.

La expresión “se inactiva un genaphA"puede referirse a que el gen modificado codifica una proteína totalmente inactiva o no funcional AphA en comparación con la bacteria que aloja un genaphAde tipo salvaje o no modificado. Asimismo resulta aceptable que la región de ADN modificada sea incapaz de expresar naturalmente el genaphAdebido a la deleción de una parte del gen o la deleción de todo el gen, la sustitución de una o más bases en la secuencia de nucleótidos del gen que causa una sustitución de aminoácido en la proteína codificada por el gen (mutación de sentido erróneo), la introducción de un codón de parada (mutación sin sentido), la deleción de una o dos bases que causa un desplazamiento del marco de lectura del gen, la inserción de un gen de resistencia a un fármaco y/o de una señal de terminación de la transcripción, o la modificación de una región contigua del gen, incluyendo secuencias que controlan la expresión génica, tales como uno o más promotores, uno o más intensificadores, uno o más atenuadores, uno o más sitios de unión ribosómica, etc. La inactivación del gen asimismo puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, métodos convencionales, tales como un tratamiento de mutagénesis utilizando irradiación de UV o nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina), la mutagénesis dirigida a sitio, la disrupción génica utilizando recombinación homóloga y/o la mutagénesis por inserción-deleción (Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(11):5978-5983; Datsenko K.A. y Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y. et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128) basada en la “ integración controlada por Red/ET” o la “integración mediada por ARed/ET”.

La expresión “la expresión del genaphAha sido atenuada” puede referirse a que la bacteria modificada contiene una región operablemente ligada al gen, incluyendo secuencias que controlan la expresión génica, tales como promotores, intensificadores, atenuadores y señales de terminación de la transcripción, sitios de unión ribosómica y otros elementos de control de la expresión, que se modifican, resultando en la reducción del nivel de expresión del genaphA,y otros ejemplos (ver, por ejemplo, el documento WO95/34672; Carrier T.A. y Keasling J.D., Biotechnol. Prog., 1999, 15:58-64). La expresión "operablemente ligada" en referencia a un gen puede referirse a que la región o regiones reguladoras están ligadas a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico o un gen de manera que la expresión (por ejemplo, la expresión potenciada, incrementada, constitutiva, basal, antiterminada, atenuada, desregulada, reducida o reprimida) de la secuencia de nucleótidos pueda tener lugar, específicamente, la expresión de un producto génico codificado por la secuencia de nucleótidos.

La expresión "la expresión del genaphAha sido atenuada” asimismo puede referirse a que la cantidad de un producto de expresión del genaphA, tal como la cantidad de ARNm del gen o la cantidad de la proteína AphA codificada por el gen, en la bacteria modificada, en la que se ha atenuado la expresión del genaphA, ha sido reducida, por ejemplo, a 50% o menos, a 20% o menos, a 10% o menos, a 5% o menos o incluso a 0% de la cantidad en la bacteria no modificada.

La expresión “una bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del genaphA” asimismo puede referirse a que la bacteria ha sido modificada de manera que en la bacteria modificada la actividad enzimática total del producto proteína correspondiente del gen, tal como la proteína AphA, ha sido reducida en comparación con dicha actividad en la bacteria no modificada. La bacteria puede modificarse de manera que la actividad de la proteína AphA por célula haya sido reducida, por ejemplo, a 50% o menos, a 20% o menos, a 10% o menos, a 5% o menos o incluso a 0% de esa actividad en la bacteria no modificada.

Entre los ejemplos de una bacteria no modificada que sirve de referencia para las comparaciones anteriormente indicadas se incluyen cepas de tipo salvaje de una bacteria perteneciente al géneroEscherichia,tal comoE. colicepa K-12 subcepa MG1655 (At Cc n° 47076),E. colicepa W3110 (ATCC n° 27325) o una bacteria perteneciente al géneroPantoea,tal comoP. ananatiscepa AJ13355 (FERM n° BP-6614).

La expresión de un genaphApuede atenuarse mediante la sustitución de una secuencia de control de la expresión del gen, tal como un promotor en el ADN cromosómico, por uno más débil. Por ejemplo, es posible introducir una o más sustituciones de nucleótido en una región de promotor del gen y modificar de esta manera el promotor para debilitarlo, tal como se da a conocer en el documento WO0018935 A1. Además, es conocido que la sustitución de varios nucleótidos en la secuencia de Shine-Dalgarno (SD) y/o en una región espaciadora entre la secuencia SD y el codón de inicio, y/o en una secuencia inmediatamente cadena arriba y/o cadena bajo del codón de inicio en el sitio de unión ribosómica afecta considerablemente a la eficiencia de traducción del ARNm. Dicha modificación del RBS puede combinarse con la reducción de la transcripción del genaphA.

La expresión del genaphAasimismo puede atenuarse mediante la inserción de un trasposón o una secuencia de inserción (IS) en la región codificante del gen (patente US n° 5.175.107) o en la región que controla la expresión génica, o mediante métodos convencionales, tales como la mutagénesis con radiación ultravioleta (UV) o nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, NTG). Además, la incorporación de una mutación específica de sitio puede llevarse a cabo mediante métodos de edición cromosómica basados en, por ejemplo, la recombinación mediada por ARed/ET (Datsenko K.A. y Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645).

El genaphA(sinónimos:ECK4047, hobH, JW4015, napAyyjbP)deE. colicodifica la fosfatasa ácida de clase B, AphA (EC 3.1.3.2, NCBI, GenBank, n° de acceso NC_000913.3, posiciones nucleótidas: 4269414 a 4270127, ID génico: 948562) y está localizado entre el genyjbSen la cadena opuesta y el genyjbQen la misma cadena del cromosoma deE. colicepa K-12. La secuencia de nucleótidos del genaphA(SEC ID n° 1) y la secuencia de aminoácidos de la proteína AphA (SEC ID n° 2) codificada por el genaphAnativo aE. colicepa K-12 subcepa MG1655 son conocidas. Además, se conocen homólogos de aminoácido de AphA nativos a otras especies bacterianas pertenecientes a la familiaEnterobacteriaceae,tales como, por ejemplo, los homólogos nativos a la especieShigella flexneri(idéntica a la AphA nativa aE. colicepa K-12 subcepa MG1655 (SEC ID n° 2): 100%),Shigella sonnei(identidad: 99%),Citrobacter freundii(identidad: 91%), Salmonella enterica (identidad: 89%),Kluyvera cryocrescensyEnterobacter cloacae(identidad: 84%),Klebsiella michiganensisyRaoultella planticola(identidad: 83%) yPantoeasp. 1.19 (identidad: 75%) (ver, por ejemplo, la base de datos del NCBI, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/). Por lo tanto, la proteína AphA nativa aE. colicepa K-12 subcepa MG1655 y el genaphAcodificante de la misma presentan proteínas y genes, respectivamente, que son homólogos de la proteína con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n° 2 y la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 1.

El gencysQ(sinónimos:amt, amtA, ECK4210yJW4172)deE. colicodifica la 3'(2')-5-bisfosfato nucleotidasa, CysQ (EC 3.1.3.7, NCBI, GenBank, n° de acceso NC_000913.3, posiciones nucleótidas: 4436755 a 4437495, ID génico: 948728) y está situado entre el gencpdBen la cadena complementaria y el genytfIen la misma cadena del cromosoma deE. colicepa K-12. Se conoce la secuencia de nucleótidos del gencysQ(SEC ID n° 3) y la secuencia de aminoácidos de la proteína CysQ (SEC ID n° 4) codificada por el gencysQnativo aE. colicepa K-12 subcepa MG1655. Además, asimismo se conocen los homólogos de aminoácido de CysQ nativos a otras especies bacterianas pertenecientes a la familiaEnterobacteriaceae, tales como, por ejemplo, los homólogos nativos a la especieShigella sonnei(identidad respecto a la CysQ nativa aE. colicepa K-12 subcepa MG1655 (SEC ID n°4): 99%);Citrobacter amalonaticus(identidad: 91%),Enterobacter cloacae(identidad: 90%),Salmonella entericayKlebsiella oxytoca(identidad: 88%),Pluralibacter gergoviae(identidad: 87%) yPantoea ananatis(identidad: 81%) (ver, por ejemplo, la base de datos del NCBI). Por lo tanto, la proteína CysQ nativa aE. colicepa K-12 subcepa MG1655 y el genCysQcodificante de la misma pueden presentar, respectivamente, proteínas y genes que son homólogos de la proteína que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n° 4 y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 3.

El gencpdB(sinónimos: ECK4209, JW4171) deE. colicodifica 2',3'-nucleótido cíclico 2'-fosfodiesterasa/3'-nucleotidasa, CpdB (EC 3.1.4.16, 3.1.3.6;<N c B i ,>GenBank, n° de acceso NC_000913.3, posiciones nucleótidas: 4434622 a 4436565, complemento), ID génico: 948729) y está localizado entre el gencysQy el genytfHen la cena complementaria del cromosoma deE. colicepa K-12. Se conoce la secuencia de nucleótidos del gencpdB(SEC ID n° 5) y la secuencia de aminoácidos de la proteína CpdB (SEC ID n° 6) codificada por el gencpdBnativo aE. colicepa K-12 subcepa MG1655. Además, asimismo se conocen homólogos de aminoácido de CpdB nativos a otras especies bacterianas pertenecientes a la familiaEnterobacteriaceae,tales como, por ejemplo, el homólogo nativo a la especieShigella sonneiyShigella flexneri(identidad respecto a la CpdB nativa aE. colicepa K-12 subcepa MG1655 (SEC ID n° 6): 99%);Citrobacter freundiiySalmonella enterica(identidad: 91%),Kluyvera ascorbata(identidad: 89%),Enterobacter cloacae(identidad: 88%),Klebsiella pneumonia(identidad: 87%) yPantoea ananatis(identidad: 75%) (ver, por ejemplo, la base de datos del NCBI). Por lo tanto, la proteína CpdB nativa aE. colicepa K-12 subcepa MG1655 y el gencpdBcodificante de la misma asimismo pueden presentar proteínas y genes, respectivamente, que son homólogos de la proteína que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n° 6 y la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC iD n° 5.

Las explicaciones proporcionadas posteriormente de las variantes del genaphAnativo aE. colicepa K-12 subcepa MG1655 y codificante de la proteína AphA asimismo pueden aplicarse, mutatis mutandis, a cualquier gen y proteína codificada por dicho gen, incluyendo genes y proteínas que son nativos a otras especies bacterianas pertenecientes a la familiaEnterobacteriaceae, que pueden utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria.

Puede haber diferencias en las secuencias de ADN entre las familias, géneros, especies o cepas de bacterias. Por lo tanto, el genaphAno se encuentra limitado al gen mostrado en SEC ID n° 1, aunque puede incluir genes que son secuencias de nucleótidos variantes u homólogas de SEC ID n° 1 y que codifican variantes de la proteína AphA.

La expresión “una proteína variante” puede referirse a una proteína que presenta una o más mutaciones en la secuencia en comparación con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n° 2, ya sean sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de uno o varios residuos aminoácidos, pero que todavía mantiene la actividad o función de la proteína, o la estructura tridimensional de la proteína variante no resulta significativamente modificada respecto a la de la proteína no modificada, tal como, por ejemplo, la proteína AphA de tipo salvaje que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n° 2. El número de cambios en la proteína variante depende de la posición del residuo o residuos aminoácidos en la estructura tridimensional de la proteína o el tipo de residuo o residuos aminoácidos. Puede ser, aunque no se encuentra estrictamente limitado, entre 1 y 50; en otro ejemplo, entre 1 y 40; en otro ejemplo, entre 1 y 30; en otro ejemplo, entre 1 y 20; en otro ejemplo, entre 1 y 15; en otro ejemplo, entre 1 y 10, y en otro ejemplo, entre 1 y 5, en SEC ID n° 2. Lo anterior resulta posible debido a que los aminoácidos pueden presentar una elevada homología entre sí, por lo que la actividad o función de la proteína no resulta afectada por dicha modificación, o la estructura tridimensional de la proteína no resulta modificada significativamente respecto a la proteína no modificada, tal como, por ejemplo, la proteína de tipo salvaje. Por lo tanto, las proteínas variantes codificadas por las secuencias de nucleótidos variantes del genaphApuede presentar una homología, definida como el parámetro “ identidad”, durante el uso del programa informático blastp, no inferior a 60%, no inferior a 70%, no inferior a 75%, no inferior a 80%, no inferior a 85%, no inferior a 90%, no inferior a 95%, no inferior a 96%, no inferior a 97%, no inferior a 98%, o no inferior a 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos entera mostrada en SEC ID n° 2, con la condición de que la actividad o función de la proteína variante no resulte significativamente modificada respecto a la proteína no modificada, tal como, por ejemplo, la proteína de tipo salvaje AphA con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n° 2.

En la presente memoria descriptiva, “homología” puede significar “identidad”, es decir, la identidad de residuos aminoácidos o nucleótidos. La identidad de secuencia entre dos secuencias se calcula como la proporción de residuos coincidentes en las dos secuencias al alinear dos secuencias de manera que se alcance la máxima alineación entre ellas.

La sustitución, deleción, inserción y/o adición ejemplificativa de uno o varios residuos aminoácidos pueden ser una o más mutaciones conservadoras. La mutación conservadora representativa puede ser una sustitución conservadora. La sustitución conservadora puede ser, aunque sin limitación, una sustitución, en la que la sustitución tiene lugar mutuamente entre Phe, Trp y Tyr, en el caso de que el sitio de sustitución sea de un aminoácido aromático; entre Ala, Leu, Ile y Val, en el caso de que el sitio de sustitución sea de un aminoácido hidrófobo; entre Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, His y Thr, en el caso de que el sitio de sustitución sea de un aminoácido hidrófilo; entre Gln y Asn, en el caso de que el sitio de sustitución sea un aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, en el caso de que el sitio de sustitución sea un aminoácido básico; entre Asp y Glu, en el caso de que el sitio de sustitución sea un aminoácido ácido, y entre Ser y Thr, en el caso de que el sitio de sustitución sea de un aminoácido con grupo hidroxilo. Entre los ejemplos de sustituciones conservadoras se incluyen la sustitución de Ser o Thr por Ala, la sustitución de Gln, His o Lys por Arg, la sustitución de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn, la sustitución de Asn, Glu o Gln por Asp, la sustitución de Ser o Ala por Cys, la sustitución de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln, la sustitución de Asn, Gln, Lys o Asp por Glu, la sustitución de Pro por Gly, la sustitución de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His, la sustitución de Leu, Met, Val o Phe por Ile, la sustitución de Ile, Met, Val o Phe por Leu, la sustitución de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys, la sustitución de Ile, Leu, Val o Phe por Met, la sustitución de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe, la sustitución de Thr o Ala por Ser, la sustitución de Ser o Ala por Thr, la sustitución de Phe o Tyr por Trp, la sustitución de His, Phe o Trp por Tyr, y la sustitución de Met, Ile o Leu por Val.

La sustitución, deleción, inserción y/o adición ejemplificativa de uno o varios residuos aminoácidos asimismo pueden ser una o más mutaciones no conservadoras con la condición de que la mutación o mutaciones se componen con una o más mutaciones secundarias en la posición o posiciones diferentes de la secuencia de aminoácidos de manera que se mantenga la actividad o función de la proteína, o la estructura tridimensional de la proteína variante no resulta significativamente modificada respecto a la proteína no modificada, tal como, por ejemplo, la proteína de tipo salvaje.

El cálculo del porcentaje de identidad de un polipéptido puede llevarse a cabo mediante la utilización del algoritmo blastp. Más específicamente, el cálculo del porcentaje de identidad de un polipéptido puede llevarse a cabo utilizando el algoritmo blastp en la configuración por defecto de los parámetros de puntuación (matriz: BLOSUM62; costes de hueco: existencia=11, extensión=1; ajustes composicionales: ajuste de la matriz de puntuaciones composicional condicional) proporcionados por el National Center for Biotechnology Information (NCBI). El cálculo del porcentaje de identidad de un polinucleótido puede llevarse a cabo utilizando el algoritmo blastn. Más específicamente, el cálculo del porcentaje de identidad de un polinucleótido puede llevarse a cabo utilizando el algoritmo blastn con los ajustes por defecto de los parámetros de puntuación (puntuaciones de coincidencia/no coincidencia=1,-2; costes por hueco=lineales) proporcionados por el NCBI.

El genaphAcodificante de una proteína AphA puede ser una secuencia de nucleótidos variante. La expresión “una secuencia de nucleótidos variante” puede significar la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína variante utilizando cualquier codón de aminoácidos sinónimo según la tabla estándar de códigos genéticos (ver, por ejemplo, Lewin B., “Genes VIII”, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458). Por lo tanto, un genaphAcodificante de una proteína AphA puede ser una secuencia de nucleótidos variante debido a la degeneración del código genético.

La expresión “una secuencia de nucleótidos variante” asimismo puede significar, aunque sin limitación, una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse bajo condiciones restrictivas con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia mostrada en SEC ID n° 1 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n° 2. Entre las condiciones restrictivas pueden incluirse aquellas condiciones bajo las que se forma un híbrido específico, por ejemplo, un híbrido que presenta una homología, definida como el parámetro “identidad” al utilizar el programa informático blastn, no inferior a 60%, no inferior a 70%, no inferior a 75%, no inferior a 80%, no inferior a 85%, no inferior a 90%, no inferior a 95%, o inferior a 96%, no inferior a 97%, no inferior a 98% o no inferior a 99%, y bajo las que no se forma un híbrido no específico, por ejemplo, un híbrido con una homología inferior a la anteriormente indicada. Por ejemplo, las condiciones restrictivas pueden ejemplificarse por el lavado una o más veces, o en otro ejemplo, dos o tres veces, a una concentración salina de 1xSSC (citrato sódico estándar o cloruro sódico estándar), SDS al 0,1% (dodecilsulfato sódico) a 60°C, 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 60°C, o 0.1xSSC, SDS al 0.1% a 65°C. La duración del lavado puede depender del tipo de membrana utilizado para la transferencia y, como regla general, debe ser la recomendada por el fabricante. Por ejemplo, la duración recomendada del lavado para la membrana de nilón con carga positiva HybondTM-N+ de Amersham (GE Healthcare) bajo condiciones restrictivas es de 15 minutos. La etapa de lavado puede llevarse a cabo 2 a 3 veces. Como la sonda, asimismo puede utilizarse una parte de la secuencia complementaria a la secuencia mostrada en SEC ID n° 1. Dicha sonda puede producirse mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa; ver White T.J. et al., The polymerase chain reaction, Trends Genet., 1989, 5:185-189) utilizando oligonucleótidos como cebadores preparados basándose en la secuencia mostrada en SEC ID n° 1 y un fragmento de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos como molde. La longitud de sonda recomendada es de >50 pb; puede seleccionarse convenientemente según las condiciones de hibridación y habitualmente es de entre 100 pb y 1kpb. Por ejemplo, en el caso de que se utilice como la sonda un fragmento de ADN con una longitud aproximada de 300 pb, las condiciones de lavado después de la hibridación pueden ser, por ejemplo, 2xSSC, SDS al 0.1% a 50°C, a 60°C o a 65°C.

Debido a que el genaphanativo a la especieE. coliy codificante de la proteína AphA ya ha sido elucidado (ver anteriormente), los genes nativos a otras especies bacterianas de la familiaEnterobacteriaceaey codificantes de la proteína AphA, y las secuencias de nucleótidos variantes del genaphAcodificante de proteínas variantes de la proteína AphA pueden obtenerse mediante PCR utilizando una bacteria de la familiaEnterobacteriaceaey cebadores oligonucleótidos preparados basándose en la secuencia de nucleótidos de un genaphAnativo a la bacteria; o mediante el método de mutagénesis dirigida a sitio a través del tratamientoin vitrodel a Dn que contiene el genaphAde tipo salvaje, por ejemplo, con hidroxilamina, o mediante un método de tratamiento de un microorganismo, por ejemplo, una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceaque aloja el genaphAde tipo salvaje, con radiación ultravioleta (UV) o un agente mutágeno, tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) y ácido nitroso, habitualmente utilizados para dicho tratamiento, o mediante síntesis química de la estructura génica de longitud completa.

La expresión “tipo salvaje”, que puede ser equivalente a los términos “nativo” y “natural” tal como se utilizan en la presente memoria en referencia a un gen (por ejemplo, “un gen de tipo salvaje”) y una proteína (por ejemplo, “una proteína de tipo salvaje”) puede significar, respectivamente, un gen nativo y una proteína nativa que existe y/o se expresa naturalmente en una bacteria de tipo salvaje y/o producido por la misma, por ejemplo, una cepa de tipo salvaje de una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceae,tal como, por ejemplo,E. colicepa MG1655 (ATCC n° 47076),E. colicepa W3110 (ATCC n° 27325) yP. ananatiscepa AJ13355 (FERM n° BP-6614). Debido a que las proteínas están codificadas por genes, “una proteína de tipo salvaje” puede estar codificada por “un gen de tipo salvaje” que se encuentra nativa o naturalmente en el genoma de una bacteria de tipo salvaje.

La bacteria que puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria puede obtenerse mediante la introducción de los ADN anteriormente mencionados codificantes de proteínas con las actividades deseadas en la bacteria que ya ha sido modificada para atenuar la expresión de uno o más de los ADN anteriormente mencionados codificantes de fosfatasas. Alternativamente, la bacteria puede obtenerse mediante atenuación de la expresión de uno o más ADN anteriormente mencionados codificantes de fosfatasas en la bacteria que ya habían sido modificados para producir proteínas que presentaban las actividades deseadas.

La bacteria puede presentar, además de las propiedades ya mencionadas, otras propiedades específicas, tales como diversos requisitos de nutrientes, resistencia a fármacos, sensibilidad a fármacos y dependencia de fármacos, sin apartarse del alcance de la presente invención.

2. Método

Un método para la sulfurilación enzimática de un sustrato tal como se indica en la presente memoria incluye las etapas de hace reaccionar el sustrato con PAPS en un medio que contiene una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceaepara producir un derivado sulfatado del sustrato (asimismo puede denominarse compuesto diana) y recoger el derivado sulfatado del medio. El método puede incluir, opcionalmente, la etapa de purificar el derivado sulfatado a partir del medio de manera que pueda obtenerse el compuesto diana en el grado de pureza deseado y/u otras etapas requeridas.

La etapa de hacer reaccionar un sustrato utilizando el método descrito en la presente memoria puede llevarse a cabo bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de una proteína que presente la actividad deseada, de manera que pueda producirse un derivado sulfatado del sustrato o un compuesto diana. El medio que puede utilizarse en el método puede ser cualquier medio, con la condición de que pueda sulfurilarse un sustrato en el medio para producir un derivado sulfatado del mismo mediante la utilización del método. El medio puede contener los componentes que resulten necesarios para la sulfurilación del sustrato mediante la utilización del método tal como se describe en la presente memoria, y entre ellos se incluyen, por lo menos, un solvente, una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceae,PAPS y un sustrato. Además de dichos componentes, el medio puede contener otro u otros ingredientes, tales como, por ejemplo, una o más sales orgánicas y/o inorgánicas, una o más sustancias alcalinas o ácidas, uno o más tensioactivos, sulfato de p-nitrofenilo (pNPS), y proteínas, incluyendo enzimas. En referencia al solvente, puede utilizarse un medio acuoso, en el que pueda funcionar, por lo menos, una proteína con actividad de sulfotransferasa, de manera que pueda determinarse la actividad de la proteína. Por ejemplo, puede utilizarse un medio de cultivo en el que se ha cultivado la bacteria que puede utilizarse en el método, para la sulfurilación enzimática de un sustrato, con la condición de que el medio de cultivo se haya complementado con componentes que resulten necesarios para la sulfurilación del sustrato. Además, puede seleccionarse apropiadamente la composición del medio para que asimismo pueda funcionar otra proteína o proteínas, por ejemplo, una proteína con actividad de heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa y/o una proteína con actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa.

Debido a que la bacteria que puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria ha sido modificada para producir, por lo menos, una proteína con actividad de sulfotransferasa, puede modificarse adicionalmente para producir una proteína con actividad de heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa y/o una proteína con actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa, las proteínas que presentan las actividades anteriormente indicadas pueden utilizarse sin aislamiento y/o purificación a partir de las células bacterianas y/o el medio de cultivo en el que se ha cultivado la bacteria. Es decir, puede utilizarse un medio de cultivo que contiene la bacteria que ha sido modificada tal como se indica en la presente memoria, con la condición de que la actividad de la proteína que presenta la actividad deseada pueda determinarse en el medio o pueda producirse un derivado sulfatado del sustrato mediante la utilización del método. Un medio de cultivo que puede utilizarse puede contener células rotas de la bacteria (denominado lisado celular en bruto) de manera que pueda utilizarse más eficazmente una proteína que presente la actividad deseada. Los métodos de disrupción celular son bien conocidos de la técnica, y entre ellos se incluyen, por ejemplo, la disrupción mecánica, la homogeneización líquida (incluyendo la prensa francesa), las ondas sónicas de alta frecuencia (denominada lisis ultrasónica), los ciclos de congelación-descongelación y la molienda manual.

Las condiciones para la sulfurilación enzimática de un sustrato mediante la utilización del método tal como se describe en la presente memoria pueden seleccionarse apropiadamente y ajustarse en referencia a las propiedades de las proteínas que pueden utilizarse en el método, en el que las propiedades son bien conocidas por el experto en la materia y pueden encontrarse en, por ejemplo, The Comprehensive Enzyme Information System (Brenda, https://www.brenda-enzymes.org) y la base de datos UniProtKB (https://enzyme.expasy.org). Por ejemplo, en el caso de que se utilice una proteína nativa a una especie de mamífero, la sulfurilación puede llevarse a cabo durante 24 a 72 horas a una temperatura de entre 25°C y 35°C y el pH puede mantener entre 6.5 y 7.5.

Una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceaeque puede utilizarse en el método tal como se describe en la presente memoria puede cultivarse bajo condiciones adecuadas para el cultivo de una bacteria seleccionada para la utilización en el método. Por ejemplo, en el caso de que se cultive una bacteria perteneciente al géneroEscherichia,el cultivo puede llevarse a cabo bajo condiciones aeróbicas durante 16 a 72 horas, o durante 16 a 24 horas o durante 32 a 48 horas; la temperatura de cultivo durante el cultivo puede controlarse entre 30°C y 45°C o entre 30°C y 37°C, y el pH puede ajustarse entre 5 y 8 o entre 6 y 7.5. El pH puede ajustarse utilizando una sustancia ácida o alcalina, inorgánica u orgánica, tal como urea, carbonato cálcico o gas amonio.

El medio de cultivo puede ser un medio sintético o natural, tal como un medio habitual que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de azufre, una fuente de fósforo, iones inorgánicos y otros componentes orgánicos e inorgánicos, según se requiera. Como la fuente de carbono, pueden utilizarse sacáridos, tales como glucosa, sacarosa, lactosa, galactosa, fructosa, arabinosa, maltosa, xilosa, trehalosa, ribosa e hidrolizados de almidones; alcoholes, tales como etanol, glicerol, manitol y sorbitol; ácidos orgánicos, tales como ácido glucónico, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido málico y ácido succínico; y ácidos grasos. Como la fuente de nitrógeno, pueden utilizarse sales amónicas inorgánicas, tales como sulfato amónico, cloruro amónico y fosfato amónico; nitrógeno orgánico, tal como de hidrolizado de soja; gas amonio, y amonio acuoso. Además, asimismo puede utilizarse peptona, extracto de levadura, extracto cárnico, extracto de malta y licor de maíz. El medio puede contener uno o más tipos de dichas fuentes de nitrógeno. La fuente de azufre puede incluir sulfato amónico, sulfato de magnesio, sulfato ferroso y sulfato de manganeso. El medio puede contener una fuente de fósforo además de la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno y la fuente de azufre. Como la fuente de fósforo, puede utilizarse dihidrogenofosfato potásico, hidrogenofosfato dipotásico y polímeros de fosfato, tales como ácido pirofosfórico. Pueden encontrarse presentes, en caso apropiado, incluso en cantidades traza, vitaminas, tales como vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, nicotinamida, vitamina B12, sustancias requeridas, por ejemplo, nutrientes orgánicos, tales como ácidos nucleicos, tales como adenina y ARN, aminoácidos, peptona, casaminoácido y extracto de levadura. Aparte de ellos, pueden añadirse, en caso necesario, cantidades pequeñas de fosfato cálcico, iones de hierro de iones de manganeso.

Puede producirse un derivado sulfatado del sustrato en una forma libre o en forma de una sal del mismo, o en forma de una mezcla de ellos. Por ejemplo, pueden producirse mediante el método sales de sodio, potasio, amonio y calcio del compuesto diana. Ello resulta posible porque el grupo sulfo (-SO<3>H) puede reaccionar bajo condiciones de sulfurilación con un agente neutralizador, tal como, por ejemplo, una sustancia alcalina en una reacción de neutralización ácido-base típica para formar una sal que es la característica química de las moléculas que contienen grupo sulfo que resultará evidente al experto ordinario en la materia.

Después de la etapa de reacción del sustrato, puede recogerse un derivado sulfatado del sustrato a partir del medio mediante la utilización de técnicas convencionales, tales como, por ejemplo, concentración, precipitación, cristalización, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía líquida de presión intermedia o alta, o una combinación de ellas, las cuales son bien conocidas por el experto ordinario en la materia. Además, puede purificarse el derivado sulfatado recogido a partir del medio de manera que pueda obtenerse el compuesto diana en el grado deseado de pureza, tal como, por ejemplo, no inferior a 30%, no inferior a 40%, no inferior a 50%, no inferior a 60%, no inferior a 70%, no inferior a 80%, no inferior a 90%, no inferior a 95%, no inferior a 96%, no inferior a 97%, no inferior a 98%, no inferior a 99% o no inferior a 99,9%. La pureza puede expresarse, por ejemplo, en términos de peso en peso (p/p).

Por ejemplo, en el caso de que se obtenga heparina como el compuesto diana mediante la utilización del método de sulfurilación enzimática tal como se describe en la presente memoria, la heparina puede recogerse del medio mediante la utilización de, por ejemplo, el procedimiento que se describe en van der Meer J.-Y. et al., 2017, y en las referencias citadas en esta publicación. En particular, en primer lugar, la heparina puede precipitarse a partir del medio mediante la utilización de una sal de amonio cuaternario, tal como, por ejemplo, Hyamine® 1622. A continuación, el complejo de Hyamine®-heparina precipitado puede extraerse utilizando solución concentrada de NaCl para obtener la sal heparina sódica. La sal heparina sódica a continuación puede someterse a cromatografía de intercambio aniónico bajo el control de temperatura, pH y concentración salina, para recuperar heparina fraccionada según la carga y la actividad específica. En este estadio, habitualmente puede obtenerse heparina con un grado de pureza suficiente. La heparina puede obtenerse, por ejemplo, como heparina de bajo peso molecular (abreviada como “HBPM”). La heparina de bajo peso molecular puede referirse, por ejemplo, a una fracción de un peso molecular de entre 1000 y 10000 Da (peso molecular medio de entre 4000 y 6000 Da). La HBPM tiene la ventaja de que muestra una menor reacción adversa hemorrágica en comparación con la heparina no fraccionada.

Opcionalmente, la heparina puede purificarse adicionalmente mediante la aplicación de precipitación utilizando solventes orgánicos, tales como, por ejemplo, metanol, etanol, propanol o acetona, y el blanqueo utilizando, por ejemplo, permanganato potásico (KMnO<4>), peróxido de hidrógeno (H<2>O<2>), ácido peracético (CH<3>CO<3>H), hipoclorito sódico (NaClO) u ozono (O<3>). La heparina puede purificarse finalmente mediante precipitación a partir de metanol o etanol de alto porcentaje. En caso necesario, la heparina precipitada puede secarse al vacío a una temperatura de entre 40°C y 75°C.

Asimismo resulta aceptable que al obtener la heparina como compuesto diana mediante la utilización del método de sulfurilación enzimática tal como se describe en la presente memoria, la heparina asimismo se someta a una etapa de despolimerización. La despolimerización puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la utilización de ácido nitroso o mediante el método de fotólisis, o enzimáticamente mediante la aplicación de heparinasa I, II o III, o una combinación de ellas. El grado de despolimerización no se encuentra particularmente limitado. La despolimerización puede llevarse a cabo de manera que se obtenga heparina con un peso molecular de, por ejemplo, 1000 a 35000 Da.

Ejemplos

La presente invención se explica con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos a continuación.

Ejemplo 1. Estudio de la estabilidad de PAP y PAPS en lisado celular deE. colicepa Origami®(ÚptrA AhslU)en el que se han delecionado los genes codificantes de fosfatasa.

1.1.E. coliK-12 cepa Origami® (AptrA AhslU).

Se estudió la estabilidad de PAP y PAPS en un lisado celular en bruto deE. coliK-12 cepa Origami®(ÚptrA AhslU),que había sido modificada adicionalmente para delecionar uno o más genes codificantes de fosfatasa seleccionados de entre los genesaphA, cysQycpdB.Es conocido que la actividad enzimática de las proteínas que se sintetizan o se producen en una célula puede verse afectada por la formación correcta de los enlaces disulfuro en las proteínas (ver, por ejemplo, Ke N. y Berkmen M., Production of disulfide-bonded proteins inEscherichia coli,Curr. Protoc. Mol. Biol., 2014, 108:16.1B.1-21). Por lo tanto, se seleccionóE. coliK-12 cepa Origami® 2 (Merck, n° de cat. 71344-3) con el genotipoA(ara-leu)7697 ÚlacX74 ÚphoA PvulI phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F[lac+ lac]q pro] gor522::Tn10 trxB (StrR, TetR)para la producción de una sulfotransferasa y heparosán-N-sulfato-glucuronato-5-epimerasa. La cepa presenta mutaciones en genes codificantes de tiorredoxina reductasa(trxB)y glutatión reductasa (gor), que potencian considerablemente la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma deE. coli.

Es conocido, además, que la sulfotransferasa y heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa pueden producirse eficazmente en bacteriasE. colicomo proteínas etiquetadas con proteína de unión a maltosa (MBP) (ver, por ejemplo, Bethea H.N. et al., Redirecting the substrate specificity of heparan sulfate 2-O-sulfotransferase by structurally guided mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105(48):18724-18729; Li K. et al., Using engineered 2-O-sulfotransferase to determine the activity of heparan sulfate C5-epimerase and its mutants, J. Biol. Chem., 2010, 285(15):11106-11113). Sin embargo, puede resultar deseable mejorar adicionalmente la eficacia de la producción de proteínas diana en lisados celulares en bruto. Lo anterior puede conseguirse mediante, por ejemplo, la reducción de la degradación proteolítica de las proteínas etiquetadas con MBP. En particular, pueden delecionarse uno o más genes codificantes de proteasa en la bacteria que expresa las proteínas. Los presentes inventores descubrieron que la estabilidad de las proteínas etiquetadas con MBP en lisados en bruto de células deE. colipuede mejorarse significativamente mediante la deleción de los genesptrAyhslUcodificantes de la proteasa periplásmica III y el componente ATPasa de la proteasa HslVU, respectivamente.

De esta manera, se seleccionóE. coliK-12 cepa Origami®(AptrA AhslU)como la cepa anfitriona óptima para la producción de proteínas etiquetadas con MBP y el estudio de la estabilidad de PAP y PAPS en lisados celulares en bruto.

1.2. Construcción de cepas deE. coliA2-5.

Se delecionaron los genesptrA, hslU, cysQ, cpdByaphAuno a uno en el cromosoma deE. coliK-12 cepa Origami® 2. Se utilizó el método de deleción génica en el marco (asimismo conocido como método Dual-In/Out) (Minaeva N.I. et al., BMC Biotechnol., 2008, 8:63). Se indican las cepas de A2-5 construidas en la tabla 1.

1.3. Preparación de lisados celulares en bruto.

Se cultivó cada una de las cepas A2-5 en 10 ml de medio LB (Sambrook J. y Russell D.W., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)) a 37°C durante la noche (durante aproximadamente 16 horas) en tubos de ensayo de 50 ml. A continuación, se recolectaron las células mediante centrifugación (5000 rpm), se resuspendieron en 0.3 ml de tampón A (Tris-HCl 100 mM, pH 7.5; glicerol al 10% (v/v)) y se rompieron mediante sonicación. Las fracciones de componentes celulares insolubles se precipitaron mediante centrifugación (13000 rpm). Las fracciones solubles de lisados celulares en bruto (denominados sobrenadantes) se transfirieron a viales nuevos y se utilizaron para estudiar la estabilidad de PAP y PAPS en un ensayo de estabilidad de PAP(S).

1.4. Ensayo de estabilidad de PAP(S).

Cada mezcla de reacción (100 j l) contenía MES 50 mM (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico), pH 7.0, MgCh 1 mM, Triton x100, al 1% (v/v) y 0.4 mg/ml de PAP o PAPS. Se añadió una fracción soluble de un lisado celular en bruto (ejemplo 1.3) hasta la concentración final de proteína de 2.5 mg/ml en la mezcla de reacción. A modo de control se utilizó agua en lugar del lisado. Se incubó cada mezcla de reacción a 30°C durante el periodo de tiempo indicado en las tablas 2 y 3 y después se analizaron mediante el método de HPLC. Las condiciones del análisis de HPLC fueron las siguientes:

Equipo: Alliance Waters,

Columna: TSK GEL DEAE-5PW 2x75 mm, 10 jm ,

Detección: detector de UV (detector de absorbancia dual), detección a 235 nm de NS y NS2S, detección a 254 nm para PAP y PAPS, en donde NS se refiere a a-AUA-[1->4]-GlcNS y NS2S se refiere a a-AUA-2S-[1->4]-GlcNS, en el que AUA se refiere a ácido 4-desoxi-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico y GlcNS se refiere a N-sulfo-D-glucosamina.

Gradiente de elución: 0 min - 0%, 15 min - 5% de B, 20 min - 30% de B, 30 min - 100% de B, durante 30 min - hasta 0% de B, en donde el tampón de elución A era NaH<2>PO<4>2.56 mM (pH 3.0, ajustado con H<3>PO<4>), acetonitrilo al 5%, y el tampón de elución B era NaH<2>PO<4>2.56 mM (pH 3.0, ajustado con H<3>PO<4>), LiC<h>0.5 M.

Temperatura: 40°C.

Tasa de elución: 0.2 ml/min.

Volumen de inyección: 10 jl.

Tiempo de inyección: 50 min.

Presión: 140 a 160 psi.

Muestras de calibración: 1 a 200 mg/l.

Límite de detección: 0.005 mg/l.

Tiempo de elución: PAP (19.42 min), NS (21.94 min), PAPS (26.02 min) y NS2S (28.91 min).

Los resultados del ensayo de estabilidad de PAP(S) se muestran en las tablas 2 y 3. Tal como puede observarse en la tabla 2, PAP es notablemente inestable en un lisado celular en bruto de la cepa A2, se degradó por completo en 22 horas. La deleción del gencysQen la cepa A2 para obtener la cepa A3 resultó en la mejora de la estabilidad de PAP; sin embargo, la totalidad de PAP se había degradado en 22 horas. La deleción del gencpdBen la cepa A3 para obtener la cepa A4 resultó en una mejora considerable de la estabilidad de PAP: se mantuvo aproximadamente 25% de PAP en la mezcla de reacción tras 22 horas de incubación. La deleción del genaphAen la cepa A4 para obtener la cepa A5 resultó en una mejora dos veces superior de la estabilidad de PAP; se mantuvo aproximadamente 50% de PAP en la mezcla de reacción tras 22 horas de incubación. De esta manera, la estabilidad de PAP puede mejorarse mediante la deleción de uno o más genes codificantes de AphA, CysQ y CpdB.

Tal como puede observarse en la tabla 3, PAPS es notablemente inestable en un lisado celular en bruto de la cepa A2; se había degradado por completo en 22 horas. La deleción del gencysQen la cepa A2 para obtener la cepa A3 resultó en una mejora diez veces superior de la estabilidad de PAPS en 22 horas. La deleción del gencpdBen la cepa A3 para obtener la cepa A4 no resultó en la mejora de la estabilidad de PAPS. La deleción del genaphAen la cepa A4 para obtener la cepa A5 resultó en una mejora dos veces superiores de la estabilidad de PAPS. De esta manera, la estabilidad de PAPS puede mejorarse mediante la deleción de uno o dos genes codificantes de AphA y CysQ.

Ejemplo 2. Sulfurilación enzimática de heparosán-N-sulfato de bajo peso molecular utilizando PAPS como donante de grupo sulfo.

La sulfurilación enzimática de heparosán N-sulfato de bajo peso molecular (abreviado como “HSBPM”) se llevó a cabo utilizando PAPS como donante de grupo sulfo y lisados celulares en bruto de cepas A2-5 que pueden producir heparosán sulfato 2-O-sulfotransferasa (HS 2-OST) y heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa (HNSG-5epi).

2.1. Construcción de plásmido pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356).

2.1.1. Construcción de vector pMAL*

El vector pMAL-c2X (New England BioLabs, n° de cat. E8000S) se modificó para sustituir el fragmento de ADN codificante del conector peptídico S<3>N<10>LGIEGRISEFGS con un fragmento de ADN codificante del extremo C-terminal de la proteína m Bp , en el que el residuo de ácido glutámico en la posición 359 se sustituyó por un residuo de alanina (E359A), el residuo de lisina en la posición 362 se sustituyó por un residuo de alanina (K362A) y el residuo de ácido aspártico en la posición 363 se sustituyó por un residuo de alanina (D363A) (Rob J.C. et al., Crystallization of a trimeric human T cell leukemia virus type 1 gp21 ectodomain fragment as a chimera with maltose-binding protein, Prot. Science, 1998, 7:1612-1619). Además, se introdujeron los sitios de restricciónHindIII-BamHI-Sad-XhoI-NotIen el vector.

El fragmento de PCR que contenía una parte del extremo C-terminal de MBP flanqueado por los sitios de restricción 5'-BglII y3’-HindIIIse amplificó utilizando los cebadores P1 (SEC ID n° 7) y P2 (SEC ID n° 8), el plásmido pMAL-c2X como molde. El producto de PCR se ligó en los sitios de restricciónBglIl/HindIIIde plásmido pMAL-c2x. De esta manera, se construyó el vector pMAL*.

2.1.2. Construcción del plásmido pMAL*-2OSTY94A(D69-N356).

Un fragmento de ADN (SEC ID n° 9) que alojaba una secuencia codificante (CDS) codificante de HS 2-OST mutante con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n° 10 que corresponde al polipéptido entre el residuo de ácido aspártico en la posición 69 (D69) y el residuo de asparagina en la posición 356 (N356) en HS 2-OST nativo aCricetulus longicaudatus(UniProtKB, n° de acceso O0889.1), en el que el residuo de tirosina en la posición 94 se ha sustituido por un residuo de alanina (Y94A), se sintetizó químicamente mediante síntesis de ADN personalizada GeneArt® (Thermo Fisher Scientific). El fragmento de ADN se digirió utilizando las restrictasasNotlyXhoI,y se clonó en el vector pMAL*/NotI-XhoI.

2.1.3. Construcción de plásmido pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356).

El fragmento de ADNFspI-HindIIIde 3.6 kpb de plásmido pMAL*-2OST(D69-N356) se subclonó en los sitios de restricciónEcoRV/HindIIIdel vector de clonación pACYC184 (GenBank/EMBL, n° de acceso X06403). De esta manera, se construyó el plásmido pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356).

2.2. Construcción del plásmido pSUMO-dreGlce(G70-N585).

Un fragmento de ADN (SEC ID n° 11) codificante del péptido SUMO etiquetado en N con 6xHis (SEC ID n° 12) derivado del vector pETite™ N-His SUMO Kan (Lucigen Corporation, 2904 Parmenter St, Middleton, WI53562 EE. UU.), en el que el péptido se fusionó con el fragmento (G70-N585) de HNSG-5epi que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n° 13 que corresponde al polipéptido entre el residuo de glicina en la posición 70 (G70) y el residuo de asparagina en la posición 585 (N585) en HNSG-5epi nativo aDanio rerio(secuencia de referencia del NCBI: NP_998014.1) se sintetizó químicamente mediante síntesis de ADN personalizada GeneArt® (Thermo Fisher Scientific). El fragmento de ARN se dirigió utilizando las restrictasasNdelyXhol,se clonó en el vector pMAL*/NdeI-XhoI (ejemplo 2.1.1). De esta manera, se construyó el plásmido pSUMO-dreGlce(G70-N585).

2.3. Construcción de las cepas A2-5 que alojaban los plásmidos pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356) y pSUMO-dreGlce(G70-N585).

Se introdujeron los plásmidos pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356) y pSUMO-dreGlce(G70-N585) en las cepas A2-5 utilizando el procedimiento estándar de electroporación (cubeta de 0.1 cm (Bio-Rad), voltaje: 2 kV; duración: 5 ps). En primer lugar, se introdujo el plásmido pSUMO-dreGlce(G70-N585) para construir las cepas A2-5/pSUMO-dreGlce(G70-N585). A continuación, se introdujo el plásmido pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356) en las cepas A2-5/pSUMO-dreGlce(G70-N585) para construir las cepas A2-5 diana que alojaban dos plásmidos. Las cepas A2-5 que alojaban los plásmidos pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356) y pSUMO-dreGlce(G70-N585) reciben la denominación de cepas A2-5/pSUMO/pACYC184.

2.4. Preparación de fracciones solubles de lisados celulares en bruto de A2-5/pSUMO/pACYC184.

Los cultivos celulares de las cepas A2-5 que alojaban los plásmidos pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356) y pSUMO-dreGlce(G70-N585) en un volumen de 1.25 ml cada uno, cultivados durante la noche en caldo LB que contenía ampicilina (200 mg/l) y cloranfenicol (30 mg/l), se inocularon en 50 ml del caldo LB que contenía ampicilina (150 mg/l) y cloranfenicol (30 mg/l) en matraces y después se cultivaron a 37°C hasta una DO<600>de aproximadamente 0.8. A continuación, se indujo la síntesis de HS 2-OST y HNSG-5epi mediante la adición de IPTG (isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido) a una concentración final de 0.5 mM. Se continuó con el cultivo a 20°C durante 48 horas.

Las biomasas resultantes se recolectaron mediante centrifugación (5000 rpm), se resuspendieron en 0.3 ml de solución de MES 50 mM (ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico) (pH 7) y se sometieron a sonicación para la fragmentación de las células. A continuación, se precipitaron fracciones insolubles de lisados celulares en bruto que contenían proteínas insolubles mediante centrifugación (13000 rpm), se resuspendieron en 0.3 ml de un tampón para muestras (Tris-HCl 20 mM, pH 6.8; DTT 50 mM (1,4-ditiotreitol), SDS al 0.1% (v/v), glicerol al 30% (v/v) y se incubaron a 95°C durante 10 min. A continuación, las fracciones insolubles se precipitaron nuevamente mediante centrifugación (13000 rpm). Los sobrenadantes obtenidos se utilizaron como preparaciones de proteínas insolubles. Las fracciones solubles de lisados celulares en bruto (denominados sobrenadantes) obtenidos como resultado del procedimiento anterior y que contenían proteínas solubles, incluyendo proteínas con actividades de heparán sulfato 2-O-sulfotransferasa y heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa se transfirieron a viales nuevos y se almacenaron a 4°C durante como máximo 3 a 5 horas hasta la utilización. Las concentraciones medias de proteínas en las fracciones solubles preparadas de esta manera de lisados celulares en bruto eran de 20 mg/ml.

Con el fin de analizar el contenido de proteínas en fracciones solubles e insolubles de lisados celulares en bruto de cepas A2-5 que alojaban los plásmidos pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356) y pSUMO-dreGlce(G70-N585), 1 pl de cada preparación se sometió a análisis de SDS-PAGE (fig. 3). Tal como puede observarse en la figura 3, las cantidades absoluta y relativa de HS 2-OST y HNSG-5epi en todos los lisados celulares en bruto analizados de las cepas eran iguales.

2.5. 2-O-Sulfurilación de HSBPM utilizando PAPS como donante de grupos sulfo.

Se llevó a cabo la 2-O-sulfurilación de HSBPM en una mezcla de reacción de un volumen total de 100 pl que contenía: MES 50 mM, pH 7; MgCh 1 mM, Triton x100 al 1% (v/v), CaCh 1 mM, PAPS 1.2 mM, HSBPM 1 mg/ml (ejemplo auxiliar) y 83 pl de fracción soluble de un lisado celular en bruto (ejemplo 2.4). La reacción negativa (de control) contenía los componentes anteriormente indicados excepto el lisado, que se sustituyó por agua. La mezcla de reacción se incubó a 30°C durante 48 horas. A continuación, una parte de la mezcla de reacción se trató con heparinasa I, II y III (New England BioLabs, n° de cat. P0735S, PO736S y P0737S). Una mezcla de reacción en un volumen total de 100 pl contenía: 30 pl de la mezcla de reacción obtenida después de la incubación, 10 pl de tampón de heparinasa (New England BioLabs), heparinasa I, II y III (1 pl de cada enzima) y 60 pl de H<2>O. La mezcla de reacción se incubó a 30°C durante 24 horas y después se analizó utilizando el método de HPLC para la presencia y cantidad de los disacáridos NS (a-AUA-[1->4]-GlcNS) y NS2S (a-AUA-2S-[1->4]-GlcNS). Las condiciones del análisis de HPLC eran las indicadas en el ejemplo 1.4.

Los resultados de la 2-O-sulfurilación del HSBPM se muestran en la tabla 4. Tal como puede observarse en la tabla 4, la 2-O-sulfurilación del HSBPM utilizando PAPS como donante de grupos sulfo era aproximadamente 1.4 veces más eficaz al utilizar el lisado celular en bruto de cepa A5/pSUMO/pACYC184 en la que se habían delecionado los genescysQ, cpdByaphA,en comparación con la cepa A2/pSUMO/pACYC184.

Ejemplo 3. Sulfurilación enzimática de heparosán N-sulfato de bajo peso molecular en presencia de pNPS.

Se llevó a cabo la sulfurilación enzimática del HSBPM asimismo en lisados celulares en bruto de cepas de A2-5(pSUMO/pACYC184 que contenían pNPS y una arilsulfotransferasa utilizando PAPS como un donante de grupos sulfo.

3.1. Expresión y purificación de arilsulfotransferasa 1A1 deRattus norvegicus.

En primer lugar, se construyó el plásmido pETDuet-N-Tag6xHis-ST1A1 que alojaba el gen codificante de ST1A1 nativo aRattus norvegicus.Un fragmento de ADN (SEC ID n° 14) que contenía el gen codificante de la arilsulfotransferasa 1A1 (abreviada como “ST1A1”, asimismo conocida como “Sult1a1”) nativa aRattus norvegicus(secuencia de referencia del NCBI: NP_114022.1) se sintetizó químicamente mediante síntesis de ADN personalizada GeneArt® (Thermo Fisher Scientific). El fragmento de ADN obtenido se digirió utilizando las restrictasasEcoRIeHindlIIy se clonó en el vectorpETDuet-1/EcoRI-HindIII(Novagen). De esta manera, se obtuvo un gen codificante de ST1A1 nativo aRattus norvegicusfusionado con etiqueta 6xHis.

A continuación, el ST1A1 etiquetado con 6xHis se expresó y purificó utilizando cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) en una columna HiTrap de 1 ml (GE Healthcare). Se aplicaron los procedimientos estándares recomendados por el fabricante.

3.2. O-Sulfurilación de HSBPM en presencia de pNPS.

Se llevó a cabo la 2-O-sulfurilación de HSBPM en una mezcla de reacción de un volumen total de 100 pl que contenía MES 50 mM, pH 7; MgCh 1 mM, Triton x100 al 1% (v/v), CaCh 1 mM, PAP 46 pM, pNPS 10 mM, HSBPM 1 mg/ml (ejemplo auxiliar), 4.75 pg de ST1A1 (ejemplo 3.1) y 74 pl de fracción soluble de un lisado celular en bruto (ejemplo 2.4). La reacción negativa (de control) contenía los componentes anteriormente indicados excepto por el lisado, que se sustituyó por agua. La mezcla de reacción se incubó a 30°C durante 48 horas. Las condiciones del tratamiento de la mezcla de reacción con heparinasas y el análisis de las mezclas obtenidas utilizando HPLC eran las mismas que las indicadas en el ejemplo 2.5.

Los resultados de 2-O-sulfurilación de HSBPM en presencia de pNPS se muestran en la tabla 5. Tal como puede observarse a partir de la tabla 5, el rendimiento de sulfurilación de HSBPM en presencia de pNPS utilizando PAPS como donante de grupos sulfo era de 75% al utilizar el lisado celular en bruto de la cepa A5/pSUMO/pACYC184 con deleción de los genescysQ, cpdByaphA,mientras que no se detectó el producto sulfurilado del HSBPM al utilizar el lisado celular en bruto de A2/pSUMO/pACYC184. Además, la 2-O-sulfurilación de HSBPM en presencia de pNPS utilizando PAPS como donante de grupos sulfo era aproximadamente 16 y 15 veces superior al utilizar el lisado celular en bruto de cepa A5/pSUMO/pACYC184 con deleción de los genescysQ, cpdByaphA,en comparación con la cepa A3/pSUMO/pACYC184 con deleción del gencysQy la cepa A4/pSUMO/pAcYc184, con deleción de los genescysQycpdB,respectivamente.

Ejemplo 4. Sulfurilación enzimática de PAP utilizando pNSP como donante de grupos sulfo.

4.1. Construcción del plásmido pPlac-N-etiqueta 6-His-ST1A1.

Para construir el plásmido pPlac-N-etiqueta 6xHis-ST1A1, se obtuvo un fragmento de ADN mediante PCR utilizando los cebadores P3 (SEC ID n° 15) y P4 (SEC ID n° 16) y el plásmido pETDuet-N-etiqueta 6xHis-ST1A1 (ejemplo 3.1) como molde. El fragmento de ADN obtenido se ligó en los sitiosNdeI/HindIIIdel plásmido pMAL* (ejemplo 2.1.1).

4.2. Construcción de cepas A2-5 que alojaban el plásmido pPlac-N-etiqueta 6xHis-ST1A1.

Se introdujo el plásmido pPlac-N-etiqueta 6xHis-ST1A1 en las cepas A2-5 (ejemplo 1.2, tabla 1) mediante la utilización del procedimiento estándar de electroporación (cubeta de 0.1 cm (Bio-Rad), voltaje: 2 kV; duración: 5 ps). Las cepas A2-5 que alojaban el plásmido pPlac-N-etiqueta 6xHis-ST1A1 se denominan cepas A2-5/pST1A1.

4.3. Preparación de fracciones solubles de lisados celulares en bruto de cepas A2-5/pST1A1.

Las células de las cepas A2-5/pST1A1, preparadas al efecto mediante el cultivo durante la noche en placas de agar, se inocularon en 5 ml de caldo LB que contenía ampicilina (200 mg/l) en tubo de ensayo de 20 ml hasta la DO<595>inicial de 0.1 y se cultivaron a 37°C hasta una DO<595>final de 1.2. A continuación, se indujo la síntesis de N-etiqueta 6xHis-ST1A1 mediante la adición de IPTG (isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 1 mM. Se continuó el cultivo a 25°C durante 16 horas. Se recolectó la biomasa resultante mediante centrifugación a 4°C durante 10 minutos a 3.3 fcr (fuerza centrífuga relativa), se lavó dos veces con 25 ml de solución de NaCl al 0.9% y se congeló a -20°C hasta la utilización.

El sedimento de células descongeladas se resuspendió en 0.5 ml de tampón (Tris-HCl 100 mM, glicerol al 10% (v/v), pH 7.4) y las células se rompieron mediante sonicación. Se eliminaron los residuos celulares mediante centrifugación a 13000 rpm durante aproximadamente 20 minutos. Los lisados celulares en bruto resultantes se utilizaron como preparaciones de proteína ST1A1.

4.4. Sulfurilación de PAP utilizando pNPS como donante de grupos sulfo.

Cada mezcla de reacción de un volumen total de 100 pl contenía: Tris-HCl 50 mM, pH 7; PAP 230 pM; pNPS 1 mM; glicerol al 10% (v/v); 0.1 mg/ml de un lisado celular en bruto de cepas A2-5/pST1A1. Las mezclas se prepararon en una placa de 96 pocillos estándar. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de PAP. Las mezclas de reacción se incubaron a 30°C durante 3 horas en MultiskanGo (Thermo Scientific). Se midió la DO<405>cada 5 minutos para todos los pocillos utilizados, de manera que se obtiene la cinética de la síntesis de pNP (fig.

4). Se determinó la concentración absoluta de pNP utilizando una curva de calibración que se obtuvo como la dependencia de la DO<405>de la concentración de pNP. La cantidad acumulada de PAPS en las mezclas de reacción (en proporción molar) se supuso que era igual a la cantidad acumulada de pNP en vista de la ecuación: PAP pNPS = PAPS pNP.

Tal como puede observarse a partir de los datos experimentales obtenidos (figura 4), se observó el rendimiento de sulfurilación más alto de PAP al utilizar el lisado celular en bruto de la cepa A5/pST1A1 con deleción de los genescysQ, cpdByaphA.El rendimiento de acumulación (en pM) de PAPS en el lisado celular en bruto de la cepa A5/pST1A1 era aproximadamente dos veces superior al rendimiento en el lisado celular en bruto de la cepa A2/pST1A1 sin deleción de los genescysQ, cpdByaphA.

Ejemplo auxiliar. Preparación de heparosán N-sulfato de bajo peso molecular (HSBPM).

(1) Preparación de heparosano.

(1.1) Fermentación de heparosano.

Se obtuvo una solución de cultivo que contenía heparosano utilizando la bacteria productora de heparosano (cepa deEscherichia coliBL21 (DE3)/pVK9-kfiABCD) y las condiciones de cultivo indicadas en el ejemplo 1 del documento WO2015/050184.

(1.2) Purificación de heparosano.

Se recogió el sobrenadante de cultivo a partir de la solución de cultivo mediante centrifugación. Con el fin de eliminar los ingredientes del medio, se lavó 1 ml del sobrenadante de cultivo con agua Milli-Q utilizando una membrana UF y se concentró a 250 pl. A 250 pl de la solución concentrada con la membrana de UF, se añadieron 500 pl de etanol al 100% y se precipitó el heparosano mediante centrifugación. El precipitado resultante se secó al aire, obteniendo heparosano. Asimismo a partir del sobrenadante de cultivo remanente, se purificó heparosano utilizando el mismo procedimiento. Se obtuvieron en total 10 g de heparosano.

(2) N-desacetilación de heparosano.

A) A 1.22 g del heparosano, se le añadieron 61 ml de hidrazina-^O y 4.7 ml de ácido sulfúrico 1 N y, tras sustituir la fase gaseosa por nitrógeno, se calentó la mezcla a 100°C y se hizo reaccionar durante 4.75 horas.

B) Tras detener la reacción mediante enfriamiento con hielo, se añadieron 61 ml de solución acuosa de NaCl al 16% y 610 ml de MeOH y la mezcla se centrifugó. Se separó el sobrenadante. El precipitado resultante se disolvió en 50 ml de H<2>O y a continuación se desaló y se concentró utilizando una membrana de UF Amicon (3 kDa).

C) A la solución concentrada resultante, se le añadió el doble de volumen de H<2>O y el volumen equivalente de NaHCO<3>1 M y después se añadió gota a gota solución de I<2>0.2 M/KI 0.4 M hasta tornarse de color amarillo. A continuación, se añadió gota agota hidrazina-^O para reducir el exceso de yodo a ion yoduro y a continuación se desaló la solución y se concentró utilizando nuevamente una membrana de UF Amicon (3 kDa). La solución concentrada se secó bajo presión reducida, obteniendo heparosano N-desacetilado. La proporción residual de grupo acetilo en el heparosano N-desacetilado obtenido era de 14.9% (indicado posteriormente).

(3) Despolimerización de heparosano N-desacetilado.

(3.1) Preparación de heparinasa III.

(3.1.1) Construcción de plásmido de expresión que aloja el genhepCnativo aFlavobacterium heparinum.

El genhepCcodificante de la heparinasa III nativa aFlavobacterium heparinumse clonó en el vector pMIV-Pnlp0 (solicitud publicada de patente US n° 20050196846) para construir el plásmido de expresión del genhepc,pMIV-PnlpO-hepC. El plásmido pMIV-Pnlp0-ter incluye un promotornlp0potente (PnlpO) y un terminadorrrnBy puede funcionar como unidad de expresión mediante la inserción de un gen objetivo entre el promotor y el terminador. “PnlpO” representa un promotor para el gennlpDde tipo salvaje nativo aEscherichia coliK-12.

Los detalles de la construcción del plásmido de expresión se muestran posteriormente. Se obtuvo un fragmento de ADN que incluía aproximadamente 300 pb de una región de promotor (PnlpO) del gennlpDmediante PCR con el ADN cromosómico deEscherichia coliMG1655 como molde utilizando el cebador P5 (SEC ID n° 17) y el cebador P6 (SEC ID n° 18). Se diseñaron los sitios para los enzimas de restricciónSalíyPaelen cada extremo 5'-terminal de dichos cebadores. Los ciclos de PCR fueron los siguientes: en primer lugar, 95°C durante 3 minutos, seguido de dos ciclos de 95°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos y 72°C durante 40 segundos; a continuación, 25 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 55°C durante 20 segundos y 72°C durante 15 segundos, y finalmente 72°C durante 5 minutos. Un fragmento de ADN resultante se trató conSalIyPaeIy se insertó en el sitioSall-Paelde pMIV-5JS (solicitud publicada de patente japonesa 2008-99668) con el fin de obtener el plásmido pMIV-Pnlp0. La secuencia de nucleótidos del fragmentoPael-Salldel promotor Pnlp0 insertado en dicho plásmido pMIV-Pnlp0 es tal como se muestra en SEC ID n° 19.

A continuación, el fragmento de ADN (SEC ID n° 20) que incluía aproximadamente 300 pb de una región de terminador del genrrnBse obtuvo mediante PCR con el ADN cromosómico de MG1655 como molde utilizando el cebador P7 (SEC ID n° 21) y el cebador P8 (SEC ID n° 22). Se diseñaron los sitios de enzima de restricciónXbalyBamHlen cada extremo 5'-terminal de dichos cebadores. Los ciclos de PCR fueron los siguientes: en primer lugar, 95°C durante 3 minutos, seguido de 2 ciclos de 95°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos y 72°C durante 40 segundos; a continuación, 25 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 59°C durante 20 segundos y 72°C durante 15 segundos, y finalmente 72°C durante 5 minutos. El fragmento resultante se trató conXbalyBamHly se insertó en el sitioXbal-BamHlde pMIV-Pnlp0, obteniendo el plásmido pMIV-Pnlp0-ter.

A continuación, se sintetizó artificialmente una cadena de ADN que incluía el ORF del genhepCnativo aFlavobacterium heparinum(ATCC n° 13125; Su H. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62:2723-2734). Se amplificó un fragmento de ADN del genhepCmediante PCR con dicha cadena de ADN como molde utilizando el cebador P9 (SEC ID n° 23) y el cebador P10 (SEC ID n° 24). Se llevó a cabo la PCR utilizando la polimerasa PrimeStar (TaKaRa) en la composición de reacción indicada en el protocolo. El ciclo de PCR fue el siguiente: en primer lugar, 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 55°C durante 10 segundos y 72°C durante 8 minutos, y finalmente el mantenimiento a 4°C. Además, se obtuvo un fragmento de ADN de pMIV-Pnlp0 mediante PCR con pMIV-Pnlp0 como ADN de molde utilizando los oligonucleótidos cebadores P11 (SEC ID n° 25) y P12 (SEC ID n° 26). La PCR se llevó a cabo utilizando la polimerasa PrimeStar (TaKaRa) y la composición de reacción indicada en el protocolo. El ciclo de PCR fue el siguiente: en primer lugar, 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 55°C durante 10 segundos y 72°C durante 6 minutos, y finalmente el mantenimiento a 4°C. Los dos fragmentos de ADN resultantes se ligaron utilizando el kit de clonación InFusion (marca comercial registrada) HD (Clontech) para construir el plásmido de expresión de genhepC,pMIV-Pnlp0-hepC. La secuencia de nucleótidos del genhepCclonada y la secuencia de aminoácidos de la heparinasa III (HepC) codificada por la misma se muestran en<s>E<c>ID n° 27 y n° 28, respectivamente.

(3.1.2) Construcción de la cepa deEscherichia coliBL21 (DE3) que expresa el genhepCy preparación de solución de enzima heparinasa III.

Se introdujo el plásmido de expresión del genhepC,pMIV-Pnlp0-hepC, en la cepa deEscherichia coliBL21 (DE3) (Life Technologies) mediante electroporación (Cell; 80 pl, 200 O, 25 pF, 1,8 kV, cubeta: 0.1 ml), obteniendo la cepa deEscherichia coliBL21 (DE3)/pMIV-Pnlp0-hepC como cepa productora de heparinasa III. Esta cepa de precultivó en medio LB con adición de cloranfenicol 25 pg/ml a 37°C durante la noche. A continuación, la solución de cultivo se inoculó en 300 ml de medio LB en un matraz de Sakaguchi a una concentración final de 2% (v/v). El cultivo bajo agitación se llevó a cabo a 37°C durante 4 horas y a continuación se detuvo el cultivo. Tras la centrifugación, las células microbianas se lavaron dos veces con NaCl al 0.85% y se suspendieron en 30 ml de tampón HEPES 50 mM (pH 7.0). La suspensión se sometió a disrupción mediante sonicación para romper las células microbianas. La solución de células microbianas rotas se centrifugó para preparar una solución de enzima heparinasa III como sobrenadante (solución de extracto sin células).

(3.2) Despolimerización con heparinasa III de heparosano N-desacetilado.

Se disolvieron 1 g de heparosano N-desacetilado con una proporción residual de grupos N-acetilo de 14.9% obtenido en (2) y 2 ml de solución de heparinasa III 31.3 mUI/pl en 100 ml de solución tampón Tris (pH 8.0) que contenía NaCl l0o mM y CaCh 1.5 mM y se hicieron reaccionar a 37°C durante 5.3 horas. A la solución de reacción se le añadieron 100 ml de solución acuosa de NaCl 16% y 900 ml de EtOH y se mezclaron, y se centrifugaron para eliminar el sobrenadante y obtener heparosano N-desacetilado despolimerizado.

(4) N-sulfatación de heparosano N-desacetilado despolimerizado.

A) Se disolvió 1 g del heparosano N-desacetilado despolimerizado obtenido en (3) en 50 ml de agua Milli-Q y se añadieron a lo anterior 50 ml de una solución acuosa de NaHCO<3>20 mg/ml/trimetilaminaSO<3>20 mg/ml, y la mezcla se hizo reaccionar a 55°C durante la noche.

B) A la mezcla se le añadió 1 l de EtOH, que a continuación se centrifugó para eliminar el sobrenadante y obtener heparosano N-sulfato despolimerizado.

C) El heparosano despolimerizado N-sulfato se disolvió en agua Milli-Q hasta obtener 500 pl y se llevó a cabo el análisis de los disacáridos para calcular el rendimiento respecto al heparosano N-desacetilado. Además, se sometió a GPC para calcular la distribución de pesos moleculares. Se muestran los procedimientos a continuación.

<Análisis de disacáridos>

Se llevó a cabo el análisis de disacáridos del heparosano despolimerizado N-sulfatado de acuerdo con las condiciones previamente publicadas (T. Imanari et al., “High-performance liquid chromatographic analysis of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides”, J. Chromatogr. A, 1996, 720:275-293). Es decir, se cuantificó la cantidad de cada disacárido constituyente mediante descomposición del heparosano despolimerizado N-sulfatado en disacáridos insaturados utilizando las heparinasas II y II y el análisis mediante HPLC de cada producto descompuesto.

De manera similar, se llevó a cabo el análisis de disacáridos del heparosano N-desacetilado. Se llevó a cabo el análisis de disacáridos del heparosano N-desacetilado tras N-sulfatar el heparosano N-desacetilado. Es decir, se cuantificó la cantidad de cada disacárido constituyente mediante N-sulfatación de heparosano N-desacetilado, descomponiéndolo a continuación en disacáridos insaturados utilizando las heparinasas II y II y analizando cada producto descompuesto mediante HPLC. La N-sulfatación del heparosano N-desacetilado se llevó a cabo tal como se llevó a cabo la N-sulfatación del heparosano N-desacetilado despolimerizado.

El análisis de disacáridos se llevó a cabo específicamente mediante el procedimiento siguiente.

1) Se mezclaron 0.2 U de heparinasa II (Sigma), 0.02 a 0.03 mUI de heparinasa III, 5 pg de una muestra de polisacáridos y 10 pl de tampón para la digestión enzimática (CH<3>COONa 100 mM, (CH<3>COo)<2>Ca 10 mM, pH 7.0) y se diluyeron con agua Milli-Q hasta obtener 100 pl de volumen medido para la utilización como solución de reacción.

2) La solución de reacción se conservó a 37°C durante 16 horas o más y posteriormente se sometió a ebullición a 100°C durante 2 minutos para detener la reacción.

3) Las impurezas se eliminaron mediante filtración a través de un filtro de 0.47 pm, obteniendo una solución que a continuación se utilizó como muestra para el análisis de disacáridos.

4) El análisis se llevó a cabo utilizando una columna Inertsil ODS-3 de 150 mm x 2.1 mm con un tamaño de partícula de 5 pm, bajo las condiciones siguientes: temperatura de 50°C, caudal de 0.25 ml/min y longitud de onda de detección de 230 nm, y utilizando una composición de eluyente de acetonitrilo al 4% y tributilamina 1.2 mM como solución A y de acetonitrilo al 4% y CsCl 0.1 M como solución B, con un gradiente de 1% a 90% de solución B.

Se calculó el rendimiento a partir de la suma de las cantidades de disacáridos constituyentes producidos a partir de cada muestra de polisacáridos. Es decir, se calculó el rendimiento como porcentaje (proporción molar) de la cantidad total de disacáridos producida a partir de heparosano despolimerizado N-sulfatado respecto a la cantidad total de disacáridos producida a partir de heparosano N-desacetilado. Además, en ese momento, se confirmó que 99% o más de los grupos amino producidos mediante N-acetilación estaban N-sulfatados en el heparosano despolimerizado N-sulfatado obtenido.

Además, se calculó la tasa residual de grupos N-acetilo en el heparosano N-desacetilado basándose en la cantidad de cada disacárido constituyente producido a partir de heparosano N-desacetilado. Es decir, se calculó la tasa residual de grupos acetilo como porcentaje (proporción molar) de la cantidad de disacáridos con el grupo acetilo respecto a la cantidad total de disacáridos. La tasa residual de grupos acetilo era de 14.9%.

<Análisis de GPC>

El heparosano despolimerizado N-sulfatado y el heparán sulfato (disuelto a una concentración de 1 mg/ml en agua Milli-Q) se sometieron a filtración en gel mediante HPLC (análisis de GPC). Como columna se utilizó una GS520 (Shodex, Asahipak GS-520HQ, 7.5 mm x 300 mm, tamaño de partícula: 7 |jm); como eluyente se utilizó una solución acuosa de dihidrogenofosfato potásico 100 mM y el análisis se llevó a cabo a un caudal de 0.6 ml/min, a una temperatura de la columna de 40°C y a una longitud de onda de detección de 200 nm. Se calcularon los pesos moleculares medios (Mn y Mw) utilizando un juego de marcadores de peso molecular de pululano (Shodex, STANDARD P-82, rango de pesos moleculares entre 5900 y 708000) como patrón.

Aplicabilidad industrial

El método de la presente invención resulta útil para la producción enzimática de derivados O-sulfatados y N-sulfatados de alcoholes y aminas. En particular, el método resultado adecuado para la producción de heparina y heparán sulfato.

Tabla 1. Cepas construidas.

Tabla 2. Estabilidad de PAP.

NA: no analizado

Tabla 3. Estabilidad de PAPS.

NA: no analizado

Tabla 4. 2-O-Sulfurilación de HSBPM utilizando PAPS.

1) Cepa:

A2*: A2/pSUMO/pACYC184

A3*: A3/pSUMO/pACYC184

A4*: A4/pSUMO/pACYC184

A5*: A5/pSUMO/pACYC184

2) Disacárido:

NS: a-AUA-[1->4]-GlcNS,

N2S: a-AUA-2S-[1->4]-GlcNS,

en el que AUA se refiere a ácido 4-desoxi-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico y

GlcNS se refiere a N-sulfo-D-glucosamina.

3) Suma: NS NS2S. La cantidad acumulada de NS y NS2S era inferior a la cantidad de HSBPM inicial debido a que la eficacia del corte del HSBPM con heparinasa I, II y II era de aproximadamente 30%.

4) Rendimiento de sulfurilación: N2S/(NS NS2S). No depende de la eficacia del corte de HSBPM.

Tabla 5. 2-O-sulfurilación de HSBPM en presencia de pNPS.

1), 2), 3) y 4): ver las explicaciones de la tabla 4.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para la sulfuración enzimática de un sustrato, que comprende:

(i) hacer reaccionar el sustrato con 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato en un medio que contiene una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceaepara producir un derivado sulfatado de dicho sustrato, y (ii) recoger el derivado sulfatado del medio,

en el que dicha bacteria ha sido modificada:

(A) para producir, por lo menos, una proteína que presenta una actividad de sulfotransferasa, y (B) para atenuar la expresión de un genaphAo un gencysQ.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha bacteria modificada para atenuar la expresión del genaphAha sido modificada además para atenuar la expresión del gencysQo un gencpdB,o una combinación de los mismos.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha bacteria modificada para atenuar la expresión del gencysQha sido modificada además para atenuar la expresión del genaphAo el gencpdB,o una combinación de los mismos.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha proteína que presenta una actividad de sulfotransferasa se selecciona de entre el grupo que consiste en una proteína que presenta una actividad de O-sulfotransferasa, una proteína que presenta una actividad de N-sulfotransferasa y una proteína que presenta una actividad de N-desacetilasa/N-sulfotransferasa.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicha proteína que presenta una actividad de O-sulfotransferasa se selecciona de entre el grupo que consiste en una proteína que presenta una actividad de heparán sulfato 2-O-sulfotransferasa, una proteína que presenta una actividad de heparán sulfato 3-O-sulfotransferasa, una proteína que presenta una actividad de heparán sulfato 6-O-sulfotransferasa y una combinación de las mismas.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha bacteria ha sido modificada además para producir una proteína que presenta una actividad de heparosán-N-sulfato-glucuronato 5-epimerasa.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha bacteria ha sido modificada además para producir una proteína que presenta una actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho medio contiene la proteína que presenta una actividad de 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato-sulfotransferasa.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho sustrato presenta, por lo menos, un grupo químico seleccionado de entre un grupo hidroxilo y un grupo amino.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho sustrato se selecciona de entre el grupo que consiste en heparosano, heparán sulfato y heparina.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho derivado sulfatado se selecciona de entre el grupo que consiste en heparina, heparán sulfato, condroitín sulfato, colina sulfato y dermatán sulfato.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha bacteria pertenece al géneroEscherichiaoPantoea.

13. Método según la reivindicación 12, en el que dicha bacteria esEscherichia colioPantoea ananatis.

14. Método para producir un derivado sulfatado de un sustrato, que comprende:

(i) hacer reaccionar el sustrato con 3'-fosfoadenosín-5'-fosfosulfato en un medio que contiene una bacteria perteneciente a la familiaEnterobacteriaceaepara producir el derivado sulfatado de dicho sustrato, y (ii) recoger el derivado sulfatado del medio,

en el que dicha bacteria ha sido modificada:

(A) para producir, por lo menos, una proteína que presenta actividad de sulfotransferasa, y

(B) para atenuar la expresión de un genaphAo un gencysQ.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha bacteria modificada para atenuar la expresión del genaphA hasido modificada además para atenuar la expresión del gencysQo un gencpdB,o una combinación de los mismos.

16. Método según la reivindicación 14, en el que dicha bacteria modificada para atenuar la expresión del gencysQha sido modificada además para atenuar la expresión del genaphAo el gencpdB,o una combinación de los mismos.