CN103635491A - 类鲨鱼硫酸软骨素及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及类鲨鱼硫酸软骨素及其制备方法。具体而言，本发明涉及类鲨鱼硫酸软骨素，其显示非常低量的4-硫酸酯、高电荷密度和可与天然硫酸软骨素相比的生物活性；本发明还涉及制备所述类鲨鱼硫酸软骨素的方法，其提供大幅提高的产率和更好的产物质量的重现性。本发明的类鲨鱼硫酸软骨素显示高的分子量和电荷密度；其可与天然产物相比的体外生物学效应和抗炎功效使得该多糖可潜在地在药物制剂和营养制品中用作药物。
Description
本发明涉及类鲨鱼硫酸软骨素及其制备方法。具体而言，本发明涉及类鲨鱼硫酸软骨素，其显示非常低量的4-硫酸酯、高电荷密度和可与天然硫酸软骨素相比的生物活性；本发明还涉及制备所述类鲨鱼硫酸软骨素的方法。
硫酸软骨素(下文称为CS)，属于称为糖胺聚糖(GAGs)的天然复合多糖类，由通过β(1->3)连接的D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)的不同硫酸酯化的残基的交替二糖序列组成。
取决于二糖性质，已知具有不同碳水化合物主链的CS。事实上，即使天然的和合成的已知CS均主要由多种百分比的两种类型的二糖单元(即在GalNAc的4位或6位硫酸酯化)组成，但具有不同的硫酸酯基团的数量和位置的二糖可以以多种百分比例位于多糖链内。例如，在CS主链中存在通常为低量的未硫酸酯化的二糖，而具有在不同位置(诸如GlcA的2位和GalNAc的6位(二糖D)或GalNAc的4位和6位(二糖E))的O-连接的两个硫酸酯基团的二硫酸酯化的二糖可以以多种与特定动物来源有关的比例存在于CS主链中[Volpi N.,J PharmPharmacol61,1271,2009.Volpi N.,J Pharm Sci96,3168,2007]。
CS显示具有以下结构式的二糖重复单元:
其中R2、R4和R6独立地是H或SO3-。
以下报道最多出现的一些简称的含义，所述简称目前用于简要地分辨组成CS的交替的二糖序列的不同硫酸酯化的残基。
Di-0S (R2=H；R4=H；R6=H)
Di-6S(C) (R2=H；R4=H；R6=SO3-)
Di-4S(A) (R2=H；R4=SO3-；R6=H)
Di-4,6diS(E) (R2=H；R4=SO3-；R6=SO3-)
Di-2,6diS(D) (R2=SO3-；R4=H；R6=SO3-)
Di-2,4diS(B) (R2=SO3-；R4=SO3-；R6=H)
Di-2,4,6triS (R2=SO3-；R4=SO3-；R6=SO3-)
可通过能得出CS结构特征和参数(例如特定的硫酸酯基团、电荷密度、分子量和纯度)以及生物活性的灵敏的、特异的、验证过的和公开的分析方法表征和区分天然的和合成的CS样品。
天然提取的CS样品可以表征结构和特性[Volpi N.,J PharmPharmacol61,1271,2009；Volpi N.,J Pharm Sci96,3168,2007；MucciA.等,Carbohydr Polymers41,37,2000；Volpi N.,Analyt Biochem277,19,2000]。
关于CS的三-和四-硫酸酯化形式(分别为“triS”和“tetraS”)，可以注意到的是，经常在天然提取的CS样品中检测到它们，然而它们通常表征合成的CS；将二-2,4,6triS作为标准品以评价合成的CS产品中的triS CS的存在，因为天然来源的产品中不存在其他理论上可能的triS形式。
以下表1阐述从多种器官和组织、主要是软骨中提取和纯化的天然CS样品中鉴别的主要的二糖。
表1
Mn=数均分子量；Mw=重均分子量；多分散性指数=Mw/Mn；电荷密度是每个二糖单元的硫酸酯基团的数量)；ND=未检测出
表1阐述从若干来源纯化的主要的天然CS样品的特征的主要结构参数。
特别地，对于陆生的CS样品(牛、猪和鸡样品)而言，分子量参数相当相似，但是与鱼类样品(鲨鱼、鳐鱼和乌贼样品)相当不同，所述鱼类样品的分子量值大于前者所述陆生的CS样品的。
此外，鱼类CS样品具有特殊的大于约1.0的电荷密度值(由于二硫酸酯化的二糖的存在)，且不同于电荷密度值低于约1.0的陆生样品(由于没有二硫酸酯化的二糖)。
所有的天然CS的另一个特性是当用软骨素酶ABC(对于4S或6S硫酸酯化的二糖以及未硫酸酯化的二糖的特异性水解酶)消化时，多糖链被完全消化为二糖单元。其可以使用FACE(荧光辅助碳水化合物电泳)分析容易地观测。天然CS的完全消化是由于多糖链没有三-和四-硫酸酯化的结构。三-和四-硫酸酯化的二糖(如存在)不被软骨素酶ABC所识别，不能完全多糖消化，这产生在FACE分析中容易检测的部分未消化的寡糖链。
最后，由于生物合成途径，所有已知的天然CS显示同时存在GalNAc的4位和6位单硫酸酯化的二糖(4-硫酸酯化的二糖从不低于30%)，虽然它们的比例根据来源变化。
如上文所述，CS是具有可变结构和性质(取决于提取来源)的非常复杂的非均质的大分子。
此外，由于涉及特定组合和物种的生物合成过程，可生物合成不同聚合度的CS，得到具有不同分子量和多分散性的大分子。
由于这些结构差异，除可能存在特定寡糖序列以及用于治疗应用的制剂的纯度或在营养制品中的纯度之外，CS可具有不同的性质和性能。
事实上，已报道了取决于CS结构的不同的和特殊的活性[Volpi N.,Biomaterials23,3015,2002；Volpi N.等,Biochimie81,955,1999；Volpi N.,Biomaterials20,1359,1999；Suzuki S.等,J Biol Chem243,7,1968]。
基于研究证据和众多临床研究的综合分析（meta-analysis），欧洲风湿病防治联合会(European League Against Rheumatism,EULAR)现在在欧洲在膝骨关节炎的治疗中推荐天然提取的CS作为骨关节炎的症候缓效性药物(SYSADOA)[Jordan KM等,Ann Rheum Dis62,1145,2003]、髋骨关节炎[Jordan KM等,Ann Rheum Dis62,1145,2003]和手骨关节炎[Zhang W.等,Ann Rheum Dis66,377,2007]。
此外，CS单独或与其他成分组合广泛用作营养制品，主要在欧洲和美国[McAlindon TE等,JAMA283,1469,2000.Volpi N.等,FoodAnal Meth1,195,2008.Volpi N.等,Separation Sc1,22,2009]。
CS功效与其抗炎活性（诸如其抑制作为人白细胞弹性蛋白酶(HLE)的降解酶的活性的能力）密切相关[Ronca F.等,OsteoarthritisCartilage6Suppl A,14,1998.Egea J.等,Osteoarthritis Cartilage18Suppl1,S24,2010]。
在世界范围内药物或营养制品申请中使用的CS通过从以下若干动物的组织中提取获得：诸如牛和猪[Fuentes EP等,Acta FarmBonaerense17,135,1998]、鸟[Luo XM等,Poult Sci81,1086-1089,2002]、软骨鱼类fishes[Sugahara K.等,Eur J Biochem239,871,1996.Lignot B等,J Biotechnol103,281,2003]等。
然而，这些产物的动物源为潜在消费者带来与可能存在可传播传染源相关的安全问题或涉及宗教的限制应用，所述传染源为诸如在牛类动物中引起海绵样脑病的那些。
此外，考虑到增长的需求和增加的市场容量，这些产物的提取性质使得它们的供应有潜在不可靠性。
这样的考虑已经提醒人们开展关于更可靠的CS来源的替代物的研究，其实例为如科学和专利文献中所述的由大肠杆菌(E.coli)的K4荚膜多糖（capsular polysaccharide）起始的生物技术制备。
在本文中，术语生物技术制备是指其中在人工培养系统中通过微生物或通过更高级有机体的分离细胞来制备最终产物的主要部分的制备方法，通常且宽泛地是指发酵。
基本上，本领域至今已使用了三种主要的途径。
第一种可以认为是类CS化合物的制备，其将大肠杆菌O5:K4:H4的K4荚膜多糖用作原料，然后将其进行化学转化，而第二种方法可以看作是通过微生物直接生物合成类CS化合物，且认为第三种方法是生物合成制备未硫酸酯化的软骨素，随后进行化学或生物化学的硫酸酯化。
属于上述第一种方法的EP-A-1304338描述了从在液体培养物中制备的K4多糖起源的CS的制备，首先将其提取并纯化，接着再溶解、并进行酸水解，其主要作用是除去连接线性聚合物中存在的GlcA残基的果糖残基。第二个作用是部分水解多糖链，产生较低分子量的产物。接着，将与未硫酸酯化的软骨素相同的该脱果糖基（de-fructosylated）的聚合物在GalNAc残基的C-4或C-6位通过化学方式在4或6位使用适当的保护基团进行不同地硫酸酯化。而且，该文公开了CS，其含量的至少70%为在半乳糖胺部分的4和6位单-硫酸酯化的和/或二-硫酸酯化的，葡糖醛酸部分的2位未硫酸酯化，其具有6-25的kDa的和0.7-2.0的羧基/硫酸酯基比例(即电荷密度)。
例证以上第二种方法的WO2009/149155描述了通过若干种微生物(细菌及真菌)的类CS化合物的直接制备。该文还公开了类陆生CS化合物，其半乳糖胺部分的4-和6-位硫酸酯化；据报道该化合物显示约300Da至35kDa的分子量(Mw)和为低于1至高于1的范围的4S/6S硫酸酯比例。
以上第三种方法包括制备未硫酸酯化的软骨素的若干不同策略，其主要为在无细胞系统中聚合物的酶催化合成，如同在例如EP-A-1950308和EP-A-1964924中所公开的，以及在例如WO2008/133350中所述的在重组细胞中的生物合成，在能够从UDP-GlcA产生由大肠杆菌K4提取的基因kfoA和kfoC的宿主中表达而获得。
意大利专利申请号MI2010A001300公开了未硫酸酯化的软骨素的生物合成制备的另一个实例，其特别涉及软骨素的生物技术制备方法，包括在适合的培养基中培养重组体微生物，优选大肠杆菌DSM23644，在微生物培养物中回收和纯化未硫酸酯化的软骨素，接着用化学方法进行硫酸酯化。
目前为止描述的用于制备CS的方法的共同特点是在酸-催化的果糖残基的移除期间和GalNAc残基硫酸酯化所需的化学合成步骤期间均极大减少原物质的分子量。
例如，EP-A-1304338描述了6-25kDa分子量的CS，而用作原料的K4多糖的分子量公开为150-400kDa。
本发明的第一个方面是不含三-、四-和2,4二-硫酸酯化的二糖类的类鲨鱼硫酸软骨素，其由60-99%的6-硫酸酯、0.5-30%的2,6-二硫酸酯、0.1-5%的4,6-二硫酸酯、0.1-5%的未硫酸酯化的软骨素和0.1-1%的4-硫酸酯组成，所有的百分比表达为相对于所述类鲨鱼硫酸软骨素的总二糖含量，所述类鲨鱼硫酸软骨素显示40-85kDa的数均分子量(Mn)和50-95kDa的重均分子量(Mw)。
优选地，本发明的类鲨鱼硫酸软骨素由70-90%的6-硫酸酯、8.5-20%的2,6-二硫酸酯、0.1-5%的4,6-二硫酸酯、0.1-5%的未硫酸酯化的软骨素和0.1-1%的4-硫酸酯组成，所有的百分比表达为相对于所述类鲨鱼硫酸软骨素的总二糖含量，所述类鲨鱼硫酸软骨素显示40-65kDa的数均分子量(Mn)和50-70kDa的重均分子量(Mw)。
本发明的CS目标物特征为高分子量和主要在6位的特殊的硫酸酯化的基团，以及非常少的量的4-硫酸酯化的二糖。
检验本发明的CS的特征，并将它们与涉及天然提取的CS样品的上文中的表1中显示的样品的特征比较，可以看出本发明的CS大概类似于鲨鱼CS。
而且，本发明的CS目标物不显示任何多硫酸酯化的二糖、特别地其不显示三-或四-硫酸酯化的二糖，所述三-或四-硫酸酯化的二糖通常表征通过现有技术中公开的合成方法而得到的CS，且用软骨素酶ABC消化时可作为未分解的产物检测到。
此外，本发明的CS目标物的结果是高度纯化的(基于用软骨素酶ABC消化后的非降解产物的量)且明显不同于EP-A-1304338中公开的具有6-25kDa的分子量和高量的未硫酸酯化的软骨素(>10%)和宽范围的电荷密度(0.7-2)的CS，而本发明的CS的电荷密度的范围较窄、且优选为1.05-1.30。
Mn和Mw可以根据本领域技术人员已知的普通方法计算；例如高性能体积排阻色谱法(HPSEC)；优选地，Mn和Mw可以通过装备用于凝胶渗透色谱法(GPC)的集成的特定软件的HPSEC测定。
优选地，本发明的CS中2,6-二硫酸酯和4,6-二硫酸酯总量达总二糖含量的10-25%。
根据另一个方面，本发明涉及组合物包含本发明的类鲨鱼硫酸软骨素和药学或营养学上可接受的载体例如微晶纤维素、糊精、麦芽糖糊精、环糊精、磺丁基醚-β-环糊精、大豆卵磷脂、棕榈油酸、脂质体、sucresters等。
如技术人员基于本领域普通常识会理解的，本发明的组合物可以多种形式配制：固体(例如片剂、硬胶囊、软凝胶胶囊)或液体(例如溶液剂或粉末的饮品混合物)，优选胃肠外和/或口服的药物和/或营养制品制剂，且可还包含其他非活性和/或活性成分。
在此类另外的成分中，本发明的组合物还可以且优选地包含至少一种以下物质:盐酸氨基葡萄糖、硫酸氨基葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、透明质酸、肝素、角蛋白、皮肤素(dermatin)、甲磺酰甲烷(methylsulphonylmethane)、叶酸或还原叶酸、B-族维生素、S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)、抗坏血酸或抗坏血酸锰，且可以根据需求和案例可能需要的环境以有效量施用于有需要的受试者。
例如类鲨鱼CS和/或本发明的组合物可以以100-3000mg/天的量、优选以1000-2000mg/天的量、更优选以1200-1800mg/天的量施用，一般分为每天2次/3次剂量。
根据另一个方面，本发明涉及用于预防或治疗骨关节炎或用于维持肌肉骨骼的健康的本发明的类鲨鱼硫酸软骨素或组合物，例如，在药物或食品添加剂或营养补充剂中用作活性成分。
例如，如上文定义的本发明的类鲨鱼CS或组合物可用于制备药物、食品添加剂或营养补充剂，所述药物、食品添加剂或营养补充剂用于预防和/或治疗髋部、手部和膝部骨关节炎(OA)及其主要症状、诸如疼痛、关节肿胀、炎症、阿尔茨海默病、微生物感染、动脉硬化、骨质疏松及用作癌症治疗和组织再生(包括神经组织再生)中的辅药。
根据又一个方面，本发明涉及制备上文定义的类鲨鱼软骨素的方法，其包括:
a)使用选自四甲基-、四乙基-和四丁基-铵或吡啶鎓的盐使以游离酸形式预先溶于含水环境中的未硫酸酯化的软骨素成盐；
b)将来自步骤a)的成盐的未硫酸酯化的软骨素干燥至5-15%的含水量；
c)将来自步骤b)的成盐的未硫酸酯化的软骨素在100℃-170℃的温度干燥至0.1-3%的含水量；
d)通过以1-3小时的时间间隔加入1-2当量的三氧化硫吡啶络合物或三氧化硫二甲基甲酰胺络合物在0℃-30℃的温度将溶于N-甲基吡咯烷酮或二甲基甲酰胺中的来自步骤c)的成盐的未硫酸酯化的软骨素的6-位选择性硫酸酯化，直至加入总共2-15当量的三氧化硫吡啶络合物或三氧化硫二甲基甲酰胺络合物；将得到的溶液在搅拌下放置2-24h；
e)用碳酸氢钠或碳酸钠水溶液淬灭步骤d)中进行的反应，将得到的溶液过滤，并浓缩至干燥，得到干燥的固体；
f)将干燥的固体溶于氯化钠水溶液中，将得到的溶液超滤并渗析；
g)回收来自步骤f)的溶液的产物；
h)纯化来自步骤g)的产物，得到酸形式或为其钠盐的来自步骤g)的产物；
i)回收来自步骤h)的产物。
步骤a)中未硫酸酯化的软骨素的成盐优选使用选自以下的盐进行：四甲基-、四乙基-和四丁基-铵，最优选使用四丁基铵进行，而步骤b)中未硫酸酯化的软骨素的干燥可通过冷冻干燥或喷雾干燥进行。
步骤c)中未硫酸酯化的软骨素盐的干燥优选进行至0.5-2%的水，而来自所述步骤的未硫酸酯化的软骨素盐的溶解优选在二甲基甲酰胺中进行。
优选添加总共6-12、更优选6-9当量的三氧化硫吡啶络合物来进行步骤d)中的选择性硫酸酯化。
或者，当步骤d)中的选择性硫酸酯化通过三氧化硫二甲基甲酰胺络合物进行时，添加总共1-9、优选2-4当量。
此外，步骤d)中的选择性硫酸酯化优选在10℃-20℃的温度进行，而在步骤d)的末尾，优选将得到的溶液在搅拌下放置2-6h。
根据本发明的方法的又一个优选的实施方案，通过冷冻干燥、喷雾干燥或在醇环境中沉淀回收来自步骤f)的溶液的产物。
本发明的方法能保持不改变天然多糖的分子量。
令人惊讶地，本发明的方法能避免进行任何旨在保护任何仲醇羟基的步骤，可能因为GalNAc的6-位的伯醇羟基的反应性保证了反应的选择性。
此外，与现有技术相比，本发明的方法能得到大幅提高的产率和更好的产物质量的重现性；例如，就EP-A-1304388而言，其中硫酸酯化步骤产生更宽的达到0.7-2.0的范围的羧基/硫酸酯基比例。
而且，本发明的方法能得到显示非常低的量的4-硫酸酯化的二糖和基本没有多硫酸酯化的二糖的产物；特别地，其能得到没有triS或tetraS糖类的产物。
通常，本发明的方法可以通过在含水环境中溶解作为游离酸或钠盐的未硫酸酯化的软骨素来进行，其例如通过将K4荚膜聚合物(通过发酵得到)脱果糖基(defructosilating)来得到，如Manzoni(Biotechnology Letters18,383-6,1996)和Rodriguez(Eur.J.ofBiochem177,117-24,1988)所述。
如果未硫酸酯化的软骨素为其钠盐形式，在其完全溶解后，适宜地在0℃-30℃的温度将得到的溶液在含阳离子交换树脂(例如Amberjet1200H,Rohm和Haas等)的柱洗脱，适宜地在pH1.5-4.0、优选1.5-3.0收集洗脱的级分，并回收含水的酸部分。
或者，该步骤可以分批进行:在将未硫酸酯化的软骨素钠盐溶于水中之后(所述溶解优选通过在0℃–30℃搅拌20-60分钟而完成)，将阳离子树脂(Amberjet1200H,Rohm和Haas，等)加入，在树脂加入后溶液的pH为1.5至3.0。然后将该溶液过滤，并收集得到的酸性滤液。
然后向通过直接溶解作为游离酸的未硫酸酯化的软骨素而得到的或如上文所述纯化其钠盐溶液(连续或分批)而得到的未硫酸酯化的软骨素的酸溶液中加入选自以下的离子的水溶液：四甲基-、四乙基-和四丁基-铵或吡啶鎓，适宜地直至pH6.0-8.0、优选6.-7.0，通过例如冷冻干燥或喷雾干燥将该溶液蒸发至干燥直至5-15%的含水量以回收相应的软骨素盐。
然后将得到的软骨素盐在100℃-170℃的温度进行第二次干燥步骤直至0.1-3%的含水量以最终回收相应的未硫酸酯化的软骨素盐。
然后通过以下步骤将如上所述得到的相应的未硫酸酯化的软骨素盐在6-位选择性硫酸酯化(不需要保护任何官能团)：在0℃-30℃、优选10℃-20℃的温度将其溶于选自N-甲基吡咯烷酮或二甲基甲酰胺的溶剂中，适宜地在含阳离子交换树脂(例如Amberjet1200H,Rohm和Haas，等)的柱中将完全溶解的未硫酸酯化的软骨素盐洗脱，以1-3小时的时间间隔加入1-2当量的三氧化硫吡啶络合物或三氧化硫二甲基甲酰胺络合物，直至加入总共2-15当量的三氧化硫吡啶络合物或三氧化硫二甲基甲酰胺络合物，将得到的溶液在搅拌下放置2-24h、优选2-6h。
其后将得到的反应物质在碳酸氢钠或碳酸钠水溶液中淬灭，然后回收，例如通过用碳酸氢钠处理，并过滤得到的不溶性盐，蒸发至干燥，再次溶于氯化钠水溶液中，回收，最后例如通过超滤和渗析进行处理以除去剩余的盐和低分子量杂质，最后例如通过冷冻干燥、喷雾干燥或在醇环境中沉淀来回收产物。
然后将如上文所述的得到的软骨素6-硫酸酯例如通过阳离子交换树脂柱色谱进行纯化，以得到其酸形式，且-可能地-随后通过加入例如氢氧化钠得到其钠盐。
最后将如此得到的软骨素6-硫酸酯回收，例如将其在真空下在50℃-70℃在炉中干燥，或者色谱纯化，得到不含三-、四-和2,4二-硫酸酯化的二糖的类鲨鱼硫酸软骨素，其显示40-85kDa的Mn、50-95kDa的Mw。
以下实施例阐述本发明。
实施例1
成盐
将20g通过将K4荚膜聚合物(如Manzoni(Biotechnology Letters18,383-6,1996)和Rodriguez(Eur.J.of Biochem177,117-24,1998)所述通过发酵获得)脱果糖基制备的软骨素钠盐溶于软化水(500ml)中。完全溶解后，将得到的溶液在5℃在含阳离子交换树脂(160ml的Amberjet1200H,Rohm和Haas)(预先水合并制备为酸形式)的柱中洗脱。在pH1.9回收洗脱的部分，收集含水的酸部分，并向其中加入16%四丁基铵的水溶液直至pH7.0；然后通过冷冻干燥将该溶液蒸发至干燥以回收20.8g软骨素，为四丁基铵盐。
然后将得到的盐在静止干燥器中在105℃在真空下进行第二次热处理达4h，直至剩余湿度低于0.2%。由此得到18.5g四丁基铵盐形式的软骨素。
实施例2
成盐
将12g通过将K4荚膜聚合物(如Manzoni(Biotechnology Letters18,383-6,1996)和Rodriguez(Eur.J.of Biochem177,117-24,1998)所述通过发酵获得)脱果糖基制备的软骨素钠盐溶于20ml软化水中，且在通过1M HCl酸化至pH2.5并加入80ml乙醇之后，未硫酸酯化的软骨素析出，为游离酸。
过滤并用乙醇洗涤后，得到10.3g产物，为白色固体，将其在真空下在50℃干燥后，显示90%的酸滴定度(基于产物自身计算)，且包含8%的残余水。
将得到的固体混悬于20ml水中，并加入40%w/w的四丁基氢氧化铵的水溶液直至pH8。然后将得到的溶液冷冻干燥直至2.5%的残留水，以得到15.9g固体软骨素，为四丁基铵盐。
然后将得到的盐在静止干燥器中在105℃在真空下进行第二次热处理达4h，直至剩余湿度少于0.2%。由此得到15.4g四丁基软骨素。
实施例3
硫酸酯化
将1.4g如实施例1中所述得到的四丁基软骨素和84ml DMF装入保持在惰性气氛(N2)下的250ml的四颈烧瓶中，其装备有机械搅拌和膜泡风冷系统(bubble cooling system)、氯化钙捕集器(calciumchloride trap)和温度计。
将得到的混悬液搅拌直至完全溶解，随后将温度调节在23℃。
一旦调节到所述温度，将固体三氧化硫吡啶络合物(1.07g，3当量)分批加入该溶液中，将该反应混合液保持在搅拌下达1h，然后再加入固体三氧化硫吡啶络合物(1.07g；3当量)。在相同的温度再搅拌1h后，将该反应混合物转移至含饱和的碳酸氢钠溶液的500ml烧瓶中，并在10℃冷却。
使温度上升至20℃后，在Buchner进行过滤，将滤液回收，并将其在真空下蒸发至干燥。
将得到的干燥的固体(2.3g)精细研磨，并再溶于0.3M NaCl溶液(130ml)中，使用3kDa截留膜将由此得到的溶液进行超滤，并将渗余物的pH保持在7.0。然后将超滤的溶液渗析以除去盐，通过冷冻干燥回收产物。
最后将得到的产物在50℃和10mbar干燥，直至得到1g物质，显示95%的滴定度(通过葡糖醛酸-脉冲安培检测“PAD”计算)、60kDa的Mn和67.3kDa的Mw，其通过装备有用于GPC的集成的特定软件的高性能体积排阻色谱（HPSEC）测定。
实施例4
硫酸酯化
将1.21g如实施例1中所述得到的为四丁基铵盐的软骨素和72mlDMF装入保持在惰性气氛(N2)中的250ml四颈烧瓶中，其装备有机械搅拌和膜泡风冷系统、氯化钙捕集器和温度计。
将得到的混悬液搅拌直至完全溶解，随后将温度调节在10℃。
一旦调节到所述温度，将固体三氧化硫DMF络合物(0.88g，3当量)加入该溶液中，将该反应混合液保持在搅拌下达1h。保持相同的温度加入碳酸氢钠(0.97g，6当量)，并继续搅拌1h，使温度上升至20℃。将得到的混悬液经Buchner过滤，并将回收的滤液在真空下蒸发至干燥。
将得到的干燥的固体(2.05g)精细研磨，并再溶于0.3M NaCl溶液(130ml)中，使用3kDa截留膜将由此得到的溶液进行超滤，并将渗余物的pH保持在7.0。然后将超滤的溶液渗析以除去盐，通过冷冻干燥回收产物。
最后将得到的产物在50℃和10mbar干燥，直至得到0.95g物质，显示94%的滴定度(通过测定葡糖醛酸-PAD计算)、62kDa的Mn和68.3kDa的Mw，其通过装备有用于GPC的集成的特定软件的高性能体积排阻色谱(HPSEC)测定。
实施例5
软骨素6-硫酸酯的分析
根据Joon-Soo Sim等公开的方法(J.Chromatography B,2005第818卷,第133-139页)，通过对如上文所述使用软骨素酶ABC得到的CS进行处理，将从实施例3和4得到的CS的组合物通过其消化产物的HPLC进行研究。
所述分析通过使用以下柱进行：HPLC-SAX，250x4.6mm10μm，梯度洗脱，由3.5mM HCl(pH=3.5)(100%)的起始相开始，直至在3.5mM HCl中的1M NaCl(pH=3.5)(100%)。
将用软骨素酶ABC消化而得到的相同的产物在FACE(荧光辅助碳水化合物电泳)分析中进行分析，以指出非消化多糖的存在。结果显示消化率超过95%。高消化率表明得到的CS的结构中基本不存在三-和/或四-硫酸酯二糖。
以下的表2显示所鉴定的实施例3和4中制备的产物的主要的二糖。
表2
| CS(实施例3) | CS(实施例4) | |
| 分子量: | ||
| Mn(kDa) | 55.2 | 62 |
| Mw(kDa) | 67.3 | 68.3 |
| 多分散性 | 1.2 | 1.2 |
| 二糖: | ||
| Di-0S | 3.5 | 2.8 |
| Di-6S | 72.1 | 83.1 |
| Di-4S | 0.1 | 0.2 |
| Di-2,6diS | 18.9 | 13.8 |
| Di-4,6diS | 3.5 | 0.1 |
| Di-2,4diS | ND | ND |
| triS | ND | ND |
| tetraS | ND | ND |
| 电荷密度 | 1.21 | 1.10 |
Mn=数均分子量；Mw=重均分子量；多分散性指数=Mw/Mn；电荷密度是每个二糖单元的硫酸酯基团的数量)；ND=未检测出
通过比较上表与表1可以看出，本发明的CS目标物的组成显示与鲨鱼CS密切相关，因为前者显示非常低量的Di-4S，且主要由Di-6S组成，而Di-0S、Di-2,6diS和Di-4,6diS结果与为鲨鱼CS报道的值大致重合；此外本发明的CS显示大于1.0的电荷密度。而且，进行实施例3和4所得到的产物不显示CS的triS和tetraS形式。
此外，当与现有技术中公开的一些产物相比时，本发明的CS目标物显示特定的硫酸酯含量，如下表3中所阐述。
表3
实施例6
由于CS功效与其抗炎活性密切相关，诸如其抑制为人白细胞弹性蛋白酶(HLE)的降解酶活性的能力，在体外测试本发明的CS目标物抑制HLE的该活性的能力，并与牛CS(欧洲药典第一部CS标准品)和从鲨鱼软骨样品提取的CS进行比较。
比较结果在图1中显示。
将根据实施例3中描述的方法得到的本发明的类鲨鱼CS样品与Bioiberica销售的牛CS(欧洲药典第一部CS)和从鲨鱼软骨提取的CS进行比较。
通过分光光度测试法使用专门用于HLE的人造显色底物(N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺)测定弹性蛋白酶活性。在将酶用增加量的CS预温育后，通过用显色底物(N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺)温育测定活性。在反应停止后，通过分光光度推定法定量测定得到的产物。
表4
图1阐述表4中报道的数据，且显示类鲨鱼本发明的CS能以有效地方式有意义地抑制人白细胞弹性蛋白酶活性，可与天然CS样品显示这一活性比得上。
本发明的CS目标物显示的体外生物活性和抗炎性质使得其能比得上天然产物，因此潜在地可在药物制剂和营养制品中用作药物。
Claims (20)
1.不含三-、四-和2,4二-硫酸酯化的二糖类的类鲨鱼硫酸软骨素，其由60-99%的6-硫酸酯、0.5-30%的2,6-二硫酸酯、0.1-5%的4,6-二硫酸酯、0.1-5%的未硫酸酯化的软骨素和0.1-1%的4-硫酸酯组成，所有的百分比表达为相对于所述类鲨鱼硫酸软骨素的总二糖含量，所述类鲨鱼硫酸软骨素显示40-85kDa的数均分子量(Mn)和50-95kDa的重均分子量(Mw)。
2.根据权利要求1的类鲨鱼硫酸软骨素，其由70-90%的6-硫酸酯、8.5-20%的2,6-二硫酸酯、0.1-5%的4,6-二硫酸酯、0.1-5%的未硫酸酯化的软骨素和0.1-1%的4-硫酸酯组成，所有的百分比表达为相对于所述类鲨鱼硫酸软骨素的总二糖含量，所述类鲨鱼硫酸软骨素显示40-65kDa的数均分子量(Mn)和50-70kDa的重均分子量(Mw)。
3.根据权利要求1或2的类鲨鱼硫酸软骨素，其中2,6-二硫酸酯和4,6-二硫酸酯的总量达总二糖含量的10-25%。
4.根据权利要求1至3中任意一项的类鲨鱼硫酸软骨素，其用于预防或治疗骨关节炎或用于维持肌肉骨骼的健康。
5.组合物，其包含根据权利要求1至3中任意一项的类鲨鱼硫酸软骨素和药学或营养学上可接受的载体。
6.根据前述权利要求的组合物，其用于预防或治疗骨关节炎或用于维持肌肉骨骼的健康。
7.制备根据前述权利要求中任意一项的类鲨鱼软骨素的方法，其包括:
a)使用选自四甲基-、四乙基-和四丁基-铵或吡啶鎓的盐，使以游离酸形式预先溶于含水环境中的未硫酸酯化的软骨素成盐；
b)将来自步骤a)的游离酸和/或钠盐形式的成盐的未硫酸酯化的软骨素干燥至5-15%的含水量；
c)将来自步骤b)的成盐的未硫酸酯化的软骨素在100℃-170℃的温度干燥至0.1-3%的含水量；
d)通过以1-3小时的时间间隔加入1-2当量的三氧化硫吡啶络合物或三氧化硫二甲基甲酰胺络合物在0℃-30℃的温度将溶于N-甲基吡咯烷酮或二甲基甲酰胺中的来自步骤c)的成盐的未硫酸酯化的软骨素的6-位选择性硫酸酯化，直至加入总共2-15当量的三氧化硫吡啶络合物或三氧化硫二甲基甲酰胺络合物；将得到的溶液在搅拌下放置2-24h；
e)用碳酸氢钠或碳酸钠水溶液淬灭步骤d)中进行的反应，将得到的溶液过滤，并浓缩至干燥，得到干燥的固体；
f)将干燥的固体溶于氯化钠水溶液中，将得到的溶液超滤并渗析；
g)回收来自步骤f)的溶液的产物；
h)纯化来自步骤g)的产物，得到酸形式或为其钠盐的来自步骤g)的产物；
i)回收来自步骤h)的产物。
8.根据前述权利要求的方法，其中步骤a)中的未硫酸酯化的软骨素的成盐使用选自四甲基-、四乙基-和四丁基-铵的盐进行。
9.根据权利要求7或8的方法，其中步骤a)中的未硫酸酯化的软骨素的成盐使用四丁基铵进行。
10.权利要求7至9中任意一项的方法，其中步骤b)中的未硫酸酯化的软骨素的干燥通过冷冻干燥或喷雾干燥进行。
11.根据权利要求7至10中任意一项的方法，其中在步骤c)中的未硫酸酯化的软骨素盐的干燥进行至0.5-2%的水。
12.根据权利要求7至11中任意一项的方法，其中来自步骤c)的未硫酸酯化的软骨素盐的溶解在二甲基甲酰胺中进行。
13.根据权利要求7至12中任意一项的方法，其中添加总共6-12当量的三氧化硫吡啶络合物进行步骤d)中的选择性硫酸酯化。
14.根据权利要求7至13中任意一项的方法，其中添加总共6-9当量的三氧化硫吡啶络合物进行步骤d)中的选择性硫酸酯化。
15.根据权利要求7至12中任意一项的方法，其中添加总共1-9当量的三氧化硫二甲基甲酰胺络合物进行步骤d)中的选择性硫酸酯化。
16.根据前述权利要求的方法，其中添加总共2-4当量的三氧化硫二甲基甲酰胺络合物进行步骤d)中的选择性硫酸酯化。
17.根据前述权利要求中任意一项的方法，其中步骤d)中的选择性硫酸酯化在10℃-20℃的温度进行。
18.根据前述权利要求中任意一项的方法，其中在步骤d)的末尾将得到的溶液保持在搅拌下达2-6h。
19.根据前述权利要求中任意一项的方法，其中在步骤g)中通过冷冻干燥、喷雾干燥或在醇环境中沉淀来回收产物。
20.治疗或预防骨关节炎或维持肌肉骨骼的健康的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1至3和5中任意一项的CS或组合物。
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