TW202020147A

TW202020147A - 使用腸桿菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）之細菌使醇和胺經酶催化性磺醯化之方法

Info

Publication number: TW202020147A
Application number: TW108124444A
Authority: TW
Inventors: 瑟吉斯莫諾夫; 伊琳娜托瑪可娃
Original assignee: 日商味之素股份有限公司
Priority date: 2018-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2020-06-01
Also published as: EP3821025A1; JP2021529511A; CN112384629A; US20210115484A1; WO2020013346A1; JP7424320B2; CN112384629B; EP3821025B1; HRP20231510T1; HUE064469T2; EP3821025C0; ES2962132T3

Abstract

本發明提供使受質經酶催化性磺醯化之方法，該方法包含下列步驟：在含有屬於腸桿菌科(Enterobacteriaceae )之細菌的培養基中使受質與3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸酯(PAPS)反應以產生該受質之硫酸化衍生物和從該培養基收集該硫酸化衍生物，其中該細菌已經過修飾以至少產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質並減弱aphA 基因、cysQ 基因或cpdB 基因或彼等之組合的表現。

Description

使用腸桿菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）之細菌使醇和胺經酶催化性磺醯化之方法

本發明關於微生物工業，特別是關於在含有屬於腸桿菌科之細菌的培養基中使醇和胺經酶催化性磺醯化以產生該醇和胺之O-和N-硫酸化衍生物之方法。該方法可用於產生，例如肝素和硫酸乙醯肝素。

含有一或多個硫酸基團之無機和有機分子為已知之分子。其中，已知存在含有硫酸基之生物分子且其在生物過程中具有重要作用，這些生物分子包括，例如肝素(heparin)、硫酸乙醯肝素(heparan)、硫酸軟骨素、硫酸膽鹼和硫酸皮膚素(dermatan)。肝素和硫酸乙醯肝素特別受到關注，因為它們可用於製藥工業以用於，例如治療性治療。

肝素和硫酸乙醯肝素(縮寫為“HS”)為線性多醣，其具有多變地硫酸化之重複雙醣單元。肝素主要由動物之肥大細胞產生，然而，HS係由幾乎所有類型之細胞產生。肝素和HS可與多種蛋白質相互作用並調節各種生物過程，諸如，例如細胞周期、細胞生長、細胞分化、細胞黏附、活動性、脂質代謝、血管生成、血液凝結、廢除GrB(顆粒酶B)之剝離活性和腫瘤轉移。已知肝素於治療和預防深度靜脈血栓形成、肺栓塞和動脈血栓栓塞之用途。肝素亦可用於治療心臟病發作和不穩定型心絞痛。

化學結構(即，構成肝素和HS之分子的基本多醣組分之種類和數量)可根據組織和發育階段而變化。因此，無共同之肝素和HS結構。然而，重複之雙醣單元之主要結構基序(-4GlcA1β-4GlcNAcα1-)和(-4)-α-L-IdoA2S-(1-4)-D-GlcNS6S-(1-)係存在於肝素和HS之糖胺聚醣骨架中(Kuberan B.et al ., Chemoenzymatic synthesis of classical and non-classical anticoagulant heparan sulfate polysaccharides,J .Biol .Chem ., 2003, 278(52):52613-52621；Mulloy B.et al ., Pharmacology of heparin and related drugs,Pharmacol .Rev ., 2016, 68(1):76-141)。肝素和HS之分子結構中的基本差異為已知且這些包括分子量、硫酸化比例和艾杜糖醛酸(iduronic acid)(以下簡稱“IdoA”)殘基之含量(參見，例如Gallagher J.T. and Walker A., Molecular distinctions between heparan sulphate and heparin. Analysis of sulphation patterns indicates that heparan sulphate and heparin are separate families of N-sulphated polysaccharides,Biochem J ., 1985, 230(3):665-674；Shriver Z.et al ., Heparin and heparan sulfate: analyzing structure and microheterogeneity,Handb .Exp .Pharmacol ., 2012, 207:159-176)。此外，與相同之HS活性相比較，肝素之抗凝血活性高約100倍。

從葡糖醛酸(縮寫為“GlcA”)和N-乙醯化葡萄糖(縮寫為“ GlcNAc”)單位生物合成之肝素和硫酸乙醯肝素已被詳細研究(參見，例如Mulloy B.et al ., 2016；Sugahara K. and Kitagawa H., Heparin and heparan sulfate biosynthesis, IUBMBLife , 2002, 54(4):163-175)。特別是，描述用於修飾該糖胺聚醣骨架(稱為肝素前體)以產生肝素和HS之生物合成事件。肝素和HS之生物合成包括以下步驟：i) 藉由HS/肝素GlcNAc N-脫乙醯酶/N-磺基轉移酶(縮寫為“NDNST”)催化GlcNAc殘基之N-脫乙醯化和N-硫酸化，ii) 藉由能將葡糖醛酸(縮寫為“GlcA”)殘基轉化成IdoA殘基之肝素前體(heparosan)-N-硫酸-葡糖醛酸酯C5-表異構酶(縮寫為“HNSG-5epi”、“C5-epi”)催化葡糖醛酸基C5-差向異構化，iii) 分別藉由硫酸乙醯肝素2-O-磺基轉移酶(縮寫為“HS 2-OST”)、硫酸乙醯肝素6-O-磺基轉移酶(縮寫為“HS 6-OST”)和硫酸乙醯肝素3-O-磺基轉移酶(縮寫為“HS 3-OST”)之催化將位於IdoA殘基之C2位置上和N-磺基葡糖胺(縮寫為“GlcNS)殘基之C6-和C3-位置上的羥基連續O-硫酸化。該N-和O-硫酸化係在存有磺基供體3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸酯(縮寫為“PAPS”)時發生。硫酸化之比例可取決於欲硫酸化之官能基的位置和種類(第1圖)。再者，從肝素前體生物合成肝素和HS之事件並不統一，其可能導致不同之化學結構範圍。第2A圖中顯示肝素之化學結構的實例(PubChem CID：772，PubChem數據庫，國家生物技術信息中心(NCBI)，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，而第2B圖中顯示HS之化學結構的實例(PubChem CID： 53477714)。

製造肝素和HS之方法已為人知，這些方法包括，例如分離和純化來自哺乳動物和非哺乳動物來源之肝素、化學、化學酶催化性和生物技術類技術。用於從動物分離肝素之工業過程始於1922年，此方法仍被視為用於產生肝素的主要方法。豬、牛、犬和綿羊(綿羊)可作為肝素的來源(van der Meer J.-Y.et al ., From farm to pharma: an overview of industrial heparin manufacturing methods,Molecules , 2017, 22(6):1025)。然而，當使用從哺乳動物來源分離之肝素時有宗教和健康問題的考量。藉由使用單峰駱駝(dromedary)(Camelus dromedaries )作為肝素來源可稍微解決這些問題。儘管從動物來源分離之肝素具有不良副作用(諸如，例如出血和由肝素誘導之具有動脈血栓的血小板減少症(thrombocytopenia)(HIT)，其仍用於組合療法中以治療人類之中風和心臟發作。

藉由從家禽，諸如，例如雞和火雞；魚，諸如，例如鮭魚(Salmo salar )；和其他來源分離出肝素來產生肝素的方法亦為已知(van der Meer J.-Y.et al , 2017，和其中之參考文獻)。該揭示用於從動物和海洋來源產生肝素之方法的專利文獻已發表。例如，在室溫下使用酶催化性水解原料之步驟以從動物黏膜組織中萃取肝素之簡化方法(US6232093 B1)已為人知。於另一方法中係使用色層分析技術(WO2006120425 A1)從魚來源中分離出極低分子量肝素(縮寫為“VLMWH”)。

由於處於生物安全水準之肝素和硫酸乙醯肝素(HS)具有治療重要性，因此需要廉價且能大規模地從非動物來源商業生產該等物質之方法。因此，現已研發用於產生肝素和HS之替代方法。例如，HS顯示出可使用一組參與生物合成HS之經選殖的酶迅速且容易地合成(Kuberan B.et al ., 2003)。然而，該方法費力且昂貴，因其需要純化之人類葡糖醛酸基C5-表異構酶和硫酸乙醯肝素2-、3-和6-O-磺基轉移酶，以及作為磺基供體之PAPS。於另一實施例中，該經生物工程處理之肝素係使用化學酶催化性方法從肝素前體取得，該化學酶催化性方法包括使用下列物質處理肝素前體之步驟：i)鹼之水溶液，以經由單步驟將肝素前體部分解聚和將胺基N-脫乙醯化，ii)三甲胺三氧化硫複合物，以進行選擇性N-硫酸化，iii)C5-差向異構酶和2-O-磺基轉移酶之混合物，以達成GlcA殘基之C5-原子處的羧基異構化和IdoA殘基之2-O-硫酸化，iv)6-O-磺基轉移酶之混合物，以達成GlcNS殘基之6-O-硫酸化，和v)3-O-磺基轉移酶，以達成GlcNS(6S)殘基之3-O-硫酸化(WO2012116048 A1)。藉由該方法產生之經生物工程處理之肝素在N-乙醯葡糖胺和N-磺基葡糖胺、數均分子量(M_N )、重均分子量(M_W )和多分散性指數(PDI)方面基本上等同於該藥物肝素。在所描述之方法中，由於磺基供體(PAPS)之成本非常高，因而使用再生系統來恢復磺基供體(PAPS)(Zhang Z.et al ., Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors,J .Am .Chem .Soc ., 2008, 130(39):12998-13007)。

然而，使受質與磺基供體在含有屬於腸桿菌科之細菌的培養基中反應，以使該受質經酶催化性磺醯化來產生其硫酸化衍生物之方法仍屬未知，該方法中之該腸桿菌科細菌已經過修飾以產生至少一種具有磺基轉移酶活性之蛋白質並減弱aphA 基因、cysQ 基因或cpdB 基因或彼等之組合的表現。

根據目前所揭示之主題，本發明提供用於使具有至少一個羥基或至少一個胺基之受質經酶催化性磺醯化以產生其硫酸化衍生物，諸如分別為O-硫酸化衍生物或N-硫酸化衍生物之新穎方法。於一如本文所描述之方法之示例性實施態樣中，可使N-硫酸肝素前體經磺醯化以產生其經O-硫酸化之衍生物，諸如，例如與最初之N-硫酸肝素前體相比較，具有至少一個額外之O-磺基的肝素和硫酸乙醯肝素。因此，根據目前揭示之主題，N-硫酸肝素前體之O-硫酸化衍生物可在不使用動物來源下產生。

如本文所描述之方法可包括下列步驟：使受質與磺基供體(其可為，例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸酯(PAPS))在含有已經過修飾之屬於腸桿菌科之細菌的培養基中反應，以至少產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質並減弱aphA 基因、cysQ 基因和cpdB 基因或彼等之組合的表現。該方法之一種優點為該細菌之細胞的粗製溶胞產物中含有具有所需活性之蛋白質，諸如，例如具有磺基轉移酶活之蛋白質，因此，該粗製溶胞產物可成功地用於如本文所描述之方法中。即，在如本文所描述之方法中，該一或多種具有所需活性之蛋白質可在未預先分離和/或純化下使用。因此，當使用如本文所描述之方法時，該使醇和胺磺醯化之過程可被簡化且該過程之成本可降低。

該方法可藉由修飾該可用於如本文所描述之方法中的細菌，從而使該細菌亦可產生具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質而進一步改善，使得該方法中可很容易地重新生成和重複使用該昂貴且不穩定之PAPS。或者，該方法可藉由使用可用於如本文所描述之方法中的培養基，從而使該培養基含有如本文所描述之細菌和具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質而進一步改善，使得PAPS可在該培養基中重新生成。因此，根據目前所揭示之主題，可以較低之價格產生高產量之該受質的O-和N-硫酸化衍生物。

本發明之一態樣為提供使受質經酶催化性磺醯化之方法，該方法包含： (i)令該受質與3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸酯在含有屬於腸桿菌科之細菌的培養基中反應以產生該受質之硫酸化衍生物；和 (ii)從該培養基收集該硫酸化衍生物，其中該細菌已經過修飾： (A)以至少產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質，和 (B)減弱aphA 基因或cysQ 基因之表現。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該經修飾以減弱該aphA 基因之表現的細菌已被進一步修飾以減弱cysQ 基因或cpdB 基因或彼等之組合的表現。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該經修飾以減弱cysQ 基因之表現的細菌已被進一步修飾以減弱aphA 基因或cpdB 基因或彼等之組合的表現。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該具有磺基轉移酶活性之蛋白質係選自由下列所組成之群組：具有O-磺基轉移酶活性之蛋白質、具有N-磺基轉移酶活性之蛋白質和具有N-脫乙醯酶/N-磺基轉移酶活性之蛋白質。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該具有O-磺基轉移酶活性之蛋白質係選自由下列所組成之群組：具有硫酸乙醯肝素2-O-磺基轉移酶活性之蛋白質、具有硫酸乙醯肝素3-O-磺基轉移酶活性之蛋白質、具有硫酸乙醯肝素6-O-磺基轉移酶活性之蛋白質及彼等之組合。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該細菌已被進一步修飾以產生具有肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶活性之蛋白質。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該細菌已被進一步修飾以產生具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該培養基含有該具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該受質具有至少一個選自羥基和胺基之化學基團。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該受質係選自由下列所組成之群組：肝素前體、硫酸乙醯肝素和肝素。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該硫酸化衍生物係選自由下列所組成之群組：肝素、硫酸乙醯肝素、硫酸軟骨素、硫酸膽鹼和硫酸皮膚素(dermatan sulfate)。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該細菌屬於埃希氏菌屬(Escherichia )或泛菌屬(Pantoea )。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該細菌為大腸桿菌(Escherichia coli )或菠蘿泛菌(Pantoea ananatis )。

本發明之另一態樣係提供用於產生受質之硫酸化衍生物之方法，其包含： (i)令該受質與3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸酯在含有屬於腸桿菌科之細菌的培養基中反應以產生該受質之硫酸化衍生物；和 (ii)從該培養基收集該硫酸化衍生物，其中該細菌已經過修飾： (A)以至少產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質；和 (B)減弱aphA 基因或cysQ 基因之表現。

本發明之另一態樣係提供如上述之方法，其中該經修飾以減弱該cysQ 基因之表現的細菌已被進一步修飾以減弱aphA 基因或cpdB 基因或彼等之組合的表現。

本技藝之技術熟習人士將從閱讀以下根據附圖構建之實施態樣的詳細描述及結合附圖清楚明白本發明之其他目的、特性、等同物和伴隨之優點。

現在本申請案之發明將參考僅用於示例之示例性實施態樣及參考附圖更詳細地說明。

發明之詳細描述 1.細菌

可用於如本文所描述之方法中的細菌可為屬於腸桿菌科之細菌，該細菌已經過修飾以至少產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質。該細菌可經進一步修飾以產生具有肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶活性之蛋白質和/或具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質。可用於如本文所描述之方法中的細菌亦已經過修飾以減弱aphA 基因、 cysQ 基因或cpdB 基因或彼等之組合的表現。

在如本文所描述之方法中，屬於腸桿菌科之細菌可來自下列菌屬者：腸桿菌 (Enterobacter )、歐文氏菌 (Erwinia )、埃希氏菌 (Escherichia )、克雷伯氏菌 (Klebsiella )、摩根氏菌 (Morganella )、泛菌 (Pantoea )、光桿狀菌 (Photorhabdus )、普羅維登斯菌 (Providencia )、沙門氏菌 (Salmonella )、耶爾森氏菌 (Yersinia )，等，只要該細菌能夠至少產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質且可經修飾以減弱至少一種選自下列群組之基因的表現：aphA 基因、cysQ 基因和cpdB 基因或彼等之組合。具體而言，可使用那些根據NCBI(國家生物技術信息中心)數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)中使用之分類法被歸類為腸桿菌科之細菌。來自腸桿菌科之可經修飾之菌株的實例包括埃希氏菌屬 、腸桿菌屬 或泛菌屬之細菌 。

可經修改以取得根據目前揭示之主題的埃希氏菌之埃希氏菌菌株並無特別限制，具體而言，可使用Neidhardt等人之作品中所描述者(Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives ofEscherichia coli K-12, p. 2460-2488.In F.C. Neidhardtet al . (ed.),Escherichia coli andSalmonella : cellular and molecular biology, 2^nd ed. ASM Press, Washington, D.C., 1996)。菌種大腸桿菌(E. coli )為一種特殊實例。大腸桿菌之具體實例包括大腸桿菌W3110(ATCC 27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC 47076)，等，這些係源自原型野生型菌株，大腸桿菌K-12菌株。這些菌株可從，例如美國典型培養物保藏中心(ATCC；地址：PO Box 1549，Manassas，VA 20108，美國)獲得。即，該各別菌株被指派註冊編號並可使用這些註冊編號來訂購菌株(參見http://www.atcc.org/)。該菌株之註冊編號列於美國典型培養物保藏中心之目錄中。

該腸桿菌屬細菌之實例包括成團腸桿菌(Enterobacter agglomeran s)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes )，等。該泛菌之實例包括菠蘿泛菌(Pantoea ananatis )，等。成團腸桿菌之一些菌株基於16S rRNA之核苷酸序列分析，等，最近被重新分類為成團泛菌(Pantoea agglomerans )、菠蘿泛菌或斯氏泛菌(Pantoea stewartii )，等。屬於腸桿菌屬或泛菌屬之細菌均可使用，只要其為被歸類於腸桿菌科之細菌。當藉由遺傳工程技術培育菠蘿泛菌菌株時，可使用菠蘿泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)及其衍生物。這些菌株在被分離出時被鑑定為成團腸桿菌並以成團腸桿菌保藏。然而，如上述，它們最近基於16S rRNA之核苷酸定序，等被重新分類為菠蘿泛菌。

可用於如本文所描述之方法中的細菌係指其中該具有所需活性之蛋白質的活性可被確定之細菌。例如，可經修飾以產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質的細菌可指其中該具有磺基轉移酶活性之蛋白質的活性可被確定之細菌。本文對“可經修飾以產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質的細菌”之解釋亦可比照應用於任何可用於如本文所描述之方法中的細菌，特別是可經修飾以產生具有所需活性之蛋白質的細菌，諸如，例如“可經修飾以產生具有肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶活性之蛋白質的細菌”和“可經修飾以產生具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質的細菌”。

短語“具有磺基轉移酶活性之蛋白質”可指在稱為磺醯化(亦可稱為硫酸化或磺化)之過程中造成催化磺基(-SO₃ H)從供體分子(亦稱為磺基之供體)轉移至受質(其可為醇、胺或胺基醇)之反應的蛋白質(酶學委員會(EC)編號：2.8.2.-；Chapman E.et al ., Sulfotransferases: structure, mechanism, biological activity, inhibition, and synthetic utility；Angew .Chem .Int .Ed .Engl ., 2004, 43(27):3526-35488)。具有磺基轉移酶活性之蛋白質可稱為磺基轉移酶(縮寫為“ST”)。由於可用於如本文所描述之方法中的磺基轉移酶可為如下文中將解說之O-磺基轉移酶或N-磺基轉移酶，短語“具有磺基轉移酶活性之蛋白質”可包括短語“具有O-磺基轉移酶活性之蛋白質”和“具有N-磺基轉移酶活性之蛋白質”。因此，短語“具有O-磺基轉移酶活性之蛋白質”可指在O-磺醯化過程中催化磺基從供體分子轉移至受質(其可為醇或胺基醇)之反應的蛋白質；而短語“具有N-磺基轉移酶活性之蛋白質”可指在N-磺醯化過程中催化磺基從供體分子轉移至受質(其可為胺或胺基醇)之反應的蛋白質。

能夠將受質之羥基磺醯化以產生其硫酸化衍生物之磺基轉移酶可統稱為O-磺基轉移酶(縮寫為“O-ST”或“OST”)。具體而言，O-磺基轉移酶為可催化磺基轉移至該受質之羥基(-OH)以產生其硫酸化衍生物之反應的酶，該硫酸化衍生物亦稱為硫酸化物，具有化學式R-OSO₃ H或R-OSO₃ ^- ，其中“R”可指化學基團，諸如，例如本技藝之一般技術人士所周知之有機基團。該能夠將受質之胺基磺醯化以產生其硫酸化衍生物之磺基轉移酶可統稱為N-磺基轉移酶(縮寫為“N-ST”或“NST”)。具體而言，N-磺基轉移酶為可催化磺基轉移至該受質之一級和/或二級胺基(-NH₂ 、 -NHR')以產生其硫酸化衍生物之反應的酶，該硫酸化衍生物亦稱為胺基磺酸化物，具有化學式R-NH-SO₃ H或R-NH-SO₃ ^- 和/或R-NR'-SO₃ H或R-NR'-SO₃ ^- ，其中R和R'係指如上述之化學基團R，且其中R和R'可指相同或不同種類之化學基團。

已知各種OST和NST，且這些包括，但不限於芳基磺基轉移酶(EC 2.8.2.1)、醇磺基轉移酶(EC 2.8.2.2)、胺磺基轉移酶(EC 2.8.2.3)、[硫酸乙醯肝素]-葡糖胺N-磺基轉移酶(EC 2.8.2.8，縮寫為“N-HSST”)、軟骨素6-磺基轉移酶(EC 2.8.2.17)、角質素磺基轉移酶(2.8.2.21)、[硫酸乙醯肝素]-葡糖胺3-磺基轉移酶同種型1、2和3(對應為EC 2.8.2.23、2.8.2.29和2.8.2.30；縮寫為“3-OST-1”、“3-OST-2”、和“3-OST-3”)，等，其分類在，例如UniProtKB數據庫(https://enzyme.expasy.org/EC/ 2.8.2.-)中。

天然存在於各種生物(諸如，例如哺乳動物(包括人)、魚、昆蟲、蠕蟲，等)中之磺基轉移酶為已知且這些可用於如本文所描述之方法中。OST之具體實例包括，但不限於硫酸乙醯肝素2-O-磺基轉移酶(HS 2-OST)、硫酸乙醯肝素3-O-磺基轉移酶(HS 3-OST)和6-O-磺基轉移酶(HS 6-OST)，這些酶能夠將分別位於N-硫酸乙醯肝素之己醣醛酸殘基(特別是L-艾杜醣醛酸(IdoA)殘基)之C2位置處和N-磺基葡糖胺(GlcNS)殘基之C3和C6位置處之羥基O-磺醯化(或者，O-硫酸化、O-磺酸化)。

例如，可使用人類(智人(Homo sapiens )；UniProtKB數據庫，編目流水號Q7LGA3)、小鼠(家鼠(Mus musculus )；編目流水號Q8R3H7)、雞(原雞(Gallus gallus )；編目流水號Q76KB1)、蛙(例如非洲爪蟾(Xenopus laevis )；編目流水號O93336)、斑馬魚(斑馬魚(Danio rerio )；編目流水號A1L1P8)、蛔蟲(例如旋毛蟲(Trichinella pseudospiralis )；編目流水號A0A0V1JLD7)、昆蟲(例如豆莢草盲蝽(Lygus hesperus )；編目流水號A0A146LU86)，等之天然產生的HS 2-OST。

於另一實例中，可使用人類(智人；UniProtKB數據庫，編目流水號Q9Y663)、小鼠(家鼠；編目流水號O35310)、大鼠(褐家鼠 (Rattus norvegicus) ；編目流水號Q80W66)、果蠅(黑腹果蠅 (Drosophila melanogaster) ，編目流水號Q9VWJ7)、水螅(尋常水螅(Hydra vulgaris )、纖細水螅(Hydra attenuate )) ；編目流水號T2MJ19)、線蟲(例如旋毛蟲(Trichinella murrelli )；編目流水號A0A0V0UDE4)，等之天然產生的HS 3-OST。

於另一實例中，可使用人類(智人；UniProtKB數據庫，編目流水號O60243)、小鼠(家鼠；編目流水號Q9QYK5)、雞(原雞；編目流水號Q76KB2)、牛(博斯金牛 (Bos taurus )；編目流水號1BNW3)、猴子(例如恒河猴(rhesus macaque)(獼猴Macaca mulatta ))；編目流水號F7DP42)、蝙蝠(鼠耳(Myotis lucifugus )；編目流水號G1PY33)、果蠅(黑腹果蠅，編目流水號B4GL90)、線蟲(例如線蟲(Caenorhabditis briggsae) ；編目流水號A8XKD5)，等之天然產生的HS 6-OST。

NST之具體實例包括，但不限於能將含有胺基之受質的一級和二級胺基N-磺醯化(或者N-硫酸化、N-磺化)之胺磺基轉移酶和芳基胺磺基轉移酶，該含有胺基之受質為，諸如，例如苯胺(aniline)、苯基胺(phenylamine)、苯胺(benzenamine)、芳基胺、2-萘基胺，等。例如，可使用大型蚤(Daphnia magna )(UniProtKB數據庫，編目流水號A0A0P5VC43)、果蠅(例如瓜實蠅(Zeugodacus cucurbitae )；編目流水號A0A0A1X0U6)、那些列於，例如KEGG(京都基因和基因組百科全書)數據庫(http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:2.8.2.3)中者，等之天然產生的NST。

已知，除了N-磺基轉移酶活性之外，該具有N-磺基轉移酶活性之蛋白質可具有N-脫乙醯酶活性。因此，在特定情況下，具有N-磺基轉移酶活性之蛋白質亦可稱為具有N-脫乙醯酶/N-磺基轉移酶活性之蛋白質，且其亦可用於如本文所描述之方法中。短語“具有N-脫乙醯酶/N-磺基轉移酶活性之蛋白質”可指催化硫酸乙醯肝素中之葡糖胺聚醣之葡糖胺(GlcNAc)殘基N-脫乙醯化和N-硫酸化反應之蛋白質(硫酸乙醯肝素N-脫乙醯酶，EC 3 .-.-.-；硫酸乙醯肝素N-磺基轉移酶，EC 2.8.2.-)。具有N-脫乙醯酶/N-磺基轉移酶活性之蛋白質可稱為雙官能N-脫乙醯酶/N-磺基轉移酶(縮寫為“NDST”)。

NDST之具體實例包括，但不限於人類(智人；UniProtKB數據庫，編目流水號P52848)、小鼠(家鼠；編目流水號Q3UHN9)、豬(野豬 ( Sus scrofa) ；編目流水號F6XY50)、羊(綿羊 (Ovis aries ) ；編目流水號UPI00072F9665)、馬(馬(Equus caballus ) ；編目流水號F6SHQ3)、鳥(例如日鳽(Eurypyga helias )；編目流水號UPI0005288C4A)，等之天然產生的NDST，且這些蛋白質可用於如本文所描述之方法中。

具有磺基轉移酶活性之蛋白質的活性可藉由放射性同位素法，使用[³⁵ S]3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸酯和閃爍計數測定(Habuchi H.et al ., Biosynthesis of heparan sulphate with diverse structures and functions: two alternatively spliced forms of human heparan sulphate 6-O-sulphotransferase-2 having different expression patterns and properties,Biochem .J ., 2003, 371(Pt 1):131-142)或使用芳基磺基轉移酶和作為磺基供體之對-硝苯基磺酸酯(縮寫為“pNPS”)進行耦合之雙酶催化性比色分析(Sterner E.et al ., Assays for determining heparan sulfate and heparin O-sulfotransferase activity and specificity,Anal .Bioanal .Chem ., 2014, 406(2):525-536)。該蛋白質濃度可藉由Bradford蛋白質分析或藉由Lowry法測定，該Lowry法係使用牛血清白蛋白(BSA)作為標準和考馬斯(Coomassie)染料(Bradford M.M.,Anal .Biochem ., 1976, 72:248-254；Lowry O.H.et al .,J .Biol .Chem ., 1951, 193:265-275)。

可用於如本文所描述之方法中的受質可為具有至少一個羥基或至少一個胺基團或彼等之組合的任何受質(即，任何分子)，只要該受質可使用OST或NST或彼等之組合磺醯化，以產生該受質之硫酸化衍生物。亦可接受的是，該受質可具有(單獨地或除一或多個羥基和/或一個或多個胺基外)至少一個被N-乙醯化之胺基，只要該受質可使用NDST磺醯化。該受質可為，但不限於那些描述於，例如Chapman E.et al ., 2004中者，且這些包括苯酚，包括4-硝基苯酚(亦稱為對硝基苯酚，縮寫為“pNP”)、兒茶酚胺、芳基羥胺、羥基類固醇、多巴胺、酪胺(tyramine)、米諾醇(minoxidol)、孕烯醇酮(pregnenolone)、脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone)(縮寫為“DHEA”)、寡醣，諸如，例如肝素前體、肝素前體之硫酸化衍生物，諸如，例如具有N-乙醯化葡糖胺(GlcNAc)殘基之硫酸乙醯肝素、硫酸乙醯肝素葡糖胺聚醣(縮寫為“HSGAG”)、N-硫酸化肝素前體(縮寫為“NS-肝素前體”)、硫酸角質素，等。肝素前體為該受質之特定實例，用於製造彼之方法為已知(參見，例如US 2016201103 A1)。

任何分子均可作為用於如本文所描述之方法中之磺基供體，只要該分子可供給磺基給磺基轉移酶，從而可測定該磺基轉移酶之磺基轉移酶活性。實際上，可使用任何分子，只要該分子可供給磺基給O-磺基轉移酶、N-磺基轉移酶和/或N-脫乙醯酶/N-磺基轉移酶，從而使該磺基轉移酶可為具有磺基轉移酶活性之蛋白質。例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸酯(PAPS；PubChem數據庫CID：10214)(亦稱為3'-磷酸5'-腺苷醯硫酸酯)或其鹽(諸如，例如鈉鹽或鋰鹽)可作為磺基供體(參見，例如Chapman E.et al ., 2004中之方案1)。該PAPS可以外源方式使用，亦即，其可添加在含有可用於如本文所描述之方法中的細菌之培養基中；和/或其可以與磺基轉移酶天然結合之內源形式使用，因為已知生物體中有可催化PAPS形成之酶(ATP磺醯化酶和腺苷5'-磷酸硫酸激酶)存在，然後該PAPS被募集並與磺基轉移酶結合作為輔助因子。由於PAPS為昂貴且不穩定之化學化合物，較佳為使用由生物體內源性合成之PAPS且因此，該PAPS與磺基轉移酶天然結合。在比情況下，開發出用於再生或回收發生磺醯化之培養基中之PAPS的系統(參見，例如Sterner E.et al ., 2014中之第1圖；Gregory J.D. and Lipmann F., The transfer of sulfate among phenolic compounds with 3’,5’-diphosphoadenosine as coenzyme,J .Biol .Chem ., 1957, 229(2):1081-1090)。在該系統中，磺基轉移酶將PAPS轉化為3'-磷酸腺苷-5'-磷酸酯(縮寫為“PAP”)並將該受質磺醯化。然後，使用具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性的蛋白質將PAP再循環為PAPS，該具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性的蛋白質可利用對-硝基苯基硫酸酯(pNPS)作為PAP之磺基供體。

短語“具有肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶活性之蛋白質”可指能催化鄰接N-硫酸化肝素前體中之N-硫酸化糖殘基的D-葡糖醛酸(GlcA)殘基轉化成艾杜糖醛酸(IdoA)殘基之反應的蛋白質(EC 5.1.3.17；Mochizuki H.et al ., Heparosan-glucuronate 5-epimerase: Molecular cloning and characterization of a novel enzyme,Glycobiology , 2015, 25(7):735-744)。該具有肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶活性之蛋白質可藉由使用[5-³ H]肝素前體作為受質之放射性同位素方法測定(Mochizuki H.et al ., 2015)。

具有肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶活性之蛋白質可稱為肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶(HNSG-5epi)。HNSG-5epi之具體實例包括，但不限於人類(智人；UniProtKB數據庫，編目流水號O94923)、小鼠(家鼠；編目流水號Q9EPS3)、牛(黃牛；編目流水號O18756)、斑馬魚(斑馬魚；編目流水號Q6TS33)、倉鼠(例如中國倉鼠(Cricetulus griseus )；編目流水號A0A061I8R4)、羊(綿羊；編目流水號W5QB79)、大象(例如非洲草原象(Loxodonta africana )；編目流水號G3T4X0)，等所天然具有之HNSG-5epi，且這些蛋白質可用於如本文所描述之方法中。

pNPS可作為用於再生PAPS之系統中的磺基供體，當與具有可用於如本文所描述之方法中之該等活性的蛋白質相關時，短語“具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質”廣義而言可指具有芳基磺基轉移酶活性之蛋白質(EC 2.8.2.1)，其為具有O-磺基轉移酶活性之蛋白質(EC 2.8.2.-)的實例。因此，本技藝之一般技術人士將可清楚明白本文所給予之對具有O-磺基轉移酶活性之蛋白質的解釋亦可比照應用於具有芳基磺基轉移酶活性之蛋白質，反過來，此可比照應用於具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質。現已清楚明白的，具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質的活性可使用該可用於測定具有磺基轉移酶活性之蛋白質的活性之方法測定，且這些方法包括，例如其中使用PAP作為受質和使用pNPS作為磺基供體之方法(Sterner E.et al ., 2014)。

具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質可被稱為3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶(縮寫為“PAPS ST”)且廣義而言，其可指芳基磺基轉移酶。可用於再生PAPS之芳基磺基轉移酶之具體實例包括，但不限於人類(智人；ST1A3，UniProtKB數據庫，編目流水號P0DMM9)、大鼠(褐家鼠；ST1A1，編目流水號P17988；NCBI(國家生物技術信息中心，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)基因編目流水號NP_114022.1)、小鼠(家鼠；ST1A1，編目流水號P52840)，等天然具有之芳基磺基轉移酶。

已知OST、NST、NDST、HNSG-5epi和PAPS ST可以不同之蛋白質同種型之形式存在，此為編碼ST、NST、NDST、HNSG-5epi和PAPS ST之基因替換剪接之結果，且這些蛋白質之同種型亦可用於如本文所描述之方法中，只要其可為具有根據如本文所解釋之方法所需活性的蛋白質。

當與特定物種(諸如，例如細菌或哺乳動物物種)天然具有之蛋白質或核酸有關時，短語“天然具有的”可指該物種所天然具有之蛋白質或核酸。亦即，特定物種所天然具有之蛋白質或核酸可分別指天然存在於該物種中且可從該物種分離出，並使用本技藝之一般技術人士已知之方法測序的蛋白質或核酸。此外，由於該從存有該蛋白質或核酸之物種分別分離出的蛋白質或核酸之胺基酸序列或核苷酸序列可很容易地測定，因此當與蛋白質或核酸有關時，短語“天然具有的”亦可指可使用，例如基因工程技術(包括重組DNA技術)或化學合成方法，等取得之蛋白質或核酸，只要由此獲得之蛋白質的胺基酸序列或核酸之核苷酸序列與該物種中天然存在之蛋白質的胺基酸序列或核酸之核苷酸序列相一致。特定物種所天然具有之胺基酸序列的實例包括，但不限於肽、寡肽、多肽，包括蛋白質，特別是酶，等。特定物種所天然具有之核苷酸酸序列的實例包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)且這些不限於調控序列，包括啟動子、衰減子、終止子和類似物、基因、基因間序列、編碼信號肽之序列、蛋白質之前部分、人工胺基酸序列，等。本文中描述各種物種所天然具有之胺基酸序列和核苷酸序列，及其同源物之實例，且這些實例包括，但不限於長尾矮倉鼠(Cricetulus longicaudatus ；UniProtKB登錄編號O0889.1)天然具有且由對應之mRNA(GeneBank，登錄編號D88811.1)編碼的硫酸乙醯肝素2-O-磺基轉移酶(HS 2-OST)；斑馬魚(斑馬魚；NCBI參考序列，登錄編號NP_998014.1)天然具有且由對應之mRNA (NCBI參考序列，登錄編號NM_212849.1)編碼的肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶(HNSG-5epi)；具有大鼠(褐鼠；NCBI參考序列，NP_114022.1)所天然具有且由對應之mRNA (NCBI參考序列，登錄騙號NM_031834.1)編碼之胺基酸的芳基磺基轉移酶1A1。

下文中參考使用具有磺基轉移酶活性之蛋白質修飾細菌(其中該細菌可用於如本文所描述之方法中)之方法對該具有磺基轉移酶活性之蛋白質的解釋亦可比照應用於任何具有該所需活性且可用於該方法中之蛋白質。具有該所需活性之蛋白質的實例包括，但不限於具有肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶活性之蛋白質和具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質，等，因為該細菌可具有除了本文所描述者外之其他性質。

可用於如本文所描述之方法中的細菌已經過修飾以產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質。由於蛋白質係由基因編碼，因此該細菌可經修飾以表現編碼具有磺基轉移酶活性之蛋白質的基因對本技藝之一般技術人士而言是顯而易見的。

短語“經修飾以表現編碼具有磺基轉移酶活性之蛋白質的基因之細菌”可指該天生或天然不具有編碼具有磺基轉移酶活性之蛋白質的基因之細菌已經過修飾，從而使該細菌含有編碼具有磺基轉移酶活性之蛋白質的基因(稱為宿主細菌)，其中該基因天生或天然存在於宿主細菌不同之生物體(稱為供體生物)中或為與宿主細菌不同之生物體(稱為供體生物)所天然具有的。相對於該宿主細菌而言，該供體生物所天然具有且被引入宿主細菌中之基因可被稱為異源基因，因為該基因並非天生或天然具有的。

短語“經修飾以表現編碼具有磺基轉移酶活性之蛋白質的基因之細菌”亦可指其中已引入編碼具有磺基轉移酶活性之蛋白質的基因之宿主細菌因該等修飾之結果而變成能夠產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質。

該已經過修飾以產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質的細菌可藉由引入編碼具有磺基轉移酶活性之蛋白質的基因來取得。用於將重組DNA引入受體細菌之方法可為已報告且為本技藝之一般技術人士眾所周知之常規方法。該等方法包括，例如轉化、轉染、感染、軛合和動員。使用含有編碼具有磺基轉移酶活性之蛋白質的基因之重組DNA來轉化、轉染、感染、軛合或動員細菌可賦予該細菌表現該基因及合成由該基因編碼之蛋白質的能力。例如，據報導，使用氯化鈣處理受體細胞從而增加該大腸桿菌K-12之細胞對DNA之滲透性的方法可有效地轉化和轉染DNA(Mandel M. and Higa A., Calcium-dependent bacteriophage DNA infection,J .Mol .Biol ., 1970, 53:159-162)。專門和/或普遍性轉導之方法已有說明(Morse M.L.et al ., Transduction inEscherichia coli K-12,Genetics , 1956, 41(1):142-156；Miller J.H., Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972)。用於將DNA隨機和/或靶向整合入受體生物之基因組中的其他方法可應用於，諸如，例如«Mu-驅動整合/擴增»(參見，例如Akhverdyan V.Z.et al .,Appl .Microbiol .Biotechnol ., 2011, 91:857-871)、«Red/ET-驅動整合»或«λRed/ET-介導之整合»(Datsenko K.A. and Wanner B.L.,Proc .Natl .Acad .Sci .USA , 2000, 97(12):6640-6645；Zhang Y.,et al .,Nature Genet ., 1998, 20:123-128)。再者，為了多次插入所需基因，除了Mu-驅動的複製轉座(Akhverdyan V.Z.et al .,Appl .Microbiol .Biotechnol ., 2011, 91:857-871)和導致所需基因擴增之基於recA -依賴性同源重組之化學誘導的染色體演化(Tyo K.E.J.et al .,Nature Biotechnol ., 2009, 27:760-765)外，可使用其他利用轉位、位點特異性和/或同源Red/ET-介導之重組和/或P1介導之普遍性轉導的不同組合之方法(參見，例如Minaeva N.I.et al .,BMC Biotechnol ., 2008, 8:63; Koma D.et al .,Appl .Microbiol .Biotechnol ., 2012, 93(2):815-829)。

宿主細菌中之基因的表現可藉由以稀有密碼子(相關於宿主細菌而言稱為低使用密碼子)替換同義之中或高使用密碼子來改善，其中該密碼子用途可定義為宿主細菌之細胞中每單位時間密碼子之轉譯頻率或宿主細菌之定序蛋白質編碼閱讀框架的平均密碼子頻率(Zhang S.P.et al ., Low-usage codons inEscherichia coli , yeast, fruit fly and primates,Gene , 1991, 105(1):61-72)。每一生物之密碼子用途可在“密碼子用途數據庫”中找到，該數據庫為CUTG之延伸Web版本(從GenBank表列之密碼子用途，http：//www.kazusa.or.jp/codon/；Nakamura Y.et al ., Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000,Nucleic Acids Res ., 2000, 28(1):292)。在大腸桿菌中，該等突變可包括，但不限於：以稀有Arg密碼子AGA、AGG、CGG、CGA替換CGT或CGC；以稀有Ile密碼子ATA替換ATC或ATT；以稀有Leu密碼子CTA替換CTG、CTC、CTT、TTA或TTG；以稀有Pro密碼子CCC替換CCG或CCA；以稀有Ser密碼子TCG替換TCT、TCA、TCC、AGC或AGT；以稀有Gly密碼子GGA、GGG替換GGT或GGC；等。以低使用密碼子替換同義之高使用密碼子可能較佳。以稀有和/或低使用密碼子替換同義之中或高使用密碼子可與共同表現該編碼識別稀有密碼子之tRNA的基因組合。密碼子可使用，例如用於將目標突變引入DNA之目標位置的位點特異性突變法來替換。該位點特異性突變法之實例包括利用聚合酶鏈反應(PCR)之方法(Higuchi R., Using PCR to engineer DNA, 61-70. In: PCR Technology, Erlich H.A. (ed.), Stockton Press, New York (1989); Carter, P.,Methods Enzymol ., 1987, 154:382-403)及利用噬菌體之方法(Kramer W. and Frits H.J.,Methods Enzymol ., 1987, 154:350-367; Kunkel T.A.et al .,Methods Enzymol ., 1987, 154:367-382)。

當將基因引入宿主細菌中時，由該經修飾之細菌攜帶該基因即足以使該基因在該細菌中表現。具體而言，引入該基因可足以使該基因在該宿主細菌中運作之啟動子序列(也被稱為啟動子)之控制下表現。該啟動子可為該宿主細菌天然具有之啟動子，或為該供體生物或甚至為另一種生物所天然具有之異源啟動子。該啟動子可為該欲引入之基因的天然啟動子，或為另一基因之啟動子。亦可使用，例如本文所解釋之強啟動子作為啟動子。

用於終止基因轉錄之終止子序列(亦稱為終止子)可位於該基因之下游。該終止子並無特別限制，只要其能在宿主細菌中運作。該終止子可為該宿主細菌天然具有之終止子，或為該供體生物或甚至為另一種生物所天然具有之異源終止子。該終止子可為該欲引入之基因的天然終止子，或為另一基因之終止子。

再者，當引入二或更多個基因副本時，由該經修飾之細菌攜帶每個基因足以使該基因在該細菌中表現。例如，所有欲引入之基因可存在於單一表現載體中或存在於染色體中。或者，該基因可存在於二或更多個表現載體中，或可分別存在於一或更多個表現載體和該染色體中。當基因存在於不同核酸分子中或存在於單一核酸分子中時，該基因可以能使所有引入之基因表現的方式存在於該核酸分子中。實際上，可選擇任何方式將基因引入宿主細菌中，只要使該基因可達成在該細菌中表現。短語“可達成表現”可指可從DNA轉錄，從而可合成與該作為模板之DNA互補的RNA時。短語“可達成表現”亦可指可從DNA轉錄，從而可合成與該作為模板之DNA互補的RNA並可從RNA轉譯，從而可產生肽，諸如，例如具有所需活性之蛋白質，從而可測定該蛋白質之活性。

«Fundamental Microbiology, vol. 8, Genetic Engineering»，Kyoritsu Shuppan Co., Ltd (1987)中詳細揭示各種微生物之天然載體、啟動子和終止子且這些可用於本發明中。

較佳地，將基因引入宿主細菌中，使其在能在該細菌中運作之強啟動子(與該基因之天然啟動子或該宿主細菌天然具有之啟動子相比較，該啟動子較強)的控制下表現。可使用可在屬於腸桿菌科之細菌中提供高水準之基因表現的強啟動子。可用於腸桿菌科之細菌中的強啟動子之實例包括lac 啟動子、trp 啟動子、trc 啟動子、tac 啟動子和λ噬菌體之P_R 和P_L 啟動子。此外，亦可藉由使用各種報告基因來獲得高活性類型之現有啟動子作為強啟動子。例如，藉由使啟動子區中之-35和-10區更接近共有序列可增強該啟動子之活性(WO00/18935)。高活性型啟動子之實例包括各種tac 樣啟動子(Katashkina J.I.et al ., Russian Federation Patent Application No. 2006134574 A)。用於評估啟動子之強度的方法和強啟動子之實例描述於(Goldstein M.A. and Doi R.H., Prokaryotic promoters in biotechnology,Biotechnol .Annu .Rev ., 1995, 1:105-128)，等中。

基因之轉錄效率可被進一步提高。此可藉由，例如將突變引入該基因之啟動子區以獲得較強之啟動子功能，由此導致位於該啟動子下游之基因的轉錄水準增加來實現。此外，已知取代Shine-Dalgarno(SD)序列中，和/或介於SD序列與起始密碼子之間的間隔子區中，和/或緊接該核醣體結合位點中之起始密碼子上游和/或下游之序列的數個核苷酸將會大幅影響mRNA之轉譯效率。例如，根據在該起始密碼子之前的三個核苷酸之性質可發現20倍之表現水準(Gold L.et al .,Annu .Rev .Microbiol ., 1981, 35:365-403；Hui A.et al .,EMBO J ., 1984, 3:623-629)。

此外，基因之轉譯效率可被進一步提高。此可藉由，例如以較強之RBS代替該染色體上之基因的核醣體結合位點(RBS)來實現。短語“較強之RBS”可指與該基因之天然或野生型RBS相比較，提供改善之mRNA轉譯的RBS。噬菌體T7之基因10的RBS可用來作為較強之RBS的實例(Olins P.O.et al ,Gene , 1988, 73:227-235)。

可在該宿主細菌之細胞中自動複製之載體可用來作為載體。較佳地，該載體為多副本載體且較佳為具有標記基因，諸如，例如用於選擇所需之轉化株的抗生素抗性基因。此外，該載體可具有用於表現該經引入之基因的啟動子和/或終止子。該載體可為，例如源自細菌質粒之載體、源自酵母質粒之載體、源自噬菌體、黏粒、噬粒(phagemid)之載體，等。適合用於轉化屬於腸桿菌科之細菌之載體的實例包括，但不限於廣宿主範圍之質粒，諸如pMW118/119、pBR322、pUC19，等。亦可藉由，例如同源重組、Mu驅動之整合，等將基因之多個副本引入細菌之染色體DNA中。同源重組可使用在染色體DNA中具有多個副本之序列進行。在染色體DNA中具有多個副本之序列包括，但不限於存在於轉座因子(transposable element)末端之重複DNA或反向重複子。此外，將基因引入轉座子(transposon)並允許其被轉移以將該基因之多個副本引入染色體DNA是可行的。藉由使用Mu驅動之整合可將3個以上之該基因副本在單一動作中引入染色體DNA中(Akhverdyan V.Z.et al .,Biotechnol . (Russian ), 2007, 3:3-20)。

引入之基因可藉由確認是否存有該欲引入之基因的一部分或全部基因之核苷酸序列確認。核苷酸序列之存在可藉由，例如PCR(Sambrook J.,et al .: «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 3^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (2001))測定。引入之基因亦可藉由確認是否存有該欲引入之基因的表現確認。是否存有該基因之表現可藉由確認是否存有該基因之轉錄量或藉由確認是否存有由該基因編碼之蛋白質確認。是否存有基因之轉錄量可藉由確認是否存有從該基因轉錄之mRNA確認。用於確認是否存有mRNA之方法的實例包括北方雜交、RT-PCR，等(Sambrook J.,et al .: «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 3^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (2001))。是否存有蛋白質可藉由，例如使用抗體進行西方點墨法測定(Sambrook J.,et al .: «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 3^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (2001))。

基因之副本數、存在與否可，例如藉由限制性分解染色體DNA，隨後使用基於該基因序列之探針進行南方點墨、螢光原位雜交(FISH)，等測量。基因表現之水準可藉由使用各種眾所周知之方法，包括北方點墨、定量RT-PCR，等測量從該基因轉錄之mRNA的量來測定。由該基因編碼之蛋白質的量可藉由已知方法，包括SDS-PAGE，再藉由免疫點墨分析(西方點墨分析)或蛋白質樣品之質譜分析，等測量。

使用DNA之重組分子操作的方法和分子選殖方法，諸如製備質粒DNA、分解、連接和轉化DNA、選擇作為引物之寡核苷酸、併入突變，等可為本技藝之一般技術人士所周知的一般方法。這些方法描述於，例如Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 或Green M.R. and Sambrook J.R., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)；Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak and Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA”, 4^th ed., Washington, DC, ASM Press (2009)中。

可用於如本文所描述之方法中的細菌亦可經修飾以弱化至少一種編碼磷酸酶(EC 3.1.3.-)之基因的表現，該基因之實例列於，例如UniProtKB數據庫(http://enzyme.expasy.org/EC/3.1.3.-)中。根據該方法，該細菌可經修飾以弱化下列基因之一或多者的表現：aphA 基因、cysQ 基因和cpdB 基因。於一實例中，該細菌可經修飾以弱化aphA 基因之表現。該具有表現已被弱化之aphA 基因的細菌可經進一步修飾以弱化cysQ 基因或/和cpdB 基因之表現。於另一實例中，該細菌可經修飾以減弱cysQ 基因之表現。具有表現被已弱化之cysQ 基因的細菌可經進一步修飾以弱化aphA 基因或/和cpdB 基因之表現。

下文中關於aphA 基因表現減弱之解釋亦可比照應用於該可用於如本文所描述之方法中的細菌中之任何表現被減弱的基因。該等基因之實例包括，但不限於cysQ 和cpdB 基因。

短語“細菌已經過修飾以弱化aphA 基因之表現”可指該細菌已經過修飾，該修飾方式係使該經修飾之細菌中該aphA 基因之表現被弱化。舉例而言，該aphA 基因之表現可由於該aphA 基因被去活化而弱化。

短語“aphA 基因被去活化”可指與攜帶野生型或未經修飾之aphA 基因的細菌相比較，該經修飾之基因編碼完全無活性或無功能之蛋白質AphA。亦可接受的是，該經修飾之DNA區由於下述原因而無法自然表現該aphA 基因：該基因之一部分缺失或整個基因缺失、該基因之核苷酸序列中有一或更多個鹼基被替換而導致由該基因編碼之蛋白質中的胺基酸取代(錯義突變)、引入終止密碼子(無義突變)、一或二個鹼基缺失而導致該基因之閱讀框移位、插入耐藥基因和/或轉錄終止信號或修飾該基因之相鄰區域，包括控制基因表現之序列，諸如啟動子、增強子、衰減子、核醣體結合位點，等。該基因之去活化亦可藉由，例如習知方法進行，諸如使用UV照射或亞硝基胍(N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍)之誘變處理、定點誘變、使用同源重組和/或插入-缺失誘變破壞基因，此係基於“Red/Et驅動之整合”或“λRed/Et介導之整合”(Yu D.et al .,Proc .Natl .Acad .Sci .USA , 2000, 97(11):5978-5983；Datsenko K.A. and Wanner B.L.,Proc .Natl .Acad .Sci .USA , 2000, 97(12):6640-6645；Zhang Y.et al .,Nature Genet ., 1998, 20:123-128)。

短語“aphA 基因之表現被弱化”可指該經修飾之細菌含有可操作地連接該基因之區域(包括控制基因表現之序列，諸如啟動子、增強子、衰減子和轉錄終止信號、核糖體結合位點和其他表現控制元件)，該區域經過修飾而導致該aphA 基因表現水準降低；和其他實例(參見，例如，WO95/34672；Carrier T.A. and Keasling J.D.,Biotechnol .Prog ., 1999, 15:58-64)。與基因相關時，短語“可操作地連接”可指該調控區係以能使該核苷酸序列之表現(例如經增強、增加、組成型、基礎、抗終止的、弱化的、失調、降低或受抑制之表現)發生，具體地說，由該核苷酸序列編碼之基因產物可以表現的方式連接該核酸分子或基因之核苷酸序列。

短語“aphA 基因之表現被弱化”亦可指其中該aphA 基因之表現被弱化的經修飾之細菌中，該aphA 基因之表現產物的量(諸如該該基因的mRNA之量或由該基因編碼之AphA蛋白質之量)降低，例如降低至該未經修飾之細菌中之量的50%或更少、20%或更少、10%或更少、5%或更少或甚至降低至0%。

短語“細菌已經過修飾以弱化aphA 基因之表現”亦可指該細菌已使用能使該經修飾之細菌中該對應之基因蛋白產物，諸如AphA蛋白之總酶催活性較該未經修飾之細菌中的活性來得低的方式修飾。該細菌可經修飾從而使每一細胞之AphA蛋白的活性降低，例如降至該未經修飾之細菌中之活性的50%或更少、20%或更少、10%或更少、5%或更少或甚至降低至0%。

作為上述比較之參考的未經修飾之細菌的實例可包括屬於埃希氏菌屬之細菌的野生型菌株，諸如大腸桿菌株K-12亞株MG1655(ATCC 47076、大腸桿菌W3110菌株(ATCC 27325)或屬於泛菌屬之細菌的野生型菌株，諸如菠蘿泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)，等。

aphA 基因之表現可藉由以較弱者替換該基因之表現控制序列，諸如該染色體DNA中之啟動子而被弱化。例如，依WO0018935 A1中所揭示者，在該基因之啟動子區中引入一或多個核苷酸取代以藉此修飾該欲弱化之啟動子是行的。此外，已知取代Shine-Dalgarno(SD)序列中，和/或介於SD序列與起始密碼子之間的間隔子區中，和/或緊接該核醣體結合位點中之起始密碼子上游和/或下游之序列的數個核苷酸將會大幅影響mRNA之轉譯效率。修飾該RBS可與減少aphA 基因轉錄結合。

aphA 基因之表現亦可藉由在該基因之編碼區或在該控制基因表現之區中插入轉座子或插入序列(IS)被弱化(美國專利案編號5,175,107)，或可藉由習知方法，諸如使用紫外線(UV)照射或亞硝基胍(N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍，NTG)進行誘變而被弱化。此外，可藉由已知之基於，例如λRed/Et介導之重組的染色體編輯方法納入定點突變(Datsenko K.A. and Wanner B.L.,Proc .Natl .Acad .Sci .USA , 2000, 97(12):6640-6645)。

大腸桿菌之aphA 基因(同義詞：ECK4047、hobH 、JW4015、napA 、yjbP )編碼B類酸性磷酸酶，AphA (EC 3.1.3.2；NCBI，GenBank，登錄編號NC_000913.3，核苷酸位置：4269414至4270127，基因ID：948562)，且其位於大腸桿菌菌株K-12染色體之相反股中的yjbS 基因和相同股中之yjbQ 基因之間。該大腸桿菌菌株K-12亞株MG1655所天然具有之aphA 基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和由該aphA 基因編碼之AphA蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO：2)為已知者。再者，屬於腸桿菌科之其他細菌物種所天然具有之AphA之胺基酸同源物亦為已知者，諸如，例如下列菌種所天然具有之同源物：福氏志賀菌(Shigella flexneri ) (與大腸桿菌菌株K-12亞株MG1655天然具有之AphA(SEQ ID NO：2)之同一性：100%)、宋內志賀菌(Shigella sonnei ) (同一性：99%)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii )(同一性：91%)、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica )(同一性：89%)、棲冷克呂沃爾氏菌(Kluyvera cryocrescens )和陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae )(同一性：84%)、密歇根克雷伯菌(Klebsiella michiganensis )和植物拉烏爾氏菌(Raoultella planticol a)(同一性：83%)、泛菌屬1.19(同一性：75%)，等(參見，例如NCBI數據庫，國家生物技術信息中心，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)。因此，大腸桿菌菌株K-12亞株MG1655天然具有之AphA和編碼它的aphA 基因亦可分別具有為該具有SEQ ID NO：2中所示之胺基酸序列之蛋白質的同源物和該具有SEQ ID NO：1中所示之核苷酸序列的同源物之蛋白質和基因。

該大腸桿菌之cysQ 基因(同義詞：amt 、amtA 、ECK4210、JW4172)編碼3'(2'),5'-雙磷酸核苷酸酶，CysQ (EC 3.1.3.7；NCBI，GenBank，登錄編號NC_000913.3，核苷酸位置：4436755至4437495，基因ID：948728)，且其位於大腸桿菌菌株K-12染色體之相反股中的cpdB 基因和相同股中之ytfI 基因之間。該大腸桿菌菌株K-12亞株MG1655天然具有之cysQ 基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和由該cysQ 基因編碼之CysQ蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO：4)為已知者。此外，屬於腸桿菌科之其他細菌物種所天然具有之CysQ之胺基酸同源物亦為已知者，諸如，例如下列菌種所天然具有之同源物：宋內志賀菌(與大腸桿菌菌株K-12亞株MG1655天然具有之CysQ(SEQ ID NO：4)的同一性：99%)、丙二酸鹽陰性檸檬酸桿菌(Citrobacter amalonaticus )(同一性：91%)、陰溝腸桿菌(同一性：90%)、腸道沙門氏菌和產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca )(同一性：88%)、日勾維多细菌源菌(Pluralibacter gergoviae )(同一性：87%)、菠蘿泛菌(同一性：81%)，等(參見，例如NCBI數據庫)。因此，大腸桿菌菌株K-12亞株MG1655天然具有之CysQ蛋白和編碼它的cysQ 基因亦可分別具有為該具有SEQ ID NO：4中所示之胺基酸序列之蛋白質的同源物和該具有SEQ ID NO：3中所示之核苷酸序列的同源物之蛋白質和基因。

大腸桿菌之 cpdB 基因(同義詞：ECK4209；JW4171)編碼2',3'-環核苷酸2'-磷酸二酯酶/3'-核苷酸酶，CpdB(EC3.1.4.16、3.1.3.6；NCBI，GenBank，登錄編號NC_000913.3，核苷酸位置：4434622至4436565，互補)，基因ID：948729)且其位於大腸桿菌菌株K-12之染色體的相反股中之cysQ 基因和ytfH 基因之間。該大腸桿菌菌株K-12亞株MG1655天然具有之cpdB 基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)和由該cpdB 基因編碼之CpdB蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO：6)為已知者。此外，屬於腸桿菌科之其他細菌物種所天然具有之CpdB之胺基酸同源物亦為已知者，諸如，例如下列菌種所天然具有之同源物：宋內志賀菌和福氏志賀菌(與大腸桿菌菌株K-12亞株MG1655天然具有之CpdB(SEQ ID NO：6)的同一性：99%)、弗氏檸檬酸桿菌和腸道沙門氏菌(同一性：91%)、抗壞血酸克呂沃爾氏菌(Kluyvera ascorbata )(同一性：89%)、陰溝腸桿菌(同一性：88%)、肺炎克雷伯菌(同一性：87%)、菠蘿泛菌(同一性：75%)，等(參見，例如NCBI數據庫)。因此，大腸桿菌菌株K-12亞株MG1655天然具有之CpdB和編碼它的cpdB 基因亦可分別具有為該具有SEQ ID NO：6中所示之胺基酸序列之蛋白質的同源物和該具有SEQ ID NO：5中所示之核苷酸序列的同源物之蛋白質和基因。

下文中對大腸桿菌菌株K-12亞株MG1655所天然具有和編碼該AphA蛋白之aphA 基因之變體的解說亦可比照應用於任何基因和由該基因編碼之蛋白質，包括可用於如本文所描述之方法中的屬於腸桿菌科之其他細菌物種所天然具有之基因和蛋白質。

該細菌科、屬、菌種或菌株之間的DNA序列中可能有些差異。因此，aphA 基因並不限定於SEQ ID NO：1中所示之基因，但可包括具有SEQ ID NO：1之變體核苷酸序列或同源物，及編碼AphA蛋白之變體的基因。

短語“變體蛋白質”可指與SEQ ID NO：2中所示之胺基酸序列相比較，在序列中具有一或多個突變之蛋白質，無論該突變是否為一或數個胺基酸殘基之取代、缺失、插入和/或添加，其仍保持該蛋白質之活性或功能，或者該變體蛋白質之三維結構相對於該未經修飾之蛋白質(諸如，例如具有SEQ ID NO：2中所示之胺基酸序列的野生型蛋白質AphA)並未顯著改變。變體蛋白質中之變化的數目係取決於該蛋白質之三維結構中之胺基酸殘基的位置或該胺基酸殘基之類型。在SEQ ID NO：2中，該變化之數目可為，但不嚴格限於1至50，於另一實例中可為1至40，於另一實例中可為1至30，於另一實例中可為1至20，於另一實例中可為1至15，於另一實例中可為1至10，且於另一實例中可為1至5。這是可能的，因為胺基酸彼此可具有高度同源性，從而使該蛋白質之活性或功能不受該等改變影響，或者該蛋白質之三維構造相對於未經修飾者(諸如，例如野生型蛋白質)，該蛋白質之結構沒有明顯改變。因此，當使用電腦程式blasp時，由該aphA 基因之變體核苷酸序列編碼之變體蛋白質相對於SEQ ID NO：2中所示之完整胺基酸序列可能具有之同源性(定義同於參數“同一性”)不低於60%、不低於70%、不低於75%、不低於80%、不低於85%、不低於90%、不低於95%、不低於96%、不低於97%、不低於98%或不低於99%，只要該蛋白質維持其活性或功能，或者該變體蛋白質之三維構造相對於該未經修飾之蛋白質(諸如，例如具有SEQ ID NO：2中所示之胺基酸序列的野生型蛋白質AphA)沒有明顯改變。

本說明書中，“同源性”可指“同一性”，即，該胺基酸殘基或核苷酸之同一性。二個序列之間的序列同一性之計算方式為當比對該二個序列以取得彼此最大之對齊時，該二個序列中匹配之殘基的比率。

該一或數個胺基酸殘基之示例性取代、缺失、插入和/或添加可為保守性突變。該代表性保守性突變可為保守性取代。該保守性取代可為，但不限於如下述之取代：若該取代位點為芳族胺基酸，則其中取代係在Phe、Trp和Tyr之間相互取代；若該取代位點為疏水性胺基酸，則其中取代係在Ala、Leu、Ile和Val之間相互取代；若該取代位點為親水性胺基酸，則其中取代係在Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、His和Thr之間相互取代；若該取代位點為極性胺基酸，則其中取代係在Gln和Asn之間相互取代；若該取代位點為鹼性胺基酸，則其中取代係在Lys、Arg和His之間相互取代；若該取代位點為酸性胺基酸，則其中取代係在Asp和Glu之間相互取代；若該取代位點為具有羥基之胺基酸，則其中取代係在Ser和Thr之間相互取代。保守性取代之實例包括以Ser或Thr取代Ala，以Gln、His或Lys取代Arg，以Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，以Asn、Glu或Gln取代Asp，以Ser或Ala取代Cys，以Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，以Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，以Pro取代Gly，以Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，以Leu、Met、Val或Phe取代Ile，以Ile、Met、Val或Phe取代Leu，以Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，以Ile、Leu、Val或Phe取代Met，以Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，以Thr或Ala取代Ser，以Ser或Ala取代Thr，以Phe或Tyr取代Trp，以His、Phe或Trp取代Tyr，及以Met、Ile或Leu取代Val。

該一或數個胺基酸殘基之示例性取代、缺失、插入和/或添加亦可為非保守性突變，其先決條件為該突變被胺基酸序列之不同位置處的一或多個次要突變補償，從而得以維持該蛋白質之活性或功能，或者該變體蛋白質之三維結構相對於該未經修飾之蛋白質(諸如，例如野生型蛋白質)並未顯著改變。

多肽之同一性百分比可使用blastp算法來計算。更具體地說，多肽之同一性百分比的計算可在由美國國家生物技術信息中心(NCBI)提供之評分參數之默認設置(矩陣：BLOSUM62；空隙成本：存在=11延伸=1；組成調整：條件組成分數矩陣調整)中使用blastp算法進行。多核苷酸之同一性百分比可使用blastn算法計算。更具體地說，多核苷酸之同一性百分比的計算可在NCBI提供之評分參數之默認設置(匹配/不匹配得分=1，-2；空隙成本=線性)中使用blastn算法進行。

編碼AphA蛋白之aphA 基因可為變體核苷酸序列。短語“變體核苷酸序列”可指使用任何根據該標準遺傳密碼表之同義胺基酸密碼子編碼變體蛋白質之核苷酸序列(參見，例如Lewin B., “GenesVIII ”, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458)。因此，由於遺傳密碼之簡併性，編碼AphA蛋白之aphA 基因可為變體核苷酸序列。

短語“變體核苷酸序列”亦可指，但不限於能在嚴格條件下與SEQ ID NO：1中所示之序列互補的核苷酸序列雜交之核苷酸序列，或指可從編碼具有如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列的蛋白質之核苷酸序列製備的探針。嚴格條件可包括可形成特定之雜交體的條件，在該條件下該形成之雜交體的同源性(當使用電腦程式blastn時被定義為參數“同一性”)不低於60%、不低於70%、不低於75%、不低於80%、不低於85%、不低於90%、不低於95%、不低於96%、不低於97%、不低於98%或不低於99%且不形成非特異性雜交體，例如同源性低於上述者之雜交體。例如，嚴格條件之實例為：在60℃下，使用鹽濃度1x SSC(標準檸檬酸鈉或標準氯化鈉)、0.1% SDS(十二烷基硫酸鈉)、在60℃下，使用鹽濃度0.1x SSC、0.1% SDS，或在65℃下，使用鹽濃度0.1x SSC、0.1%SDS洗滌一或多次，或於另一實例中，洗滌二或三次。洗滌期間取決於用於點墨法之膜的類型，通常應為該製造商所建議者。例如，在Amersham Hybond^TM -N+帶正電之尼龍膜(GE Healthcare)方面，在嚴格條件下之建議的洗滌期間為15分鐘。該洗滌步驟可進行2至3次。亦可使用與SEQ ID NO：1中所示之序列互補的序列之一部分作為探針。該等探針可藉由PCR(聚合酶鏈反應；參考White T.J.et al ., The polymerase chain reaction,Trends Genet ., 1989, 5:185-189)製備，該PCR係使用基於SEQ ID NO：1中所示之序列製備的寡核苷酸作為引物和含有該核苷酸序列之DNA片段作為模板。該探針之建議的長度＞50 bp；此可根據該雜交條件適當地選擇，通常為100bp至1kbp。例如，當使用長度約300bp之DNA片段作為探針時，該雜交後之洗滌條件可為，例如在50℃、60℃或65℃下，使用2 x SSC、0.1% SDS。

由於物種大腸桿菌所天然具有和編碼AphA蛋白之aphA 基因已被闡明(參見上文)，腸桿菌科之其他細菌物種所天然具有和編碼AphA蛋白之aphA 基因，及該編碼AphA蛋白之變體蛋白質的aphA 基因之變體核苷酸序列可藉由下述方法取得：PCR，該PCR係利用腸桿菌科之細菌和基於該細菌所天然具有之aphA 基因的核苷酸序列製備之寡核苷酸引物；或定點誘變法，該定點誘變法係在活體外使用，例如羥基胺處理含有野生型aphA 基因之DNA；或處理攜帶野生型aphA 基因之微生物(例如屬於腸桿菌科之細菌)的方法，該方法係使用紫外線(UV)照射或突變劑，諸如經常用於該處理之N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸；或藉由化學方式合成全長之基因結構。

如本文所使用之短語“野生型”(其等同於本文所使用之短語“天然具有的”和“天然的”)當與基因(例如“野生型基因”)和蛋白質(例如“野生型蛋白”)有關時，可分別表示存在於野生型細菌中和/或天然表現於野生型細菌中和/或由野生型細菌產生之天然具有的基因和天然具有的蛋白質，該野生型細菌為，例如屬於腸桿菌科之細菌，諸如，例如大腸桿菌MG1655菌株(ATCC 47076)、大腸桿菌W3110菌株(ATCC 27325)、菠蘿泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)，等。由於蛋白質係由基因編碼，“野生型蛋白質”可由野生型細菌之基因組中天然具有或天然發生之“野生型基因”編碼。

可用於如本文所描述之方法中的細菌可藉由下述步驟取得：將上述編碼具有所需活性之蛋白質的DNA引入該已經過修飾之細菌中，以弱化一或多種上述編碼磷酸酶之DNA的表現。或者，該細菌可藉由下述步驟取得：弱化該一或多種上述編碼磷酸酶之DNA在已經過修飾之細菌中之表現，以產生具有所需活性之蛋白質。

除了已提及之特性外，該細菌還可具有其他特定特性，諸如各種營養需求、藥物抗性、藥物敏感性和藥物依賴性，而不背離本發明之範圍。

2. 方法如本文所描述之使受質經酶催化性磺醯化之方法包括下述步驟：在含有屬於腸桿菌科之細菌的培養基中使受質與PAPS在含有屬於腸桿菌科之細菌的培養基中反應以產生該受質之硫酸化衍生物(亦可稱為標的化合物)，並從該培養基收集該硫酸化衍生物。可選擇地，該方法可包括從該培養基純化該硫酸化衍生物，從而可取得為所需純度之標的化合物之步驟和/或其他所需之步驟。

該使用如本文所描述之方法使受質反應之步驟可在適合使具有所需活性之蛋白質運作的條件下進行，從而可產生該受質之硫酸化衍生物或標的化合物。可用於該方法中之培養基可為是任何培養基，只要受質可在該培養基中磺醯化，以使用該方法產生其硫酸化衍生物。該培養基可含有使用如本文所描述之方法使受質磺醯化所需之組分，且這些至少包括溶劑、屬於腸桿菌科之細菌、PAPS和受質。除了這些組分外，該培養基可含有一或多種其他成分，諸如，例如有機和/或無機鹽、酸性或鹼性物質、表面活性劑、對硝苯基硫酸化物(pNPS)、蛋白質(包括酶)，等。關於溶劑，可使用以水為底質之培養基，在該培養基中至少具有磺基轉移酶活性之蛋白質可運作，從而可測定該蛋白質之活性。例如，可使用其中已培養可用於該方法中之細菌的培養基，以使該受質經酶催化性磺醯化，其先決條件為該培養基經輔以使該受質經酶催化性磺醯化所必需的組分。再者，該培養基之組成可經適當地選擇，從而使其他蛋白質(例如具有肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶活性之蛋白質和/或具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質，等亦可運作。

由於可用於如本文所描述之方法中之細菌已經過修飾以至少產生具有肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶活性之蛋白質和/或具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質，該具有上述活性之蛋白質可在未從該細菌細胞和/或培養該細菌之培養基中分離和/或純化之情況下使用。亦即，可使用含有如本文所描述之已經過修飾之細菌的培養基，只要該具有所需活性之蛋白質的活性可在該培養基中測定，或可使用該方法產生該受質之硫酸化衍生物。可使用之培養基可含有經破壞之該細菌細胞(稱為粗製細胞溶胞產物)，從而可更有效地使用該具有所需活性之蛋白質。細胞破壞之方法為本技藝中所周知且這些包括，例如機械破壞、液體均質化(包括法壓)、高頻聲波(稱為超音波性細胞溶解)、凍融循環、手動研磨，等。

使用如本文所描述之方法使受質經酶催化性磺醯化之條件可經適當地選擇並藉由參考可用於該方法中之蛋白質的屬性調節，該屬性為本技藝之技術熟習人士所周知且可在，例如綜合酶信息系統(The Comprehensive Enzyme Information System) (Brenda, https://www.brenda-enzymes.org)和UniProtKB數據庫(https://enzyme.expasy.org)中找到。例如，當使用哺乳動物物種天然具有之蛋白質時，該磺醯化反應可在25至35℃之溫度下進行24至72小時並可將pH保持在6.5至7.5。

可用於如本文所描述之方法中之屬於腸桿菌科之細菌可在適合用於培養所選擇之用於該方法中之細菌的條件下進行培養。例如，當培養屬於埃希氏菌屬之細菌時，該培養可在有氧條件下進行16至72小時、16至24小時或32至48小時，該培養期間之培養溫度可控制在30至45℃或30至37℃內，且pH可調整為在5至8或6至7.5之間。該pH值可使用無機或有機酸性或鹼性物質(諸如尿素、碳酸鈣或胺氣)調整。

該培養基可為合成或天然之培養基，諸如依需要含有碳源、氮源、硫源、磷源、無機離子和其他有機和無機組分的典型培養基。可作為碳源的有：醣類，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、麥芽糖、木糖、海藻糖、核糖和澱粉之水解產物；醇類，諸如乙醇、甘油、甘露醇和山梨糖醇；有機酸類，諸如葡糖醛酸、富馬酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸；脂肪酸，等。可作為氮源的有：無機銨鹽類，諸如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨；有機氮，諸如大豆水解產物；氨氣；水性氨；等。此外，亦可利用蛋白腖、酵母萃取物、肉萃取物、麥芽萃取物、玉米漿，等。該培養基可含有一或多種類型之這些氮源。該硫源可包括硫酸銨、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳，等。除了碳源、氮源和硫源之外，該培養基可含有磷源。可作為磷源的有：磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鹽聚合物，諸如焦磷酸，等。可存有適當量，即使是微量之維生素，諸如維生素B1、維生素B2、維生素B6、菸酸、菸醯胺、維生素B12，必要之物質，例如有機營養物質，諸如核酸(諸如腺嘌呤和RNA)、胺基酸、蛋白腖、酪蛋白胺基酸、酵母萃取物，等。除此之外，若需要時，可添加少量之磷酸鈣、鐵離子、錳離子，等。

該受質之硫酸化衍生物可以游離形式或其鹽或其混合物之形式製備。例如，該標的化合物之鈉、鉀、銨、鈣，等鹽類可藉由該方法製之。這是可行的，因為磺基(-SO₃ H)可在磺醯化條件下，在典型之酸鹼中和反應中與中和劑(諸如，例如鹼性物質)反應以形成鹽，此為本技藝之一般技術人士所清楚明白之含磺基分子的化學特性。

在使受質反應之步驟之後，該受質之硫酸化衍生物可使用常規技術，諸如，例如濃縮、沉澱、結晶化、離子交換色層分析法、中或高壓液相色層分析法或彼等之組合(這些為本技藝之一般技術人士所周知)從培養基收集。此外，該從培養基收集之硫酸化衍生物可經純化，以取得具有所需純度之標的化合物，該純度為，例如不低於30%、不低於40%、不低於50%、不低於60%、不低於70%、不低於80%、不低於90%、不低於95%、不低於96%、不低於97%、不低於98%、不低於99%或不低於99.9%。該純度可以，例如重量比(w/w)，等表示。

例如，當使用如本文所描述之酶催化性磺醯化之方法取得作為標的化合物之肝素時，該肝素可使用，例如描述於van der Meer J.-Y.et al ., 2017中及其中引用之參考文獻中的程序從培養基收集。特別是，首先，可使用季銨鹽，諸如，例如Hyamine®1622從培養基將肝素沉澱下來。然後，可使用濃NaCl溶液萃取該沉澱之Hyamine®-肝素複合物以得到肝素鈉鹽。然後，可在受控之溫度、pH和鹽濃度下令該肝素鈉鹽進行陰離子交換色層分析法以回收根據電荷和比活性分餾之肝素。在此階段，通常可取得具有足夠純度之肝素。肝素可，例如以低分子量肝素(縮寫為“LMWH”)之形式取得。低分子量肝素可指，例如分子量為1000至10000 Da之分液(平均分子量為4000至6000 Da)。LMWH具有與非分餾之肝素相比較，其顯示出較少之不良出血反應的優點。

可選擇地，該肝素可藉由應用使用有機溶劑(諸如，例如甲醇、乙醇、丙醇或丙酮)進行沉澱和使用，例如高錳酸鉀(KMnO₄ )、過氧化氫(H₂ O₂ )、過醋酸(CH₃ CO₃ H)、次氯酸鈉(NaClO)或臭氧(O₃ )進行漂白來進一步純化。最後，可藉由將肝素從高百分比之甲醇或乙醇沉澱下來進行純化。若需要時，可將該沉澱之肝素在真空中，40至75℃之溫度下乾燥。

亦可接受的是，當使用如本文所描述之經酶催化性磺醯化之方法取得作為標的化合物之肝素時，亦可將肝素進行解聚步驟。解聚可，例如藉由使用亞硝酸或藉由光解方法進行，或藉由施加肝素酶I、II或III或彼等之組合以酶催化方式進行。解聚程度並無特別限制。可進行解聚以取得分子量為，例如1000至35000 Da之肝素。實施例

本發明將參考以下非限制性實施例更具體地解釋。

實施例 1 . 研究在刪除磷酸酶編碼基因之大腸桿菌菌株Origami®2(ΔptrA ΔhslU )之細胞溶胞產物中的PAP和PAPS之穩定性。

1.1. 大腸桿菌K-12菌株Origami®2(ΔptrA ΔhslU )。研究在大腸桿菌K-12菌株Origami®2(ΔptrA ΔhslU )之粗製細胞溶胞產物中之PAP和PAPS的穩定性，該大腸桿菌菌株已被進一步修飾以刪除一或多個選自aphA 基因、cysQ 基因和cpdB 基因之磷酸酶編碼基因。已知，在細胞中合成或由細胞產生之蛋白質的酶催化活性可被適當形成之蛋白質二硫鍵影響(參見，例如Ke N. and Berkmen M., Production of disulfide-bonded proteins inEscherichia coli ,Curr .Protoc .Mol .Biol ., 2014, 108:16.1B.1-21)。因此，選擇具有基因型Δ(ara-leu )7697 ΔlacX74 ΔphoA Pvu IIphoR araD139 ahpC galE galK rpsL F'[lac ⁺ lacI^q pro ]gor522 ::Tn10 trxB (Str^R , Tet^R )之大腸桿菌K-12菌株Origami®2(Merck，目錄編號71344-3)來生產磺基轉移酶和肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶。該菌株之編碼硫氧還蛋白還原酶(trxB )和麩胱甘肽還原酶(gor )的基因中具有突變，該突變大幅增進大腸桿菌細胞質中之二硫鍵的形成。

亦已知磺基轉移酶和肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶可在大腸桿菌細菌中以麥芽糖結合蛋白(MBP)-標籤之蛋白質形式有效地產生(參見，例如Bethea H.N.et al ., Redirecting the substrate specificity of heparan sulfate 2-O-sulfotransferase by structurally guided mutagenesis,Proc .Natl .Acad .Sci .USA , 2008, 105(48): 18724-18729；Li K.et al ., Using engineered 2-O-sulfotransferase to determine the activity of heparan sulfate C5-epimerase and its mutants,J .Biol .Chem ., 2010, 285(15):11106-11113)。然而，可能需要進一步提高在粗製細胞溶胞產物中之靶蛋白的產製效率。此可藉由，例如減少MBP標籤之蛋白質之蛋白水解性降解來達成。尤其是，可將表現該蛋白質之細菌中的一或多個蛋白酶編碼基因刪除。我們發現，藉由分別刪除編碼週質蛋白酶III和HslVU蛋白酶之ATP酶組分的ptrA 和hslU 基可顯著改善大腸桿菌細胞之粗製細胞溶胞產物中的MBP標籤之蛋白質之穩定性。

因此，選擇大腸桿菌K-12菌株Origami®2 (ΔptrA ΔhslU )作為用於產生MBP標籤之蛋白質及研究粗製細胞溶胞產物中之PAP和PAPS之穩定性的最佳宿主菌株。

1.2. 構建大腸桿菌Δ2-5-菌株。將大腸桿菌K-12菌株Origami®2之染色體中的ptrA 、hslU 、cysQ 、cpdB 和aphA 基因一個一個刪除。使用框架內基因刪除法(亦稱為雙輸入/輸出法) (Minaeva N.I.et al .,BMC Biotechnol ., 2008, 8:63)。該構建之Δ2-5菌株描述於表1中。

1.3. 粗製細胞溶胞產物之製備方法。令Δ2-5-菌株各自在37℃下，在50 mL試管中之10mL LB-培養基(Sambrook, J. and Russell, D.W. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001))中生長隔夜(約16小時)。然後，藉由離心(5000rpm)收獲細胞，將其再懸浮於0.3 mL緩衝液A (100mM Tris-HCl，pH 7.5；10%(v/v)甘油)中並藉由超音波處理破壞之。藉由離心將不溶性細胞組分之分液沉澱下(13000 rpm)。將該粗製細胞溶胞產物之可溶性分液(稱為上清液)轉移到新的小瓶內並用於在PAP(S)-穩定性分析中研究PAP和PAPS之穩定性。

1.4. PAP(S)-穩定性分析。各反應混合物(100μL)含有：50mM MES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)，pH 7.0；1mM MgCl₂ ；Triton x100，1%(v/v)；和0.4 mg/mL PAP或PAPS。加入粗製細胞溶胞產物(實施例1.3)之可溶性分液，使反應混合物中之最終蛋白質濃度高達2.5 mg/mL。使用水代替溶胞產物作為對照組。將各反應混合物在30℃下培育一段如表2和3中指示之期間，然後使用HPLC法進行分析。該HPLC分析之條件如下：設備：Alliance Waters，管柱：TSK GEL DEAE-5PW 2x75mm，10 µm，檢測：UV-檢測器(雙吸光度檢測器)，在235nm處檢測NS和NS2S，在254nm處檢測PAP和PAPS，其中NS意指α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS且NS2S意指α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS，其中ΔUA意指4-脫氧基-L-蘇-六-烯吡喃糖基糖醛酸且GlcNS意指N-磺基-D-葡糖胺，洗提梯度：0分鐘-0%B，15分鐘-5%B，20分鐘-30%B，30分鐘-100%B，30分鐘-至0%B，其中該洗提緩衝液A為2.56 mM NaH₂ PO₄ (pH 3.0，使用H₃ PO₄ 調節)，5%乙腈；且洗提緩衝液B為2.56 mM NaH₂ PO₄ (pH 3.0，使用H₃ PO₄ 調節)，0.5 M LiCl₂ ，溫度：40℃，洗提速率：0.2 mL/min，進樣體積：10μL，注射時間：50分鐘，壓力：140-160 psi，校準樣品：1-200 mg/L，檢測極限：0.005 mg/L，洗提時間：PAP(19.42分鐘)、NS(21.94分鐘)、PAPS (26.02分鐘)、NS2S(28.91分鐘)。

該PAP(S)-穩定性分析之結果顯示於表2和3中。如表2中所知，PAP在Δ2-菌株之粗製細胞溶胞產物中特別不穩定，其在22小時內被完全降解。刪除Δ2-菌株中之cysQ 基因以獲得導致PAP之穩定性改善的Δ3-菌株；然而，全部PAP在22小時內降解。刪除Δ3-菌株中之cpdB 基因以獲得導致PAP之穩定性大幅改善的Δ4-菌株；培育22小時後約25%之PAP仍保持在反應混合物中。刪除Δ4-菌株中之aphA 基因以獲得導致PAP之穩定性改善二倍的Δ5-菌株；培育22小時後約50%之PAP仍保持在反應混合物中。因此，PAP之穩定性可藉由刪除一或多個編碼AphA、CysQ和CpdB之基因來改善。

從表3中可看出，PAPS在Δ2-菌株之粗製細胞溶胞產物中非常不穩定；其在22小時內完全降解。刪除Δ2-菌株中之cysQ 基因以獲得導致PAPS在22小時內之穩定性改善10倍的Δ3-菌株。刪除Δ3-菌株中之cpdB 基因以獲得Δ4-菌株，該Δ4-菌株未導致PAPS之穩定性改善。刪除Δ4-菌株中之aphA 基因以獲得導致PAPS之穩定性改善二倍的Δ5-菌株。因此，PAPS之穩定性可藉由刪除一或二個編碼AphA和CysQ之基因來改善。

實施例 2 . 使用PAPS作為磺基供體使低分子量N-硫酸肝素前體經酶催化性磺醯化。使用PAPS作為磺基供體及Δ2-5菌株之粗製細胞溶胞產物(其可產生肝素前體硫酸2-O-磺基轉移酶(HS 2-OST)和肝素前體-N-硫酸-葡糖尿酸酯5-表異構酶(HNSG-5epi))使低分子量N-硫酸肝素前體(縮寫為“LMWHS”)經酶催化性磺醯化。

2.1. 構建pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)質粒。 2.1.1. 構建pMAL*載體。修飾該pMAL-c2X載體(新英格蘭生物實驗室，目錄編號E8000S)，以編碼MBP蛋白之C端的DNA片段取代編碼肽連接子S₃ N₁₀ LGIEGRISEFGS之DNA片段，其中該在位置359之麩胺酸殘基被丙胺酸殘基(E359A)替換，位置362處之離胺酸殘基被丙胺酸殘基(K362A)替換且在位置363處之天門冬胺酸殘基被丙胺酸殘基(D363A)替換(Rob J. C.et al ., Crystallization of a trimeric human T cell leukemia virus type 1 gp21 ectodomain fragment as a chimera with maltose-binding protein,Prot .Science , 1998, 7:1612-1619)。此外，將限制性位點Hind III-Bam HI-Sac I-Xho I-Not I引入載體中。

使用引物P1(SEQ ID NO：7)和P2(SEQ ID NO：8)，作為模板之pMAL-c2X質粒擴增該含有鄰接5'-Bgl II和3'-Hind III限制性位點之MBP之C端的一部分之PCR片段。將該PCR產物連接入該pMAL-c2X質粒之Bgl II/Hind III限制性位點中。如此，構建出pMAL*載體。

2.1.2. 構建pMAL*-2OSTY94A(D69-N356)質粒。攜帶編碼突變體HS 2-OST之編碼序列的DNA片段(SEQ ID NO：9)係由GeneArt®訂製DNA合成(Thermo Fisher Scientific)以化學方式合成，該突變體HS 2-OST具有SEQ ID NO：10中所示之胺基酸序列，該SEQ ID NO：10中所示之胺基酸序列對應於長尾倉鼠(Cricetulus longicaudatus )天然具有之HS 2-OST(UniProtKB，登記編號O0889.1)中的多肽(從位置69(D69)之天門冬胺酸殘基至位置356(N356)之天門冬醯胺殘基)，其中在位置94之酪胺酸殘基被丙胺酸殘基替換(Y94A)。使用限制酶Not I和Xho I分解該DNA片段並選殖入pMAL*/Not I-XhoI 載體中(實施例2.1.1)。如此，構建出pMAL*-2OSTY94A(D69-N356)質粒。

2.1.3. 構建pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)質粒。將pMAL*-2OST(D69-N356)質粒之3.6kbpFsp I-Hind III DNA片段分殖入pACYC184選殖載體(GenBank/EMBL，登記編號X06403)之Eco RV/Hind III限制性位點中。如此，構建出pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)質粒。

2.2. 構建pSUMO-dreGlce(G70-N585)質粒。源自pETite™ N-His SUMO Kan載體(Lucigen公司，美國懷俄明州米德爾頓市帕門街2905(2905 Parmenter St, Middleton) 53562)之編碼N-標籤之6xHis-SUMO肽(SEQ ID NO：12)的DNA片段(SEQ ID NO：11)係由GeneArt®訂製DNA合成(Thermo Fisher Scientific)以化學方式合成，該肽係與具有SEQ ID NO：13中所示之胺基酸序列的HNSG-5epi之(G70-N585)片段融合，該SEQ ID NO：13中所示之胺基酸序列對應於斑馬魚天然具有之HNSG-5epi中的多肽(從位置70(G70)之甘胺酸殘基至位置585(N585)之天門冬醯胺殘基)(NCBI參考序列：NP_998014.1)。使用限制酶Nde I和Xho I分解該DNA片段並選殖入pMAL*/Nde I-Xho I載體中(實施例2.1.1)。如此，構建出pSUMO-dreGlce(G70-N585)質粒。

2.3. 構建攜帶pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)和pSUMO-dreGlce(G70-N585質粒之Δ2-5-菌株。使用標準電穿孔程序(0.1cm比色皿(Bio-Rad公司)；電壓，2kV；持續時間，5μs)將pACYC184-MBP*-2OSTY94A (D69-N356)和pSUMO-dreGlce(G70-N585)質粒引入Δ2-5菌株中。首先，將該pSUMO-dreGlce(G70-N585)質粒引入構建體Δ2-5/pSUMO-dreGlce(G70-N585)菌株中。然後，將該pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)質粒引入Δ2-5/pSUMO-dreGlce(G70-N585)菌株中以構建攜帶二個質粒之靶的Δ2-5-菌株。攜帶pACYC184-MBP*-2OSTY94A (D69-N356)和pSUMO-dreGlce(G70-N585)質粒之Δ2-5-菌株被稱為Δ2-5/pSUMO/pACYC184菌株。

2.4. Δ2-5/pSUMO/pACYC184之粗製細胞溶胞產物之可溶性分液的製備方法。將生長在含有胺苄青黴素(200mg/L)和氯黴素(30mg/L)之LB肉湯中一整夜，體積各為1.25 mL之攜帶pACYC184-MBP*-2OSTY94A(D69-N356)和pSUMO-dreGlce (G70-N585)質粒之Δ2-5菌株的細胞培養物接種在含有50 mL LB肉湯之燒瓶中，該50 mL LB肉湯中含有胺苄青黴素(150mg/L)和氯黴素(30mg/L)，然後在37℃下培養至OD₆₀₀ 約0.8。然後，加入IPTG(異丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)，使最終濃度為0.5 mM以誘導HS 2-OST和HNSG-5epi合成。在20℃下繼續培養48小時。

藉由離心(5000 rpm)收穫所產生之生物物質，將其再懸浮於0.3mL之50 mM MES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)溶液(pH7)中並進行超音波處理以破壞細胞。然後，藉由離心(13000 rpm)將含有不溶性蛋白質之粗製細胞溶胞產物的不溶性分液沉澱下，再懸浮於0.3 mL之樣品緩衝液(20mM Tris-HCl，pH 6.8；50mM DTT (1,4-二硫代蘇糖醇)、0.1%(v/v)SDS、30%(v/v)甘油)中並在95℃下培育10分鐘。然後，藉由離心(13000 rpm)再次將不溶性分液沉澱下。使用所取得之上清液作為不溶性蛋白質製劑。將從上述步驟取得且含有可溶性蛋白，包括具有硫酸乙醯肝素2-O-磺基轉移酶和肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶活性之蛋白質的粗製細胞溶胞產物的可溶性分液轉移入新的小瓶中並儲存在4℃下長達3至5小時，直至使用時。由此製備之粗製細胞溶胞產物的可溶性分液中之蛋白質的平均濃度為20 mg/mL。

為了分析攜帶pACYC184-MBP*-2OSTY94A (D69-N356)和pSUMO-dreGlce(G70-N585)質粒之Δ2-5菌株的粗製細胞溶胞產物的可溶性和不溶性分液中之蛋白質含量，取每種製劑1µL進行SDS-PAGE分析(第3圖)。從第3圖可知，該菌株之所有分析的粗製細胞溶胞產物中之HS 2-OST和HNSG-5epi的絕對量和相對量相同。

2.5. 使用PAPS作為磺基供體進行LMWHS之2-磺醯化反應。在總體積為100µL之反應混合物中進行LMWHS之2-磺醯化反應，該反應混合物中含有：50 mM MES，pH 7；1 mM MgCl₂ ；1%(v/v)Tritonx100；1mM CaCl₂ ；1.2 mM PAPS；1 mg/mL LMWHS (輔助實例)；和83μL之粗製細胞溶胞產物的可溶性分液(實施例2.4)。該陰性(對照)反應物含有上述除了溶胞產物以外之組分，該溶胞產物係使用水代替。將反應混合物在30℃下培育48小時。然後，使用肝素酶I、II和III(New England Biolabs公司，目錄編號P0735S、PO736S、P0737S)處理該反應混合物之一部分。總體積為100μL之反應混合物中含有：30μL之培育後獲得之反應混合物、10μL之肝素酶緩衝液(New England Biolabs公司)、肝素酶I、II和III(每種酶1μL)和60μL之H₂ O。將反應混合物在30℃下培育24小時，然後使用HPLC法分析雙醣NS(α-ΔUA-[1→4]-GlcNS)和NS2S(α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS)之存在和量。HPLC分析之條件描述於實施例1.4中。

LMWHS之2-磺醯化的結果顯示於表4中。如表4中所示，與Δ2/pSUMO/pACYC184菌株相比較，當使用cysQ 基因、cpdB 和 aphA 基因缺失之Δ5/pSUMO/pACYC184菌株的粗製細胞溶胞產物時，使用PAPS作為磺基供體進行LMWHS之2-磺醯化反應的效力增加約1.4倍。

實施例 3 . 在pNPS之存在下使低分子量N-硫酸肝素前體經酶催化性磺醯化。亦在含有pNPS和芳基磺基轉移酶之Δ2-5/pSUMO/ pACYC184菌株的粗製細胞溶胞產物中使用PAPS作為磺基供體使LMWHS經酶催化性磺醯化。

3.1. 表現和純化褐家鼠芳基磺基轉移酶1A1。首先，構建攜帶該編碼褐家鼠天然具有之ST1A1之基因的pETDuet-N-Tag6xHis-ST1A1質粒。由GeneArt®訂製DNA合成(Thermo Fisher Scientific)以化學方式合成含有該編碼褐家鼠天然具有之芳基磺基轉移酶1A1(縮寫為“ST1A1”，亦稱為“Sult1a1”)的基因(NCBI參考序列：NP_114022.1)之DNA片段(SEQ ID NO：14)。使用限制酶EcoR I和Hind III分解所獲得之DNA片段並將其選殖入pETDuet-1/EcoR I-Hind III載體(Novagen)中。由此獲得與6xHis標籤融合之編碼褐家鼠天然具有之ST1A1的基因。

然後，表現該6xHis標籤之ST1A1並使用固定化金屬離子親和層析術(IMAC)在1-mL HiTrap柱(GE Healthcare)上純化。應用該製造商建議之標準程序。

3.2. 在pNPS之存在下進行LMWHS之2-O-磺醯化反應。在總體積為100µL之反應混合物中進行LMWHS之2-O-磺醯化反應，該反應混合物中含有：50 mM MES，pH 7；1 mM MgCl₂ ；1%(v/v) Triton x 100；1mM CaCl₂ ；46 μM PAP；10 mM pNPS；1 mg/mL LMWHS (輔助實例)；4.75μg ST1A1(實施例3.1)；和74μL之粗製細胞溶胞產物的可溶性分液(實施例2.4)。該陰性(對照)反應物含有上述除了該溶胞產物以外之組分，該溶胞產物係使用水代替。將反應混合物在30℃下培育48小時。使用肝素酶處理該反應混合物和使用HPLC分析所得之混合物的條件與實施例2.5中所描述者相同。

在pNPS之存在下進行LMWHS之2-O-磺醯化反應的結果顯示於表5中。從表5中可知，當使用cysQ 基因、cpdB 和 aphA 基因缺失之Δ5/pSUMO/pACYC184菌株的粗製細胞溶胞產物時，在pNPS之存在下使用PAPS作為磺基供體時，LMWHS之磺醯化產量為75%，然而當使用Δ2/pSUMO/pACYC184菌株之粗製細胞溶胞產物時未檢測到該LMWHS之磺醯化產物。再者，與使用缺失cysQ 基因之Δ3/pSUMO/pACYC184菌株及缺失cysQ 和cpdB 基因之Δ4/pSUMO/pACYC184菌株相比較，當使用缺失cysQ 基因、cpdB 和 aphA 基因之Δ5/pSUMO/pACYC184菌株的粗製細胞溶胞產物時，在pNPS之存在下使用PAPS作為磺基供體反應時，LMWHS之2-O-磺醯化分別高出約16和15倍。

實施例 4 . 使用pNPS作為磺基供體使PAP經酶催化性磺醯化。 4.1. 構建pPlac-N-Tag6xHis-ST1A1質粒。為了構建pPlac-N-Tag6xHis-ST1A1質粒，使用引物P3 (SEQ ID NO：15)和P4(SEQ ID NO：16)及作為模板之pETDuet-N-Tag6xHis-ST1A1質粒(實施例3.1)，藉由PCR取得DNA片段。將所得之DNA片段連接入pMAL*質粒之Nde I/Hind III位點(實施例2.1.1)。

4.2. 構建攜帶pPlac-N-Tag6xHis-ST1A1質粒之Δ2-5-菌株。使用標準電穿孔程序(0.1cm比色杯(Bio-Rad公司)；電壓，2kV；持續時間，5μs)，將pPlac-N-Tag6xHis-ST1A1質粒引入Δ2-5菌株(實施例1.2，表1)中。該攜帶pPlac-N-Tag6xHis-ST1A1質粒之Δ2-5菌株稱為Δ2-5/pST1A1菌株。

4.3.Δ2-5/pST1A1菌株之粗製細胞溶胞產物的可溶性分液之製備方法。將藉由在瓊脂盤上生長過夜所新鮮製備之Δ2-5/pST1A1菌株的細胞接種在20 mL試管中之5 mL含有胺苄青黴素(200 mg/L)的LB肉湯中，直至達到最初OD₅₉₅ 為0.1，並在37℃下培養使最終OD₅₉₅ 為1.2。然後，藉由添加IPTG(異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)使最終濃度為1mM來誘導N-Tag6xHis-ST1A1合成。在25℃下繼續培養16小時。藉由在4℃，3.3 RCF(相對離心力)下離心10分鐘來收穫所得之生物物質，以25mL之0.9% NaCl溶液洗滌二次並在-20℃下冷凍直至使用。

將解凍之細胞沉澱小丸重新懸於0.5 mL緩衝液(100 mM Tris-HCl，10%(v/v)甘油，pH 7.4)中並藉由超音波處理破壞細胞。藉由在13000 rpm離心約20分鐘來移除細胞碎片。使用所產生之粗製細胞溶胞產物作為ST1A1蛋白製劑。

4.4. 使用pNPS作為磺基供體進行PAP之磺醯化反應。總體積為100µL之各反應混合物含有：50 mM Tris-HCl，pH 7；230μM PAP；1 mM pNPS；10%(v/v)甘油；0.1 mg/mL之Δ2-5/pST1A1菌株的粗製細胞溶胞產物。在標準的96孔盤中製備該混合物。藉由添加PAP來啟動反應。將反應混合物在30℃下，在MultiskanGo(Thermo Scientific)中培育3小時。每5分鐘對所有使用之孔測量OD₄₀₅ ，從而取得pNP合成之動力學(第4圖)。使用根據OD₄₀₅ 對pNP濃度之依賴性所取得之校準曲線來測定pNP絕對濃度。鑑於等式：PAP+pNPS=PAPS+pNP，假定反應混合物中之PAPS的累積量(以莫耳比表示)等於pNP之累積量。

從所得之實驗數據可知(第4圖)，當使用缺失cysQ 、cpdB 和aphA 基因之Δ5/pST1A1菌株的粗製細胞溶胞產物時可觀察到最高之PAP磺醯化產量。與不具有cysQ 基因、cpdB 基因和aphA 基因缺失之Δ2/pST1A1菌株的粗製細胞溶胞產物相比較，Δ5/pST1A1菌株之粗製細胞溶胞產物中的PAPS之累積產量(以μM計)高約2倍。

輔助實施例 . 低分子量N-硫酸肝素前體(LMWHS)之製備方法。 (1) 肝素前體之製備方法。 (1.1) 肝素前體發酵法。使用肝素前體產製細菌(大腸桿菌 BL21(DE3)/pVK9-kfiABCD菌株)和WO2015/050184之實施例1中描述之培養條件取得含有肝素前體之培養液。

(1.2) 肝素前體之純化。藉由離心從培養液收集培養上清液。為了除去培養基成分，使用UF膜以Milli-Q水洗滌1mL之培養上清液，並濃縮成250μL。在使用UF膜濃縮之250μL溶液中添加500μL之100%乙醇，並藉由離心將肝素前體沉澱下。將所得之沉澱物在空氣中乾燥以獲得肝素前體。亦使用相同之程序從剩餘之培養物上清液純化肝素前體。共獲得l0g肝素前體。

(2) 肝素前體之N-脫乙醯化。 A) 在1.22g之肝素前體中加入61 mL之肼·H₂ O和4.7 mL之1N硫酸，使用氮替換該氣相後，將混合物加熱至100℃並反應4.75小時。 B) 以冰冷卻來終止反應後，加入61 mL之16% NaCl水溶液和610 mL之MeOH並將混合物離心。移除該上清液。將所得之沉澱物溶解在50 mL之H₂ O中，然後脫鹽並使用Amicon UF膜(3 kDa)濃縮之。 C) 在所得之濃縮溶液中加入二倍體積之H₂ O和體積之1M NaHCO₃ ，然後，將0.2 M I₂ /0.4M KI溶液滴入其中直到顏色變成黃色。隨後，滴入肼·H₂ O以將過量之碘還原成碘離子，然後將該溶液脫鹽並再次使用Amicon UF膜(3kDa)濃縮。將濃縮溶液在減壓下乾燥以獲得N-脫乙醯化肝素前體。所取得之N-脫乙醯化肝素前體中之乙醯基的殘留率為14.9%(稍後描述)。

(3) N-脫乙醯化肝素前體之解聚化。 (3.1)肝素酶III之製備方法。 (3.1.1)構建攜帶肝黃桿菌(Flavobacterium heparinum )天然具有之hepC基因的表現質粒。將該編碼黃桿菌肝素天然具有之肝素酶III之 hepC基因選殖入pMIV-Pnlp0載體(美國專利申請刊物編號20050196846)中以構建hepC基因表現質粒pMIV-Pnlp0-hepC。該pMIV-Pnlp0-ter包括強效nlp0啟動子(Pnlp0)和rrnB終止子，並可藉由將目標基因插入啟動子和終止子之間來作為表現單元。“Pnlp0”代表用於大腸桿菌K-12天然具有之野生型nlpD基因的啟動子。

用於構建表現質粒之細節顯示於下文中。使用引物P5 (SEQ ID NO：17)和引物P6 (SEQ ID NO：18)，以來自大腸桿菌MG1655之染色體DNA作為模板，藉由PCR取得DNA片段，該DNA片段包含約300bp之nlpD基因的啟動子區(Pnlp0)。這些引物各自之5'端均已設計限制酶Sal I和Pae I之位點。依下述進行PCR循環：首先，在95℃下保持3分鐘，然後在95℃下保持60秒，在50℃下保持30秒，及在72℃下保持40秒，共二個循環，隨後在94℃下保持20秒，在55℃下保持20秒且在72℃下保持15秒共25個循環，最後在72℃下保持5分鐘。使用Sal I和Pae I處理所產生之DNA片段，並將其插入pMIV-5JS(日本專利申請刊物編號2008-99668)之Sal I-Pae I位點中以獲得質粒pMIV-Pnlp0。插入該pMIV-Pnlp0質粒中之Pnlp0啟動子的Pae I-Sal I片段之核苷酸序列如SEQ ID NO：19中所示。

隨後，使用引物P7 (SEQ ID NO：21)和引物P8 (SEQ ID NO：22)，以來自MG1655之染色體DNA作為模板，藉由PCR取得DNA片段(SEQ ID NO：20)，該DNA片段(SEQ ID NO：20)包含約300bp之rrnB 基因的終止子區。在這些引物之各自的5'端已設計限制酶Xba I和BamHI 之位點。依下述進行PCR循環：首先，在95℃下保持3分鐘，然後在95℃下保持60秒，在50℃下保持30秒，及在72℃下保持40秒，共二個循環，隨後在94℃下保持20秒，在59℃下保持20秒且在72℃下保持15秒，共25個循環，最後在72℃下保持5分鐘。使用Xba I和BamHI I處理所產生之片段並將其插入pMIV-Pnlp0-ter之Xba I-BamHI I位點中以獲得質粒pMIV-Pnlp0-ter。

接著，藉由人工合成DNA鏈，該DNA鏈包括肝黃桿菌(ATCC 13125；Su H.et al .,Appl .Environ .Microbiol ., 1996, 62:2723-2734)天然具有之hepC 基因的ORF。使用引物P9(SEQ ID NO：23)和引物P10(SEQ ID NO：24)並以該DNA鏈作為模板，藉由PCR擴增該hepC 基因之DNA片段。該PCR係使用PrimeStar聚合酶(Takara)在該實驗方案中描述之反應組成物中進行。依下述進行PCR循環：首先，在94℃下保持5分鐘，然後在98℃下保持5秒，在55℃下保持10秒及在72℃下保持8分鐘，共30個循環，最後保持在4℃。此外，使用引物P11 (SEQ ID NO：25)和引物P12 (SEQ ID NO：26)之寡核苷酸作為引物，以pMIV-Pnlp0作為模板DNA，藉由PCR取得pMIV-Pnlp0之DNA片段。該PCR係使用PrimeStar聚合酶(Takara)和該實驗方案中描述之反應組成物進行。依下述進行PCR循環：首先，在94℃下保持5分鐘，然後在98℃下保持5秒，在55℃下保持10秒及在72℃下保持6分鐘，共30個循環，最後保持在4℃。使用In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組(Clontech)連接所得之二個DNA片段以構建hepC 基因表現質粒pMIV-Pnlp0-hepC。選殖之hepC 基因的核苷酸序列和由其編碼之肝素酶III (HepC)之胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO：27和28中。

(3.1.2) 構建表現hepC 基因之大腸桿菌BL21(DE3)菌株和製備肝素酶III酶溶液。藉由電穿孔(細胞；80μL，200Ω，25μF，1.8kV，比色管；0.1mL)將hepC 基因表現質粒pMIV-Pnlp0-hepC引入大腸桿菌BL21(DE3)菌株(Life Technologies)中以取得作為肝素酶III產製菌株之大腸桿菌BL21(DE3)/pMIV-Pnlp0-hepC菌株。將該菌株在37℃下，預先培養在添加25μg/mL氯黴素之LB培養基中過夜。隨後，將該培養溶液接種在Sakaguchi燒瓶中之300mL LB培養基中，使最終濃度為2%(v/v)。在37℃下，伴隨振盪地培養4小時，再終止培養。離心後，使用0.85%之NaCl洗滌該微生物細胞二次並懸浮在30mL之50mM HEPES緩衝液(pH 7.0)中。將該懸浮液進行超音波破碎以破壞該微生物細胞。將該破碎之微生物細胞溶液離心以製備為上清液形式之肝素酶III酶溶液(無細胞萃取液)。

(3.2) 使用肝素酶III將N-脫乙醯化肝素前體解聚。將1g在(2)中取得之具有14.9%之N-乙醯基殘留率的N-脫乙醯化肝素前體和2mL之31.3 mIU/μL肝素酶III溶液溶解在100 mL含有100 mM NaCl和1.5 mM CaCl₂ 之Tris緩衝溶液(pH 8.0)中，並在37℃下反應5.3小時。在該反應溶液中加入100 mL之16% NaCl水溶液和900 mL之EtOH並混合之，將溶液離心以除去上清液並獲得解聚之N-脫乙醯化肝素前體。

(4) 解聚之N-脫乙醯化肝素前體之N-硫酸化。 A)將1g在(3)中取得之解聚的N-脫乙醯化肝素前體溶解在50 mL之Milli-Q水中並將50 mL之20 mg/mL NaHCO₃ / 20 mg/mL三甲胺·SO₃ 的水溶液加入其中，將該混合物在55℃下反應過夜。 B)在混合物中添加1L EtOH，然後將其離心以除去上清液，以取得N硫酸化之解聚的肝素前體。 C)將所得之N-硫酸化之解聚的肝素前體溶解在高達500μL之Milli-Q水中並進行雙醣分析，以相對於N-脫乙醯化之肝素前體計算產量。另外，將其進行GPC以計算分子量分佈。該程序顯示於下。

＜雙醣分析＞根據先前報告之條件進行N-硫酸化之解聚的肝素前體的雙醣分析(T. Imanariet al ., “High-performance liquid chromatographic analysis of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides”,J .Chromatogr .A , 1996, 720:275-293)。即，藉由使用肝素酶II和III將N-硫酸化之解聚的肝素前體分解成不飽和雙醣並藉由HPLC分析各分解產物來定量每種組成雙醣之量。

同樣地，進行N-脫乙醯化之肝素前體的雙醣分析。在N-脫乙醯化之肝素前體被N-硫酸化後進行N-脫乙醯化之肝素前體的雙醣分析。即，藉由將N-脫乙醯化之肝素前體N-硫酸化，然後使用肝素酶II和III將其分解成不飽和雙醣，並藉由HPLC分析每種分解產物來定量每種組成雙醣之量。依照將解聚之N-脫乙醯化之肝素前體N-硫酸化的情況進行N-脫乙醯化之肝素前體的N-硫酸反應。

藉由下列程序專門進行雙醣分析。 1)將0.2U之肝素酶II的(Sigma公司)、0.02至0.03 mIU之肝素酶III、5μg之多醣樣本和10μL之用於酶催化性分解的緩衝液(100mM CH₃ COONa、10mM (CH₃ COO)₂ Ca，pH 7.0)混合並使用Milli-Q水稀釋，使測量體積達到100μL以作為反應溶液。 2)將反應溶液保持在37℃，16小時或更長之時間並隨後在100℃下煮沸2分鐘以終止反應。 3)通過0.45μm過濾器除去雜質以取得溶液，然後將其作為雙醣分析之樣本。 4)使用粒徑為5μm之Inertsil ODS-3150mm×2.1mm管柱，在50℃之溫度下，流速為0.25 mL/min且檢測波長為230 nm之條件下，使用由溶液A和溶液B組成之洗提液組成物進行分析，該溶液A為4%乙腈和1.2 mM三丁胺，該溶液B為4%乙腈和0.1M CsCl，溶液B之梯度為1至90%。

從每種多醣樣本所產生之組成雙醣之量的總和計算產量。即，相對於從N-脫乙醯化之肝素前體產生之雙醣的總量，計算從N-硫酸化之解聚的肝素前體產生之雙醣總量的百分比(莫耳比)作為產量。另外，此時，確認在所得之N-硫酸化之解聚的肝素前體中，99%或更多之藉由N-乙醯化所產生的胺基被N-硫酸化。

再者，基於從N-脫乙醯化之肝素前體產生的每種組成雙醣之量計算N-脫乙醯化之肝素前體中的N-乙醯基之殘留率。即，相對於雙醣之總量，計算該具有乙醯基之雙醣之量的百分比(莫耳比)作為該乙醯基之殘留率。該乙醯基之殘留率為14.9%。

＜GPC分析＞藉由HPLC(GPC分析)將N-硫酸化之解聚的肝素前體和硫酸乙醯肝素(以1mg/mL之濃度溶解在Milli-Q水中)進行凝膠過濾。使用GS520(Shodex，Asahipak GS-520HQ，7.5×300mm，粒徑7μm)作為管柱，使用100mM磷酸二氫鉀水溶液作為洗提液，在流速為0.6 mL/min，柱溫為40℃且檢測波長為200nm下進行分析。使用支鏈澱粉分子量標記組(Shodex，STANDARD P-82，分子量在5900至708000之範圍內)作為標準來計算平均分子量(Mn和Mw)。工業適用性

本發明之方法可用於酶催化性產生醇和胺之O-和N-硫酸化衍生物。尤其是，該方法適合用於產生肝素和硫酸乙醯肝素。

¹⁾ 菌株： Δ2*：Δ2/pSUMO/pACYC184， Δ3*：Δ3/pSUMO/pACYC184， Δ4*：Δ4/pSUMO/pACYC184， Δ5*：Δ5/pSUMO/pACYC184。²⁾ 雙醣： NS：α-ΔUA-[1→4]-GlcNS， NS2S：α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS，其中ΔUA指4-脫氧-L-蘇型-己-4-烯並吡喃糖基醣醛酸且GlcNS指N-磺基-D-葡糖胺。³⁾ 總和：NS+NS2S。NS和NS2S之累積量少於初始LMWHS之量，因為使用肝素酶I、II和III裂解LMWHS之效力為約30%。⁴⁾ 磺醯化產量：NS2S/(NS+NS2S)。其不取決於裂解LMWHS之效力。

第1圖顯示使用N-和O-磺基轉移酶時，具有( -4GlcA1β-4GlcNAcα1-)結構之糖胺聚醣單元之羥基和胺基的硫酸化比例。該硫酸化比例顯示於括號中(以%表示)，且該易於被硫酸化之羥基的位置顯示於圓圈中。該葡糖醛酸(GlcA)殘基之C5位置處之羧基異構化係以彎曲的箭頭顯示。第2A圖顯示肝素之示例性化學結構。第2B圖顯示硫酸乙醯肝素之示例性化學結構。第3A和3B圖顯示攜帶pACYC184-MBP*-2OSTY94A (D69-N356)和pSUMO-dreGlce(G70-N585)質粒之Δ2-5菌株的粗製細胞溶胞產物之可溶性和不溶性分液的SDS-PAGE分析結果。A板-可溶性分液，B板-不溶性分液；泳道：M-指示分子量之標記物、1和2-Δ2-菌株、3和4-Δ3-菌株、5和6-Δ4-菌株、7和8-Δ5-菌株；HS2-OST-與MPB*N-標籤融合之硫酸乙醯肝素2-O-磺基轉移酶、HNSG-5epi-與SUMO N-標籤融合之肝素前體-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶。第4圖顯示當使用Δ2-Δ5/pST1A1菌株之粗製細胞溶胞產物和作為磺基供體之pNPS將PAP磺醯化時該反應混合物中累積之pNP的動力學曲線。

Claims

一種使受質經酶催化性磺醯化之方法，其包含： (i)令該受質與3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸酯在含有屬於腸桿菌科(Enterobacteriaceae )之細菌的培養基中反應以產生該受質之硫酸化衍生物；和 (ii)從該培養基收集該硫酸化衍生物，其中該細菌已經過修飾： (A)以至少產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質；和 (B)減弱aphA 基因或cysQ 基因之表現。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該經修飾以減弱aphA 基因之表現的細菌已被進一步修飾以減弱cysQ 基因或cpdB 基因或彼等之組合的表現。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該經修飾以減弱cysQ 基因之表現的細菌已被進一步修飾以減弱aphA 基因或cpdB 基因或彼等之組合的表現。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中該具有磺基轉移酶活性之蛋白質係選自由下列所組成之群組：具有O-磺基轉移酶活性之蛋白質、具有N-磺基轉移酶活性之蛋白質和具有N-脫乙醯酶/N-磺基轉移酶活性之蛋白質。
如申請專利範圍第4項之方法，其中該具有O-磺基轉移酶活性之蛋白質係選自由下列所組成之群組：具有硫酸乙醯肝素(heparan)2-O-磺基轉移酶活性之蛋白質、具有硫酸乙醯肝素3-O-磺基轉移酶活性之蛋白質、具有硫酸乙醯肝素6-O-磺基轉移酶活性之蛋白質及彼等之組合。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該細菌已被進一步修飾以產生具有肝素前體(heparosan)-N-硫酸-葡糖醛酸酯5-表異構酶活性之蛋白質。
如申請專利範圍第1至6項中任一項之方法，其中該細菌已被進一步修飾以產生具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該培養基含有該具有3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸-磺基轉移酶活性之蛋白質。
如申請專利範圍第1至8項中任一項之方法，其中該受質具有至少一個選自羥基和胺基之化學基團。
如申請專利範圍第1至9項中任一項之方法，其中該受質係選自由下列所組成之群組：肝素前體、硫酸乙醯肝素和肝素(heparin)。
如申請專利範圍第1至10項中任一項之方法，其中該硫酸化衍生物係選自由下列所組成之群組：肝素、硫酸乙醯肝素、硫酸軟骨素、硫酸膽鹼和硫酸皮膚素(dermatan sulfate)。
如申請專利範圍第1至11項中任一項之方法，其中該細菌屬於埃希氏菌屬(Escherichia )或泛菌屬(Pantoea )。
如申請專利範圍第12項之方法，其中該細菌為大腸桿菌(Escherichia coli )或菠蘿泛菌(Pantoea ananatis )。
一種用於產生受質之硫酸化衍生物之方法，其包含： (i)在含有屬於腸桿菌科之細菌的培養基中使該受質與3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸酯反應以產生該受質之硫酸化衍生物；和 (ii)從該培養基收集該硫酸化衍生物，其中該細菌已經過修飾： (A)以至少產生具有磺基轉移酶活性之蛋白質；和 (B)減弱aphA 基因或cysQ 基因之表現。
如申請專利範圍第14項之方法，其中該經修飾以減弱aphA 基因之表現的細菌已被進一步修飾以減弱cysQ 基因或cpdB 基因或彼等之組合的表現。
如申請專利範圍第14項之方法，其中該經修飾以減弱cysQ 基因之表現的細菌已被進一步修飾以減弱aphA 基因或cpdB 基因或彼等之組合的表現。