KR101548139B1 - 콘드로이틴 생산 세균 및 콘드로이틴 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본원 발명에 따라, 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자 및 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자가 도입되고, 콘드로이틴 생산능을 갖는, UDP-글루쿠론산 생산 세균을 배양하고; 상기 세균으로부터 콘드로이틴을 수거함으로써 콘드로이틴을 생산한다.
콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, UDP-글루쿠론산, kfoA 유전자, kfoC 유전자
Description
본 발명은 콘드로이틴 생산 세균 및 콘드로이틴 생산 방법에 관한 것이다.
콘드로이틴은 글루쿠론산 (GlcUA) 잔기 및 N-아세틸-D-갈락토사민 (GalNAc) 잔기 (-GlcUAβ(1-3)-GalNAcβ(1-4)-; 본 명세서에서는 콘드로이틴 탄수화물 골격으로도 언급됨)의 이당류의 반복된 구조를 포함하는 다당류이다. 콘드로이틴 설페이트는 콘드로이틴의 황산화에 의해 이루어진 다당류이다.
통상적으로, 콘드로이틴 및 콘드로이틴 설페이트는 동물의 연골조직, 기관 등으로부터 추출 및 정제된다. 그러나, 최근에는 연골조직 및 기관과 같은 물질이 부족하므로, 콘드로이틴 및 콘드로이틴 설페이트에 대해 공통적인 탄수화물 골격을 인위적으로 합성하는 기술이 연구되어 왔다.
GlcUA 및 GalNAc를 이들의 공여체 기질로부터 수용체 올리고당류로 교대로 전달함으로써 콘드로이틴을 생산하는 콘드로이틴 신타제가 보고되었으며, 이 효소를 사용하는 콘드로이틴 생산 방법이 제안되었다.
문헌 [참조: J. Biol. Chem. 275(31), 24124-24129 (2000)]은 파스퇴렐라 물토시다 (Pasteurella multocida)로부터 유래되는 콘드로이틴 신타제를 기술한다.
또한, WO 2003/102193 및 WO 2003/102194는 사람으로부터 유래되는 콘드로이틴 신타제를 기술한다.
또한, US 2003-0109693 (JP 2003-199583 A)는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) K4 균주에 의해 생산되는 신규한 콘드로이틴 신타제 (KfoC)를 기술한다.
그러나, 효소적 방법에 의해 콘드로이틴을 생산하는 경우, 수용체로서의 올리고당류 및 GlcUA 및 GalNAc의 공여체를 위한 슈가 뉴클레오타이드와 같은 값비싼 물질을 준비해야 하므로, 보다 저렴한 물질을 사용하는 콘드로이틴의 생산 방법이 요구되어 왔다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주는 콘드로이틴 골격 구조를 갖는 다당류를 캡슐로서 생산하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이의 구조는 GlcUA 잔기의 C3-하이드록실기에 결합된 GalNAc 잔기, GlcUA 잔기 및 프룩토즈 잔기의 삼당류를 포함하는 반복 단위로 이루어진다. 또한, 100개 이상의 화학적으로 상이한 캡슐형 다당류가 에스케리키아 콜라이에서 검출되었다. 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 K5 균주는 헤파린/헤파란 설페이트의 탄수화물 골격을 갖는 캡슐형 다당류 K5를 생산한다 [참조: J. Biol. Chem., 272(5), p2682-2687, 1997]. 그러나, 콘드로이틴 자체를 생산하는 에스케리키아 콜라이의 존재는 알려진 바 없었다. 따라서, 에스케리키아 세균을 사용하여 콘드로이틴을 생산하는 방법은 공지되어 있지 않다.
US 공개 특허원 2007-0281342는 파스퇴렐라 물토시다로부터 유래되는 콘드로이틴 신타제 유전자가 도입된 재조합 그람-양성 바실루스 세균을 사용하여 콘드로이틴을 생산하는 방법을 기술하고 있으며, 콘드로이틴의 발효적 생산에 있어 추가의 개선이 요구되었다.
발명의 개시
본 발명의 목적은 콘드로이틴을 생산할 수 있는 신규한 미생물 및 이 미생물을 사용하여 콘드로이틴을 생산하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.
본원의 발명자들은 광범위한 연구를 수행하여, 그 결과로서 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 및 kfoC 유전자가 도입된 에스케리키아 콜라이 K5 균주와 같은 UDP-글루쿠론산 생산 세균이 고효율로 콘드로이틴을 생산한다는 것을 밝혀내었으며, 이로써 본 발명이 완성되었다.
본 발명의 목적은 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자 및 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자가 도입되고, 콘드로이틴 생산능을 갖는, UDP-글루쿠론산 생산 세균을 제공하는 것이다.
본원에서, 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자는 바람직하게는
(A) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(B) 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함한 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고 UDP-글루코즈-4-에피머라제 활성을 갖는 단 백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 암호화하는 유전자이다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자는 바람직하게는
(a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA; 및
(b) 서열번호 1에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하고 UDP-글루코즈-4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 DNA이다.
또한, 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자는 바람직하게는
(C) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(D) 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함한 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고 콘드로이틴 신타제 활성을 갖는 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 암호화하는 유전자이다.
또한, 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자는 바람직하게는
(c) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA; 및
(d) 서열번호 3에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하고 콘드로이틴 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 DNA이다.
또한, 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자는 바람직하게는
(E) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질; 및
(F) 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함한 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고 콘드로이틴 신타제 활성을 갖는 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 암호화하는 유전자이다.
또한, 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자는 바람직하게는
(e) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA; 및
(f) 서열번호 5에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하고 콘드로이틴 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 DNA이다.
UDP-글루쿠론산 생산 세균은 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 K5 균주이다.
본 발명의 또 다른 목적은 적어도
(1) 상술된 바와 같은 세균을 배양하는 단계; 및
(2) 배양물로부터 콘드로이틴을 수거하는 단계를 포함하여, 콘드로이틴을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술된 방법에 의해 콘드로이틴을 생산하고, 콘드로이틴을 황산화시켜 콘드로이틴 설페이트를 수득함을 포함하여, 콘드로이틴 설페이트를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자 및 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
도 1은 kfoA 및 kfoC 유전자의 발현을 위한 벡터의 구조를 나타내는 도이다.
도 2는 KfoA 및 KfoC 단백질의 발현을 나타내는 도 (사진)이다. 레인 1은 플라스미드가 도입되지 않은 균주를 나타내고 (대조군), 레인 2는 pTrcHis-kfoCA가 도입된 균주를 나타내며, M은 분자량 마커를 나타낸다.
도 3은 콘드로이티나제 ABC (cABC)로 처리된 분획 L (A), cABC로 처리되지 않은 분획 L (B) 및 열-불활성화된 cABC로 처리된 분획 L (C)에 대한 형광 HPLC 시스템을 사용한 이당류 조성 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 cABC로 처리된 분획 E (A), cABC로 처리되지 않은 분획 E (B) 및 열-불활성화된 cABC로 처리된 분획 E (C)에 대한 형광 이당류 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 cABC로 처리된 분획 S (A), cABC로 처리되지 않은 분획 S (B) 및 열-불활성화된 cABC로 처리된 분획 S (C)에 대한 형광 이당류 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 cABC로 처리된 콘드로이틴 표준물 (A) 및 cABC로 처리된 콘드로이틴 표준물과 cABC로 처리된 분획 L의 혼합물 (B)에 대한 형광 이당류 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 (A) 제1 항체로서 항-KfoC 항체 (EK-C), (B) 제1 항체로서 항-KfoA 항체 (EK-A) 및 (C) 정상 토끼 혈청을 사용하여 KfoA, KfoC 및 Kfo△c 단백질의 발 현을 나타내는 도 (사진)이다. 레인 1 및 5는 분자량 마커, MagicMarkXP 표준물 (Invitrogen)을 나타내고, 레인 2는 pTrcHis-kfoCA가 도입된 균주를 나타내며, 레인 3은 pTrcHis-kfo△CA가 도입된 균주를 나타내고, 레인 4는 pTrcHis-kfoA가 도입된 균주를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 기술할 것이다.
<1> 본 발명의 세균
본 발명의 세균은 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자 및 kfoC 유전자가 도입되고, 콘드로이틴 생산능을 갖는, UDP-글루쿠론산 생산 세균이다.
"UDP-글루쿠론산 생산 세균"은 글루쿠론산으로 구성되는 다당류의 생산에 사용되는 UDP-글루쿠론산을 제공한다. "UDP-글루쿠론산 생산 세균"은 UDP-글루쿠론산를 생산하는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 글루코나세토박터 (Gluconacetobacter) 속에 속하는 세균, 예를 들어 글루코나세토박터 한세니 (Gluconacetobacter hansenii) 및 글루코나세토박터 크실리누스 (Gluconacetobacter xylinus), 리조븀 (Rhizobium) 속에 속하는 세균, 예를 들어 리조븀 메플로티 (Rhizobium meffloti), 아세토박터 (Acetobacter) 속에 속하는 세균, 예를 들어 아세토박터 크실리눔 (Acetobacter xylinum), 에르비니아 (Erwinia) 속에 속하는 세균, 예를 들어 에르비니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 티오바실루스 (Thiobacillus) 속에 속하는 세균, 예를 들어 티오바실루스 페록시단스 (Thiobacillus ferrooxidans), 크실렐라 (Xylella) 속에 속하는 세균, 예를 들어 크실렐라 파스티디오사 (Xylella fastidiosa), 시노리조븀 (Sinorhizobium) 속에 속하는 세균, 예를 들어 시노리조븀 멜릴로티 (Sinorhizobium meliloti), 로도코쿠스 (Rhodococcus) 속에 속하는 세균, 예를 들어 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous), 클렙시엘라 (Klebsiella) 속에 속하는 세균, 예를 들어 클렙시엘라 아에로게네스 (Klebsiella aerogenes), 엔테로박터 (Enterobacter) 속에 속하는 세균, 예를 들어 엔테로박터 아에로게네스 (Enterobacter aerogenes) 및 에스케리키아 속에 속하는 세균, 예를 들어 에스케리키아 콜라이를 포함한다.
"UDP-글루쿠론산 생산 세균"은 바람직하게는 에스케리키아 속에 속하고 UDP-글루쿠론산을 생산할 수 있는 세균, 보다 바람직하게는 에스케리키아 콜라이에 속하고 UDP-글루쿠론산을 생산할 수 있는 세균이다.
구체적인 예는 에스케리키아 콜라이 K5 균주를 포함한다. K5 균주는 ATCC (American Type Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)에 수탁번호 ATCC23506으로 기탁되었으며, ATCC의 카탈로그 또는 홈페이지로부터 입수가능하다.
kfoA 및 kfoC 유전자가 도입될 균주는 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 유도체인 균주일 수 있으며, 이러한 유도체 균주는 에스케리키아 콜라이 K5 균주에 유전자 돌연변이를 도입하거나 유전자 재조합에 의해 에스케리키아 콜라이 K5 균주에 유전자를 도입함으로써 수득될 수 있다. 즉, 본 발명의 세균의 하나의 양상은 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 및 kfoC 유전자를 에스케리키아 콜라이 K5 균주에 도입하여 수득되는 균주; 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 및 kfoC 유전자를 에스케리키아 콜라이 K5 균주에 도입하고 유전자 돌연변이를 추가로 도입하여 수득되는 균주; 및 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 및 kfoC 유전자를 에스케리키아 콜라이 K5 균주에 도입하고 또 다른 유전자를 추가로 도입하여 수득되는 균주를 포함한다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자의 예는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA 및 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA를 포함한다.
일반적으로, 단백질을 구성하는 하나 또는 수개의 아미노산에 치환, 결실, 삽입 또는 부가가 많은 경우에서 단백질의 활성에 영향이 없으며, 따라서 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자는 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함한 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고 UDP-글루코즈-4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 "하나 또는 수개의 아미노산"은 UDP-글루코즈-4-에피머라제 활성을 손상시키지 않으면서 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 유발할 수 있는 개수의 아미노산을 말한다. 구체적으로, 그 수는, 예를 들어 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 1 내지 5의 정수이다.
한편, 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자는 서열번호 2의 전체 서열과 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 UDP-글루코즈-4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자는 주형으로서 에스케리키아 콜라이 K4 균주의 염색체 DNA를 사용하는 PCR에 의해 수득될 수 있다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주는 ATCC에 수탁번호 ATCC23502로 기탁되었으며, 카탈로그 또는 ATCC의 홈페이지에서 입수가능하다.
하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 전체 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고 UDP-글루코즈-4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는, 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가가 부위-특이적 돌연변이유발 [참조: Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987); Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987)] 등에 의해 서열번호 2의 아미노산 서열에 도입되도록 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써 수득될 수 있다.
또한, 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리드화시킴으로써 UDP-글루코즈-4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 스크리닝하여 수득될 수 있다.
용어 "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되고 비-특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다 [참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 등]. "엄격한 조건"의 구체예는 50% 포름아미드, 4 x SSC, 50 mM HEPES (pH 7.0), 10 x 덴하르트 용액, 100μg/ml 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중 42 ℃에서 하이브리드화시키고, 실온에서 2 x SSC, 0.1% SDS 용액으로 세척한 후 60 ℃에서 0.1 x SSC, 0.1% SDS 용액으로 세척하기 위한 조건을 포함한다.
상술된 바와 같이 수득되는 유전자가 UDP-글루코즈-4-에피머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는지의 여부는 생성된 유전자를 적합한 숙주에 도입하여 단백질을 발현한 후 문헌 [참조: J. Biol. Chem., 277(24), p21567-21575, 2002]에 기술된 방법에 따라 UDP-글루코즈-4-에피머라제 활성을 측정함으로써 판단될 수 있다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자의 예는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA를 포함한다. 또한, 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자의 예는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA 및 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA를 포함한다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자는 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함한 서열번호 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고 콘드로이틴 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자는 서열번호 4 또는 6의 전체 서열과 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 콘드로이틴 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "콘드로이틴 신타제 활성"은 GlcUA를 GlcUA 공여체로부터 또는 GalNAc를 GalNAc 공여체로부터 슈가 쇄의 비-환원 말단에 교대로 전달하는 활성을 말한다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자는 주형으로서 에스케리키아 콜라이 K4 균주의 염색체 DNA를 사용하는 PCR에 의해 수득될 수 있다. 또한, 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 kfoC 유전자, 예를 들어 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA를 WO2007/145197에 기술된 방법에 따라 수득할 수 있다.
하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하는 서열번호 4 또는 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 4 또는 6의 전체 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고 콘드로이틴 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는, 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가가 부위-특이적 돌연변이유발 등에 의해 서열번호 4 또는 6의 아미노산 서열에 도입되도록 서열번호 3 또는 5의 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써 수득될 수 있다
또한, 유전자는 서열번호 3 또는 5의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리드화시킴으로써 콘드로이틴 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 스크리닝하여 수득될 수 있다.
용어 "하나 또는 수개의" 및 "엄격한 조건"의 정의는 상술된 바와 같다.
상술된 바와 같이 수득되는 유전자가 콘드로이틴 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는지의 여부는 생성된 유전자를 적합한 숙주에 도입하여 단백질을 발현한 후 US 2003-0109693 (JP 2003-199583 A)에 기술된 방법에 따라 콘드로이틴 신타제 활성을 측정함으로써 판단될 수 있다.
본 발명의 세균은 상술된 바와 같이 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자 및 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자를 UDP-글루쿠론산 생산 세균에 도입함으로써 수득될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "도입"은 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 박테리오파아지를 사용하여 UDP-글루쿠론산 생산 세균에 2개의 유전자 모두를 도입하거나, 상동 재조합 등에 의해 UDP-글루쿠론산 생산 세균의 염색체에 2개의 유전자 모두를 도입하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 박테리오파아지는, 이들이 에스케리키아 콜라이로의 유전자 도입에 사용될 수 있는 한 특정하게 제한됨이 없이, 예를 들어 pTrcHis (Invitrogen Corporation), pET 벡터 (Novagen) 및 pGEX 벡터 (Amersham Pharmacia)를 포함한다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자 및 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자의 도입에 있어, 유전자의 천연 프로모터가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이에서 강력한 프로모터, 예를 들어 lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, PR 프로모터 또는 lacUV 프로모터를 사용한다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자 및 kfoC 유전자는 단일 벡터를 사용하여 하나씩 또는 동시에 도입될 수 있다. 보다 바람직하게는, 유전자의 도입 및 발현이 용이하게 수행될 수 있기 때문에, kfoA 및 kfoC 유전자 모두를 수반하는 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 박테리오파아지를 사용한다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 및 kfoC 유전자는 이들이 다른 펩타이드와 함께 융합 단백질로서 발현되도록 도입될 수 있다.
다른 펩타이드의 예는 폴리히스티딘 태그 및 GST (글루타티온-S-트랜스퍼라제) 태그를 포함한다. 유전자 생성물의 검출 (발현의 확인)이 용이하게 수행될 수 있기 때문에, 유전자 생성물을 융합 단백질로서 발현시키는 것이 바람직하다.
유전자의 도입은 공지된 형질전환법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법의 예는 전기천공법, DEAE-덱스트란법 및 인산칼슘법을 포함한다.
유전자의 도입은 유전자를 검출하는 방법, 예를 들어 RT-PCR 또는 노던 블로팅; 재조합 단백질의 발현을 고유하게 검출하는 방법, 예를 들어 웨스턴 블로팅; 및 상술된 바와 같은 활성 측정에 의해 확인될 수 있다.
에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자 및 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자가 UDP-글루쿠론산 생산 세균에 도입되는 경우, 세균은 콘드로이틴을 캡슐형 다당류로서 생산하는 능력을 획득한다.
<2> 콘드로이틴 생산 방법
본 발명의 콘드로이틴 생산 방법은 적어도
(1) 본 발명의 세균을 배양하는 단계; 및
(2) 배양물로부터 콘드로이틴을 수거하는 단계를 포함한다.
배양은 에스케리키아 속에 속하는 세균을 배양하기 위한 일반적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
배양 배지는 에스케리키아 속에 속하는 세균의 배양에 사용될 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 바람직한 예는 LB 배지 (Luria-Bertani medium) (리터당 10.0 g의 박토-트립톤, 5.0 g의 박토-효모 추출물 및 5.0 g의 NaCl을 함유) 및 CYG 배지 (2.0% 카사미노산, 0.5% 효모 추출물 및 0.2% 글루코즈, 오토클레이브 전 pH를 7.0으로 조정)를 포함한다. 유전자가 항생제-내성 유전자를 포함하는 벡터를 사용하여 도입되는 경우, 배지는 바람직하게는 유전자에 상응하는 항생제를 포함한다.
배양 조건은 에스케리키아 속이 성장할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 콘드로이틴을 고효율로 생산하기 위해서 배양은 바람직하게는 8 내지 72시간 동안 20 내지 40 ℃에서 수행된다.
콘드로이틴을 고효율로 생산하기 위해서, 세균은 플레이트 또는 액체 배지에서 예비배양될 수 있다.
배양물로부터 콘드로이틴을 수거하는 방법은 콘드로이틴이 수거될 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 이의 예는 하기 실시예에 기술된 바와 같은 방법을 포함한다. 구체적으로, 수거된 재조합 세포는 PBS (포스페이트-완충된 식염수) 등에 현탁되며, 세포를 라이소자임, DNaseI 및 프로테이나제 K로 처리한 후, 단백질을 제거한다. 콘드로이틴은, 예를 들어 분획물을 콘드로이티나제로 처리하고 이당류 조성 분석을 수행하여 검출될 수 있다.
<3> 콘드로이틴 설페이트 생산 방법
콘드로이틴 설페이트는 본 발명에서 기술된 재조합 세균으로부터 제조된 콘드로이틴을 추가로 황산화하여 생산될 수 있다.
황산화는 글리코사미노글리칸을 황산화하는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 특별히 제한됨이 없이, 예를 들어 JP 61-47701 A에 기술된 방법을 포함한다.
또한, 황산화는 설페이트 그룹을 콘드로이틴으로 전달하기 위한 효소 (설포트랜스퍼라제)를 사용하여 수행될 수 있다. 설페이트 공여체로서 3'-포스포아데노신 5'-포스포설페이트 (PAPS)의 존재 하에서, 설포트랜스퍼라제가 본원에 기술된 재조합 세균에 의해 생산되는 콘드로이틴에 반응하여 콘드로이틴 설페이트를 생산할 수 있다. 설페이트 그룹을 콘드로이틴에 전달하기 위한 공지된 설포트랜스퍼라제의 예는 콘드로이틴 6-O-설페이트 그룹 트랜스퍼라제 [참조: J. Biol. Chem., 275(28), 21075-21080 (2000)] 및 갈락토사미노글리칸 4-설페이트 그룹 트랜스퍼라제 [참조: JP 2000-4877 A]를 포함한다.
하기에서, 본 발명은 실시예를 참조로 하여 상세히 기술될 것이다.
실시예 1: KfoC/KfoA 공동-발현 벡터의 제조
<kfoA 유전자의 증폭>
주형으로서 이.콜라이 K4 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 문헌 [참조: J. Biol. Chem., Vol. 277, Issue 24, 21567-21575]에 기술된 방법에 따라 수행하고, 생성된 PCR 생성물을 pTrcHis (히스티딘 융합 단백질 발현 벡터, Invitrogen)에 삽입하여 pTrcHis-kfoA를 수득하였다.
사용되는 프라이머는 하기와 같다:
<kfoC 유전자의 증폭>
주형으로서 이.콜라이 K4 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 JP 2003-199583 A에 기술된 방법에 따라 수행하고, 생성된 PCR 생성물을 pTrcHis에 삽입하여 pTrcHis-kfoC를 수득하였다.
사용되는 프라이머는 하기와 같다:
<pTrcHis-kfoCA의 제조>
pTrcHis-kfoCA를 하기와 같이 상술된 pTrcHis-kfoA 및 pTrcHis-kfoC로부터 제조하였다.
먼저, NotI-SalI 부위를 PCR에 의해 pTrcHis-kfoC의 C-말단 서열에 도입하였다. PCR을 하기에 나타낸 프라이머를 사용하여 수행함으로써 kfoC의 C-말단측으로부터 pTrcHis-kfoC의 전체 길이를 증폭시키고, 생성된 PCR 생성물을 자가-결합시켜 플라스미드 pTrcHis-kfoC-NotI-SalI을 수득하였다.
사용되는 프라이머는 하기와 같다:
이어서, 프라이머(
)를 각각 리보좀 결합 부위 (RBS)의 상류 및 pTrcHis-kfoA의 kfoA의 C-말단 영역에서 고안하고, 주형으로서 pTrcHis-kfoA를 사용하는 PCR을 위해 사용하였다. 이어서, 생성된 PCR 생성물을 pCR4-TOPO (Invitrogen)에 삽입하여 pCR4-TOPO-kfoA 를 수득하였다.
kfoA를 함유하는 삽입물을 NotI-SalI으로 pCR4-TOPO-kfoA로부터 절단시킨 후, pTrcHis-kfoC-NotI-SalI의 NotI-SalI 부위에 도입하고, 생성된 플라스미드를 pTrcHis-kfoCA라 명명하였다 (도 1).
실시예 2
재조합 KfoC 및 KfoA의 공동 발현
발현 벡터 pTrcHis-kfoCA를 전기천공 (세포 100 μL, 200 Ω, 25 μF, 2.5 kV, 큐벳 0.1 cm)에 의해 에스케리키아 콜라이 K5 균주에 도입하여 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfoCA 균주를 수득하였다. 콜로니를 100 ppm의 암피실린으로 보충된 LB 배지로 옮긴 후, 시드 배양물을 37 ℃에서 밤새 항온배양하였다. 1 mL의 시드 배양물을 100 ppm의 암피실린으로 보충된 20 mL의 CYG 배지에 옮겼다. 재조합 세균을 37 ℃에서 3시간 동안 배양한 후 (OD600 = 1.8, 1.7-2.0), 배양물에 IPTG를 1.0 mM의 최종 농도로 가하였다. 생성된 배양물을 37 ℃에서 추가로 5시간 동안 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다.
세균 세포를 원심분리에 의해 900 μL의 배양물로부터 수거하였다. 수득된 세포를 90 μL의 라엠리 완충액 (x1)에 현탁시켰다. 10분 동안 끓는 수조에서 가열한 후, 10 μL의 상청액을 5/20% 구배 겔에서 SDS-PAGE를 수행하고, PVDF 막에 옮긴 후, 웨스턴 분석을 수행하여 재조합 단백질의 발현을 검출하였다. 1/2,000로 희석된 항-Penta-His-HRP (QIAGEN)를 재조합 히스티딘 융합 단백질의 검출에 사용 하였다. 그 결과, 재조합 단백질 KfoA 및 KfoC의 발현을 확인하였다 (도 2).
실시예 3
다당류의 제조 및 이당류 분석에 의한 이의 검출
<세균 세포의 제조>
이.콜라이 K5/pTrcHis-kfoCA 균주를 시드 배양물로서 100 ppm의 암피실린으로 보충된 LB 배지에서 배양하였다. 시드 배양물 (750μL)을 100 ppm의 암피실린으로 보충된 CYG 배지 (15 mL)에 옮긴 후, 이를 37 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양물에 IPTG (최종 농도: 1 mM)를 가하고, 5시간 동안 추가로 더 배양하였다. 세균 세포를 원심분리로 수거하였다.
<배양 상청액의 제조>
시드 배양물 (1 mL)를 100 ppm 암피실린으로 보충된 CYG 배지 (20 mL)에 옮긴 후, 37 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양물에 IPTG (최종 농도: 0.1 mM)를 가하고, 5시간 동안 추가로 더 배양하였다. 배양 상청액을 원심분리로 수거하였다.
<다당류 분획의 제조>
다당류를 재조합 세포 및 배양 상청액으로부터 하기의 3가지 방법으로 제조하였다.
제조 1) 상술되는 바와 같이 수득된 세균을 PBS 중에 재현탁시키고, 37 ℃에서 1시간 동안 리보자임 및 DNase I으로 처리한 후, 37 ℃에서 1시간 동안 프로테이나제 K로 처리하였다. 이어서, 효소를 열 불활성화시키고, 단백질을 70% 황산암모늄으로 침전시켜 제거하였다. 생성된 상청액 분획을 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 대해 투석하여 샘플 L을 수득하였다.
제조 2) 상술되는 바와 같이 수득된 세균을 제조업자의 교시에 따라 플라스미드 P1 (리보자임 함유), P2, 및 P3 (QIAGEN)를 정제하기 위한 제제로 순서대로 처리하였다. 원심분리시켜 수거한 후, 상청액을 에탄올 침전시켰다. 침전물을 원심분리로 수거하고, 100 μL의 멸균수에 재현탁시켰다. 현탁물을 DNaseI로 37 ℃에서 1시간 동안 처리하여 DNA를 분해시킨 후, 37 ℃에서 1시간 동안 프로테이나제 K로 처리하였다. 이어서, 효소를 열불활성화시키고, 단백질을 70% 황산암모늄으로 침전시켜 제거하였다. 생성된 상청액 분획을 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 대해 투석하여 샘플 E를 수득하였다.
제조 3) 배양 상청액 (20 mL)을 증발건조시켰다. 건조된 물질을 2 ml의 증류수에 용해시켰다. 용액을 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 대해 투석하여 샘플 S를 수득하였다.
<이당류 분석에 의한 콘드로이틴의 검출>
샘플 L, E 및 S (각각 100 μL)를 50 mM NaOAc를 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 중에서 cABC (콘드로이티나제 ABC; 제조사: Seikagaku Corporation)로 37 ℃에서 밤새 처리하였다.
대조군으로서, cABC로 처리되지 않은 샘플 L, E 및 S 및 열-불활성화된 cABC로 처리된 샘플 L, E 및 S를 준비하였다. 한외여과를 수행하여 10,000 이상의 크기를 갖는 거대분자를 제거하고, 샘플을 형광 HPLC 시스템을 사용하는 이당류 조성 분석으로 분석하였다 [참조: J. Biol. Chem. 2000 Jul 21; 275 (29): 2269-2275) (도 3, 4 및 5). Senshu Pak Decosil C22 (4.6 I.D. x150mm)을 HPLC 시스템에서 분리용 컬럼으로 사용하고, 형광 검출기의 여기 및 방사 파장을 각각 346nm 및 410nm으로 고정하였다.
그 결과, cABC로 처리되는 샘플의 경우에서만 특이적 피크가 검출되었다. 각각의 샘플의 이당류 조성 프로필은 도 6(A)에 나타난 바와 같이 cABC로 콘드로이틴 표준물을 처리하여 수득되는 샘플의 프로필과 긴밀하게 상응하였다. 한편, cABC로 처리되는 콘드로이틴 표준물이 cABC로 처리되는 샘플 L과 혼합되는 경우, 단지 하나의 피크가 검출되었으며, 따라서 샘플 L이 콘드로이틴을 함유하는 것으로 확인되었다 (도 6(B)). 샘플 E 및 S의 경우, 동일한 결과가 수득되었다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예 4
Kfo△C/KfoA 공동-발현 벡터의 제조
<kfo△C 유전자의 증폭>
WO2007/145197에 기술된 방법에 따라, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 N-말단-절단된 KfoC를 암호화하는 DNA (kfo△C 유전자)를 클로닝하였다. kfo△C 유전자를 pTrcHis에 삽입하여 pTrcHis-kfo△C를 수득하였다.
<pTrcHis-kfo△CA의 제조>
실시예 1에서 제조되는 플라스미드 pTrcHis-kfoCA를 제한효소 SphI 및 SmaI을 사용하여 절단하였다.
DNA 단편 (2.9 kDa)을 동일한 제한효소를 사용하여 플라스미드 pTrcHis-kfo△C의 분해에 의해 수득하였다. 통상의 방법에 따라, DNA 단편을 절단된 플라스미드의 SphI-SmaI 부위에 삽입한 후, 생성된 플라스미드를 pTrcHis-kfo△CA로 명명하였다.
실시예 5
항-KfoA 및 항-KfoC 항체의 제조
<항-KfoA 항체의 제조>
서열번호 15의 펩타이드 서열 (CIVSR RDGDI AESWS SPEKA NK, 순도: > 70 %)을 포함하는 올리고펩타이드를 합성하고, 4 mg의 올리고펩타이드를 통상의 방법으로 KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)에 접합시켰다. 완전 애주번트와 혼합하여 항원 용액을 제조한 후, 2주 간격으로 5회 면역화를 수행하였다. 전혈을 수거하고, 항체 역가를 확인하였다. 각각의 토끼 혈액으로부터, 항-KfoA 혈청을 수득하였다: 각각 48 mL (샘플 A) 및 60 mL (샘플 B). 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제한 후, 샘플 A로부터 IgG 분획 EK-A 32 ml (IgG 농도: 5.30 mg/mL)를 수득하였다.
<항-KfoC 항체의 제조>
서열번호 16의 펩타이드 서열 (CQEPP GKENE TDRAA GK, 순도: > 70 %)을 포함하는 올리고펩타이드를 합성하고, 4 mg의 올리고펩타이드를 통상의 방법으로 KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)에 접합시켰다. 완전 애주번트와 혼합하여 항원 용액을 제조한 후, 2주 간격으로 5회 면역화를 수행하였다. 전혈을 수거하고, 항체 역가를 확인하였다. 각각의 토끼 혈액으로부터, 항-KfoA 혈청을 수득하였다: 각각 65 mL (샘플 A) 및 39 mL (샘플 B). 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제한 후, 샘플 A로부터 IgG 분획 EK-A 39 ml (IgG 농도: 4.41 mg/mL)를 수득하였다.
실시예 6
실시예 2에서와 동일한 방식으로, 플라스미드 pTrcHis-kfo△CA를 이.콜라이 K5 균주에 도입하여 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfo△CA 균주를 수득하고, 재조합 균주를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 평가하였다. 100 ppm의 암피실린으로 보충된 LB 배지 (0.5 mL)에서 배양된 시드 배양물을 100 ppm의 암피실린으로 보충된 CYG 배지 (10 mL)에 옮기고, 37 ℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. IPTG (최종 농도: 1 mM)를 가한 후, 4시간 동안 더 배양하였다. 세균 세포를 900 μL의 배양물로부터 수거하고, 90 μL의 라엠리 완충액 (x1)에 현탁시켰다. 끓는 수조에서 10분 동안 가열한 후, 10 μL의 상청액을 7.5% 겔에서 SDS-PAGE를 수행하고, PVDF 막에 옮기 고, 웨스턴 분석을 하여 재조합 단백질의 발현을 검출하였다. 1/1,000로 희석된 항-KfoA 항체 (EK-A) 및 항-KfoC 항체 (EK-C)를 재조합 단백질 KfoA, KfoC 및 Kfo△C를 검출하기 위한 1차 항체로서 사용하였다. 항-토끼 면역글로불린 HRP (DAKO, #P0448)을 2차 항체로 사용하였다. 또한, 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfoCA 및 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfoA의 배양물을 사용하는 동일한 실험을 수행하여 재조합 단백질의 발현 수준을 비교하였다. 그 결과, 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfoCA와 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfoA 사이에서 KfoA와 KfoC(Kfo△C)의 발현 수준에는 큰 차이가 없었다 (도 7).
실시예 7
다당류의 제조 및 이당류 분석에 의한 이의 검출
<세균 세포의 제조>
실시예 3에서와 동일한 방식으로 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfo△CA, 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfoCA 및 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfoA 균주의 배양물로부터 세균 세포 및 상청액을 121 ℃에서 5분 동안 오토클레이브 후 제조하였다.
<다당류 분획의 제조>
상청액 (1 mL)을 흐르는 수돗물에 대해 밤새 투석시킨 후, 투석된 용액을 동결건조시켰다. 동결건조된 물질을 lOOμL의 5OmM Tris-HCl (pH 8.0)에 용해시켜 다당류 분획으로서 사용하였다.
<이당류 분석에 의한 콘드로이틴의 검출>
실시예 3에서와 같은 방식으로, 수득된 분획을 이당류 조성 분석에 의해 분석하였다. 콘드로이틴 표준 용액 (200μg/mL 및 100μg/mL)을 형광 HPLC에 의해 분석하여 콘드로이틴 보정 곡선을 만들었다. 콘드로이틴 농도와 불포화된 이중 슈가의 피크 면적 △Di-OS 사이의 관계를 수학식 1로 나타내었다:
불포화된 이당류와 일치되는 피크 (△Di-OS)를 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfo△CA 및 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfoCA로부터 제조되는 샘플에서 검출하였다 (데이터는 나타내지 않음). 표 1은 재조합 배양물에서 수학식 1을 이용해 계산되는 콘드로이틴 농도에 대한 결과를 나타낸다.
이.콜라이 K5/pTrcHis-kfo△CA와 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfoCA 사이의 콘드로이틴 생산능 비교시, 재조합 균주 이.콜라이 K5/pTrcHis-kfo△CA가 발효에 의한 콘드로이틴의 생산에 보다 적합하다. 이러한 결과는 콘드로이틴 생산이 N-말단-절단된 KfoC를 암호화하는 kfo△C 유전자를 사용함으로써 증진될 수 있다는 것을 제시한다.
본 발명의 세균을 사용하여, 콘드로이틴 및 콘드로이틴 설페이트를 고효율 및 저비용으로 생산할 수 있다.
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<211> 1020
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1017)
<400> 1
atg aat ata tta gtt aca ggt gga gca ggc tat att ggc tcg cat act 48
Met Asn Ile Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ser His Thr
1 5 10 15
agt tta tgt ctt ctg aat aaa ggt tac aat gtt gta atc att gac aac 96
Ser Leu Cys Leu Leu Asn Lys Gly Tyr Asn Val Val Ile Ile Asp Asn
20 25 30
tta att aat tca tct tgc gag agc att cga agg att gaa tta ata gct 144
Leu Ile Asn Ser Ser Cys Glu Ser Ile Arg Arg Ile Glu Leu Ile Ala
35 40 45
aaa aaa aaa gtt act ttc tat gag ttg aac atc aac aat gaa aaa gaa 192
Lys Lys Lys Val Thr Phe Tyr Glu Leu Asn Ile Asn Asn Glu Lys Glu
50 55 60
gtt aat caa att cta aaa aaa cac aaa ttt gat tgt ata atg cat ttt 240
Val Asn Gln Ile Leu Lys Lys His Lys Phe Asp Cys Ile Met His Phe
65 70 75 80
gcc ggt gca aag tct gtt gct gaa tct tta ata aaa ccc att ttt tat 288
Ala Gly Ala Lys Ser Val Ala Glu Ser Leu Ile Lys Pro Ile Phe Tyr
85 90 95
tat gat aat aat gtt tca ggg acg ttg caa tta att aat tgc gct ata 336
Tyr Asp Asn Asn Val Ser Gly Thr Leu Gln Leu Ile Asn Cys Ala Ile
100 105 110
aaa aac gat gtg gct aat ttt att ttt agc tct tct gca acg gtt tat 384
Lys Asn Asp Val Ala Asn Phe Ile Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr
115 120 125
ggt gaa agc aaa ata atg cct gta aca gaa gat tgc cat ata gga gga 432
Gly Glu Ser Lys Ile Met Pro Val Thr Glu Asp Cys His Ile Gly Gly
130 135 140
aca tta aat cca tat ggt aca tca aag tat ata tca gaa ttg atg att 480
Thr Leu Asn Pro Tyr Gly Thr Ser Lys Tyr Ile Ser Glu Leu Met Ile
145 150 155 160
aga gat att gca aaa aaa tat agc gat act aat ttt ttg tgt ctg aga 528
Arg Asp Ile Ala Lys Lys Tyr Ser Asp Thr Asn Phe Leu Cys Leu Arg
165 170 175
tat ttt aac cca aca ggt gct cac gag tcg gga atg atc ggt gaa agt 576
Tyr Phe Asn Pro Thr Gly Ala His Glu Ser Gly Met Ile Gly Glu Ser
180 185 190
ccc gct gat ata cca agc aat tta gtt cct tat ata tta caa gtt gct 624
Pro Ala Asp Ile Pro Ser Asn Leu Val Pro Tyr Ile Leu Gln Val Ala
195 200 205
atg ggt aaa cta gaa aaa ctt atg gtg ttt ggg ggg gat tac cct aca 672
Met Gly Lys Leu Glu Lys Leu Met Val Phe Gly Gly Asp Tyr Pro Thr
210 215 220
aag gat gga acc ggt gtt cgt gat tat ata cac gta atg gat tta gcg 720
Lys Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val Met Asp Leu Ala
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Glu Gly His Val Ala Ala Leu Ser Tyr Leu Phe Arg Asp Asn Asn Thr
245 250 255
aat tat cat gtt ttt aat tta ggt act ggt aaa gga tat tct gtt tta 816
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260 265 270
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Glu Leu Val Ser Thr Phe Glu Lys Ile Ser Gly Val Arg Ile Pro Tyr
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Pro Leu Pro Glu Ser Thr Asn Asp Tyr Val Trp Ala Gly Lys Arg Lys
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Glu Leu Asp Asp Tyr Pro Arg Lys Gln Leu Ile Ile Asp Gly Leu Ser
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Ile Val Ile Pro Thr Tyr Asn Arg Ala Lys Ile Leu Ala Ile Thr Leu
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Ala Cys Leu Cys Asn Gln Lys Thr Ile Tyr Asp Tyr Glu Val Ile Val
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Glu Ser Leu Leu Asn Ile Lys Tyr Val Arg Gln Lys Asp Tyr Gly Tyr
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Gln Leu Cys Ala Val Arg Asn Leu Gly Leu Arg Ala Ala Lys Tyr Asn
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1 5 10 15
Lys
Claims (11)
- 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) K4 균주로부터 유래되는 kfoA 유전자 및 에스케리키아 콜라이 K4 균주로부터 유래되는 kfoC 유전자가 도입되고, 캡슐형 다당류로서 콘드로이틴 생산능을 갖는, UDP-글루쿠론산 생산 에스케리키아 콜라이 세균으로서,여기서, 상기 kfoA 유전자가,(A) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및(B) 1 내지 5개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가로부터 선택되는 보존성 변형을 포함하는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고 UDP-글루코즈-4-에피머라제 활성을 갖는 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 암호화하고,상기 kfoC 유전자가,(C) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;(D) 1 내지 5개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가로부터 선택되는 보존성 변형을 포함하는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고 콘드로이틴 신타제 활성을 갖는 단백질;(E) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및(F) 1 내지 5개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가로부터 선택되는 보존성 변형을 포함하는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고 콘드로이틴 신타제 활성을 갖는 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 암호화하는, UDP-글루쿠론산 생산 에스케리키아 콜라이 세균.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 kfoA 유전자가,(a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA인, 세균.
- 삭제
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 kfoC 유전자가,(c) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA인, 세균.
- 삭제
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 kfoC 유전자가,(e) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA인, 세균.
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 세균이 에스케리키아 콜라이 K5 균주인, 세균.
- (1) 제1항 또는 제3항에 따른 세균을 배양하는 단계; 및(2) 배양물로부터 콘드로이틴을 수거하는 단계를 적어도 포함하는, 콘드로이틴의 생산 방법.
- 제9항에 따른 방법에 의해 콘드로이틴을 생산하고, 상기 콘드로이틴을 황산화시켜 콘드로이틴 설페이트를 수득함을 포함하는, 콘드로이틴 설페이트의 생산 방법.
- 삭제
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