细菌产生软骨素的组合物和方法
发明背景
技术领域
本发明涉及软骨素产生的重组DNA技术领域,包括通过联合重组细菌发酵和发酵后硫酸化产生硫酸软骨素。
背景技术
软骨素属于称为糖胺聚糖(GAG)的杂多糖家族。糖胺聚糖(GAG)是无支链的、带负电荷的多糖链,由重复的二糖单位组成,其中之一是酸性糖而另一种是可以被硫酸化的氨基糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)。由于它们非柔性的性质和高的负电荷,GAG表现出高度延展的构象,占用大量空间,吸收阳离子和水并在细胞外基质中形成多孔的凝胶。因此,在大多数动物中被发现的GAG帮助水合和扩展组织,并使基质能够承受压力(compressiveforce)。通过这种机制,例如衬贴膝关节的软骨基质可以支持数百个大气压的压力。
硫酸软骨素对于维持软骨的强度和韧性是重要的并作为营养补充剂销售以减轻关节疼痛和促进健康的软骨和关节功能。临床研究支持使用硫酸软骨素治疗骨性关节炎(参见,例如,Kahan等,ArthritisandRheumatism2009;60:524-533;Michel等,ArthritisandRheumatism2005;52:779-786和Uebelhardt等,OsteoarthritisandCartilage2004;12:269-276)、间质性膀胱炎(参见,例如,Nickel等,BJUInt.2009;103:56-60和Cervigni等,Int.Urogynecol.J.PelvicFloorDysfunct.2008;19:943-947)、和滑膜炎(参见,例如,Hochberg和Clegg,OsteoarthritisandCartilage2008;16(Suppl.3):S22-S24和OsteoarthritisandCartilage2009;17(Suppl.1):S32-S33)。这些文献以整体引用的方式并入本文。
目前通过使用化学和酶处理从蛋白中解离多糖并产生不同质量的多糖产品,从动物,包括牛、猪、鲨和家禽的软骨提取来产生硫酸软骨素(Barnhill等,J.Am.Pharm.Assoc.2006;46:14-24,Volpi,J.Pharm.Pharmacol.2009;61:1271-1280)。
软骨素包含D-葡糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)。它由二糖重复单位β3GalNAc-β4GlcUA组成。通常,GalNAc残基在4位和6位不定地是硫酸化的。硫酸软骨素作为蛋白聚糖的组分自然发生,蛋白聚糖在人和其他动物中是软骨组织,例如关节的结构部件。蛋白聚糖由核心蛋白和多糖组分,例如硫酸软骨素组成,其通过如图1所示的寡糖接头与蛋白共价附接。核心蛋白以多种多糖链修饰。蛋白聚糖可以通过细胞外间隙存在的蛋白的含多糖部分锚定在细胞膜上或分泌和定位于细胞外基质中(Prydz和Dalen,J.CellSci.2000;113:193-205)。
负责合成软骨素骨架的糖基转移酶(软骨素合成酶)通过向接受底物添加来自UDP-GalNAc和UDP-GlcUA供体GalNAc和GlcUA的交替单糖单位来进行。已经在人类中确定了这些酶(Kitagawa等,J.Biol.Chem.2001;276:43894-43900;Yada等,J.Biol.Chem.2003;278:39711-39725),并且已经在多种其他动物,包括马、牛、啮齿类动物、狗、鸡、斑马鱼、线虫、和昆虫(www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/8950)中确定了人软骨素合成酶的同源物。
有些细菌也产生软骨素或软骨素样多糖聚合物作为它们的荚膜的组分。与在脊椎动物中发现的硫酸软骨素不同,微生物软骨素不是作为蛋白聚糖存在,而是在细菌细胞表面作为脂质连接的多糖和在培养基中作为游离(即与细胞不相连的)多糖存在(Whitfield,Annu.Rev.Biochem.2006;75:39-68;DeAngelis,Glycobiol.2002;12:9R-16R)。
据报道两种细菌,大肠杆菌K4(Rodriguez等,Eur.J.Biochem.1988;177:117-124)和多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)血清型F(Rimler,Vet.Rec.1994;134:191-192)可以产生非硫酸化软骨素样荚膜多糖,其潜在地可进行化学修饰以产生硫酸软骨素。Rodriguez等展示了大肠杆菌K4产生具有果糖侧链(K4抗原)的非硫酸化的软骨素骨架作为荚膜聚合物成分。Ninomiya等(J.Biol.Chem.2002;277:21567-21575)鉴定并测序了在大肠杆菌K4中软骨素样荚膜多糖生物合成所需的关键基因。这些序列保存于GenBankTM中具有登录号AB079602。Ninomiya等公开的序列包含大肠杆菌K4“2组”荚膜基因簇的所谓的“区域2”部分。Whitfield提供了大肠杆菌中荚膜基因簇组成的详细说明(Annu.Rev.Biochem.2006;75:39-68)。大肠杆菌2组荚膜基因簇的区域2基因编码决定荚膜多糖结构的蛋白。AB079602序列包含一个编码大肠杆菌K4软骨素聚合酶的基因,称为kfoC。大肠杆菌K4软骨素聚合酶是一种双功能糖基转移酶,将GlcUA和GalNAc交替转移到软骨素糖链和相关寡糖的非还原性末端,产生K4抗原多糖的软骨素骨架。大肠杆菌K4产生的软骨素样荚膜多糖包含连接(β1,3)到软骨素GlcUA残基的果糖。多杀巴斯德氏菌血清型F也产生非硫酸化的软骨素荚膜成分,并且如DeAngelis&Padgett-McCue,J.Biol.Chem.2000;275:24124-29报道的,已经克隆了在此生物中负责软骨素聚合的糖基转移酶。与K4软骨素聚合酶一样,巴斯德氏菌软骨素合酶(pmCS,Genbank登录号AAF97500)是单一的多肽酶,在提供合适的受体底物时,它可以从UDP-GlcUA和UDP-GalNAc合成软骨素聚合物。
涉及从动物组织中纯化的产生硫酸软骨素的传统方法费力且成本高。此外,从动物组织产生硫酸软骨素必然涉及硫酸软骨素产品中存在传染性病原体的可能。在从动物组织产生过程中必须小心以使这种潜在的传染性病原体存在的可能性最小化。可以使用利用重组DNA技术产生软骨素的替代方法克服这些缺点。最近,DeAngelis(美国专利申请公开第20030109693号)和Cimini等(Appl.Microbiol.Biotechnol.2010;85(6):1779-87(EpubOct.1,2009))已建议了微生物产生软骨素。然而,产生软骨素(多杀巴斯德氏菌)或软骨素样(大肠杆菌K4)多糖的已知微生物是已知的对各种哺乳动物的病原体并因此不适合大规模发酵。它们也是相对低的多糖生产者。
特别的是,多杀巴斯德氏菌被认为不适合商业生产软骨素,因为它的产量低、要求昂贵的培养基、和生物危害等级2(BL2)状态,这需要专门且昂贵的设施。得自微生物的高产率是商业上可以获利的软骨素生产必然需要的。DeAngelis(美国专利申请公开第20030109693号)提及在宿主细胞,例如食品级的乳球菌属(Lactococcus)或芽孢杆菌属(Bacillus)中表达pmCS以合成重组软骨素的可能性。然而,芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌,并正因如此,其具有比革兰阴性生物如大肠杆菌和多杀巴斯德氏菌非常不同的膜/细胞壁结构。因此,预期聚合物的有效分泌在芽孢杆菌中将是有问题的。
大肠杆菌K4也不适合生产软骨素,因为它是已知的人类病原体。此外,它本身不产生软骨素,反而如上文指出的产生软骨素的果糖基化形式。需要对此多糖进行大量的化学或酶修饰以生产软骨素。这样的修饰增加了方法的总成本。另外,它需要引入进一步的流程和质量控制措施以确定这样的修饰是完整的并且产生一致的产品。
因此,软骨素生产需要一种有效、安全且合算的方法。本发明通过提供构建体和宿主细胞和方法以供软骨素(可随后被硫酸化以产生硫酸软骨素)的重组微生物产生来满足这一需求。
发明概述
本发明涉及一种包含基因簇的构建体,所述基因簇包含kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kfoA、kfoC、和kfoF,其中所述基因簇不含kfoD、orf3(kfoI)、kfoE、或orf1(kfoH)中的一种或多种的功能性基因,并且其中所述构建体适于在非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。在一些实施方案中,软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中,软骨素是从宿主细胞分泌的。在一些实施方案中,基因簇进一步包含kfoG、kfoB或kfoG和kfoB两者均包含。在一些实施方案中,基因簇进一步包含kfoM和kfoT。在一些实施方案中,构建体包含pDD66、pDD67、pCX040、pCX041、pCX042、pCX043、pCX096、或pBR1052。
本发明涉及一种包含基因簇的构建体,所述基因簇包含kfoA、kfoC、和kfoF,其中所述基因簇不含kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、或kpsS中的一种或多种的功能性基因,并且其中所述构建体适于在非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。在一些实施方案中,软骨素是从宿主细胞分泌的。在一些实施方案中,构建体还不含kfoD、orf3、kfoE、或orf1中的一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中,软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中,基因簇进一步包含kfoG、kfoB、或kfoG和kfoB两者均包含。在一些实施方案中,构建体包含pCX039、pCX044、或pCX092。在一些实施方案中,构建体包含pCX045或pCX048。
本发明涉及一种包含基因簇的构建体,所述基因簇包含选自下组的基因:kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG及其组合,其中所述构建体不含kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、或kpsS中的一种或多种的功能性基因,并且其中所述构建体适于在非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素或增加软骨素的量。在一些实施方案中,软骨素不从宿主细胞分泌。在一些实施方案中,构建体还不含kfoD、orf3、kfoE、或orf1中的一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中,软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中,构建体包含kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、和kfoG。在一些实施方案中,构建体包含pCX075、pCX081、pCX082、pCX092、pCX101、pBR1102、pBR1100、或pBR1101。在一些实施方案中,构建体包含pCX045或pCX048。
在一些实施方案中,修饰本发明的任一种构建体中的一个或多个基因以获得在细菌宿主细胞中的最佳密码子选择。
在一些实施方案中,本发明的任一种构建体进一步包含启动子。在一些实施方案中,启动子选自下组:Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λpL、PT7、PphoA、ParaC、PxapA,Pcad,和PrecA。在一些实施方案中,启动子为Pm。
在一些实施方案中,本发明的任何构建体进一步包含第二启动子。在一些实施方案中,第二启动子选自下组:Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λpL、PT7、PphoA、ParaC、PxapA、Pcad、和PrecA。在一些实施方案中,第二启动子为Pm。在一些实施方案中,第二启动子在构建体中与一个或多个基因可操作地连接。在一些实施方案中,第二启动子与kpsFEDUCS可操作地连接。
在一些实施方案中,构建体进一步包含xylS调节基因。
在一些实施方案中,本发明的任何构建体进一步包含抗生素抗性基因。在一些实施方案中,抗生素抗性基因选自下组:氯霉素(CamR)、卡那霉素(KanR),氨苄青霉素(AmpR)、四环素(TetR)、博来霉素(BleR)、大观霉素(SpcR)、磺酰胺(SuR)、链霉素(StrR)、羧苄青霉素(CbR)、和红霉素(EryR)。
在一些实施方案中,本发明的任何构建体包含一个K4基因簇。
在一些实施方案中,本发明的任何构建体适于在非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素,其中细菌宿主细胞是或源自选自埃希氏杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的非致病性生物。
本发明涉及一种包含本发明的任何构建体的非致病性细菌宿主细胞。在一些实施方案中,细菌宿主细胞是或者源自选自埃希氏杆菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、甲基单胞菌属、不动杆菌属和鞘氨醇单胞菌属的非致病性生物。在一些实施方案中,细菌宿主细胞是选自下组的细菌菌株:MSC279、MSC280、MSC315、MSC316、MSC317、MSC319、MSC322、MSC323、MSC324、MSC325、MSC326、MSC328、MSC346、MSC347、MSC348、MSC350、MSC356、MSC359、MSC392、MSC402、MSC403、MSC404、MSC405、MSC410、MSC411、MSC436、MSC437、MSC438、MSC439、MSC458、MSC459、MSC460、MSC461、MSC466、MSC467、MSC469、MSC480、MSC494、MSC498、MSC499、MSC500、MSC510、MSC511、MSC522、MSC526、MSC537、MSC551、MSC561、MSC562、MSC563、MSC564、MSC566、MSC567、MSC619、MSC625、MSC627、MSC640、MSC641、MSC643、MSC646、MSC650、MSC656、MSC657、MSC658、MSC659、MSC660、MSC669、MSC670、MSC671、MSC672、MSC673、MSC674、MSC675、MSC676、MSC677、MSC678、MSC679、MSC680、MSC681、MSC682、MSC683、MSC684、MSC687、MSC688、MSC689、MSC690、MSC691、MSC692、MSC693、MSC694、MSC700、MSC701、MSC702、MSC722、MSC723和MSC724。
本发明涉及一种产生软骨素的方法,包括将本发明的任何构建体转移到非致病性细菌宿主细胞中,并在细菌宿主细胞产生软骨素的发酵条件下培养细菌宿主细胞。
本发明涉及一种产生软骨素的方法,包括在足以产生软骨素的发酵条件下培养包含本发明的任何构建体的非致病性细菌宿主细胞。
本发明涉及一种产生非致病性细菌宿主细胞的方法,包括将本发明的任何构建体转移到非致病性细菌宿主细胞中。
在一些实施方案中,在本发明的任何方法中,本发明的任何构建体的基因簇或基因整合到细菌宿主细胞的染色体中。
在一些实施方案中,在本发明的任何方法中,本发明的任何构建体的基因簇或基因的两个或更多个拷贝整合到细菌宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中,所述基因簇或基因的两个或更多个拷贝包括相同基因或基因簇的两个或更多个拷贝。
在一些实施方案中,本发明的任何方法产生的软骨素是非果糖基化的。
在一些实施方案中,本发明的方法进一步包括硫酸化软骨素。
本发明涉及一种产生硫酸软骨素的方法,包括通过本发明的任何方法产生软骨素;和硫酸化软骨素。
在一些实施方案中,在本发明的任何方法中的硫酸化软骨素的过程包括将三氧化硫-三乙胺复合物或氯磺酸与软骨素在甲酰胺中混合。
在一些实施方案中,在任何本发明的方法中的细菌宿主细胞是或源自选自埃希氏杆菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、甲基单胞菌属、不动杆菌属和鞘氨醇单胞菌属的非致病性生物。
在一些实施方案中,在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞是或源自革兰氏阴性生物。
在一些实施方案中,在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞是野油菜黄单胞菌。在一些实施方案中,野油菜黄单胞菌选自下组的细菌菌株:MSC255、MSC256、MSC257、MSC225、和MSC226。
在一些实施方案中,在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞是非致病性的大肠杆菌。在一些实施方案中,非致病性的大肠杆菌选自大肠杆菌K-12和大肠杆菌B。在一些实施方案中,大肠杆菌K-12是选自MSC188和MSC175组成的组的细菌菌株。在一些实施方案中,大肠杆菌B是细菌菌株MSC364。
在一些实施方案中,通过同源重组缺失或灭活在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞的内源基因。
在一些实施方案中,在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞不表达对宿主细胞是内源性的胞外多糖。
在一些实施方案中,在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞适合从实验室克隆菌株的接合转移。
在一些实施方案中,本发明的方法进一步包括从细菌宿主细胞回收软骨素。
在一些实施方案中,本发明的方法进一步包括从细胞外培养基回收软骨素。
在一些实施方案中,从在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞在24-72小时内分泌1g/L-50g/L的软骨素。在一些实施方案中,从细菌宿主细胞在24-72小时内分泌5g/L-50g/L的软骨素。在一些实施方案中,从细菌宿主细胞在24-72小时内分泌15g/L-50g/L的软骨素。
在一些实施方案中,本发明的任何方法进一步包括纯化软骨素。
在一些实施方案中,在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞在25℃-37℃下培养。
在一些实施方案中,在本发明的任何方法中的细菌宿主细胞在包含甘油的培养基中培养。
本发明涉及由本发明的任何方法产生的软骨素。
本发明涉及包含本发明的任何方法产生的软骨素的组合物。
本发明涉及结合选自下组的氨基酸序列的抗体或抗体片段:SEQIDNO:92的KpsF、SEQIDNO:93的KpsE、SEQIDNO:94的KpsD、SEQIDNO:95的KpsU、SEQIDNO:96的KpsC、SEQIDNO:97的KpsS、SEQIDNO:91的KpsT、SEQIDNO:83的KfoA、SEQIDNO:84的KfoB、SEQIDNO:85的KfoC、SEQIDNO:86的KfoI(Orf3)、SEQIDNO:87的KfoE、SEQIDNO:88的KfoH(Orf1)、SEQIDNO:89的KfoF、和SEQIDNO:90的KfoG。
附图简述
图1A显示了软骨素和硫酸软骨素的结构。图1B显示了硫酸软骨素和蛋白聚糖的核心蛋白之间的连接。
图2显示了如本发明之前提出的大肠杆菌K4荚膜合成中所涉及的基因簇的组成。在该图中所示区域2的组成是如Ninomiya等(J.Biol.Chem.2002;277:21567-21575)所描述。大肠杆菌K4荚膜基因簇的区域1和区域3在本发明之前未测序而因此在本发明之前它们的结构是未知的。
图3显示了本发明人对Ninomiya等(J.Biol.Chem.2002;277:21567-21575)所描述的大肠杆菌K4荚膜区域2序列(AB079602)的分析。图3A显示存在额外的推定编码序列orf1、orf2和orf3,并进一步显示基于大肠杆菌K4与多杀巴斯德氏菌血清型B和E的区域2的序列比对;来自大肠杆菌K4的基因(比对数据如图3B所示),kfoD、orf3、kfoE、orf1与多杀巴斯德氏菌M1404血清型B基因bcbDEFG和多杀巴斯德氏菌P1234血清型E基因ecbDEFG之间具有同源性。同源物由双头箭头连接。
图4涉及本发明人确定的大肠杆菌K4菌株ATCC23502的区域2基因的序列。图4A列出了本发明人确定的序列与先前Ninomiya等报道的序列相比之间的差异。图4B显示了本发明人确定的区域2基因序列编码的预测氨基酸序列(如图4B所示的SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:26、SEQIDNO:24、和SEQIDNO:20)与Ninomiya等报道的序列编码的氨基酸序列(在图4B所示的K4KfoputORF2和K4KfoG_BAC00518;K4KfoputORF_1;K4KfoE_BAC00520;K4KfoD_BAC00521;K4KfoB_BAC00524)的比较。
图5显示了大肠杆菌K4菌株U1-41的K4荚膜基因簇的组成。该基因簇包含17个预测编码蛋白的开放阅读框(除IS2以外)。
图6示意性代表了构建为3个片段,kpsFEDUCS(“FS片段”)、kpsMTkfoABCFG(“MG片段”)和kfoDIEH(“DH片段”)的合成基因的结构。如所描绘的,限制性位点整合在策略性定位以允许将成合成的片段装配到一个或多个操纵子并利于单个基因的操纵。
图7A显示了用于通过缺失特定基因或基因簇构建衍生细菌菌株的popin,pop-out策略。图7B显示了此策略中用于在野油菜黄单胞菌中实施这一策略的自杀载体pCX027(SEQIDNO:141)的图谱。
图8A-8U代表了本发明的质粒和DNA片段pBHR1、pDD39、pDD42、pDD47、pREZ6、pDD49、pJ201:11352、pDD50、pDD54、pJ241:10662、pJ241:10664、pJ241:10663、pDD37、pDD38、pDD51、pDD52、pDD57、pDD58、pDD61、pDD62、pDD63、pDD59、pDD67、pDD60、pDD66、pBR1052、pMAK-CL、pDD74、pDD76、pDD73、pDD77、pDD79、pDD80、pCX045、pCS048、pCX039、pCX044、pCX040、pCX042、pCX041、pCX043、MSC467、MSC561和pBR1087的DNA图谱。
图9显示了使用针对大肠杆菌K42组荚膜基因簇编码蛋白的抗血清进行的Western印迹的结果的举例。
图10A-10D显示了用于将克隆的大肠杆菌K4软骨素生物合成基因引入野油菜黄单胞菌的质粒构建体的DNA图谱。
图11A显示了抑制性ELISA中测量的典型的K4果糖基化的软骨素荚膜多糖(“K4P”)的校准曲线。图11B显示了在用于软骨素的软骨素酶/HPLC测定中测量的典型的二糖,2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-(β-D-葡萄糖-4-烯吡喃糖基糖酮酸)-D-半乳糖(“Δdi-0S”)的标准曲线。
图12显示了软骨素酶的重组软骨素消化率。
图13显示了软骨素酶的K4果糖基化的软骨素荚膜多糖(K4P)和去果糖基化的K4P(DFK4P)的消化率。
图14A-14X显示了本发明的质粒构建体pCX096、pCX097、pCX100、pCX101、pCS102、pCX075、pCX082、pCX081、pCX092、pBR1077、pBR1082、pCX050、pCX070、pCX093、pCX094、pCX095、pMAK705p1、pBR1103、pBR1093lacZ、pBR100-lac、pBR1094mt1、pBR1101-mt1、pBR1095fru和pBR1102-fru的DNA图谱。
图15显示了产生软骨素的大肠杆菌菌株的家族树和用于菌株衍生化的步骤。
发明详述
本发明涉及用于产生软骨素的构建体和重组细胞,产生软骨素的方法,从所述方法产生的软骨素以及软骨素的用途。如本文所述,本发明是基于一种允许产生软骨素和硫酸软骨素的新技术。本发明通过以更低的成本却提供更优的产品质量,提供一种安全、稳定、且可靠的软骨素和硫酸软骨素供应,来满足本领域的一个重要需求。此过程还可以提供一种素食的和合乎犹太教规定的(kosher)产品。重组产生的软骨素可以使用已知的方法硫酸化以形成硫酸软骨素。因此,本发明包括硫酸化重组产生的软骨素的方法,重组产生的硫酸软骨素产品,以及重组产生的硫酸软骨素产品的用途。
如下面详细描述的,本发明人测序了编码参与大肠杆菌K4果糖基化的软骨素荚膜多糖(K4P)生物合成的蛋白的大肠杆菌K4基因簇的序列,基于天然序列合成和装配了DNA片段,将这些基因转移到适于大规模发酵的替代的宿主细胞,并证明了在这些宿主细胞中重组果糖基化的软骨素荚膜多糖的产生。由于替代的宿主细胞应产生非-果糖基化的软骨素是优选的,确定了大肠杆菌K4负责软骨素果糖基化的基因,并将其从转移到替代宿主的大肠杆菌K4软骨素生物合成基因集中缺失。结果是含有该基因集的替代宿主产生了非-果糖基化的软骨素。替代宿主产生的该重组软骨素(rCH)可以硫酸化以产生硫酸软骨素产品。
如本文所用的,术语“K4P”指由野生型大肠杆菌K4菌株合成的天然的或天然存在的果糖基化的软骨素荚膜多糖。术语“软骨素”指软骨素骨架。软骨素可以是果糖基化的或未果糖基化的(或非果糖基化的)。除非特别指出,如本文所用的术语“软骨素”包括果糖基化的和未果糖基化的两种形式。此外,如本文所用的,术语软骨素指未硫酸化的软骨素。本发明的方法产生的软骨素可以通过酶学或化学方式硫酸化,如下面详细说明的,在此情况下,将其称为硫酸软骨素。
在一个方面中,本发明包含含有大肠杆菌K4基因集或基因簇的DNA构建体。如本文所述的术语“K4基因簇”指大肠杆菌K4的涉及软骨素样荚膜多糖(K4P)生物合成的基因的集合。术语“K4基因簇”可以指大肠杆菌K4涉及软骨素样荚膜多糖生物合成的所有基因或这些基因的一个子集。
如实施例1详细描述的,大肠杆菌K4包含涉及称为K4P的软骨素样荚膜多糖合成的多基因的集合。如上面指出的,该多糖由通过加入果糖残基修饰的软骨素骨架组成。如图2所示,这些基因组织在三个主要区域(区域1(“Rl”)、区域2(“R2”)、和区域3(“R3”))中。基于Ninomiya等(2002)描述的区域2的序列(GenBank登录号AB079602),预测区域2包含7个与荚膜生物合成相关的基因,kfoA、kfoB、kfoC、kfoD、kfoE、kfoF和kfoG。Ninomiya等没有披露预期的大肠杆菌K4荚膜基因簇区域1和区域3部分的序列。然而,根据已知的其它大肠杆菌荚膜基因簇的组成,预测区域1会包含6个基因,kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS且预测区域3会包含2个基因,kpsM和kpsT。kpsM、kpsT、kpsD、kpsE、kpsC和kpsS基因编码将荚膜多糖从细胞质易位到细胞表面所需的蛋白,认为在细胞表面成熟的荚膜多糖通过与该膜的脂质成分的共价键锚定到外部细胞膜上(Whitfield,2006)。kpsF和kpsU基因编码预期催化CMP-Kdo生物合成中的步骤的蛋白。已经提出了大肠杆菌中CMP-Kdo在软骨素荚膜生物合成中的功能(Roberts,Annu.Rev.Microbiol.1996;50:285-315),但尚未得到实验证实(Whitfield,2006)。因此,在本发明披露之前认为整个K4基因簇包含15个基因。
为了确认Ninomiya等报道的序列(GenBank登录号AB079602),本发明人测序了大肠杆菌K4菌株ATCC23502的K4荚膜基因簇区域2。当将本发明人确定的序列和AB079602序列进行比较时,发现了多个单碱基对差异,包括在26个位置的取代、缺失和插入。如实施例1中详细说明的,这些差异中的一些导致在基因簇编码的区域2蛋白的预测氨基酸序列中的实质差异。此外,本发明人检测了Ninomiya等确定的作为分离基因的间隔序列的区域并确定了在之前未确定的区域2中的三个额外的开放阅读框orf1(本文也称为kfoH),orf2和orf3(本文也称为kfoI)。
为了确定包含所有三个区域的基因的整个K4基因簇的正确序列,从StatensSerumInstitut(Copenhagen,Denmark)获得了大肠杆菌血清型K4菌株U1-41。U1-41是ATCC23502菌株的前体并已经报道在培养中产生K4荚膜多糖。它也是用于大肠杆菌血清分型的K4参考菌株并由Rodriguez等(1988)用于产生用于K4P结构测定的多糖制备物。对在大肠杆菌U1-41中跨越K4荚膜基因簇的共约23kb的DNA进行了测序。该序列(SEQIDNO:117)证实了区域1中kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC和kpsS基因的存在和区域3中kpsM和kpsT基因的存在。发现U1-41的区域2序列和本发明人确定的ATCC23502的区域2序列是相同的。
如实施例1中详细描述的,发现U1-41的基因簇含有(除IS2序列以外)17个预测编码软骨素生物合成相关蛋白的开放阅读框(而不是如Ninomiya等先前描述的15个)。这些基因的排列对于大肠杆菌2组荚膜基因簇是典型的。包含保守的基因kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC和kpsS的区域1和包含保守的基因kpsM和kpsT的区域3在区域2的9个开放阅读框的两侧。区域1和区域3的基因包含大肠杆菌中所有2组荚膜的合成和易位所需的蛋白。区域1还包含两个编码酶的基因(kpsF和kpsU),如上文指出的,预测该酶催化CMP-Kdo生物合成中的步骤。在区域2中确定的9个基因中,3个编码具有明确荚膜生物合成相关活性的蛋白:kfoA(UDP-GlcNAc差向异构酶,转化UDP-GlcNAc为UDP-GalNAc前体),kfoF(UDP-Glc-脱氢酶,转化UDP-Glc为UDP-GlcUA前体)和kfoC(软骨素合酶,即聚合酶,它可以将任一前体,UDP-GalNAc或UDP-GlcUA添加到受体软骨素分子上)。
存在于K4荚膜基因簇的区域2中的其他基因kfoB、kfoG、kfoD、kfoE、kfoH(orf1)和kfoI(orf3)编码的蛋白的功能是未知的。kfoB和kfoG基因编码与已知产生其他葡糖胺聚糖(GAG)荚膜的细菌,例如多杀巴斯德氏菌血清型A、F和D(Townsend等,J.Clin.Microbiol.2001;39:924-929)和大肠杆菌血清型K5(Petit等,Mol.Microbiol.1995;4:611-620)的荚膜簇中存在的基因编码的蛋白同源的蛋白。这些间接证据表明kfoB和kfoG能够在含GAG的K4荚膜的生物合成中发挥功能。如在实施例7中详细解释的,本发明人已经发现kfoB和kfoG基因不是在大肠杆菌中产生软骨素必需的,但kfoG基因是软骨素的最优产生所必需的。
在本发明之前,没有证据表明kfoD、kfoE、kfoH(或者orf1)和kfoI(或orf3)参与K4荚膜的生物合成。有趣的是,发现4个连续的K4基因,kfoD、kfoI(或orf3)、kfoE、和kfoH(或orf1)与连续的多杀巴斯德氏菌血清型B基因bcbDEFG和多杀巴斯德氏菌血清型E基因ecbDEFG具有同源性。但是,在本发明之前不知道这两个巴斯德氏菌属菌株是软骨素产生者,也不知道这些基因在大肠杆菌K4中的功能。因此,看来kfoD、kfoI(orf3)、kfoE和kfoH(orf1)可能不参与软骨素合成。如实施例6和7所示,这些基因都不是软骨素生物合成所需的,但这些基因中的一种或多种对于K4基因集产生的软骨素的果糖基化是必不可少的。
用U1-41K4荚膜基因簇的序列为基础,本发明人进一步设计了合成的基因,为在宿主,例如大肠杆菌、野油菜黄单胞菌、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaselodea)和枯草芽孢杆菌中表达对这些基因进行了密码子优化。这些密码子优化的基因的设计和合成在实施例2中详细解释。实施例4描述了为在异源细菌中表达这些基因的质粒载体的构建。
本发明中密码子优化的基因的完整的核苷酸序列和它们所编码的氨基酸序列如下所示。本发明中使用的kpsF的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:1所示。kpsF是一个981核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个327个氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:2所示。本发明中kpsE的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:3所示。kpsE是一个1146核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个382氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:4所示。本发明中kpsD的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:5所示。kpsD是一个1674核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个558氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:6所示。本发明中kpsU的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:7所示。kpsU是一个738核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个246氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:8所示。本发明中kpsC的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:9所示。kpsC是一个2025核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个675氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:10所示。本发明中kpsS的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:11所示。kpsS是一个1209核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个403氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:12所示。本发明中kpsM的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:13所示。kpsM是一个774核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个258氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:14所示。本发明中kpsT的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:15所示。kpsT是一个666核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个222氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:16所示。本发明中kfoA的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:17所示。kfoA是一个1017核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个339氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:18所示。本发明中kfoB的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:19所示。kfoB是一个1638核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个546氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:20所示。本发明中kfoC的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:21所示。kfoC是一个2058核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个686氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:22所示。本发明中kfoD的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:23所示。kfoD是一个1431核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个477氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:24所示。本发明中kfoE的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:25所示。kfoE是一个1566核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个522氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:26所示。本发明中kfoF的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:27所示。kfoF是一个1167核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个389氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:28所示。本发明中kfoG的完整核苷酸序列如本文SEQIDNO:29所示。kfoG是一个1464核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个488氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:30所示。
orf1(本文也称为kfoH)的完整核苷酸序列在本文中如SEQIDNO:31所示。orf1是一个723核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个241氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:32所示。orf3(本文也称为kfoI)的完整核苷酸序列在本文中如SEQIDNO:33所示。orf3是一个378核苷酸的序列(不包括终止密码子),其编码一个126氨基酸的序列,在本文中如SEQIDNO:34所示。
在多个实施方案中,本发明包括DNA构建体,其包含大肠杆菌K4基因簇、大肠杆菌K4基因簇的一个或多个区域、大肠杆菌K4基因簇的基因的一个或多个子集、大肠杆菌K4基因簇的一个或多个单独基因、及其组合,其中所述构建体用于产生软骨素或在细菌宿主细胞中增加软骨素的量。在多个实施方案中,构建体可以包括上述的全部17个基因簇或上述17基因簇的一个或多个基因,即kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kpsM、kpsT、kfoA、kfoB、kfoC、kfoD、kfoE、kfoF、kfoG、kfoH和kfoI。在一些实施方案中,该构建体包含K4簇的一个或多个区域(即,本文所述的区域1、2和/或3)。在一些实施方案中,该构建体包含K4簇基因的一个或多个子集(包括本文所述的区域1、2和/或3的基因的子集)。该构建体可以包含基因簇,在簇中的基因是以相对于簇中任意其他基因的任意顺序存在的。正因如此,构建体内基因簇中的基因的顺序可以与K4簇中基因的天然存在顺序不同。类似地,构建体可以包含K4簇的一个区域、一个基因的子集、或一个基因,它们可以在构建体中以相对于K4簇任意其他区域、基因子集或单个基因的任意顺序存在。在一些实施方案中,基因在构建体中以特定顺序存在。构建体可以包含一个或多个分离自上面提到的大肠杆菌血清型K4菌株U1-41的天然基因(即具有存在于大肠杆菌K4U1-41或其它血清型K4菌株中的序列的基因)和/或一个或多个合成的基因,即基于分离自U1-41的天然基因的基因,但其中的DNA序列已经进行修饰以在细菌宿主细胞中获得最佳密码子选择而且不改变这些基因编码的氨基酸序列。这种合成基因的设计和制备在实施例2中说明。
如上所述和在实施例6和7中进一步详细说明的,kfoD、kfoI、kfoE和kfoH基因中的一种或多种对于在大肠杆菌中果糖基化软骨素是必不可少的,但是这些基因都不是合成软骨素所需的。同时删除或灭活所有这四种基因导致产生未果糖基化的软骨素。在一些实施方案中,本发明的构建体不含kfoD、kfoI、kfoE和kfoH中的一种或多种的功能性基因。换言之,在这些实施方案中,构建体中不存在kfoD、kfoI、kfoE和kfoH中的一种或多种的功能性基因。不含功能性基因的构建体(即不存在某功能性基因的构建体)包括其中整个基因不存在的构建体,以及其中的基因或其部分存在但是非功能性(即无效的)的构建体。在一些实施方案中,本发明的构建体包含已经修饰以灭活kfoD、kfoI、kfoE和kfoH中的一个或多个的基因簇。
在一些实施方案中,本发明还包括构建体,其包含含有kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kfoA、kfoC和kfoF的基因簇,其中所述构建体不含kfoD、kfoI、kfoE和kfoH中的一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中,构建体适于在如本文所述的非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。在一些实施方案中,软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中,构建体可以进一步包含kfoG和/或kfoB。如上所述,没有发现kfoB和kfoG基因是产生软骨素必不可少的,但是发现kfoG基因是最优产生软骨素所必需的(参见实施例7)。在一些实施方案中,本发明的构建体可以进一步包含kpsM和/或kpsT。
在一些实施方案中,构建体用于产生从细胞中分泌的重组软骨素。
在一些实施方案中,这些构建体包括表达载体pDD66(含kpsMT-kfoABCFG-kpsFEDUCS的表达载体)、pDD67(包含kpsFEDUCS-kpsMT-kfoABCFG的表达载体)、pCX040(包含kpsMT-kfoACFG-kpsFEDUCS的表达载体)、pCX041(包含kpsMT-kfoABCF-kpsFEDUCS的表达载体)、pCX042(包含kpsFEDUCS-kpsMT-kfoACFG的表达载体)、pCX043(包含kpsFEDUCS-kpsMT-kfoABCF的表达载体)和pCX096(包含kpsFEDUCS-kfoABCFG的表达载体)。另一个实施方案是表达质粒pBR1052。如实施例4中描述的,pBR1052包含与pDD66(kpsMT-kfoABCFG-kpsFEDUCS)相同的K4基因集,并额外具有插入kpsF基因紧邻上游的Pm启动子序列的第二拷贝。pDD66的核苷酸序列如SEQIDNO:35所示;pDD67的核苷酸序列如SEQIDNO:36所示;pCX040的核苷酸序列如SEQIDNO:37所示;pCX041的核苷酸序列如SEQIDNO:38所示;pCX042的核苷酸序列如SEQIDNO:39所示;pCX043的核苷酸序列如SEQIDNO:40所示;pCX096的核苷酸序列如SEQIDNO:149所示;和pBR1052的核苷酸序列如SEQIDNO:41所示。这些DNA构建体的设计和构建在实施例4中详细说明。
在一些实施方案中,本发明包括构建体,其用于产生细胞内软骨素的目的,即不从宿主细胞分泌的软骨素。软骨素的胞内产生是可取的以消除培养基中高水平多糖导致的发酵的粘度。此外,与分泌相比细胞内产生可能实现更高水平的软骨素。在一些实施方案中,构建体不含区域3的kpsM和kpsT中至少一种的功能性基因。在一些实施方案中,构建体包含基因簇,其不含或已经修饰以灭活区域3的kpsM和kpsT中至少一种。在一些实施方案中,构建体不含区域1的kpsE、kpsD、kpsC和kpsS中至少一种的功能性基因。在一些实施方案中,构建体包含基因簇,其不含或已经修饰以灭活区域1的kpsE、kpsD、kpsC和kpsS中至少一种。在一些实施方案中,构建体不含区域3的kpsM和kpsT中至少一种和区域1的kpsE、kpsD、kpsC和kpsS中至少一种的功能性基因。在一些实施方案中,构建体包含一个基因簇,其不含或已经修饰以灭活区域3的kpsM和kpsT中至少一种和区域1的kpsE、kpsD、kpsC和kpsS中至少一种。这些构建体在实施例4和9中描述。
在一些实施方案中,本发明包括构建体,其包含含有kfoA、kfoC和kfoF的基因簇,其中所述基因簇不含kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、和kpsS中的一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中,构建体适于在如本文所述的非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。在一些实施方案中,软骨素不从宿主细胞分泌。在一些实施方案中,软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中,构建体也不含kfoD、orf3、kfoE和orf1中的一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中,构建体可以进一步包含kfoG和/或kfoB。在一些实施方案中,构建体包含kfoA、kfoB、kfoC、kfoF和kfoG。
在一些实施方案中,本发明的构建体包含选自kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG、及其组合的基因,其中所述构建体不含kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC和kpsS中一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中,构建体适于在如本文所述的非致病性细菌宿主细胞中产生软骨素。在一些实施方案中,构建体适于在如本文所述的非致病性细菌宿主细胞中增加软骨素的量。在一些实施方案中,将构建体转移至细菌宿主细胞,其包含一个或多个已经存在的大肠杆菌K4基因簇拷贝、簇的区域、簇的基因子集、或已经整合到宿主染色体中的簇的基因。在一些实施方案中,软骨素是非果糖基化的。在一些实施方案中,构建体也不含kfoD、orf3、kfoE和orf1中一种或多种的功能性基因。在一些实施方案中,构建体包含kfoA、kfoB、kfoC、kfoF和kfoG。
在一些实施方案中,本发明的构建体包含表达载体pCX039(包含kfoABCFG的表达载体)、pCX044(包含表达载体的kfoACFG)、pCX092(包含kfoABCF的表达载体)、pCX045(包含kpsMT-kfoABCFG-kpsFEDUS的表达载体)和pCX048(包含kpsM-kfoABCFG-kpsFEDUCS的表达载体)。pCX039的核苷酸序列如SEQIDNO:42所示;pCX044的核苷酸序列如SEQIDNO:43所示;pCX092的核苷酸序列如SEQIDNO:154所示;pCX045的核苷酸序列如SEQIDNO:44所示;和pCX048的核苷酸序列如SEQIDNO:45所示。这些DNA构建体的设计和构建在实施例4中详细说明。
在一些实施方案中,本发明的构建体包含表达载体pCX075(包含kfoABFG的表达载体)、pCX081(包含kfoABCG的表达载体)、pCX082(包含kfoBCFG的表达载体)、pCX101(包含kfoABCFG-kpsMT的表达载体)、pBR1102(包含kfoABCFG的表达载体)、pBR1100(包含kfoABCFG的表达载体)和pBR1101(包含kfoABCFG的表达载体)。pCX075的核苷酸序列如SEQIDNO:153所示;pCX081的核苷酸序列如SEQIDNO:151所示;pCX082的核苷酸序列如SEQIDNO:152所示;pCX101的核苷酸序列如SEQIDNO:150所示;pBR1102的核苷酸序列如SEQIDNO:170所示;pBR1100的核苷酸序列如SEQIDNO:171所示;和pBR1101的核苷酸序列如SEQIDNO:172所示。这些DNA构建体的设计和构建在实施例18和20中详细说明。
本发明的构建体可以包含一种或多种已经进行修饰以在如本文所述的细菌宿主细胞中获得最佳密码子选择的基因。
本发明的构建体可以进一步包含启动子。启动子应该能够在如本文所述的细菌宿主细胞中驱动基因簇的表达。许多这类用于在所需的细菌宿主细胞驱动表达的启动子是本领域技术人员熟知的并可用于本发明。已经通常用于表达异源蛋白的启动子的例子,包括但不限于,Pm、lac、trp、tac、λpL、T7、phoA、araC、xapA、cad和recA(参见,例如,Weikert等,Curr.Opin.Biotechnol.1996;7:494-499)。这样的启动子可以是组成型或诱导型的。终止控制区也可以是来自于优选的宿主天然的各种基因。任选地,终止位点可以是不必要的。
在一些实施方案中,本发明的构建体包含Pm启动子以及xylS调节基因(Mermod等,J.Bacteriol.1986;167:447-54)。分离自恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)TOL质粒的Pm启动子和它的调节基因xylS提供了一种在多种革兰氏阴性细菌中显示功能的强的、调节良好的启动子(Blatny等,Plasmid1997;38:35-51)。XylS蛋白可以作为单体或二聚体存在。在二聚体形式中,XylS蛋白可以结合Pm启动并刺激转录。某些效应分子,例如直接结合XylS并促进该蛋白二聚化的间苯甲酸(3-苯甲酸甲酯)(meta-toluicacid(3-methylbenzoate)),提高XylS蛋白质的二聚化以及由此在Pm启动子的转录起始(Dominguez-Cuevas等,J.Bact.2008;190:3118-3128)。启动子可以与基因簇的一个或多个基因可操作地连接。
本发明的构建体可以进一步包含第二启动子。例如,如果在替代宿主中分析克隆的K4基因的表达分析表明某一基因或基因集的表达水平低于最佳,可以在选择的位点对表达构建体添加第二启动子以增强不是在最佳水平表达的基因或基因集的转录。通常情况下,添加的启动子将插入感兴趣的基因或基因集的紧邻上游(即5'-)。第二启动子可以是Pm或上面所列的作为用于表达K4基因集的例子的任何启动子。在一些实施方案中,第二启动子可以是Pm。第二启动子可以与基因簇的一个或多个基因可操作地连接。在一个实施方案中,第二启动子可以与kpsFEDUCS基因集可操作地连接。参见,例如,如实施例4中描述的表达载体pBR1052。对于任何给定的质粒或染色体基因集,通过Western印迹分析凭经验确定使用第二启动子可以利于表达或增加其表达的基因或基因的组合。
本发明的构建体可以进一步包含赋予特定抗生素抗性的抗生素抗性基因。这样的基因是本领域公知的。抗生素抗性基因的例子,包括但不限于,氯霉素抗性基因(CamR)、卡那霉素抗性基因(KanR),氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)、大观霉素抗性基因(SpcR)、磺酰胺抗性基因(SuR)、博来霉素抗性基因(BleR)、链霉素抗性基因(StrR)、羧苄青霉素抗性基因(CbR)、和红霉素抗性基因(EryR)。
本发明的构建体是用于在细菌宿主细胞中产生软骨素。虽然可以在本发明中使用任意细菌细胞作为宿主细胞,在一些实施方案中,宿主是革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌的例子包括但不限于埃希氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、甲基单胞菌属、不动杆菌属和鞘氨醇单胞菌属。在一些实施方案中,宿主是非致病性的革兰氏阴性细菌。非致病性革兰氏阴性细菌的例子包括但不限于非致病性大肠杆菌,例如大肠杆菌K-12或大肠杆菌B、野油菜黄单胞菌、少动鞘氨醇单胞菌和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。
在一些实施方案中,通过同源重组缺失或灭活本文所述的细菌宿主细胞的内源基因。
无法制造自己的天然胞外多糖的宿主衍生物是需要的。使用这种衍生物宿主将利于重组软骨素(rCH)生物合成的可视和化学鉴定,以及当引入K4基因集时,宿主产生的rCH的纯化。此外,在适当设计的衍生物宿主中的rCH生物合成不会受到天然多糖合成竞争的限制。例如,灭活或缺失天然多糖生物合成途径的第一糖基转移酶基因会防止利用天然途径的任何潜在脂质载体并防止在天然途径的酶与脂质载体的K4酶,或与作用于新生多糖链并可能限制利用度的任意其他细胞组分之间的竞争。整个天然生物合成基因簇的失活(如通过缺失)将去除大多数的竞争因素,但可能会对生理和/或膜结构产生不良影响。
如实施例3中详细描述的,通过举例的方式但不限于这些例子,本发明使用大肠杆菌K-12(“K-12”)、大肠杆菌B(“EcB”)、和野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestrispv.campestris)(“Xcc”)作为宿主表达本发明的构建体。利用如实施例3详细描述的两个步骤的“pop-in/pop-out”同源性驱动的方法进行在编码合成天然胞外多糖的酶的基因簇的一个或多个基因中包含缺失的衍生宿主的产生。例如,可拉酸(M抗原)是由许多肠细菌产生的胞外多糖。构建了在可拉酸生物合成方面缺乏的或有缺陷的大肠杆菌K-12和大肠杆菌B菌株。菌株MSC188和MSC175是大肠杆菌K-12菌株的衍生物,其分别包含整个可拉酸操纵子,和编码在可拉酸生物合成中负责将第一个糖加载到脂质载体上的糖基转移酶的wcaJ基因的缺失。菌株MSC364是大肠杆菌B的衍生物,其包含整个可拉酸操纵子的缺失。类似地,构建了在胞外多糖,黄原胶的生物合成方面缺乏的或有缺陷的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种菌株。菌株MSC225和MSC226是Xcc菌株的衍生物,其包含编码糖基转移酶I酶的gumD基因的缺失,而菌株MSC255、MSC256和MSC257包含整个黄原胶操纵子的缺失。
本发明涉及一种产生包含任何一种或多种本发明的构建体的非致病性细菌宿主细胞的方法,其包括将任何一种或多种本发明的构建体转移至非致病性细菌宿主细胞。可以通过任何已知的表达存在于构建体中的基因的方法,将本发明的构建体引入到细菌宿主细胞中。这样的方法可包括但不限于转化、电穿孔、接合或转导。
本发明涉及非致病性细菌宿主细胞,其包含任何一种或多种本发明的构建体。正因如此,本发明也包括通过将包含本发明的表达载体的构建体引入宿主菌株,包括有缺失的衍生菌株,来构建的各种菌株。在实施例6-9、11、13和14中详细描述了某些例子。
在一些实施方案中,将本发明的构建体中含有的基因导入受体宿主菌株的染色体中使得基因整合到宿主染色体中。将克隆的基因置于染色体中提供以下优点:消除了保持选择压力以保持携带软骨素生物合成基因的质粒或载体的要求,从而能潜在地提供更稳定的表达菌株或提供在没有任何选择压力的情况下是稳定的表达菌株。相应地,本发明包括包含本发明的构建体中含有任何一种或多种基因的一个或多个拷贝整合到其染色体中的细菌菌株。
作为示例,本发明人构建了包含整合到其染色体中用于软骨素生物合成的一个或多个合成的基因的大肠杆菌K-12和Xcc菌株。本发明也包括通过将包含本发明的表达载体的构建体引入包含整合到其染色体的构建体的一个或多个拷贝的本发明的菌株构建的菌株。
在一些实施方案中,使用本发明的构建体和本文所述的方法,将K4基因簇、簇的一个或多个区域、簇的基因的一个或多个子集、或簇的一个或多个基因整合到如本文所述的非致病性细菌宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中,将基因簇、区域、子集或基因的两个或更多个拷贝整合到非致病性细菌宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中,将基因簇、区域、子集或基因的2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3个拷贝整合到非致病性细菌宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中,将基因簇、区域、子集或基因的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个拷贝整合到非致病性细菌宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中,使用相同的构建体将两个或更多个拷贝整合到宿主染色体中。在一些实施方案中,使用不同的构建体将两个或更多个拷贝整合到宿主染色体中。在一些实施方案中,也将启动子整合到宿主染色体中以控制整合到宿主染色体中的基因簇、区域、子集、或基因的表达。在一些实施方案中,整合到宿主染色体中的两个或更多个拷贝从相同的启动子或不同的启动子表达。在一些实施方案中,将选自kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG及其组合的区域2基因的两个或更多个拷贝整合到宿主染色体中。在一些实施方案中,将kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG的两个或更多个拷贝整合到宿主染色体中。在一些实施方案中,将区域1、区域3、或区域1或区域3的一个或多个基因的两个或更多个拷贝整合到宿主染色体中。在一些实施方案中,将本发明的构建体中含有的基因整合到细菌宿主细胞的染色体中,该宿主细胞也包含一个或多个本发明的构建体,其包含未整合到染色体中的基因。
这样的菌株的例子在实施例10-13和20-21中有详细描述。描述的构建体和菌株可用于产生软骨素。
本发明的菌株的例子包括但不限于,大肠杆菌K-12菌株MSC279、MSC280、MSC322、MSC323、MSC324、MSC325、MSC328、MSC346、MSC356、MSC359、MSC392、MSC402、MSC403、MSC404、MSC405、MSC410、MSC411、MSC436、MSC437、MSC438、MSC439、MSC458、MSC459、MSC460、MSC466、MSC467、MSC498、MSC499、MSC500、MSC510、MSC511、MSC522、MSC526、MSC537、MSC551、MSC561、MSC562、MSC563、MSC564、MSC566、MSC567、MSC619、MSC625、MSC627、MSC640、MSC641、MSC643、MSC646、MSC650、MSC656、MSC657、MSC658、MSC659、MSC660、MSC669、MSC670、MSC671、MSC672、MSC673、MSC674、MSC675、MSC676、MSC677、MSC678、MSC679、MSC680、MSC681、MSC682、MSC683、MSC684、MSC687、MSC688、MSC689、MSC690、MSC691、MSC692、MSC693、MSC694、MSC700、MSC701、MSC702、MSC722、MSC723和MSC724;大肠杆菌B菌株MSC315、MSC316、MSC317、MSC319和MSC347;和野油菜黄单胞菌菌株MSC326、MSC348、MSC350、MSC480、MSC461、MSC469和MSC494。
本发明涉及一种产生软骨素的方法,包括将任何一种或多种本发明的构建体转移到非致病性细菌宿主细胞中,并在发酵条件下培养细菌宿主细胞,其中软骨素由细菌宿主细胞产生。
本发明涉及一种产生软骨素的方法,包括在足以产生软骨素的发酵条件下培养包含任何一种或多种本发明的构建体的非致病性细菌宿主细胞。
本发明包括一种产生未硫酸化的软骨素的方法。该方法包括在足以产生未硫酸化的软骨素的发酵条件下培养本发明的非致病性细菌宿主细胞。在一些实施方案中,该方法包括将本发明的构建体转移至非致病性细菌宿主细胞并在发酵条件下培养细菌宿主细胞,导致细菌宿主细胞产生未硫酸化的软骨素。
在实施例7-15中描述了各种实施方案。具体而言,实施例6-9、11、13和14展示了当本发明的构建体转化到宿主细胞中时证明产生软骨素的数据,而实施例10-15展示了当本发明的构建体整合到宿主细胞染色体中时证明产生软骨素的数据。
依赖于特定构建体和其中基因的组合,产生果糖基化或非果糖基化的软骨素是可能的(参见实施例6和7)。此外,依赖于特定构建体和其中基因的组合,重组软骨素可以被分泌到培养基中或保留在胞内位置(参见实施例9)。
培养细菌细胞的方法和培养基的组成在本领域中是公知的并可用于本发明。为了重组软骨素的最优产生,应优化各种培养参数,例如温度、pH值、溶解氧浓度、诱导剂浓度和培养诱导后的持续时间,以及包括其中营养物质和盐含量的培养基的组成。实施例8描述了在各种生长培养基、温度和诱导条件下软骨素的重组产生。基于此信息,进一步优化这些参数对于本领域技术人员将是显而易见的。在一些实施方案中,细菌宿主细胞培养在20°C-37°C,例如20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C或37°C。在一些实施方案中,培养基含有酵母提取物、蛋白消化物、磷酸钾和水。在一些实施方案中,培养基含有甘油(glycerine)(也称为glycerol)。在一些实施方案中,在24-72小时内从细菌宿主细胞分泌1g/L-50g/L、5g/L-50g/L或15g/L-50g/L的未硫酸化的软骨素。
在一些实施方案中,本发明的产生软骨素的方法进一步包括从细菌宿主细胞中回收软骨素。
在一些实施方案中,本发明的产生软骨素的方法进一步包括从细胞外培养基中回收软骨素。可以通过醇沉淀或本领域中已知的任何技术从发酵液中回收软骨素,包括但不限于冻干,以获得干燥粉末。
在一些实施方案中,产生软骨素的方法可以包括纯化回收的软骨素的步骤。软骨素的纯化可以通过本领域已知的任何技术完成,包括,例如碱处理、酸处理、蛋白酶处理、层析、提取、溶剂提取、膜分离、电渗析、反渗透、蒸馏、沉淀、化学衍生、结晶、超滤和/或使用有机溶剂的多糖沉淀。参见,例如,Taniguchi,N.,1982.Isolationandanalysisofglycosaminoglycans.Pages20-40in:GlycosaminoglycansandProteoglycansinPhysiologicalandPathologicalProcessofBodySystems.R.S.Varma和R.Varma,ed.Karger,Basel,Switzerland;Fraquharson等,Oral.Microbiol.Immunol.2000;15:151-157;Manzoni等,J.Bioact.Comp.Polm.1993;8:251-257;Manzoni等,Biotechnol.Letters2000;22:759-766;Johns等,Aust.J.Biotechnol.1991;5:73-77;这些文献中的每一个通过述及整体并入本文。沉淀溶剂的例子包括但不限于丙酮、甲醇、乙醇或异丙醇。
在一些实施方案中,产生软骨素的方法进一步包括硫酸化软骨素。
本发明涉及一种产生硫酸软骨素的方法,包括由本发明的方法产生软骨素和硫酸化软骨素。
可以化学地或酶学地进行硫酸化。化学硫酸化多糖的几个方法在本领域中是已知的,其中任何一种均可用于本文。例如,硫酸化可以通过将多糖溶解到有机溶剂中,随后在受控温度下与硫酸化剂反应来完成。溶解溶剂的例子包括但不限于甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶或二甲亚砜。硫酸化试剂的例子可以包括但不限于氯磺酸、三氧化硫和各种三氧化硫-胺复合物。适合三氧化硫-胺复合物的胺的例子包括但不限于吡啶、DMF、三甲胺、三乙胺(TEA)和哌啶。在一些实施方案中,在重组软骨素硫酸化时,硫酸化的产品包含与天然硫酸软骨素对应的5.0-7.5%的硫含量。在进一步的实施方案中,硫酸化产物不发生显著的解聚。实施例15描述了一种化学硫酸化重组软骨素的方法。在一些实施方案中,硫酸化本发明的方法产生的软骨素包括在甲酰胺中将三氧化硫-三乙胺复合物或氯磺酸与软骨素混合。
本发明涉及通过任何本发明描述的方法产生的重组软骨素或重组硫酸软骨素。
本发明涉及一种组合物,该组合物包含通过任何本发明描述的方法产生的重组软骨素或重组硫酸软骨素。
在一些实施方案中,组合物可包含如葡糖胺、硫酸葡糖胺或盐酸葡糖胺的补充剂。葡糖胺(2-乙酰氨基-2-脱氧葡萄糖)是一种在软骨中存在的天然存在的化合物。硫酸葡糖胺是在软骨基质和滑液中的糖胺聚糖的一种正常组分。一些临床试验支持在骨关节炎,特别是膝盖治疗中使用硫酸葡糖胺(Herrero-Beaumont等,ArthritisRheum.2007;56:555-67;Bruyere等,OsteoarthritisCartilage2008;16:254-60)。已经提出,通过加强软骨和协助糖胺聚糖的合成,硫酸部分在滑液中提供临床益处(SilbertGlycobiology2009;19:564-567)。在营养补充剂中葡糖胺通常与硫酸软骨素组合提供,旨在促进关节健康和作为骨关节炎的治疗。
在一些实施方案中,本发明包括在患者中保持健康的关节功能的方法。在其它实施方案中,本发明包括用于治疗或预防骨关节炎、间质性膀胱炎和/或滑膜炎的方法。这些方法包括向受试者施用包含上述的重组硫酸软骨素的组合物。本发明的组合物通常可以按治疗有效量施用。
本发明涉及选择性结合K4软骨素生物合成基因簇的基因编码的蛋白的抗体或抗体片段。这些抗体和抗体片段可以用于确认细菌宿主中K4软骨素生物合成基因簇的基因的表达。在一些实施方案中,抗体或抗体片段结合选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:92的KpsF、SEQIDNO:93的KpsE、SEQIDNO:94的KpsD、SEQIDNO:95的KpsU、SEQIDNO:96的KpsC、SEQIDNO:97的KpsS、SEQIDNO:91的KpsT、SEQIDNO:83的KfoA、SEQIDNO:84的KfoB、SEQIDNO:85的KfoC、SEQIDNO:86的KfoI(Orf3)、SEQIDNO:87的KfoE、SEQIDNO:88的KfoH(Orf1)、SEQIDNO:89的KfoF、和SEQIDNO:90的KfoG。在实施例5中详细描述了抗体的产生。
发酵培养基和条件
在产生软骨素的方法中,在发酵培养基中培养具有本文所述的遗传修饰的微生物以产生软骨素。合适的或有效的发酵培养基是指在其中本发明的遗传修饰的微生物在培养时能够产生软骨素的任何培养基。这种培养基通常是包含可同化的碳、氮和磷源的含水培养基。这种培养基还可以包括适当的盐、矿物质、金属和其他营养物质。下文和实施例部分描述了示例性培养基。但是应当认识到,各种发酵条件是合适的并可以由本领域技术人员来选择。
可用于合适的发酵培养基的可同化碳的来源包括但不限于,糖及其聚合物,包括糊精、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、阿拉伯糖和木糖;脂肪酸;有机酸,如乙酸;伯醇,如乙醇和正丙醇;和多元醇如甘油。本发明的碳源包括多元醇、单糖、二糖和三糖。在一些实施方案中,碳源是甘油。
碳源,如甘油在发酵培养基中的浓度应促进细胞生长,但不能过高以至抑制所用微生物的生长。通常情况下,以一种碳源,如甘油进行发酵,其以达到所期望的生长和生物量水平的水平添加,但维持在低浓度水平(低于1g/L)以避免有机酸,特别是乙酸的积累。在其它实施方案中,碳源,如甘油在发酵培养基中的浓度大于1g/L、大于2g/L、或大于5g/L。另外,碳源,如甘油在发酵培养基中的浓度通常是小于100g/L、小于50g/L、或小于20g/L。应该指出的是,发酵组分浓度的参考可以参考初始和/或进行中的组分浓度。在某些情况下,可能希望的是在发酵过程中使发酵培养基中的碳源用完。
可用于合适的发酵培养基的可同化氮的来源包括但不限于,简单的氮源、有机氮源和复杂的氮源。这样的氮源包括无水氨、铵盐和动物、植物和/或微生物来源的物质。合适的氮源包括但不限于,蛋白水解物、微生物生物质水解物、蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、氢氧化铵、尿素和氨基酸。通常情况下,发酵培养基中氮源的浓度大于0.1g/L、大于0.25g/L、或大于1.0g/L。但是超过特定浓度,向发酵培养基中加入氮源是不利于微生物生长的。其结果是,发酵培养基中的氮源的浓度小于20g/L、小于10g/L、或小于5g/L。此外,在某些情况下,可能希望的是在发酵过程中使发酵培养基中的氮源用完。
有效的发酵培养基可以包含其它化合物,例如消泡剂、无机盐、维生素、痕量金属和/或生长促进剂。这样的其它化合物也可以存在于有效培养基中的碳、氮或矿物源中或者可以专门加入培养基中。
发酵培养基还可以包含合适的磷源。这种磷源包括无机磷源和有机磷源。磷源包括但不限于磷酸盐,如磷酸二氢或磷酸一氢钠和钾盐、磷酸铵及其混合物。通常情况下,发酵培养基中磷的浓度大于1.0g/L、大于2.0g/L、或大于5.0g/L。但是超过特定浓度,向发酵培养基中加入磷是不利于微生物生长的。因此,发酵培养基中磷浓度通常小于20g/L、小于15g/L、或小于10g/L。
合适的发酵培养基还可以包含镁源。在一些实施方案中,镁源是生理上可接受的盐的形式,如硫酸镁七水合物,虽然可以以贡献相似量的镁的浓度使用其它镁源。通常情况下,发酵培养基中镁的浓度大于0.5g/L、大于1.0g/L、或大于2.0g/L。但是超过特定浓度,向发酵培养基中加入镁是不利于微生物生长的。因此,发酵培养基中镁浓度通常小于10g/L、小于5g/L、或小于3g/L。另外,在某些情况下,可能希望的是在发酵过程中使发酵培养基中的镁源用完。
发酵培养基还可以包含生物学上可接受的螯合剂,如柠檬酸三钠二水合物或柠檬酸。在此情况下,发酵培养基中螯合剂的浓度大于0.1g/L、大于0.2g/L、大于0.5g/L、或大于1g/L。但是超过特定浓度,向发酵培养基中加入螯合剂是不利于微生物生长的。因此,发酵培养基中螯合剂浓度通常小于10g/L、小于5g/L、或小于2g/L。
发酵培养基最初也可以包含生物学上可接受的酸或碱以维持所需的发酵培养基pH。生物学上可接受的酸包括但不限于,盐酸、硫酸、硝酸、磷酸及其混合物。生物学上可接受的碱包括但不限于,无水氨、氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾及其混合物。在本发明的一些实施方案中,使用的碱是氢氧化铵。
发酵培养基还可以包含生物学上可接受的钙源,包括但不限于氯化钙。通常情况下,发酵培养基中钙源,如二水氯化钙的浓度是5mg/L-2000mg/L、20mg/L-1000mg/L、或50mg/L-500mg/L。
发酵培养基也可以包含氯化钠。通常情况下,发酵培养基中的氯化钠浓度的范围为0.1g/L-5g/L、1g/L-4g/L、或者2g/L-4g/L。
如之前讨论的,发酵培养基还可以包含痕量金属。这样的痕量金属可以作为贮液添加到发酵培养基中,为方便起见,贮液可与发酵培养基中的其余部分分开制备。用于发酵培养基的合适的痕量金属贮液如下表1A和IB所示。通常情况下,加入到发酵培养基中的这样的痕量金属溶液的量大于1mL/L、大于5mL/L、或大于10mL/L。但是超过特定浓度,向发酵培养基中加入痕量金属是不利于微生物生长的。因此,加入发酵培养基的这种痕量金属溶液的量通常小于100mL/L、小于50mL/L、或小于30mL/L。应当指出的是,除了在贮液中添加微量金属,可以单独加入各组分,各自的范围单独地对应于上述范围的痕量金属溶液指定的组分的量。
如下表1A所示,用于本发明的合适的痕量金属溶液包括但不限于,七水硫酸亚铁、五水硫酸铜、七水硫酸锌、二水钼酸钠、六水氯化钴和一水硫酸锰。将盐酸加入到贮液以保持溶液中的痕量金属盐。
表1A
痕量金属贮液A
另一种适用于本发明的痕量金属溶液如表1B所示并可包括但不限于,六水氯化铁、氯化锌、六水氯化钴、钼酸钠、氯化锰、硼酸及柠檬酸作为螯合剂。
表1B
痕量金属贮液B
发酵培养基还可以包含维生素。这些维生素可以作为贮液添加到发酵培养基中,为方便起见,贮液可与发酵培养基中的其余部分分开制备。用于发酵培养基的合适的维生素贮液如下表2所示。通常情况下,加入到发酵培养基中的这样的维生素溶液的量大于1ml/L、大于5ml/L、或大于10ml/L。但是超过特定浓度,向发酵培养基中加入维生素是不利于微生物生长的。因此,加入发酵培养基的维生素溶液的量通常小于50ml/L、小于30ml/L、或小于20ml/L。应当指出的是,除了在贮液中添加维生素,可以单独加入各组分,各自的范围单独地对应于上述的维生素溶液范围指定的组分的量。
如表2所示,用于本发明的合适的维生素溶液可以包括但不限于,生物素、泛酸钙、肌醇、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素。
表2
维生素贮液
本发明的微生物可以以常规发酵模式培养,其包括但不限于分批、分批补料、细胞回收和连续式。在一些实施方案中,在分批补料模式下进行发酵。在此情况下,在发酵过程中培养基中的某些组分被耗尽。可以相对高浓度的这样的组分启动发酵,使在需要添加之前能够支持生长一段时间。通过按照发酵耗尽的水平进行添加来使整个发酵中维持这些组分优选的范围。可以通过,例如定期采样发酵培养基并测定浓度来监测发酵培养基中组分的水平。或者,一旦开发了标准的发酵程序,可以在整个发酵过程中在特定时间对应已知水平以定时间隔进行添加。本领域技术人员将会认识到,由于培养基细胞密度的增加,在发酵过程中营养消耗的速率增加。此外,为避免将外来微生物引入发酵培养基中,如在本领域中已知的使用无菌添加方法进行添加。另外,在发酵过程中可添加少量的消泡剂。
发酵培养基的温度可以是适合生长和产生软骨素的任何温度。例如,在以接种物接种发酵培养基之前,可以将发酵培养基温度调整到并保持在20℃-45℃、25℃-40℃、或28℃-32℃的范围内。
可以通过向发酵培养基加入酸或碱来控制发酵培养基的pH值。在使用氨控制pH的情况下,它也方便地在发酵培养基中充当氮源。在一些实施方案中,将pH值保持在3.0-8.0、5.5-7.5、或6.0-7。
也可以在发酵过程中保持发酵培养基具有恒定的溶解氧含量,以为产生软骨素保持细胞的生长和维持细胞的代谢。可以使用已知的方法,例如通过使用氧电极监测发酵培养基的氧浓度。可以使用本领域已知的方法,例如通过搅拌和通过搅动、摇动或鼓泡进行通气来将氧添加到发酵培养基中。在一些实施方案中,发酵培养基中的氧浓度是在10%-200%的培养基氧饱和值的范围内,其是基于在大气压下和20℃-40℃的温度范围发酵培养基中氧的溶解度。在发酵过程中可以发生氧浓度低于此范围的周期下降,但是,没有对发酵造成不利影响。
虽然本文已经描述了培养基通气与使用空气有关,也可以使用其他的氧来源。特别有用的是使用包含氧体积分数大于周围空气中的氧体积分数的通气气体。此外,这种充气气体可以包括对发酵不产生负面影响的其它气体。
在一个本发明的发酵过程的实施方案中,如上所述制备发酵培养基。以足以在合理的生长期后产生高细胞密度的量对发酵培养基接种本发明的遗传修饰的微生物的活性生长培养物。典型的接种细胞密度基于细胞干重在0.001g/L-10g/L、0.01g/L-5g/L、或0.05g/L-1.0g/L的范围内。但是在生产规模发酵罐中,更高的接种物细胞密度是优选的。然后将细胞生长至细胞密度10g/L-150g/L、20g/L-80g/L、或50g/L-70g/L的范围。微生物在发酵过程中达到所需细胞密度的停留时间通常少于200小时、少于120小时、或少于96小时
在本发明的一种操作模式中,在发酵过程中监测发酵培养基的碳源浓度,例如甘油的浓度。可以使用已知的技术,例如,使用可用于监测上清,如发酵培养基的无细胞组分中的甘油浓度的高压液相层析监测发酵培养基的甘油浓度。如前所述,碳源浓度应保持在低于细胞生长抑制发生的水平。虽然这样的浓度可能因不同生物体而改变,但对于甘油作为碳源,细胞生长抑制发生在甘油浓度大于约60g/L,并且可以容易地通过试验确定。因此,当使用甘油作为碳源时,优选地将甘油加到发酵罐中,并保持在低于检测限。或者,将发酵培养基中的甘油浓度保持在1g/L-100g/L、2g/L-50g/L、或5g/L-20g/L的范围。虽然可以通过加入,例如基本上纯的甘油溶液将碳源浓度保持在所需的水平,但通过添加等分试样的初始发酵培养基保持发酵培养基的碳源浓度也是可以接受的。使用等分试样的初始发酵培养基是可取的,因为可以同时保持培养基中其他营养成分的浓度(例如氮源和磷源)。同样,通过加入等分试样的痕量金属溶液可以在发酵培养基中保持痕量金属的浓度。
软骨素回收
一旦通过发酵方法产生了软骨素,可以回收它以供后续使用。本发明人已经表明软骨素可以以无细胞形式在培养基中存在(“分泌软骨素”)和/或以与细胞相关的形式存在。与细胞相关的软骨素可与细胞表面相连(“细胞表面软骨素”)和/或保留在细胞内(“细胞内软骨素”)。
对于“分泌软骨素”,可以通过细胞去除,随后醇沉淀无细胞的培养基,或本领域已知的任何技术,包括但不限于冻干无细胞培养基以获得干燥粉末,来回收软骨素。
对于“细胞表面软骨素”,回收软骨素可以额外包括从细胞表面分离软骨素的步骤,随后进行细胞去除步骤从包含游离软骨素的培养基中去除细胞。对于“细胞内软骨素”,回收可以额外包括一个渗透或裂解细胞的步骤,随后完成从现在包含释放的软骨素的培养基中去除裂解或渗透细胞的步骤。可以通过醇沉淀培养基,或本领域已知的任何技术,包括但不限于冻干培养基以获得干燥粉末,从培养基回收软骨素。
此外,可以解聚回收的软骨素聚合物以降低聚合物的分子量。可以通过本领域已知的任何技术,包括但不限于酸解聚来完成软骨素的解聚反应。参见,例如,Tommeraas和Melander,Biomacromolecules2008;9:1535-1540。回收的软骨素可以解聚,例如,以产生与动物源性软骨素具有相似或相同分子量的软骨素,和/或以帮助回收的非硫酸化软骨素进行硫酸化。例如,回收的软骨素可以解聚以获得分子量为5kDa-100kDa,优选地,10kDa-70kDa,更优选,20kDa-40kDa的聚合物。
下面的定义和缩写用于解释权利要求和说明书。
如本文所用的术语“基因”指能够被表达为特定蛋白的核酸片段(或多核苷酸),任选地包括前面的调节序列(5'非编码序列)和后面(3’非编码序列)的编码序列。“天然基因”指与其自己的调节序列天然被发现的基因。“内源基因”指在生物体的基因组中处于其天然位置的天然基因。
如本文所用的术语“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。
“合适的调节序列”指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列),并影响转录、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多聚腺苷酸识别序列、RNA加工位点、效应蛋白结合位点和茎-环结构。
术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。在一般情况下,编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以整体源自天然基因,或由来自于自然界中发现的不同启动子的不同元件组成,或甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员可以理解的是不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中、或不同的发育阶段、或在响应不同的环境或生理条件下指导基因的表达。在大多数时候在大多数细胞类型中导致基因表达的启动子通常称为“组成型启动子”。进一步认识到,因为在大多数情况下调节序列的确切边界没有完全定义,不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。
如本文所用的术语“表达”指来自于本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可以指mRNA翻译成多肽。
如本文所用的术语“转化”指将核酸片段转移到宿主生物中,导致遗传学上稳定的继承。将含有转化的核酸片段的宿主生物称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
术语“构建体”、“质粒”、“载体”和“盒”是指额外的染色体元件,其经常携带不属于细胞中央代谢部分的基因,并通常是环形、或线性、双链DNA片段的形式。这种元件可以是自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或任何来源的单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列,其中大量的核苷酸序列已被连接或重组成特有的构造,其能够将启动子片段和选定的基因产物的DNA序列连同适当的3′非翻译序列导入细胞。
如本文所用的术语“密码子简并性”指遗传密码中允许核苷酸序列的变化而没有编码多肽的氨基酸序列的变化的性质。熟练的技术人员很清楚特定的宿主细胞在指定一个给定氨基酸的密码子使用上展示出的“密码子偏好”。因此,当合成基因以提高在宿主细胞中的表达时,需要设计基因使得其密码子选择频率接近宿主细胞优选的密码子选择的频率。
当其是指转化各种宿主的基因或核酸分子的编码区时,术语“密码子优化”指在基因或核酸分子编码区中密码子的改变以反映宿主生物体的典型的密码子选择而不改变DNA编码的多肽。
术语“可操作地连接”指在单一的核酸片段上连接核酸序列使得一个的功能受其他的影响。例如,启动子与编码序列可操作地连接是当它能够影响该编码序列的表达时(即,编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可在有义或反义方向上与调节序列可操作地连接。
本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的并由Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1989)(以下简称"Maniatis");和由Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1984);和由Ausubel,F.M.等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987)描述。这些文献中的每一篇通过整体引用并入本文。
在检验其下面的实施例的基础上,本发明的其它目的、优点和新的特征对于本领域技术人员将变得显而易见,实施例不是为了限制本发明。
实施例
实施例1
K4荚膜生物合成的遗传学
大肠杆菌K4荚膜被归类为“2组”荚膜。如Whitfield综述的(AnnuRevBiochem.2006;75:39-68),大肠杆菌2组荚膜的合成由一组蛋白指导,其由具有由三个区域组成的共同遗传组构的基因簇编码。大肠杆菌K4荚膜基因簇的预测结构(本发明之前)如图2所示。区域1预计包含6个基因,kpsFEDUCS,而区域3预计包含2个基因,kpsM和kpsT。基于与已知蛋白的序列同源性,预测kpsF和kpsU基因编码催化糖核苷酸CMP-Kdo生物合成步骤的蛋白。已经提出了大肠杆菌中2组荚膜的CMP-Kdo生物合成的功能(Roberts,Annu.Rev.Microbiol.1996;50:285-315),但尚未得到实验证实(Whitfield,AnnuRevBiochem.2006;75:39-68)。假定kpsM、kpsT、kpsD、kpsE、kpsC和kpsS基因编码从细胞的细胞质到细胞表面的转运所需的蛋白,在细胞质中发生糖前体的聚合,而认为在细胞表面上成熟的荚膜多糖通过与膜的脂质成分的共价连接锚定到外细胞膜上(Roberts,Annu.Rev.Microbiol.1996;50:285-315;Whitfield,AnnuRevBiochem.2006;75:39-68)。如对于大多数大肠杆菌2组荚膜一样,对于大肠杆菌K4荚膜,多糖和荚膜的脂质成分之间的共价连接的结构尚未实验确定。此外,尚未知道脂质组分的身份。区域1和区域3的基因,以及它们编码的蛋白,在产生具有非常多样的多糖组成和结构的荚膜的大肠杆菌菌株中是高度保守的(Whitfield,AnnuRevBiochem.2006;75:39-68)。在大肠杆菌的2组荚膜簇的区域2中包含的基因包括编码用于糖核苷酸前体的生物合成及用于这些前体的聚合的酶的基因,从而区域2决定荚膜多糖的结构。在大肠杆菌的2组荚膜簇的区域2中的其他基因编码功能未知且未被证明在荚膜的生物合成中具有作用的蛋白。如Ninomiya等(J.Biol.Chem.2002;277:21567-21575,GenBankAB079602)所描述的大肠杆菌K4荚膜基因簇的区域2的序列包含7个注释的预测编码蛋白的开放阅读框(kfoABCDEFG)。一个插入元件,IS2,位于基因kfoC和kfoD之间。
作为设计合成的K4荚膜生物合成基因编码序列的初步步骤,对分隔每个基因对的间基因间隔序列进行了检测。基于该序列分析,似乎可能在此区域内至少有两个编码很可能被表达并与荚膜的生物合成潜在相关的蛋白的额外的开放阅读框(ORF)。基于Ninomiya等的序列,获得了以下间隔距离:kfoA-kfoB:186bp;kfoB-kfoC:297bp;kfoC-IS2:29bp;IS2-kfoD:9bp;kfoD-kfoE:389bp;kfoE-kfoF:818bp;kfoF-kfoG:431bp。在三个最大的间隔区的每一个中确定了一个开放阅读框。
一个390bp的ORF,称为“ORF3”,包括了kfoO–kfoE区的大部分,从而从kfoD终止密码子后10个核苷酸启始和在kfoE的编码区域内终止。也就是说,假定的orf3基因与kfoE基因有10个核苷酸的重叠。这个ORF从ATG开始和在框架下游9bp处存在第二个可能的ATG起始。这两个可能的起始均缺乏一个可识别的Shine-Dalgarno(SD)序列(Shine和DalgamoProc.Natl.Acad.Sci.USA.1974;71:1342-6)。当将orf3的蛋白产物使用在BLAST搜索中时,8个“好”的命中,即得到得分>138,E值<3e-31。这些命中中的两个是针对位于用于荚膜生物合成基因簇中的多杀巴斯德氏菌基因(bcbF&ecbF)编码的蛋白。这些多杀巴斯德氏菌荚膜基因簇与根据由本发明人分析的Ninomiya等的序列的K4区域2基因一起列于图3A。Orf3、BcbF和EcbF蛋白的蛋白序列比对如图3B所示。这些多杀巴斯德氏菌序列分别来自血清型B菌株(M1404)和血清型E菌株(P1234)。血清型E荚膜的组成是未知的而血清型B荚膜据报道由甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,但没有结构的报道(Towttsend等,J.Clin.Microbiol.2001;39:924-929)。
在kfoE-kfoF区中,存在一个称为“ORF1”的630bp的ORF,如图3A所示。该ORF的ATG起始密码子与上游kfoE基因的TGA终止密码子重叠。在KfoE的编码序列内该ATG上游的7个碱基对处存在一个强SD序列(AGGAGG)。因此,该ORF应该表达的旁证是强大的。ORFl编码蛋白的BLAST结果包括对巴斯德氏菌基因(bcbE和ecbE)的强力命中,所示基因与使用ORF3获得的多杀巴斯德氏菌命中相邻。也就是说,K4簇的两个推定的ORF1和3与编码荚膜多糖的两个多杀巴斯德氏菌基因簇具有同源性。ORF1、BcbE和EcbE蛋白序列的比对如图3B所示。
在kfoF-kfoG区中,存在一个称为“ORF2”的384bp的ORF。在该ORF的ATG起始密码子前的15bp上游处存在一个GG序列,这能够提供一个弱的SD序列。用此蛋白序列的BLAST检索中没有发现明显命中。这表明该ORF可能不编码一种实际产生的多肽。
值得注意的是,来自区域2的两个其他K4荚膜簇基因(kfoD和kfoE)与位于多杀巴斯德氏菌P1234和多杀巴斯德氏菌M1404荚膜基因簇的多杀巴斯德氏菌基因具有同源性。kfoD编码的蛋白与EcbD和BcbD具有同源性,而类似地kfoE基因产物与EcbG和BcbG具有同源性。因此,如图3中所示,4个连续的K4基因(kfoD、orf3、kfoE和orf1)与连续的多杀巴斯德氏菌B血清型基因bcbDEFG和多杀巴斯德氏菌E血清型基因ecbDEFG具有同源性。如上所述,这两个巴斯德氏菌菌株不是软骨素产生者而在本发明之前,K4基因kfoD、orf3、kfoE和orf1在软骨素生物合成中发挥的功能即使有,也是未知的。
K4中的kfoD、orf3、kfoE、orf1基因集紧接(9bp)IS2的事实提出了许多关于它们的起源和在软骨素荚膜合成中的作用的可能性。不希望被理论所束缚,本发明人设想K4区域2的基因簇是通过IS2-介导的重组/插入到包含kfoABCFG的亲本软骨素产生簇而出现的。另外,本发明人假设kfoD、orf3、kfoE和orf1基因可能参与软骨素骨架的果糖基化。果糖基化是多杀巴斯德氏菌的血清型F荚膜和大肠杆菌K4荚膜间一个明显的结构差异。很有可能两者间遗传结构的显著差异,即存在或不存在kfoD、orf3、kfoE、orf1基因簇,是其结构差异的反映。通过与多杀巴斯德氏菌产软骨素F血清型菌株P4182的荚膜生物合成基因簇的类比(Townsend等,J.Clin.Microbiol.2001;39:924-929),有可能仅有的与软骨素骨架产生有关的K4区域2基因可能是kfoA、kfoB、kfoC、kfoF和kfoG。如实施例6和7中描述的,本发明人确认了软骨素产生不需要kfoD、orf3、kfoE和orf1基因和这些基因中的一种或多种是软骨素果糖基化必不可少的。
为了在设计K4荚膜生物合成基因的合成编码序列之前确认Ninomiya等的序列,本发明人测序了得自ATCC的大肠杆菌K4菌株ATCC23502的K4荚膜基因簇的区域2。根据制造商的方案使用Qiagen基因组DNA试剂盒(QiagenInc.,Valencia,CA)从ATCC菌株23502的新鲜过夜培养物中制备了基因组DNA。通过(5次)20号针头剪切的等分试样的基因组DNA用作PCR反应模板以产生一系列6种大小从2.2kB到2.7kB的重叠的PCR产物。根据制造商的方案使用QiagenQIAquickPCR纯化试剂盒纯化PCR反应产物并发送商业供应商(BiotechnologyResourceCenter,DNASequencingFacility,CornellUniversity,Ithaca,NewYork)测定DNA序列。这6种重叠PCR产物的序列覆盖了如Ninomiya等(2002)确定的区域2序列。总体而言,本发明人确定的序列与Ninomiya等报道的序列相符合,具有99.8%的同一性。然而,存在单碱基对的差异,包括在26个位置的取代、缺失和插入。这些差异中的一些导致在由该基因簇编码的区域2蛋白的预测氨基酸序列上的实质差异。所观察到的核苷酸序列差异和由此引起的对预测的蛋白序列的影响如图4A和图4B所示。
为了确定K4荚膜生物合成基因的正确序列,从StatensSerumInstitut(Copenhagen,Denmark)获得大肠杆菌血清型K4菌株U1-41。Ul-41是ATCC23502菌株的前体并用来产生用于K4多糖结构测定的多糖制剂(Rodriguez等,1988)。测定了大约23kb的覆盖大肠杆菌U1-41中K4荚膜基因簇的区域1、2和3的DNA序列。该序列(SEQIDNO:117)由23,230个碱基对组成,跨越从区域1的kpsF基因的ATG翻译起始密码子上游125bp到区域3的kpsM基因的ATG翻译起始密码子上游110bp的区域。
为了测序,根据制造商的方案使用Qiagen基因组DNA试剂盒(QiagenInc.,Valencia,CA)从大肠杆菌U1-41的新鲜过夜培养物中制备基因组DNA。通过(5次)20号针头剪切的基因组DNA的等分试样用作PCR反应模板以产生一系列11种大小从2.1kB到2.8kB的重叠PCR产物。这些PCR反应,此处称为反应1-11,使用以下的寡核苷酸引物:反应1;(DHD089及DHD090),反应2;(DHD091及DHD092),反应3;(DHD093及DHD175),反应4;(DHD120和DHD096),反应5;(DHD097,DHD098),反应6;(DHD099和DHD100),反应7;(DHD101和DHD102),反应8;(DHD103和DHD104),反应9;(DHD105和DHD106),反应10;(DHD162和DHD108),反应11;(DHD169和DHD110)。这些引物的序列如下所示。
DHD0895>GCACCTCCATGAGACATTGC>3(SEQIDNO:118)
DHD0905>CCACTGCCATACGGTTTAGC>3(SEQIDNO:119)
DHD0915>GCTTGCCTTTGCAGAAACGG>3(SEQIDNO:120)
DHD0925>CCAACAATATCGAGCAGTGG>3(SEQIDNO:121)
DHD0935>GTCATTCGTCAGAACGGTGC>3(SEQIDNO:122)
DHD1755>CCAGTGCCTGATAATCAGC>3(SEQIDNO:123)
DHD1205>GGCTTAACGCTGTGGAAGTC>3(SEQIDNO:124)
DHD0965>ATATTGGGATTCCTGGTCGC>3(SEQIDNO:125)
DHD0975>ACGACATCAAAGGCTTGACG>3(SEQIDNO:126)
DHD0985>ATAGCCCTGAAGCTGAAGCC>3(SEQIDNO:127)
DHD0995>CGAGTGATTGCTTGGTATCC>3(SEQIDNO:128)
DHD1005>AAACGATTGAGCGGGTTAGC>3(SEQIDNO:129)
DHD1015>AGAGTGGTTCAATCCTCTGG>3(SEQIDNO:130)
DHD1025>TGTCTTGGCTAATGCTGACG>3(SEQIDNO:131)
DHD1035>CGAGTAGTTATCTGGCTCTG>3(SEQIDNO:132)
DHD1045>GTCAGTTAGACTCTGATGAC>3(SEQIDNO:133)
DHD1055>CTTGAACGGTCCAACTTCAC>3(SEQIDNO:134)
DHD1065>AGTTCAGGAGCTTGAATGCG>3(SEQIDNO:135)
DHD1625>TTCGCACGCATTTATAGCCG>3(SEQIDNO:136)
DHD1085>TCATCTTGCGAGAGCATTCG>3(SEQIDNO:137)
DHD1695>CTTCCGCTAAATCCATTACG>3(SEQIDNO:138)
DHD1105>AGATCTATTTATCCCTGCGG>3(SEQIDNO:139)
根据制造商的方案使用PfuUltraII聚合酶(STRATAGENE,LaJolla,CA)进行PCR反应1、2、3、7、8、9、10和11。在每100μL反应中,加入Pfu反应缓冲液(制造商提供)到终浓度为1X,加入引物至终浓度各0.4μM,加入dNTP至终浓度各250μM并加入100ng的U1-41基因组DNA作为模板。使用以下循环参数在Perkin-ElmerGeneAmp2400热循环仪中进行PCR反应:95℃2分钟,1个循环;95℃20秒,55℃20秒,和72℃40秒,35个循环;72℃3分钟,1个循环;和4℃保温。如上所述进行PCR反应4、5和6,但有以下例外。在反应5和6的情况下,加入引物到终浓度每种0.5μM而且退火步骤是在60℃而不是55℃。在反应4的情况下,加入引物至每种终浓度0.5μM,并使用下面的循环参数在梯度96热循环仪(STRATAGENE,LaJolla,CA)中进行PCR反应:95℃1分钟,1个循环;95℃30秒,52℃30秒,和72℃1分钟,35个循环;72℃5分钟,1个循环;和6℃保温。
根据制造商的方案使用QiagenQIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)纯化PCR反应1、2、3、7、8、9、10和11的产物。回收在100μL的EB洗脱缓冲液中,然后用作测序反应的模板。根据制造商的方案使用QiagenQIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)纯化PCR反应4、5和6的产物,然后通过制备性琼脂糖凝胶电泳进一步纯化。从凝胶上切下片段并根据制造商的方案使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)从凝胶切片洗脱,并回收于100μL的EB洗脱缓冲液中。凝胶纯化片段作为测序反应的模板。纯化的反应1-11的PCR产物送往商业供应商(CornellUniversityLifeSciencesCoreLaboratoriesCenter,CornellUniversity,Ithaca,NewYork)DNA测序。获得自这11种重叠PCR产物的序列覆盖了Ninomiya等(2002)确定的区域2序列并还包括区域1和区域3基因的全部。
来自U1-41的K4荚膜基因簇的序列证明了如在大肠杆菌2组荚膜基因簇中是典型的一样,在区域1中存在kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC和kpsS基因。预测的U1-41KpsF、KpsE、KpsD、KpsU、KpsC和KpsS蛋白的氨基酸序列与其它大肠杆菌2组荚膜产生者编码的这些蛋白的序列是同源的。它们都显示与这些蛋白的共有序列和大肠杆菌Nissle1917(K5血清型)KpsF、KpsE、KpsD、KpsU、KpsC和KpsS序列(Grozdanovetal.,J.Bacteriol.2004;186:5432-41)具有>95%的同一性。序列也揭示了如在大肠杆菌2组荚膜基因簇中是典型的一样,在区域3中存在kpsM和kpsT基因。预测的U1-41KpsM和KpsT蛋白的氨基酸序列与其它大肠杆菌2组荚膜产生者编码的这些蛋白的序列是同源的。它们都显示与这些蛋白的共有序列和大肠杆菌Nissle1917(K5血清型)KpsM和KpsT序列具有>90%的同一性。
U1-41DNA序列包括约13.5kb区域2片段,其可以与Ninomiya等的区域2序列和本发明人确定的ATCC23502的区域2的序列比对。该跨度上U1-41序列和本发明人确定的ATCC23502的区域2的序列是相同的。排除IS2序列,在确定的区域2中存在9个预期作为多肽表达的开放阅读框(ORF)。这9个中包括上面详细说明的以前没有确定的两个ORF。编码这些ORF的基因最初曾被称为orf1和orf3,而现在计划分别命名为kfoH和kfoI。图5显示了本发明人从ATCC23502和U1-41的DNA序列确定的K4荚膜基因簇的排列。发现上述的Orf2在本发明人确定的区域2的序列中并不是作为单独的开放阅读框存在。在本发明人确定的序列中,包含orf2的序列是kfoG编码序列的一部分。在Ninomiya等发表的序列中的移码将kfoG序列分裂成两个更小的开放阅读框,Ninomiya等注释的kfoG基因和本发明人注释的orf2序列。因此,orf2是Ninomiya等发表的错误序列的产物。
除了IS2序列,该基因簇包含17个预期编码蛋白的开放阅读框。这些基因的排列对于大肠杆菌2组荚膜基因簇是典型的(Whitfield2006)。包含保守基因kpsFEDUCS的区域1和包含保守基因kpsMT的区域3,在区域2的9个开放阅读框(和IS2)的侧翼。区域1和区域3基因包括大肠杆菌所有2组荚膜的合成和易位所需的蛋白。区域1还包括两个编码预期催化CMP-Kdo生物合成步骤中的酶的基因(kpsF和kpsU)。如上所述,已经提出了CMP-Kdo在大肠杆菌2组荚膜的生物合成的功能,但还没有实验证实。在2组荚膜基因簇中,区域2的基因通常包括那些编码决定荚膜多糖结构的血清型特异的蛋白的基因。区域2中确定的9个基因中,3个编码具有明确荚膜生物合成相关活性的蛋白:kfoC(软骨素合酶,即聚合酶)、kfoA(UDPGlcNAc差向异构酶,转化UDPGlcNAc为UDPGalNAc前体)和kfoF(UDPGlc-脱氢酶,转化UDPGlc为UDPGlcUA前体)。
存在于K4荚膜基因簇区域2的其他基因:kfoB、kfoG、kfoD、kfoE、kfoH和kfoI的功能尚不清楚。kfoB编码与存在于已知的产生其他糖胺聚糖(GAG)荚膜的细菌,多杀巴斯德氏菌的血清型A、F、D和大肠杆菌K5血清型的荚膜簇的基因编码的蛋白同源的蛋白。相似地KfoG蛋白也与存在于多杀巴斯德氏菌血清型A、F和D的荚膜基因簇的基因编码的蛋白具有同源性。间接证据表明kfoB和kfoG在含GAG的K4荚膜生物合成中发挥功能。
与KfoB和KfoG相反,在本发明之前,没有这样的证据暗示kfoD、kfoE、kfoH和kfoI参与GAG的生物合成。如上所述和实施例6和7中描述的,本发明人在本文中表明这些基因中的一种或多种(即基因kfoD、kfoE、kfoH和kfoI)是K4荚膜多糖的软骨素骨架果糖基化必不可少的,但这些基因中均不是产生软骨素骨架必需的。
在U1-41和ATCC23502中,插入元件IS2存在于基因kfoC和kfoD之间。已报道由于IS2内起始转录,IS2在观察到的方向上的插入激活下游基因的表达(Glansdorf等,ColdspringHarborSymp.Quant.Biol.,1981;45:153-156)。因此,不希望被理论约束,提出IS2的存在能够调节下游基因kfoD、kfoI、kfoE、kfoH、kfoF和kfoG的表达,但预测不能防止这些基因的表达。
实施例2
密码子优化的大肠杆菌K4荚膜生物合成基因的合成
将本发明人确定的U1-41K4荚膜基因簇的序列作为设计用于在替代宿主中表达的合成基因的基础。设计了合成构建体以允许包含K4荚膜生物合成基因中的一个或多个合成操纵子的表达,并基于共有的优选密码子表对密码子选择进行了优化,所示密码子表采用在大肠杆菌、野油菜黄单胞菌、少动鞘氨醇单胞菌和枯草芽孢杆菌中的表达是可接受的密码子。表3A给出了对于大肠杆菌、野油菜黄单胞菌和枯草芽孢杆菌基因组以及K4P荚膜生物合成相关的大肠杆菌K4区域2基因、和包括结冷胶(gellan)生物合成相关的基因的53个少动鞘氨醇单胞菌基因的密码子选择表。此表显示了在K4区域2生物合成基因中不利密码子的惊人使用。这些密码子不仅对野油菜黄单胞菌或少动鞘氨醇单胞菌表达是极为不利的,而且对于在大肠杆菌中表达也是不利的。为了在大肠杆菌中最佳的表达,预计大量密码子优化将是必要的。基于这些密码子选择表的比较,为合成的软骨素生物合成基因设计了共有的优选密码子选择表,如表3B所示。期望这种密码子选择模式能够在各种广泛潜在的替代宿主中提供有效的翻译。
表3A
密码子选择
所示的值反映了对于每个密码子的发生率,以占指定该密码子编码的氨基酸的全部密码子的百分比表示。从枯草芽孢杆菌菌株168、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种ATCC33913、大肠杆菌K-12W3110和少动鞘氨醇单胞菌53CDS的基因组包含的20,972个密码子计算了密码子的使用。
如下表3B所示的密码子选择是用于合成基因设计的共有的密码子选择表和如下构建的合成基因集的最终密码子选择。在合成基因中的实际使用情况反映了设计上的考虑,如DNA和mRNA二级结构、包含和排除限制性酶切位点和整体GC含量。
表3B
共有密码子选择
1值是占那种氨基酸的全部密码子的%
2值是在合成的基因集中如合成的密码子总数
合成的基因集是由3个片段,kpsFEDUCS(“FS片段”)、kpsMTkfoABCFG(“MG片段”)和kfoDIEH(“DH片段”)构建的。图6示意性图示了这3个合成片段的结构。将如图6所示的独特限制性位点整合于策略性位点以允许将合成片段装配到一个或多个可以插入到质粒表达载体中的操纵子中。最初的策略是作为表达实验的单一操纵子装配基因。其他限制性位点也是策略性地分布于整个合成序列,在允许构建对于任何给定的基因的非极性缺失的位置。这利于K4荚膜簇编码蛋白的功能的遗传分析以及其它质粒序列的修饰。对于大多数合成基因,除了kpsC、kpsT、kfoE、kfoH,使用了一个共有的强大的核糖体结合位点(AGGAGGttaataaATG,SEQIDNO:46)。在大肠杆菌K4U1-41序列中,将这些基因的翻译起始位点偶联到基因翻译终止的紧邻上游,并导致核糖体结合位点与这些上游基因的编码序列重叠。
由商业供应商DNA2.0(MenloPark,CA)以3个分离的片段合成了包含如上所述的FS、MG和DH片段的合成序列。3个合成片段的核苷酸序列列为:FS片段(SEQIDNO:47)、MG片段(SEQIDNO:49)和DH片段(SEQIDNO:48)。
实施例3
替代宿主菌的构建
最初的选择表达K4生物合成基因的替代宿主包括大肠杆菌K-12(“K-12”)、大肠杆菌B(“EcB”)、少动鞘氨醇单胞菌(“Sph”)和野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(“Xcc”)。K-12菌株W3110和MG1655获得自耶鲁大学大肠杆菌基因库中心。Sph菌株ATCC31461获得自ATCC。Xcc菌株NRRLB-1459(ATCC13951)获得自ARS培养物保藏中心(NCUAR),Peoria,IL。大肠杆菌B(ATCC11303)获得自ATCC。
一般而言,为导入K4基因通过两种方式制备替代宿主。通过接合转移将基因/质粒从与含迁移质粒pRK2013的大肠杆菌三亲本杂交的大肠杆菌实验室克隆菌株递送到某些替代宿主可能是有优势的。为从接合环境中选择替代宿主的转移接合体,替代宿主的抗生素抗性衍生物(通常是链霉素抗性)是必需的。另外,可以使用大肠杆菌菌株S17-1(Simon等,BioTechnology1983;1:784-791)。该菌株具有质粒RP4的染色体整合形式并将合适的质粒直接迁移到新的宿主。然而,该菌株是链霉素抗性的,所以不能使用链霉素在接合后体中选择该菌株。
Sph、Xcc和K-12中基因或基因簇缺失的产生是采用两个步骤的,“pop-in/pop-out”同源性驱动的方法(参见图7)进行的。在步骤一中,通过在一个侧翼区中的重组(并以该载体上的标记选择),将含有所需的缺失结构(缺失侧翼的同源区)的克隆版本的质粒整合到染色体中(pop-in)产生同源侧翼区的重复。在步骤二中,在相对的侧翼区发生重组去除(popping-out,“消除(resolving)”)克隆载体(加标记)和目标染色体区,但留下设计的缺失。通过在无标记选择情况下的多代培养,接着通过标记缺失和所需表型的筛选(通过菌落形态和/或PCR确定)获得这样的菌株。对于大肠杆菌以外的革兰氏阴性生物,所需缺失通常在可以接合转移至目标(非大肠杆菌)宿主菌,但不能其中复制的“自杀”载体中构建。为了我们的目的,我们通过修改pCM184(见图7B,Marx和Lidstrom,BioTechniques2002;33(5):1062-1067)构建了一个“自杀”载体。通过NotI和SacⅡ消化去除卡那霉素抗性基因和侧翼loxP位点,用T4DNA聚合酶处理末端并连接。所得质粒,pCX027(SEQIDNO:141),如图7B所示,包含四环素抗性以选择整合体(在Sph或Xcc)以及一个大的多克隆位点。为了在大肠杆菌中产生缺失,使用质粒pMAK705(Hamilton等,J.Bacteriol.1989;171(9):4617-4622)。该质粒含有温度敏感的pSC101复制子(replicon),为在高温下步骤一中整合的产生和步骤二(“消除”)中质粒序列的缺失提供了便利。通过PCR和Southern印迹分析证实了的“胞外多糖(EPS)减去”突变体的基因结构。
上述所有目标的缺失构建体的构建方法是相同的。使用合适的基因组DNA作为模板通过PCR获得上游和下游同源区域。限制性位点设计到PCR引物中,使得生成的DNA片段能够克隆到所需的质粒中,或者,对于下述的XccgumD基因,使用基因组中天然存在的限制性位点。设计缺失(和用于克隆的限制性位点)使得在目标基因编码区的N-端和C-端短区间建立符合读框的融合物。在效果上,用限制性酶的识别序列替换目标编码区。在上游和下游片段间的工程化限制性位点序列对融合的编码区加入2-3个非天然密码子。此过程产生良好定义的突变,期望其对下游基因的表达小/无极性的影响。
大肠杆菌K-12
可拉酸(M抗原)是由许多肠细菌产生的胞外多糖(GrantWD等,J.Bacteriol.1969;100:1187-1193),通常在较低的生长温度下会获得更大的产量(Stout,V.,J.Bacteriol.1996;178:4273-4280)。本实施例描述了在可拉酸生物合成上缺陷的大肠杆菌K-12菌株的构建。当这样的菌株进一步工程化以可以在30℃或更低温度进行的重组软骨素的产生时,它们不产生干扰或污染性的可拉酸。使用质粒pMAK705(Hamilton,C.M.等,J.Bacteriol.1989;171:4617-4622)构建在染色体的可拉酸生物合成基因簇中的精确缺失。该质粒包含一个温度敏感的复制子并且和不能在较高温度下以染色体外的状态存在。通常,在目标位点构建精确突变的步骤是由于“pop-in/pop-out”机制并由Hamilton等描述(见上文)。通过在非允许温度和质粒编码的抗生素(氯霉素;Cm)抗性选择下的转化体生长,将含有设计突变的质粒克隆引导到染色体中(“pop-in”),通常是通过在目标位点的同源重组。随后这些整合体在无氯霉素条件下的多代生长产生细胞亚群,其中质粒重组出染色体并在细胞分裂过程中从细胞丢失,要么留下初始的野生型结构要么留下突变结构。由Cm敏感性确定这些“pop-outs”。然后通过表型(如果可能)和PCR或Southern印迹确定具有所需突变结构的菌株。
大肠杆菌K-12中的可拉酸生物合成操纵子由19或20个连续的基因组成,覆盖约24kb(Stevenson,G.等,J.Bacteriol.1996;178:4885-4893)。第20个基因,wcaM,表现为操纵子/转录单元的一部分,但不是产生可拉酸必需的。本文所含是编码在可拉酸生物合成中负责加载第一个糖到脂载体上的糖基转移酶的wcaJ基因。本实施例描述包含整个20个基因的操纵子缺失或仅是wcaJ基因缺失的大肠杆菌K-12株的构建。大肠杆菌K-12菌株W3110的基因组序列以GenBankAP009048公开(Blattner,F.R.等,Science1997;277:1453-1462)。
可拉酸操纵子的缺失:设计PCR引物扩增W3110可拉酸操纵子的第一个基因(wza)的上游和最后的基因(wcaM)的下游的约950bp。这些片段提供与染色体中的所需的重组位点的同源性。设计PCR引物以在随后的克隆中使用的扩增的PCR产物的末端产生非天然限制性位点。用引物CAX129(HindIII位点下划线)和CAX128(AscI位点下划线)扩增上游区域。用引物CAX130(AscI位点下划线)和CAX131(XbaI位点下划线)扩增下游区域。
CAX128GGCGCGCCAGCGTCCTGCTGTTTGATGACG(SEQIDNO:50)
CAX129AAGCTTGCCAGGAGATTGACGCCAGC(SEQIDNO:51)
CAX130GGCGCGCCGGAATCCTCAGTTGGACCCGC(SEQIDNO:52)
CAX131TCTAGAACTTTACCCTCACGGTCCAGCG(SEQIDNO:53)
用Pfu聚合酶(Stratagene)进行PCR反应,在95℃变性,57℃退火和72℃延伸(每个步骤20秒),进行30个循环。模板由100ng大肠杆菌K-12W3110基因组DNA组成。PCR片段克隆到pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)并转化到大肠杆菌TOP10(Invitrogen)中,确定选择的克隆的插入子的序列与公布的数据匹配。用HindIII和AscI消化上游的克隆,并用XbaI和AscI消化下游的克隆。凝胶纯化所需的片段(GeneCleanTurbo,Q-BIOgene)并与用HindIII和XbaI消化并随后用南极磷酸酶(NewEnglandBiolabs)处理过的pMAK705连接。分析大肠杆菌DH5α(Invitrogen)的Cm抗性(LBCm34μg/mL,30℃)转化体获得质粒的结构,并将具有所需结构的质粒命名为pMAK-CL。在该质粒中(并且染色体的缺失最终由该质粒衍生),上游和下游的片段在AscI位点的结合产生一个由wza基因的5’端和wcaM基因的3’端组成的小的345bp的开放阅读框。设计此特征的目的是尽量减少对来自wcaM更远下游的任何基因的可拉酸操纵子启动子的潜在表达的破坏。
通过电穿孔,在30℃(允许的温度)铺在含有17μg/mLCm的LB(Maniatis,1989)琼脂平板上进行Cm抗性选择将质粒pMAK-CL转化到大肠杆菌W3110中。几个转化菌落划线接种到M9(Maniatis,1989)Cm17μg/mL的琼脂平板上并在43℃(非允许温度)下温育。两天后出现多个菌落(推定的整合体),将这些重新划线到M9Cm在43°C进行确认。两个推定的整合体在37℃下在LB培养基中生长约25代,并制备稀释液涂布到LB平板上在室温下(22-24℃)生长。三天后,菌落转移到两个LB琼脂平板上,一个含Cm17μg/mL,在30℃下生长。在两个原始整合体的衍生物中Cm-敏感的分离株出现的频率为62%和94%。这些可能是由“pop-out”和pMAK-CL质粒丢失导致的。“菌落PCR”用于评估这些菌株中的可拉酸操纵子的结构。少量菌落悬浮于与PCR相容的管中的10μL无菌去离子水中。向其中加入20μL1.5倍浓缩的“TaqMaster”组分混合物(Eppendorf),使得反应中的终浓度/量为:1XTaq聚合酶缓冲液、1X“TaqMaster”试剂、各0.33mM的dNTP、各0.4μM的引物、和0.5单位的Taq聚合酶。在95℃,8分钟开始PCR,继续在95℃下变性30秒、在55℃下退火30秒并在68℃下延伸3分钟,进行35个循环,并且在68℃下延伸7分钟完成。用在上游同源区域的正向引物(CAX132)和在下游同源区的反向引物(CAX135)进行初始表征。
CAX132CCGAATTGTTATCTTGCCTGC(SEQIDNO:54)
CAX135GGTAGCATCTCTTTGGGTATCG(SEQIDNO:55)
含有所需的操纵子缺失的菌株的PCR预期产生一条1000bp的片段,这在分析的23个“pop-out”菌株中的9个中发现。为了确保在这些菌株中没有发生不希望的重排,使用同源区域外部的引物:CAX162(正向)和CAX163(反向)进行“菌落PCR”。
CAX162GAACAGCGGTTGAGTCAGGG(SEQIDNO:56)
CAX163GGCAGAAAGCACATAGCGACC(SEQIDNO:57)
这些外部引物得到缺失所期望的结构的2065bp的PCR产物和9株中的4株产生了该PCR产物;将其中之一命名为MSC188。通过Southern印迹实现了菌株MSC188中缺失的结构的进一步确认。使用pMAK-CL作为模板,用引物CAX128和CAX129(1000bp)产生了“DIG”标记的探针(Roche)。将野生型大肠杆菌W3110和MSC188染色体DNA用限制性酶KpnI、PstI和BglII消化,并将消化物进行凝胶电泳和印迹分析。探针揭示了MSC188和W3110中预期的带型,分别为:KpnI,5921bpvs.9431bp;PstI,3902bpvs.12893bp,和BglII,9361bpvs.6201bp。
wcaJ缺失:在大肠杆菌K-12W3110中wcaJ基因的缺失策略接着如上所述的整个可拉酸生物合成操纵子的缺失。设计PCR引物扩增W3110可拉酸操纵子的wcaJ基因的上游和下游约500bp。用引物CAX126(HindIII位点下划线)和CAX125(PacI位点下划线)扩增上游区域。用引物CAX124(PacI位点下划线)和CAX127(XbaI位点下划线)扩增下游区域。
CAX124TTAATTAACAAAGGTTTCGTTAACAAAGCGG(SEQIDNO:58)
CAX125TTAATTAAATTGGTTTTCGCTCGCTCGC(SEQIDNO:59)
CAX126AAGCTTGGAAGACGCCATCTATGGTGG(SEQIDNO:60)
CAX127TCTAGAGAAGCCCGCCAGCACCGC(SEQIDNO:61)
将上游和下游PCR产物的限制性片段克隆到pMAK705以产生pMAK-wca。在该质粒和最终由它衍生的染色体缺失中,上游和下游片段在PacI位点的联合产生一个小的75bp的由wcaJ基因的5’和3’端组成的开放阅读框。设计此特征的目的是允许有益于软骨素产生的事件中的所有其他操纵子基因不中断的表达。通过用引物CAX126和CAX127的菌落PCR初步表征了大肠杆菌W3110推定的wcaJ缺失衍生物,23个预期的“pop-outs”中的11个给出了所需的信号。外部引物CAX160(正向)和CAX161(反向)用于确定推定的wcaJ缺失,4株中的3株检测到含有期望的产物(1188bp)。将具有所需DNA结构的菌株命名为MSC175。
CAX160CCGTTGATGTGGTGACTGCC(SEQIDNO:62)
CAX161AAACAGCAGCGTTCTCACCG(SEQIDNO:63)
为了Southern印迹确认,使用pMAK-wca作为模板,用引物CAX124和CAX127(514bp)产生“DIG”标记的探针。将野生型大肠杆菌W3110和MSC175的染色体DNA用限制性酶PacI、DraIII和NdeI消化,并将消化物进行凝胶电泳和印迹分析。探针探查揭示了MSC175和W3110中预期的带型,分别为:PacI,8456bpvs.>28000bp;DraIII,4502bpvs.5819bp,和NdeI,8512bpvs.9829bp。
野油菜黄单胞菌
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)用于商业产生用于各种工业和食品应用的胞外糖聚合物黄原胶(Baird,J.等,BioTechnology1983;1:778-783)。为了将此菌株和方法用于软骨素产生,需要不能生物合成黄原胶的Xcc菌株。在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种菌株ATCC13951,也称为NRRLB-1459(Capage,MR等,WorldPatentWO87/05938;Katzen,F.等,J.Bacteriol.1998;180(7):1607-1617)中,采用对大肠杆菌(上文)类似的策略来缺失整个黄原胶生物合成操纵子或仅仅是第一糖基转移酶的基因gumD。首先,在营养琼脂在30℃获得了一株自发的抗100μg/mL链霉素硫酸盐的衍生物并命名为MSC116。针对菌株NRRLB-1459(GenBank登录号#U22511)的黄原胶生物合成簇的序列和必要时针对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种ATCC33913(GenBank登录号AE008922)的基因组序列设计PCR引物。
gumD缺失:缺失gumD基因的策略利用天然存在的编码区约上游(5’)1650bp和下游(3’)1000bp的EcoRI限制性位点。在这些限制性位点外部设计PCR引物,并且这些位点与刚好在gumD编码序列内部的PCR引物靶向区域配对以产生具有同源性的上游和下游区域。为扩增上游同源的约1800bp,使用引物CAX114和CAX116。为扩增下游同源的约1100bp,使用引物CAX115和CAX117。用SbfI限制性位点(下文下划线的)修正gumD编码区末端的两个中间引物。
CAX114CCTGCAGGGTCGAACACTCGCAAGACCAGG(SEQIDNO:64)
CAX115CCTGCAGGTATCCGCATCATCGTGCTGACG(SEQIDNO:65)
CAX116CCTTGGTGATGGTGTGGCG(SEQIDNO:66)
CAX117GCCCATCCACGACTCGAACG(SEQIDNO:67)
用PfuUltraII聚合酶(Stratagene)进行PCR反应:在95℃变性(20秒),在62℃退火(20秒)和在72℃延伸(30秒),30个循环。模板由100ng野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(菌株ATCC13951;“Xcc”)的基因组DNA组成。将PCR片段克隆到pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)中并转化到大肠杆菌TOP10(Invitrogen)。上游同源克隆的相关序列与PCR产物的序列相配,但此共享序列与公开的Xcc序列的此区域(除引物)有两个碱基对的不同。公开的序列包含少数的不正确的指配是可能的。下游同源克隆的相关序列与它的PCR产物的序列和公开的Xcc序列的此区域(引物除外)相一致。
在黄单胞菌中使用“pop-in/pop-out”机制构建特定基因缺失的策略是基于质粒pCM184的一个衍生物(Marx,C.J.,和Lidstrom,M.E.,BioTechniques33(5):1062-1067,2002)。质粒pCM184由以下组成:ColE1复制子,它允许质粒在大肠杆菌中复制,但不能在黄单胞菌(或其他非肠细菌)中复制;OriT区域,用于在革兰氏阴性细菌中接合转移;氨苄青霉素和四环素的抗性基因,加上两侧为loxP序列的卡那霉素抗性基因(Kanr)。设计该质粒用于在非-大肠杆菌菌株中构建无标记的(不保留抗生素抗性基因)的缺失,但所描述的过程在缺失的位点留下小的loxP序列。但是,希望在本发明中构建的菌株不含不必要的序列,如loxP。因此,修饰pCM184以去除loxP位点和插入的卡那霉素抗性基因。这允许通过如上所述的“pop-in/pop-out”机制的变化,在黄单胞菌中使用所产生的衍生质粒构建所需的无标记的缺失。
用NotI加SacⅡ限制性酶(选择以去除loxP/Kanr/loxP区域但留下大多数限制性位点以备将来使用)消化约1.8μg的质粒pCM184,并将完成的反应物加热至75℃,持续15分钟以将酶失活。然后在12°C用T4DNA聚合酶(1.8U,NewEnglandBiolabs)加100μM的每种dNTP处理该样品(20μL)15分钟以填补NotI消化产生的单链粘端并剪去SacⅡ消化的粘端(即,构建平末端)。加入EDTA至10mM终止反应并在75℃加热20分钟。约170μg处理的质粒与400单位T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs)在10μL体积中在16℃反应4小时。随后用2.5USbfI处理连接反应物90分钟以消化不需要的DNA结构(例如改造的pCM184)。0.5μL体积的该反应物用于转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen),并铺板到LBTC5,在37℃温育过夜后产生大量菌落。限制性酶分析和DNA测序显示从一个选定菌落的细胞中所含的质粒具有所期望的结构:将该质粒命名为pCX027(SEQIDNO:141),并在图7B中图解。
用10USbfI在37℃消化包含针对gumD的上游和下游区域(上述)的克隆的PCR产物的质粒(各约2μg)2小时,然后相同的条件下用10UEcoRI(与酶特异性缓冲液)消化。热处理后(70℃20分钟),消化物进行琼脂糖凝胶电泳,并用QIAGENMini-Elute试剂盒纯化所需的片段(上游片段约1.6kb;下游片段约1.1kb)。在50μL反应中在37℃下用20UEcoRI消化质粒pCX027(约3.5μg)2.5小时,在一个60μL反应中在37℃用约18U南极磷酸酶(NewEnglandBiolabs)处理15分钟,然后在70℃加热20分钟。在10μL反应物中在16℃将处理的pCX027、纯化的gumD的上游和下游片段各约100ng进行三者的连接约20小时。将一半的这种反应物转化大肠杆菌DHα(Stratagene),然后在37℃铺入LBAP100或LBTC5板。分别使用与上游和下游序列中的区域同源的引物CAX122和CAX119进行菌落PCR(如上所述)以确定具有所需结构的克隆。
CAX119GACCAATGACACGATGATCG(SEQIDNO:68)
CAX122GCATCCGCTACAACATGCTC(SEQIDNO:69)
在几个菌落中检测到预期大小(1169bp)的PCR产物,并通过限制性分析证实了所需的结构。将配对的同源区域的方向(作为gum基因阅读框的方向)与载体Tetr基因的方向相同或相反的质粒分别命名为pCX030和pCX031。
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(“Xcc”;B-1459来自ARSCultureCollection(NCUAR),Peoria,IL;也称为ATCC13951)在30°C在营养培养液(NB,Difco)中生长过夜(除非另外指出,所有Xcc菌株在30°C生长),在新鲜NB中1:5稀释,和100μL等分试样涂布到含有100μg/mL链霉素(str)的营养琼脂(NA,Difco)平板上,然后在30℃下温育。数天后,以每107最初铺板的细胞约1个的频率检测到菌落。通过划线到NAstr50板纯化了几个自发的链霉素抗性Xcc菌株,并将一个这样的分离株命名为MSC116。
通过电穿孔(Oshiro等,J.Microbiol.Method2006;65:171-179)将质粒pCX030或pCX031转移到Xcc菌株MSC116中。分别从pCX030(4.1×104/μg)和pCX031(3.1×104/μg)的转化体获得四环素抗性菌落(TcR)。从分离的来自pCX031转化的TcR菌株制备基因组DNA,并通过PCR评估pCX031整合的位点。选择引物对以确定pCX031中使用的上游区域外部的基因组序列与下游区域的连接和pCX031中使用的下游区域外部的序列与上游区域的连接。具体地,引物CAX116(上游区域的“外部引物”)加CAX119(在下游同源区,见上文)用于测试上游连接,和CAX117(下游区域的“外部引物”;见上文)加CAX122(在上游同源区,见上文)用于测试下游连接。用GoTaqDNA聚合酶(Promega,Madison,WI),各0.5μM的引物,各250μM的dNTP,1000ng的DNA模板和0.5U的酶进行PCR。反应条件包括在94℃4分钟的初始变性,在94℃,15秒变性,在55℃,30秒退火,和在72℃,4分钟延伸,30个循环;和2分钟的最后延伸。鉴定“Pop-in”分离株的pCX031的上游和下游整合。将2个分离的“Pop-in”菌株命名为MSC221和MSC222。在30℃将这些菌株接种到LBLS(10g/L细菌用蛋白胨、5g/LNaCl、5g/L酵母提取物、无抗生素)上生长,然后用1:1000稀释以48小时的间隔三次传代培养到相同的培养基中。稀释由此产生的培养物,并将等分试样涂布到NAStr50板。将得到的菌落转移到NA和NATC5板。从2个菌株均观察到2%的频率的TcS菌株。使用如上所述的引物对(CAX116加CAX119和CAX117加CAX122),对选定的TcS菌株的菌落PCR分析证明了所有的测试菌株均具有gumD的缺失。将这些来自MSC221和MSC222的分离的“pop-out”菌株分别命名为MSC225和MSC226。MSC225和MSC226在琼脂平板上的菌落相对于MSC116亲本菌株的菌落是明显非粘液性的。
黄原胶生物合成基因簇的缺失:gumB到gumM生物合成簇的缺失主要遵循为缺失gumD基因详述的相同的步骤。分别用引物CAX136xCAX137(1434bp)和CAX138xCAX139(1420bp)通过PCR构建gumB的上游和gumM的下游同源区,整合一个为克隆到pCX027的BglⅡ限制性位点和用于上游和下游片段之间融合的NotI位点。NotI位点的融合将构建一个gumB的5'端和gumM编码序列的3'端组成的53个氨基酸的多肽的开放阅读框。限制性位点是下划线的:CAX136和CAX139中的BglⅡ;CAX137和CAX138中的NotI。
CAX136AGATCTGGCGGTAACAGGGGATTGGC(SEQIDNO:70)
CAX137GCGGCCGCCAAGACGGTATTCGGGCTGC(SEQIDNO:71)
CAX138GCGGCCGCGATCTGCTGGTGTTCTTCCGC(SEQIDNO:72)
CAX139AGATCTCCTACCGACCAGGCATTGGC(SEQIDNO:73)
用PfuUltraII聚合酶(Stratagene)进行PCR扩增上游和下游片段。反应条件包括在94℃4分钟的初始变性,在95℃,20秒变性,在57℃,30秒退火,在72℃,30分钟延伸,30个循环;和72℃,5分钟的最后延伸。模板由100ng野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(菌株ATCC13951;“Xcc”)的基因组DNA组成。将PCR片段克隆到pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)中,并转化到大肠杆菌TOP10(Invitrogen)。上游同源克隆的相关序列与PCR产物的序列相配,但此共享序列与Xcc菌株ATCC33913的公开序列的此区域(引物除外)有14个碱基对的不同。这些序列差异可能反映了B-1459/ATCC13951和ATCC33913基因组之间的细微差别。下游同源克隆的相关序列与PCR产物的序列相一致而且此序列与公开的XccATCC33913序列的此区域(引物除外)没有差异。将包含gumB(上述)的上游区域和gumM(上述)的下游区域的克隆的PCR产物的质粒(各约1μg)在37℃用7.5UNotI和7.5UBglⅡ消化2小时。消化物进行琼脂糖凝胶电泳,并用QIAGENMini-Elute试剂盒纯化所需的片段(各约1.4kb)。在15μL反应物中在37℃用15UBglⅡ消化质粒pCX027(约1.0μg)2小时,在75μL反应物中在37℃用约5U南极磷酸酶(NewEnglandBiolabs)处理15分钟,然后在65℃加热10分钟。BglⅡ消化的pCX027纯化后,在20μL反应物中在室温下将纯化的pCX027、gumB的上游片段和gumM的下游片段进行三者的连接3小时。将一半的反应混合物转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen),然后在37℃铺入LBAp100或LBTc5板。使用CAX140(上游同源区中)和CAX145(下游同源区中)进行菌落PCR(如上所述的)以确定具有所需结构的克隆。
CAX140CCGAATTTCCGAGCCTGG(SEQIDNO:74)
CAX145GCCCGCTCGCTTCGTCG(SEQIDNO:75)
用QIAGENQiaprepSpinMiniprep试剂盒从PCR阳性克隆制备质粒,并用BglII、NdeI或NcoI消化以确认质粒的结构,包括其在上游和下游序列中的同源区的方向。将其中的配对的同源区的方向与载体的Tetr基因的方向相同或相反的质粒分别命名为pKM001和pKM002。
通过电穿孔将质粒pKM001或pKM002转移到Xcc菌株MSC116(Oshiro等,J.Microbiol.Method2006;65:171-179)。从pKM001(5.3×103/μg)和pKM002(5.0×103/μg)的转化体分别获得TcR菌落。从来自pKM001转化体的分离的TCR菌株制备基因组DNA并通过PCR评估pKM001整合位点。选择引物对以确定pKM001中使用的上游区域外部的基因组序列与下游区域的连接和pKM001中使用的下游区域外部的序列与上游区域的连接。具体地,引物prKM001(用于上游区域的“外部引物”,见下文)加CAX145(在下游同源区,见上文)用于测试上游连接,和prKM002(用于下游区域的“外部引物”;见下文)加CAX142(在上游同源区,见下文)用于测试下游连接。
prKM001ACGTGGATGCGGTCGTCGC(SEQIDNO:76)
prKM003GGGGCTTGCGGGTCGGC(SEQIDNO:77)
CAX142CGTATGCTGAGAATGACGACC(SEQIDNO:78)
用GoTaqDNA聚合酶(Promega),各0.5μM的引物,各250μM的dNTP,600-1000ng的DNA模板和0.5U的酶进行PCR。反应条件包括在94℃5分钟的初始变性,在94℃,15秒变性,在55℃,30秒退火,在72℃,4分钟延伸,30个循环;和2分钟的最后延伸。鉴定“Pop-in”分离株的pKM001的上游整合。将这些分离的菌株命名为MSC242、MSC247和MSC248。
将MSC242、MSC247和MSC248接种到LBLS培养基中在30℃生长,然后使用1:1000稀释间隔48小时在相同的培养基中传代培养三次。稀释由此产生的培养物,并将等分试样涂布到NAStr50板。将得到的菌落转移到NA和NATc5板。从3个菌株观察到1-2%的频率的TcS菌株。使用prKM001加CAX145用于上游连接和prKM003加CAX142用于下游连接(见上文),通过PCR评价了选定的TcS菌株的基因组结构以确认从gumB到gumM的黄原胶合成基因的缺失。用HerculaseII融合DNA聚合酶(Stratagene)进行PCR,使用每种引物0.25μM、每种dNTP250μM、500-700ngDNA模板和0.5单位的酶。反应条件包括在98℃4分钟的初始变性,在98℃,20秒变性,在60℃,20秒退火,在72℃,2分钟延伸,30个循环;和4分钟的最后延伸。三个“pop-out”菌株(每个“pop-in”菌株各一个)显示PCR产物与黄原胶生物合成基因簇缺失相一致。将这些来自MSC242、MSC247和MSC248的黄原胶生物合成基因缺失“pop-out”菌株分别命名为MSC255、MSC256和MSC257。MSC255、MSC256和MSC257在琼脂平板上的菌落相对于MSC116亲本菌株的菌落是明显非粘液性的。
大肠杆菌B
大肠杆菌BL21(DE3),野生型大肠杆菌B(ATCC11303)的一种衍生物,的基因组据报道包含非活性的2组荚膜基因簇,其中区域1和3是完整的(并有功能),但区域2是被破坏的和非功能性的(Andreishcheva,E.N.和Vann,W.F.,Gene2006;384:113-119)。鉴于区域2的基因是聚合物-特异性的而区域1和3的基因是通用而不太特异的,通过仅提供K4区域2的基因在质粒上或整合到染色体中(见下文),大肠杆菌B就可以工程化来合成软骨素。为了提高大肠杆菌B作为软骨素产生宿主的效用,如上文对于大肠杆菌K-12所述的通过基因突变消除了可拉酸的产生。
可拉酸操纵子的缺失:按照上文所述用于K-12菌株的方法缺失大肠杆菌B可拉酸操纵子。在本发明的时候,大肠杆菌B基因组序列尚未公开。虽然K-12和B菌株是密切相关的,但预期在DNA序列上存在一些差异。因此,需要构建新的上游和下游同源区,并使用现有的用于菌株K-12的引物。具体地,用引物对CAX128xCAX129和CAX130xCAX131的PCR和大肠杆菌B基因组DNA模板用于分别产生上游和下游同源区。获得大小约1kb的产物,克隆并测序。在非-引物序列中,上游同源区(944bp)与K-12上游区只有2个碱基(转换)的不同,而下游同源区(911bp)有30个碱基(24转换,6颠换)的不同。将上游和下游片段克隆到pMAK705生成pMAK-BCL。
通过电穿孔将质粒pMAK-BCL导入大肠杆菌B。用新鲜菌落接种LB培养基并在37℃剧烈振荡温育过夜。为某个体积的新鲜、预热的LB接种过夜培养物到初始OD600读数为0.03(BioPhotometer,Eppendorf)。将培养物生长至OD600≈0.8,然后在冰上冷却约30-40分钟。通过离心(10分钟,4000g)收集细胞,通过将细胞重悬于初始体积的冰冷的去离子水,接着再离心洗涤细胞两次。最后离心后的细胞悬浮在1/500th体积的冰冷的水中。将pMAK-BCL(200ng)加入到50μL制备的大肠杆菌B悬浮液中并在冰上温育约20分钟。用GenePulserXcell(BioRad)在0.1mm间隙小杯中,在25μF、200Ω、和1.8kV的设置,产生4.5-5.0msec的持续时间进行电穿孔。用350μLSOC培养基(Maniatis,1989)稀释脉冲后的细胞,并在37℃温育1小时,然后将5-10μL涂布到LBCm34琼脂板在43℃温育。将2天后出现的菌落(代表着“pop-in”候选)在43℃划线到LBCm34琼脂平板,并将所得的菌落接种到LB培养基(无Cm)在30℃生长和系列传代。测试来自这些培养物的克隆的Cm敏感性,并确定了“pop-out”候选株。菌落PCR用于表征候选株。使用引物对CAX129xCAX132、CAX131xCAX132、CAX132xCAX135、CAX129×CAX135、和CAX162xCAX163发现一分离株得到了预期的PCR产物。将此缺失可拉酸基因簇的E.coliB分离株命名为MSC364。
实施例4
表达载体的构建
已经描述了大肠杆菌特异性的充分表征的高拷贝数和低拷贝数质粒载体(Balbas和Bolivar,MethodsEnzymol.1990;185:14-37,Das,MethodsEnzymol.1990;182:93-112,Mardanov等,Gene2007;15(395):15-21)。这样的载体采用了多种充分表征的在大肠杆菌中用于受调控基因表达的启动子系统。此外,基于广泛宿主范围质粒,如在大肠杆菌、野油菜黄单胞菌和各种各样的其他革兰氏阴性细菌中发挥功能的RK2(低拷贝数IncP)和RSF1010(高拷贝数IncQ)的允许接合转移的质粒载体也是可获得的(Franklin和Spooner,PromiscuousplasmidsinGram-negativebacteriaAcademicPress(London)1989pp247-267,Mather等,Gene1995;15:85-88,Haugen等,Plasmid1995;33:27-39.Mermod等,JBact.1986;167:447-454)。可以将合成的软骨素的生物合成基因集克隆到这些多功能的广泛宿主范围载体,使得相同的质粒可在包括野油菜黄单胞菌、少动鞘氨醇单胞菌、恶臭假单胞菌和非致病性大肠杆菌的广泛的革兰阴性细菌中用于基因转移和表达(Guiney和Lanka,PromiscuousplasmidsinGram-negativebacteriaAcademicPress(London)1989pp27-54)。
许多有用的基于IncP的载体来自于RK2,一种最初分离自临床假单胞菌分离株并随后显示能够转移自己进入几乎所有测试的革兰氏阴性细菌并在其中发挥功能的接合自转移质粒。已经构建了较小的RK2衍生物,其是稳定的复制子,当从第二质粒提供反式“辅助”功能时能够接合转移。一种这样的质粒是pFF1(Durland等,J.Bact.1990;172:3859-3867)。一些该质粒有用的衍生物已被描述,其中之一是pJB653(Blatny等,Appl.Enviorn.Micro.1997;63:370-379),其中增加了假单胞菌TOL质粒的Pm启动子和调节基因xylS以提供在多种革兰阴性细菌中显示功能的强有力的、良好调节的启动子。该载体和相关构建体是美国专利第6258565号的材料。各种基于IncQ的质粒载体源自RSF1010,一个最初分离自恶臭假单胞菌的8.7kb的质粒。RSF1010可以在大肠杆菌和各种革兰氏阴性细菌中增殖。携带Pm启动子和xylS调节蛋白的RSF1010衍生物已经构建和描述。质粒pNM185(Mermod等,J.Bact.1986;167:447-454)是一个携带Pm启动子和xylS调节基因的RSF1010衍生物。
Schumann等(Plasmid2005;54:241-248)描述了一系列允许重组蛋白稳定细胞内表达的基于质粒的枯草芽孢杆菌表达载体。这些表达载体是基于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pMTLBS72,它作为θ环在枯草芽孢杆菌中复制,并因此比经滚环机制复制的典型的枯草芽孢杆菌质粒,如pUB110更稳定。已经描述了该质粒的衍生物,其含有组成型启动子PlepA、能够由热和酸休克和由乙醇诱导的PgsiB启动子、和分别相应于木糖和IPTG的加入的PxylA和Pspac启动子。
据报道与IncP和IncQ质粒兼容的广泛宿主范围质粒pBHR1(Szpirer等,J.Bacteriol.2001;183:2101-10)购自MoBiTecGmbH(Goettingen,Germany)。该质粒进行了修改以构建一个使用上面提到的Pm/xylS表达系统的载体(pDD54)。构建基于pBHR1的表达载体的第一步是去除该质粒中存在的卡那霉素抗性(KanR)基因。这是理想的,因为pRK2013,一个可直接用于pBHR1和衍生物接合转移的质粒,同样携带KanR基因。此外,该基因和侧翼序列的缺失有利于下面详述的某些后续的克隆步骤。pBHR1还携带有一个赋予氯霉素抗性的基因(CamR),该抗生素可用于代替卡那霉素来选择该质粒。从用SbfI消化的pBHR1(如图8A图解的)制备质粒DNA,通过连接消化产物和筛选氯霉素抗性、卡那霉素敏感的转化体去除含有KanR基因的1.2kbSbfI片段。将来自一个这样的转化体的质粒命名为pDD39(参见图8A)并用于进一步的构建步骤。
通过PCR从恶臭假单胞菌ATCC33015制备的pWW0(TOL质粒)DNA扩增正调节由Pm启动子的表达的xylS基因。根据制造商的方案使用QIAGEN质粒Mini试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)从20mL恶臭假单胞菌ATCC33015的新鲜过夜培养物分离4μgpWW0DNA。该DNA制备物用作PCR反应的模板,该PCR反应扩增作为两个片段,随后通过后续PCR剪接反应连接在一起的xylS基因和侧翼DNA序列。此过程利于在xylS的翻译终止密码子的下游(3’-)9个碱基对处加入一个NsiI位点。在PCR的初始循环,一个反应(反应A)使用DHD197引物(SEQIDNO:103)和DHD201(SEQIDNO:104)而第二反应(反应B)使用引物DHD200(SEQIDNO:105)和DHD198(SEQIDNO:106)。这些引物的序列如下所示:
DHD1975>GCACTGCAGATCCCCTTTATCCGCC>3(SEQIDNO:103)
DHD1985>GCACTGCAGATCCACATCCTTGAAGGC>3(SEQIDNO:106)
DHD2005>GATTACGAACGATGCATAGCCGAAGAAGGGATGGGTTG>3(SEQIDNO:105)
DHD2015>CTTCTTCGGCTATGCATCGTTCGTAATCAAGCCACTTCC>3(SEQIDNO:104)
根据制造商的方案使用PfuUltraII聚合酶(STRATAGENE,LaJolla,CA)进行PCR反应。在各100μL的反应中,加入引物至终浓度各0.4μM,加入dNTP至终浓度各200μM,并加入10ngpWW0DNA作为模板。使用以下循环参数在Perkin-ElmerGeneAmp2400热循环仪中进行PCR反应:95℃2分钟,1个循环;95℃20秒,60℃20秒,和72℃45秒,30个循环;72℃3分钟,1个循环;和4℃保温。通过琼脂糖凝胶电泳分析这些反应产物。观察到的PCR产物的大小均与反应A(1259bp)和反应B(422bp)的产物的预期大小一致。
根据制造商的方案使用QiagenQIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)纯化这些反应的产物,每1mL无菌蒸馏去离子水中各加入1μL。向50μL这种混合物中加入10μL10XPfuUltraⅡ反应缓冲液,10μLdNTP(各10mM)储存液,10μLDHD197(4μM)储存液,10μLDHD198(4μM)储存液,16μL无菌蒸馏去离子水和2μLPfuUltraII聚合酶。对于反应A和B,使用上述程序进行PCR反应。根据制造商的方案使用QiagenQIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)纯化该反应的产物并通过琼脂糖凝胶电泳分析。在与PCR剪接反应产物的预期大小一致的位置,1610bp,观察到强的条带。根据制造商的方案使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)从凝胶上切下该条带。
根据制造商的方案将该PCR片段克隆到pCR-BluntII-TOPO克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)。所得的质粒命名为pDD42并如图8A所图解。PCR引物DHD197和DHD198在距1610bp片段每一端3个碱基对的位置加入PstI位点。确定了pDD42中PstI片段的序列(SEQIDNO:107)。该序列与基于报道的pWW0序列(GenBank,AJ344068)的xylS基因的预期序列相匹配并显示加入了源自引物DHD200和DHD201的5个碱基对,其导致在xylS翻译终止密码子的下游(3')9个碱基对处构建出一个NsiI位点。在xylS下游的非编码区,在pDD42中的克隆的PstI片段与GenBank,AJ344068报道序列之间观察到两个序列差异。在xylS基因TGA终止密码子的3’119和181bp处观察到G残基的插入。这些序列差异发生在xylS和xylH基因间的间隔区域内。
从pDD42切除含有xylS基因的PstI片段,凝胶纯化并克隆到pDD39的SbfI位点。PstI和SbfI酶产生了可以连接起来的具有相同的4个碱基突出端的消化产物,但破坏了得到的重组体中的SbfI识别位点。将含有包含于pDD42的PstI片段上的xylS基因的pDD39衍生物命名为pDD47并于图8A中示出。
使用DNA2.0(Carlsbad,CA)从头(denove)合成了一条470bp的DNA片段(SEQIDNO:79),其包含覆盖结合RNA聚合酶所需的最小Pm启动子序列的约90bp的TOL质粒DNA序列和XylS蛋白(Dominguez-Cuevas等,2008)及合成的上游和下游转录终止子和多个用于将基因克隆于Pm启动子紧邻下游的限制性位点。图8B展示了包含克隆于DNA2.0pJ201载体的此470bp片段的pJ201:11352。含启动子片段设计为侧翼为AccI位点以允许克隆入位于pBHR1及衍生的pDD47质粒的兼容的,并据说是唯一的BstBI位点。然而,消化pDD47,并随后消化pBHR1,揭示了存在两个BstBI位点。由此可见,如文献报道的pBHR1序列(GenBank:Y14439.1)并不是完全正确的。由于这种误差,需要额外的克隆步骤以增加克隆的Pm启动子到pDD47。
如图8A所示,pDD47包含唯一的EcoRI和AgeI位点,在靶向用于插入启动子的注释的BstBI位点的侧翼。它还包含一个在AgeI位点下游的NgoMIV位点。切出pDD47的763bp的EcoRI-NgoMIV片段,并克隆到EcoRI-NgoMIV切割的pREZ6以生成pDD49(图8B)。pREZ6,也图解于图8B,是pBluescriptSK+(Stratagene,LaJolla,CA)的衍生物,其中在pBluescriptSK+的唯一DraIII位点插入一个短的多聚接头序列(ttaattaagggtttaaactac(SEQIDNO:142))。在此构建体中,感兴趣的BstBI是唯一的,所以切出包含Pm启动子的pJ201:11352的AccI片段并克隆到pDD49的BstBI位点构建pDD50。接着,切出pDD50的EcoRI-AgeI片段并与pDD47的5055bp的EcoRI-AgeI片段连接以构建如图8C所示的表达载体pDD54。在K4荚膜基因的初始克隆中使用pDD54作为表达载体以转移到如下文及实施例6、7、8和9所述的替代宿主中并在其中表达。
从合成供应商DNA2.0(Carlsbad,CA)得到三条合成的基因片段kpsFEDUCS(FS片段)、kpsMTkfoABCFG(MG片段)和kfoDIEH(DH片段)。合成DNA以克隆于质粒载体pJ241中的片段形式提供。图8D显示出这些构建体的质粒图。合成的基因装配成随后克隆到pDD54的单一操纵子。在此过程的第一步骤是将FS和MG片段结合成单一的片段。通过在质粒载体pJ241上以不同的排列结合FS片段和MG片段构建了两个质粒。
根据制造商的方案使用QIAEXII凝胶提取试剂盒(QiagenInc.,Valencia,CA),用SbfI+BglⅡ消化等分试样的pJ241:10662和pJ241:10664质粒,用碱性磷酸酶处理和凝胶纯化。同时,用SbfI加BamHI消化等分试样的pJ241:10662和pJ241:10664DNA并如上所述凝胶纯化产生的分别包含合成的MG和FS基因片段的约9.1kb的和约8.0kb的SbfI-BamHI片段。凝胶纯化约9.1kb的SbfI–BamHIMG片段连接到SbfI加BglⅡ消化并磷酸酶处理的包含FS基因片段的pJ241:10664载体。虽然BamHI和BglⅡ酶识别不同的序列,分别为GGATCCvsAGATCT,它们产生相同的4bp粘端(GATC)并因此消化产物可以连接在一起,但产生的连接产物随后不能由两种酶中的任一种识别。产生的重组质粒,命名为pDD37,如图8E所示。该构建体保留合成基因5'的SbfI位点和合成基因3'的存在于pJ241:10664的BamHI位点。因此合成的基因集kpsMTkfoABCFGkpsFEDUCS(MGFS片段)可以作为约17.1kb的SbfI-BamHI片段被切出。类似地,将凝胶纯化的SbfI-BamHI约8.0kb的FS片段连接到SbfI和BglⅡ消化的和磷酸酶处理的包含MG基因片段的pJ241:10662载体中。产生的重组质粒,命名为pDD38,如图8E所示。再次,该构建体保留合成基因5'的SbfI位点和合成基因3'的存在于pJ241:10662的BamHI位点。因此,合成的基因集kpsFEDUCSkpsMTkfoABCFG(FSMG片段)可以作为约17.1kb的SbfI-BamHI片段被切出。
包含于pJ241:10663(参见图8D)的合成的基因kfoD、kfoI(或orf3)、kfoE和kfoH(orf1)(DH片段)克隆到质粒pDD37和pDD38。根据制造商的方案使用QIAEXII凝胶提取试剂盒(QiagenInc.,Valencia,CA),用EcoRI消化质粒pDD37和pDD38,用碱性磷酸酶处理和凝胶纯化。在这些质粒每一个中的特有的EcoRⅠ位点位于分离kfoC和kfoF的间隔区域。作为一个约4.2kb的EcoRI片段,从pJ241:10663切出含有合成基因kfoD、kfoI、kfoE和kfoH的DH片段并凝胶纯化。将该片段连接到经EcoRI-切割和磷酸酶处理的pDD37和pDD38两种质粒中。通过诊断性限制性酶切割测试产生的重组体中约4.2kb的EcoRI片段的方向。容易地获得了包含以正确方向加入DH片段的重组体。产生的来自pDD37的质粒pDD51和来自pDD38的质粒pDD52如图8F所示。这些构建体均包含所有的K4荚膜簇基因,但如图所示,两个质粒的基因顺序不同:在pDD51中基因顺序是kpsMTkfoABCDIEHFGkpsFEDUCS,在pDD52中基因顺序是kpsFEDUCSkpsMTkfoABCDIEHFG。在这两种情况下,整个K4基因集可以作为约21kb的SbfI-BamHI片段被切出。如上所述,将这些质粒的K4荚膜基因亚克隆到表达载体pDD54,以分别生成表达质粒pDD57和pDD58。这些质粒均示于如图8G。根据制造商的方案使用QIAEXII凝胶提取试剂盒(QiagenInc.,Valencia,CA),作为约21kb的SbfI-BamHI片段,从pDD51和pDD52切出整个合成的K4荚膜基因集,凝胶纯化并克隆到SbfI-BamHI消化的pDD54。
在pDD57和pDD58中,整个K4荚膜基因集(17个基因)是在Pm启动子和XylS基因编码的XylS调节蛋白的控制下。pDD54和pDD58质粒最初构建于大肠杆菌“TOP10”菌株,一种包含可提高其基因克隆效用的大量突变的市售菌株(Invitrogen,Carlsbad,CA)。质粒也随后转入另一通常用于重组DNA实验的大肠杆菌宿主(“DH5α”)。这些大肠杆菌菌株不是开发成为生产平台的理想候选。因此,在最初的实验中,将pDD54和pDD58转入更合适的大肠杆菌K-12菌株和如下实施例6描述的测试产生的菌株的软骨素产生。
通过修改pDD57和pDD58还构建了其他的表达质粒。如下详述的,将四环素抗性基因添加到表达质粒pDD57和pDD58中。四环素抗性作为质粒引入和保持的选择剂潜在具有两个优势。首先,四环素抗性(TcR)对于质粒保持通常是一个更严格的选择,这是因为抗性机制是基于将抗生素转运出细胞,而不是像氯霉素和许多其他抗生素一样基于对抗生素的失活。因此,培养基中选择剂的有效浓度不能由细胞生长和代谢改变。其次,自发的赋予四环素抗性的染色体突变是罕见的,而且在野油菜黄单胞菌中没有观察到。相反,在如实施例6描述的那些质粒转移实验中,在野油菜黄单胞菌中观察到了自发的赋予氯霉素抗性的染色体突变。这些突变可能会掩盖获得了感兴趣质粒的CmR转化体/接合后体,例如pDD57或pDD58。
通过加入一个基因修改表达质粒pDD57和pDD58,该基因赋予四环素抗性性质(TcR),同时保留这些质粒的氯霉素抗性性质(CmR)。PCR扩增质粒pCX027(上述实施例3和图7B描述的)和源自大肠杆菌质粒载体pBR322的四环素抗性基因(tetR),并克隆到pDD57和pDD58的唯一BamHI位点。在扩增和克隆tetR基因的过程中,该基因作如下修饰。PCR引物在tetR基因的5’端、启动子的上游添加一个BglⅡ位点,和在tetR终止密码子的3’端加一个BamHI位点。引物进一步修饰基因以消除内部BamHI位点(不改变蛋白的氨基酸序列),并消除通常存在于扩增片段的所谓的“反-tet”启动子。该启动子位于tetR启动子附近但在相反方向上指导转录(Balbás等,Gene1986;50:3-40)。进行两次PCR反应构建修饰的tetR基因,PCR反应扩增tetR基因的两条重叠片段并引入所需的序列改变。随后,由随后的PCR剪接反应连接这两个片段以生成tetR基因和所需序列的启动子区,其在tetR基因5’端、启动子的上游具有BglⅡ位点,并在tetR翻译终止密码子3’具有一个BamHI位点。
第一个PCR反应(反应A)使用引物DHD218(SEQIDNO:113)和DHD219(SEQIDNO:114)扩增包括tetR编码序列的氨基端部分和上游启动子序列的约400bp的DNA。第二个反应(反应B)使用引物DHD220(SEQIDNO:115)和DHD221(SEQIDNO:116)扩增包括tetR编码序列的其余部分和翻译终止密码子的约900bp的DNA。这些引物的序列如下图所示。DHD218中所示的阴影序列取代存在于pCX027的序列ATCGATAAGCTT(SEQIDNO:141的核酸2843-2854),并如此做时,消除位于tetR启动子区域的ClaI和HindIII位点,并改变反-tet启动子-10区的序列。DHD219和DHD220互补的阴影序列构建一个消除pCX027的tetR基因的BamHI位点的沉默突变。该突变改变CTC亮氨酸密码子为TTG亮氨酸密码子并因此不改变TetR蛋白的氨基酸序列。
DHD2185>
GCGAGATCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGCTCGGCTTTAATGCGGTAGTTTATCAC>3(SEQIDNO:113)
DHD2195>CCGGCGTACAAGATCCACAGGACGGGTGTG>3(SEQIDNO:114)
DHD2205>CTGTGGATCTTGTACGCCGGACGCATCGTG>3(SEQIDNO:115)
DHD2215>GCGGATCCTTCCATTCAGGTCGAGGTG>3(SEQIDNO:116)
使用PfuUltraII聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA)进行PCR反应A和B。在每40μL反应中,加入Pfu反应缓冲液(由制造商提供)至终浓度为1X,加入引物至终浓度各0.4μM,加入dNTPs至终浓度各200μM,加入1ngpCX027质粒DNA作为模板,并加入2.5单位的PfuUltraII聚合酶。使用以下循环参数,在Gradient96热循环仪(Stratagene,LaJolla,CA)中进行PCR反应A和B:95℃1分钟,1个循环;95℃30秒,55℃30秒,和72℃30秒,30个循环;72℃5分钟,1个循环;和6℃保温。根据制造商的方案使用QiagenQIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)纯化这些反应的产物,并进行琼脂糖凝胶电泳分析。观察的PCR产物的大小与反应A(395bp)和反应B(920bp)产物的预期大小相一致。从凝胶上切出这些片段并根据制造商的方案使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)从凝胶切片洗脱,并回收于30μL的EB洗脱缓冲液中。凝胶纯化片段作为后续PCR剪接反应,SP反应的模板。在50μL反应中,加入Pfu反应缓冲液至终浓度为1X,加入引物至终浓度各0.4μM,加入dNTPs至终浓度各200μM,各加入3μL反应A和B的凝胶纯化反应产物作为模板,并加入2.5单位的PfuUltraII聚合酶。使用以下循环参数在Gradient96热循环仪(Stratagene,LaJolla,CA)中进行SPPCR反应:95℃1分钟,1个循环;95℃30秒,55℃30秒,和72℃30秒,30个循环;72℃5分钟,1个循环;和6℃保温。根据制造商的方案使用QiagenQIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)纯化该反应的产物,并进行琼脂糖凝胶电泳分析。在与PCR剪接反应产物的预期大小,1295bp相一致的位置上。观察到强的条带。
用BglⅡ和BamHⅠ消化PCR产物并与BamHI-消化的pDD57和pDD58连接。连接产物用于转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen,Carlsbad,CA)并在含10μg/mL四环素的LB平板上置于30℃选择已经获得四环素抗性的转化体。通过诊断性PCR反应和限制性消化筛选所得的四环素抗性转化体以确定存在tetR基因并决定其方向。确定具有所需结构的质粒并命名为pDD61(pDD57::tetR)(SEQIDNO:143)和pDD62(pDD58::tetR)(SEQIDNO:144)。这些质粒的图谱如图8H所示。类似的将tetR基因插入载体pDD54的BamHI位点以产生pDD63,如图8I所示。该质粒可作为任何表达克隆的K4基因的TcR质粒的实验的仅TcR载体对照。
合成的基因集包含允许将构建的任何感兴趣的基因非极性缺失的限制性位点。通过去除单一的4.2kbEcoRI片段去除四个基因kfoDIEH的组合。从表达质粒pDD57和pDD58和如上所述的它们各自的TcR衍生物,pDD61和pDD62去除该4.2kb的EcoRI片段。这4个质粒,如图8G和8H所示,均包含3个EcoRI位点。两个位点定义感兴趣的4.2kb片段而第三个位点于赋予氯霉素抗性(CMR)的质粒基因的编码序列内部切割。用EcoRI完全消化每种质粒并重新连接所得的消化产物。转化连接产物后,选择CmR转化体并用限制性核酸内切酶消化分析。在所有情况下,容易地获得了缺失4.2kb的EcoRI片段的质粒。质粒pDD59、pDD60、pDD67和pDD66分别为pDD57、pDD58、pDD61和pDD62缺失4.2kb的EcoRI片段的衍生物,而且均缺失kfoDIEH基因。这些质粒描绘于图8J。
克隆的K4基因(参见下文实施例5)的表达的Western印迹分析表明在含有pDD66的大肠杆菌菌株中,HpsFEDUCS基因的表达不是最优。因此,修饰pDD66以在kfoG和kpsF间的间隔区域整合一个启动子(Pm)。在pDD66中,如图8K所示该间隔区域含有一个唯一的PacI位点和两个ClaI位点。用PacI和ClaI消化,切出2个片段,一个34bp的ClaI片段和一个12bp的ClaI-PacI片段并在较大的载体片段上留下ClaI和PacI末端。将一个具有序列:
TTAATTAATGTTTCTGTTGCATAAAGCCTAAGGGGTAGGCCTTTCTAGAGATAGCCATTTTTTGCACTCCTGTATCCGCTTCTTGCAAGGCTGGACTTATCCCTATCAAACCGGACACTGCATCGAT(SEQIDNO:80),的127bp的PacI–ClaIDNA片段插入ClaI-PacI消化的pDD66载体片段以产生pBR1052。加入的127bpPacI-ClaI片段包括一个拷贝的Pm启动子序列。如图8K所示,定向在pBR1052中加入的Pm启动子拷贝使得该启动子的转录起始能够产生包含kpsFEDUCS基因的RNA转录物。
上面已经描述了表达质粒pDD66和pBR1052。为了将K4软骨素生物合成基因插入到染色体中(如下面实施例10所描述)构建基因替代载体,将来自pDD66和pBR1052的K4软骨素生物合成基因克隆到上面实施例3所述的pMAK-CL替换载体中。图8L图解的pMAK-CL载体包含克隆的可拉酸(CA)基因簇的上游和下游DNA区域和在这些区域的接合处的唯一AscI克隆位点。如实施例3详述的,该载体用于构建在大肠杆菌K-12W3110中整个CA基因簇的缺失以产生菌株MSC188。从pDD66和pBR1052切出K4基因表达盒并根据制造商的方案使用QIAEXII凝胶提取试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)凝胶纯化约19kb的AscI片段,并将这些片段与AscI消化的、磷酸酯酶处理的和凝胶纯化的pMAK-CLDNA连接。选择对四环素抗性的转化体。赋予四环素抗性的基因存在于pDD66和pBR1052的AscI片段上,带有Pm启动子及上游和下游的转录终止序列。鉴定包含pBR1052或pDD66的AscI片段的pMAK-CL衍生物并分别命名为pDD74和pDD76。这些质粒在图8L中图解。
通过PCR克隆大肠杆菌fhuA基因的上游(5')和下游(3')DNA区域,组装和测序,并将此缺失片段移入pMAK705自杀质粒构建一个用于fhuA基因座的替代载体,称为pMAK705-ΔfhuA,或pDD73(图8M)。通过PCR从大肠杆菌K-12菌株W3110制备的基因组DNA(参见实施例3)扩增fhuA基因上游和下游的DNA片段,并接着通过随后的PCR剪接反应将这两个片段连接起来。此过程利于在上游和下游的DNA片段的连接处添加一个PstⅠ位点。
在第一PCR反应(反应A)的初始循环使用引物DHD236(SEQIDNO:108)和DHD237-S(SEQIDNO:109)扩增约800bp的fhuA基因的上游DNA,而第二反应(反应B)使用引物DHD238-S(SEQIDNO:110)和DHD239(SEQIDNO:111)扩增约950bp的fhuA基因下游的DNA。这些引物的序列如下所示:
DHD2365>CGCAAGCTTCGTACCGAAAGATCAGTTGC>3(SEQIDNO:108)
DHD237-S5>
CCAAAAGAGAAATCTGCAGTAGATGGGATGTTATTTTACCG>3(SEQIDNO:109)
DHD238-S5>ACATCCCATCTACTGCAGATTTCTCTTTTGGGGCACGG>3(SEQIDNO:110)
DHA2395>GCTCTAGACATCTGCCATAACAACGGAG>3(SEQIDNO:111)
使用PfuUltraII聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA)进行PCR反应A。在50μL反应中,加入Pfu反应缓冲液(由制造商提供)至终浓度为1X,加入引物至终浓度各0.4μM,加入dNTPs至终浓度各200μM,加入50ngW3110基因组DNA作为模板并加入2.5单位的PfuUltraII聚合酶。使用以下循环参数在Gradient96热循环仪(Stratagene,LaJolla,CA)中进行PCR反应A:95℃1分钟,1个循环;95℃1分钟,55℃1分钟,和72℃1分钟,30个循环;72℃4分钟,1个循环;和6℃保温。
使用Herculase聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA)进行PCR反应B。在50μL反应中,加入Herculase反应缓冲液(由制造商提供)至终浓度为1X,加入引物至终浓度各0.4μM,加入dNTPs至终浓度各200μM,加入25ngW3110基因组DNA作为模板并加入2.5单位的Herculase聚合酶。使用以下循环参数在Gradient96热循环仪(Stratagene,LaJolla,CA)中进行PCR反应B:92℃2分钟,1个循环;95℃30秒,50℃30秒,和72℃1分钟,33个循环;68℃10分钟,1个循环;和6℃保温。
根据制造商的方案使用QIAGENQIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)纯化这些反应的产物,并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。观察到的PCR产物的大小均与反应A(832bp)和反应B(949bp)的产物的预期大小相一致。从凝胶上切出这些片段并根据制造商的方案使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)从凝胶切片洗脱,并回收于30μL的EB洗脱缓冲液中。凝胶纯化片段作为后续PCR剪接反应,SP反应的模板。在50μL反应中,加入Pfu反应缓冲液至终浓度为1X,加入引物至终浓度各0.4μM,加入dNTPs至终浓度各200μM,各加入3μL反应A和B的凝胶纯化反应产物作为模板,并加入2.5单位的PfuUltraII聚合酶。使用以下循环参数在Gradient96热循环仪(Stratagene,LaJolla,CA)中进行SPPCR反应:95℃1分钟,1个循环;95℃30秒,60℃30秒,和72℃40秒,33个循环;72℃5分钟,1个循环;和6℃保温。通过琼脂糖凝胶电泳分析该反应的产物。在与PCR剪接反应产物的预期大小1750bp相一致的位置上观察到强的条带。根据制造商的方案使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)从凝胶上切下此条带。然后使用制造商的方案将该片段克隆到pCR-BluntII-TOPO克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)并测定克隆的PstI片段的序列(SEQIDNO:112)。
将此序列与基于报道的W3110基因组序列(GenBank,AP009048)的fhuA基因上游和下游的DNA片段的预期序列匹配并显示在上游和下游片段的接合处添加了来自引物DHD237-S和DHD238-S的6bpPstⅠ位点。这也证实了分别来自引物DHD236和DHD239的在上游DNA片段5'端的HindⅢ位点和下游的DNA片段3'端的XbaⅠ位点的添加。从pCR-BluntII-TOPO载体切出序列验证的PCR片段并作为一条1739bp的HindⅢ-XbaⅠ片段进行凝胶纯化,并与用HindⅢ和XbaⅠ消化并使用制造商的方案用南极磷酸酶(NewEnglandBioLabs,Ipswich,MA)处理的温度敏感的pMAK705载体(参见实施例3)连接。连接产物用于转化大肠杆菌NEB5α(NewEnglandBioLabs,Ipswich,MA)和通过PstⅠ和XbaⅠ加HindⅢ消化分析获得自在pMAK705复制允许温度,30°C铺板的氯霉素抗性转化体以鉴定那些携带含有克隆的大肠杆菌fhuA基因上游和下游DNA区域的1739bpXbaI-HindⅢ片段的重组体。将一个这样的重组质粒命名为pDD73(图8M)并在随后的实验中使用。
将xylS调节基因克隆到如下的pDD73替代载体中。作为一个PstI片段将xylS基因从pDD42切出并克隆到pDD73的PstⅠ位点以产生pDD77,其在图8N中图解。包含xylS基因的pDD77的PstI片段与存在于表达质粒pDD66和pBR1052,亲本载体pDD54和pDD63即pDD54的四环素抗性衍生物中的含xylS的PstⅠ片段是相同的。
如下面实施例10详述的,设计并合成了xylS基因启动子合成的优化版本、核糖体结合位点、和5’非翻译区(UTR),并将那些修饰序列引入xylS替代载体pDD77并随后引入染色体中。由商业供应商(DNA2.0)合成一条257bp的BlpI-BglⅡ片段(SEQIDNO:140)并将含有修饰的序列的合成的DNA克隆到xylS替代载体,pDD77,作为BlpI-BglⅡ片段取代含有天然xylS调控序列的天然的BlpI-BglⅡ片段。将含有修饰的xylS的质粒称为pDD79(图8N)。
为了在fhuA基因座将一个拷贝的kfoABCFG基因片段插入到大肠杆菌K-12染色体中,构建了替代载体。在一个PstⅠ片段上从pCX039切出kfoABCFG基因片段(没有Pm启动子),并将该片段克隆到pDD79相容NsiI位点,在此质粒中NsiI是唯一的。在产生的质粒pDD80(图8O)中,由合成的xylS启动子转录kfoABCFG基因,该启动子是设计的一个强的组成型启动子。
为了评价单个基因或基因组合的功能,构建了pDD66和pDD67表达质粒的缺失衍生物。这些衍生物的构建利用了如上所述设计到合成的K4基因片段内的侧翼限制性酶位点。通过在10μL反应中用10USacI消化0.6μgDNA2小时,接着热处理反应(以使酶失活)并在12μL反应中连接(用1mMATP加T4DNA连接酶),从pDD66缺失kpsC基因(K4区域1)。通过在30℃铺入LBTc5,将该反应的一半转化到大肠杆菌DH5α(Invitrogen)中。在pDD66中,kpsC基因侧翼是SacI位点,但在载体中有第三个SacI位点使得消化产生第3个片段,其包含tetR基因但不含质粒复制起点。因此,预期TcR转化体包含至少由载体/起点片段加tetR片段组成的质粒。针对含有这两种SacI片段但缺失kpsCSacI片段的质粒筛选转化体,并用SalⅠ消化进一步筛选候选pDD66ΔkpsC克隆以获得那些具有前两个SacI片段所需方向的克隆。将一个这样的质粒命名为pCX045(图8P)。
pDD66中的kpsT基因(K4区域3)的侧翼为MluI限制性位点并且在该质粒中没有其他MluI位点。使用上面描述的那些类似的步骤,用MluI消化pDD66,随后进行再连接生成命名为pCX048的pDD66ΔkpsT衍生物(图8P)。
通过缺失K41区和3区的基因从pDD67(上文所述,参见图8J)构建了质粒pCX039。同时用酶PmlI和MluI(各10U)消化质粒pDD67(1.5μg),接着用T4DNA聚合酶(1.5单位)加dNTPs(各150μM)在12℃处理15分钟以填平MluI产生的粘端(留下平端)。用PmlI消化留下平端。随后用T4DNA连接酶温育处理的pDD67并转化到大肠杆菌TOP10(Invitrogen),然后进行Tet抗性选择和Cm抗性筛选。用引物DHD229和DHD231进行48个双抗生素抗性细菌落的菌落PCR。
DHD229AAGGCGACAAGGTGCTGATG(SEQIDNO:81)
DHD231CAATGCGACGGATGCTTTCG(SEQIDNO:82)。
如通过琼脂糖凝胶电泳确定的,48株分离株中的14株产生了为所需的构建体预期的接近678bp的PCR产物。八个选定的候选者中的六个中的质粒具有预期的大小(通过琼脂糖凝胶电泳),并且两个选择的质粒分离物包含PmlI/MluI连接处所期望的DNA序列。命名一个质粒为pCX039(图8Q)。其包含xylS加Pm启动子驱动的K4区域2基因kfoABCFG。
pCX039中的kfoB基因(加上其核糖体结合位点)两侧紧密连接BstBI限制性位点,并在载体骨架中有第三个BstBI站点。因此,用BstBI消化pCX039产生三个片段:kfoB基因片段,一个包括质粒复制起点、四环素抗性基因和kfoCFG基因的大片段、和一个包含Cm抗性基因加Pm/kfoA的片段(见图8Q)。为构建一个缺乏kfoB基因的pCX039衍生物,在65℃用BstBI(10U)完全消化质粒(600ng)90分钟。用MiniElute试剂盒(QIAGEN)以在12μL的洗脱缓冲液中的最终洗脱从反应中除去酶。大约250ng(5μL)该消化物用T4DNA连接酶温育并转化到大肠杆菌DH5α(Invitrogen)中并选择Cm抗性。通过CM抗性选择,应该得到包含至少大载体片段(即kfoCFG/起始)加Cm/Pm/kfoA片段的质粒。通过限制性消化分析了8个选择的转化体中的质粒,并发现5个缺乏kfoBBstBI片段并在所需的相应方向上具有其他两个片段。将在一个这样的分离物中的质粒命名为pCX044(图8Q;xylS加kfoACFG)。本领域技术人员将认识到通过BstBI酶的部分质粒消化能够获得相同的质粒结构。
如上在本实施例中所述,质粒pDD66和pDD67以不同的排列包含13个K4基因:pDD66–Pm/kpsMT/kfoABCFG/kpsFEDUCS;pDD67–Pm/kpsFEDUCS/kpsMT/kfoABCFG。大多数在这些质粒中的K4基因(连同它们各自的核糖体结合位点)两侧紧密连接在质粒中仅内切两或三次的限制性酶位点的对。这些特征(和上述的其他序列元件)允许单个K4基因的选择性的、非极性的缺失。使用上述的从pCX039创建pCX044的步骤,产生了pDD66和pDD67的ΔkfoB衍生物,并分别将示于图8R中的这些质粒命名为pCX040和pCX042。在pDD66和pDD67中的kfoG基因两侧紧密连接NheI限制性位点,但在每个质粒中在四环素抗性基因的编码区中有第三个NheI位点。为了产生pDD66和pDD67的ΔkfoG衍生物,采用类似于产生ΔkfoB衍生物的方法:用NheⅠ完全消化、连接和选择大肠杆菌四环素抗性转化体。这种方法选择四环素抗性基因连同质粒复制起点的再生。针对kfoGNheI片段的缺失筛选获得的转化体中的质粒,并确定pCX041(pDD66ΔkfoG)和pCX043(pDD67ΔkfoG),如图8S所示。本领域技术人员将认识到通过BstBI或NheI酶的部分质粒消化能够获得相同的质粒结构。
实施例5
识别K4荚膜生物合成蛋白的抗体
抗体产生:针对K4软骨素生物合成基因簇编码的15个蛋白的抗体按照如下所述产生。这些抗体能够用于评价在替代宿主或天然大肠杆菌K4菌株中克隆的K4软骨素生物合成基因的表达。它们也能用于在其它2组荚膜产生大肠杆菌中评价区域1和区域3基因的表达,并潜在地与其它血清型K4大肠杆菌一起用于评价区域2的基因表达。按如下产生抗体。
对应于K4荚膜基因簇中确定的17个基因,设计PCR引物以每个20-30kDa的大小数量级扩增一系列多肽或是全蛋白。最初的PCR引物组合是基于实施例1确定的U1-41K4荚膜基因簇的序列。在一些情况下,测序验证了克隆的PCR片段,然后亚克隆到大肠杆菌质粒载体pQE30(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)中以供在大肠杆菌中的高水平表达。或者,将PCR片段直接克隆到表达载体,然后测序。pQE30载体使用受LacI抑制蛋白调控的强的噬菌体T5启动子以在大肠杆菌中实现高水平的IPTG诱导表达。设计载体在克隆的多肽的氨基端融合多-His标签以利于纯化。首先,作为有His标签的多肽在pQE30载体中表达源自KpsM、KpsF、KpsE、KpsS、KfoC、KfoH和KfoC的抗原,而以没有His标签的形式表达源自KpsD、KpsU、KpsC、KfoD、KfoI、KfoE和KfoF的抗原。通过克隆到缺失编码His残基的序列的pQE30衍生物,称为pQE30-dH中构建缺少His标签的构建体。随后的表达实验表明His标签是源自KfoC、KfoH和KfoG的多肽抗原的高效表达所必需的,而其它抗原在pQE30-dH中以无标签形式高效表达。因此,大部分抗原以无标签形式表达以避免获得识别存在于注射抗原而不存在于天然目标蛋白的表位的抗血清的可能性。
为了表达抗原,包含克隆到pQE30或pQE30-dH的抗原序列的培养物在37°C下在LB中培养至中对数期,然后通过加入1mMIPTG诱导。通常地,诱导后4小时,收获细胞并根据制造商的方案用一种基于去污剂的裂解系统蛋白提取试剂(Novagen,Madison,WI)将细胞分成可溶组分和不可溶组分。通常地,尽管也有一些多肽以可溶形式累积,在T5启动子系统的过表达导致表达的多肽以不可溶形式积累在大肠杆菌的胞质中。KpsU衍生的抗原以可溶形式表达,但发现其它所有的抗原分在不可溶的组分中。通常,经过裂解和提取程序后,在不溶组分中重His是占主导地位的多肽。为了免疫的目的,在100mL摇瓶培养中进行这些多肽抗原的表达。在诱导的培养物的裂解之后,所有培养物的不溶组分(除了KpsU抗原表达培养物)在制备的胶上跑胶。对于KpsU抗原,多肽抗原在细胞裂解物的可溶组分,因此该可溶组分在制备的胶上跑胶。将包含感兴趣蛋白的胶区域切下并送往商业机构OpenBiosystems(Huntsville,AL)以进行进一步的处理和后续的兔免疫以产生抗血清。
在初始实验中,认为12个抗原是足够好地表达的以保证抗原纯化。这12个抗原源自KpsE、KpsD、KpsU、KpsC、KpsS、KpsT、KfoA、KfoB、KfoI(Orf3)、KfoE、KfoH(Orf1)和KfoF。源自蛋白质序列KpsF、KpsM、KfoC、KfoD和KfoG的抗原不表达或低表达。根据密码子选择和物理性质,如疏水性和计算的等电点分析了糟糕表达的抗原的多肽序列。与表达得好的多肽抗原所确定的这些相同性质比较,没有发现任何明显的相关性。一些糟糕表达的抗原,如KfoG中密码子的选择是不利的,但在其他表达得好的抗原中也是不利的。KpsM抗原是特别疏水的,而这可能会潜在地影响所表达的抗原的稳定性,但因为KpsM是完整的膜蛋白,其整个序列是非常疏水的而且任何显著大小的源自KpsM的多肽将是高度疏水性的。
使用如上实施例2所述的合成的K4基因集,额外的抗原编码序列源自合成的、密码子优化的KpsM、KpsF、KfoC、和KfoG的基因。将源自合成的DNA模板的PCR产物分别克隆到表达pQE-30,即6X-His标签的载体中并测试表达。当在有6X-His标签的pQE-30载体中表达时,发现合成的序列KfoC、KfoG和KpsF抗原具有高的或适度高的积累。如上所述的将这些抗原从诱导的培养物中凝胶纯化出来并发送到OpenBiosystems(Huntsville,AL)以在兔中产生抗血清。由诱导培养物的考马斯蓝染色所确定的,带6X-His标签的KpsM抗原的合成序列在可检测水平上没有表达。
使用诱导的表达抗原的大肠杆菌菌株的细胞提取物,通过western印迹测试免疫的兔的抗血清的滴度和特异性。在这些western印迹中所有抗血清识别他们各自的抗原。使用的滴度通常为1∶1500并具有可接受的非特异性背景。用这些抗血清进行的western印迹的结果的例子如图9所示。
如图9所示,一些抗血清(例如抗KfoA、抗KpsD和抗KpsS)在携带克隆的K4基因的菌株中确定目标蛋白条带,而对其他大肠杆菌蛋白具有很少或没有可观察的非特异性的反应性。在其他抗血清中(例如抗KpsC和抗KpsF)观察到更多的非特异性结合,但通过与缺乏克隆的K4基因的大肠杆菌对照菌株相比较,可以清楚地识别出目标蛋白。在western印迹中大多数抗血清识别单一蛋白条带作为他们的特定目标,但在某些情况下,(例如KfoC)特异性地识别多个条带。western印迹前KfoC多肽似乎经历了一些细胞内或在提取物加工过程中的蛋白水解分解或加工,如图9所示,始终观察到双条带。
因此,成功获得了可以在大肠杆菌K4菌株中和表达克隆的K4荚膜基因簇的重组菌株、和可能包含一些或所有这些基因的天然大肠杆菌菌株中检测KpsF、KpsE、KpsD、KpsU、KpsC、KpsS、KpsT、KfoA、KfoB、KfoC、KfoI(Orf3)、KfoE、KfoH(Orf1)、KfoF和KfoG的抗血清。
下面给出了用于免疫兔以产生识别指示的蛋白的抗血清的重组表达的多肽的氨基酸序列。pQE30-dH载体中表达的抗原,在表达的多肽的氨基端包含添加的MGS序列,其源自质粒表达载体并不存在于目标蛋白的序列中。通过克隆到BamHI位点在pQE30载体中表达的抗原在氨基端包含添加的MRGSHHHHHHGS(SEQIDNO:85的氨基酸1-12)序列,其源自质粒表达载体并不存在于目标蛋白。通过克隆到SacI位点在pQE30载体中表达的抗原在氨基端包含添加的MRGSHHHHHHGSACEL(SEQIDNO:93的氨基酸1-16)序列,其源自质粒表达载体并不存在于目标蛋白。源自表达载体DNA序列的多肽抗原的氨基端序列是如下阴影部分。
KfoA-衍生的抗原(SEQID:NO:83):
MGSLNKGYNVVIIDNLINSSCESIRRIELIAKKKVTFYELNINNEKEVNQILKKHKFDCIMHFAGAKSVAESLIKPIFYYDNNVSGTLQLINCAIKNDVANFIFSSSATVYGESKIMPVTEDCHIGGTLNPYGTSKYISELMIRDIAKKYSDTNFLCLRYFNPTGAHESGMIGESPADIPSNLVPYILQVAMGKLEKLMVFGGDYPTKDGT
KfoB-衍生的抗原(SEQIDNO:84):
MGSWLAYNTALLHFFLNNRGRCLLVSSEQVKRNAEDCIQQLQHKLKLKFGLSFSNTINHSLEQSVNDFKTAEASITLEKEHQEIMSLSGIDIGTGDIIFKQSETEEYLIFNVLNDYPDCKELYFELQSNANTPLRVLEKENYKPSFIWETFIKQRQITLDIVNGLYQSSKKIILDNELHTSKQLNAYQAILKELSDSKEELIQYDLIIKNKTIQVQELEC
KfoC-衍生的抗原(SEQIDNO:85):
MRGSHHHHHHGSAISLNEVEKNEIISKYREITAKKSERAELKEVEPIPLDWPSDLTLPPLPESTNDYVWAGKRKELDDYPRKQLIIDGLSIVIPTYNRAKILAITLACLCNQKTIYDYEVIVADDGSKENIEEIVREFESLLNIKYVRQKDYGYQLCAVRNLGLRAAKYNYVAILDCDMKLN
KfoI(Orf3)-衍生的抗原(SEQIDNO:86):
MGSVDLDNTISFNLSGKYSHATPNKKLIEKLYEYKLNGFYIVIFTARNMRTYKENIGKINIHTLPVIIDWLNENRVPYDEVIVGKPWCGDEGFYVDDRAIRPSELCNMTLEEISNMLEQEKKCF
KfoE-衍生的抗原(SEQIDNO:87):
MGSPEDFVFDKHDYEWLLRNKVTMIPVDSNLTLGQAIVTAWNLIGDKDDKGLQLLFGDTLFKKIPAGDDLVAISHSDDNYQWSFFYETELRAVSREDNKNVICGYFSFSKPNFFIRELVTSKFDFTAALKKYHDSYSLASIYVSDWLDFGHINTYYKSKVQYTTQRAFNELCITTKSVIKSSSNESKIEAESKWFETIP
KfoH(Orf1)-衍生的抗原(SEQIDNO:88):
MRGSHHHHHHGSASLGINSYTLITLDKETRGQAETVYLAISKLFNIEQPITIFNIDTIRPNFIFTKFEGENECYIEVFRGDGDNWSFVMPSNDVKNEVIATSEKKQISNLCCTGLYHFSTIKNFISAYEHYKNLPQENWDAGELYIAPIYNYLISNGIKVYYTEINKSDVIFCGTPREYENLQG
KfoF-衍生的抗原(SEQIDNO:89):
MGSVGFTERLKRDLNTNNIIFSPEFLREGKALYDNLYPSRIVVGESSERARKFAELLSEGAIKKDIPILLTDSPEAEAIKLFANTYLAMRIAYFNELDTYASVHGLDTKQIIEGVSLDPRIGQHYNNPSFGYGGYCLPKDTKQLLANYRDVPQNLIQAIVDANTTRKDFVAEDILSRKPKVVGIYRLIMKAGSDN
KfoG-衍生的抗原(SEQIDNO:90):
MRGSHHHHHHGSDDTLFRLQRLALKDTRIKIISLPQNVGTYAAKRIGLIQAKGEFVTCHDSDDWSHPEKLFRQISPLLLNPKLICSISDWVRLQDNGIFYARAVYPLKRLNPSSLLFRRADVLQKAGVWDCVKTGADSEFIARLKLIFGDSTVHRIKLPLTLGSHRTDSLMNSPTTGYTSQGISPDRQKYWDSWSRWHIQALRNKESLYIGNSDFTNKNRPFSAPDSILVDTNAIKTALQSAHVNFT
KpsT-衍生的抗原(SEQIDNO:91):
MGSMIKIENLTKSYRTPVGRHYVFKNLNIEIPSGKSVAFIGRNGAGKSTLLRMIGGIDRPDSGKIITNKTISWPVGLAGGFQGSLTGRENVKFVARLYAKQEELKEKIEFVEEFAELGKYFDMPIKTYSSGMRSRLGFGLSMAFKFDYYIVDEVTAVGDARFKEKCAQLFKERHKESSFLMVSHSLNSLKEFCDVAIVFKDDNAVSFHEDVQEGIEEYITEQNNY
KpsF-衍生的抗原(SEQIDNO:92):
MRGSHHHHHHGSLAIAMIHQRKFMPNDFARYHPGGSLGRRLLTRVADVMQHDVPAVQLDASFKTVIQRITSGCQGMVMVEDAEGGLAGIITDGDLRRFMEKEDSLTSATAAQMMTREPLTLPEDTMIIEAEEKMQKHRVSTLLVTNKANKVTGLVRIFD
KpsE-衍生的抗原(SEQIDNO:93):
MRGSHHHHHHGSACELPEFALKFNQTVLKESERFINEMSHRIARDQLAFAETEMEKARQRLDASKAELLSYQDNNNVLDPQAQAQAASTLVNTLMGQKIQMEADLRNLLTYLREDAPQVVSARNAIQSLQAQIDEEKSKITAPQGDKLNRMAVDFEEIKSKVEFNTELYKLTLTSIEKTRVEAARKLK
KpsD-衍生的抗原(SEQIDNO:94):
MGSLNYLIKAGGVDPERGSYVDIVVKRGNRVRSNVNLYDFLLNGKLGLSQFADGDTIIVGPRQHTFSVQGDVFNSYDFEFRESSIPVTEALSWARPKPGATHITIMRKQGLQKRSEYYPISSAPGRMLQNGDTLIVSTDRYAGTIQVRVEGAHSGEHAMVLPYGSTMRAVLEKVRPNSMSQMNAVQLYRPSVAQRQKEMLNLSLQKLEEASLSAQSSTKEEAS
KpsU-衍生的抗原(SEQIDNO:95):
MGSMSKAVIVIPARYGSSRLPGKPLLDIVGKPMIQHVYERALQVAGVAEVWVATDDPRVEQAVQAFGGKAIMTRNDHESGTDRLVEVMHKVEADIYINLQGDEPMIRPRDVETLLQGMRDDPALPVATLCHAISAAEAAEPSTVKVVVNTRQDALYFSRSPIPYPRNAEKARYLKHVGIYAYRRDVLQNYSQLPESMPEQAESLEQLRLMSAGINIRTFEVAATGPGVDTPACLEKVRALMAQELAENA
KpsC-衍生的抗原(SEQIDNO:96)
MGSQRVRLIAENVSPQSLLRHVSRVYVVTSQYGFEALLAGKPVTCFGQPWYAGWGLTDDRHPQSALLSARRGSATLEELFAAAYLRYCRYIDPQTGEVSALFTVLQWLQLQRRHLQQRNGYLWVPGLTLWKSAILKPFLQTATNRLSFSRRCTAASACVVWGVKGEQQWRAEAQRKSLPLWRMEDGFLRSSGLGSDLLPPLSLVLDKRGIYYDATRPSELEVLLNHSQLTLAHQMRAEKLRQRLVESKLSKYNLGA
KpsS-衍生的抗原(SEQIDNO:97):
MRGSHHHHHHGSACELCFGDCRLLHKEAKRWAKSKGIRFLAFEEGYLRPQFITVEEGGVNAYSSLPRDPDFYRKLPDMPTPHVENLKPSTMKRIGHAMWYYLMGWHYRHEFPRYRHHKSFSPWYEARCWVRAYWRKQLYKVTQRKVLPRLMNELDQRYYLAVLQVYNDSQIRNHSNYNDVRDYINEVMYSFSRKAPKESYLVIKHHPMDRGHRLYRPLIKRLSKEYGLDERVIYVHDLPMPELLRHASLIS
实施例6
当在大肠杆菌K-12中表达时,合成基因集[kpsFEDUCS+kpsMT+kfoABCDIEHFG]产生果糖基化的软骨素。
如上述实施例4描述的,将质粒pDD54和pDD58转化入MSC188(如上述实施例3描述的,大肠杆菌K-12菌株W3110缺失可拉酸生物合成基因簇)。获得的菌株MSC204[MSC188(pDD54)]和MSC206[MSC188(pDD58)]在摇瓶培养中生长并测试软骨素产量。菌株在CYG培养基(20g/L酪蛋白氨基酸、5g/L酵母提取物、2g/L葡萄糖,pH为7.2)加氯霉素(20μg/mL)中在30℃从新鲜菌落生长过夜,并将这些培养物在相同的培养基中稀释至ODA600=0.05。在约0.1的ODA600(约1小时后),加入诱导剂间-甲苯甲酸至终浓度2mM。在诱导后4、8和24小时,测定ODA600值并对样本进行分析。培养物OD如下表6-1所示。对于每个菌株在每个时间点,高压灭菌(121℃,>15psi,5分钟)用于多糖分析的10mL样品,然后冷冻保存。各菌株的两个5mL等分样品在各时间点离心并将得到的细胞沉淀冷冻贮存以进行随后的Western印迹分析。
如表4A所示,大肠杆菌K-12菌株,MSC204和MSC206诱导后生长良好,在诱导后24小时这些培养物的OD均约为7。使用如实施例14详细描述的基于HPLC的软骨素酶依赖性分析测定这些实验的培养物样品的软骨素和果糖基化软骨素。在这些分析中的酶消化之前,对培养物样品进行去果糖基化步骤(酸处理)。也通过对果糖基化的软骨素特异的ELISA分析(实施例14)检测培养物样品。分析结果如表4A所示。
表4A
MSC204和MSC206菌株的生长和软骨素产生。
a诱导后
b分析中包括的去果糖基化步骤
c未检测出
这些结果清楚地表明,携带pDD58的重组大肠杆菌K-12(菌株MSC206)产生果糖基化的软骨素。通过ELISA进行的多糖检测证明在这些菌株中产生的重组多糖是果糖基化的软骨素,因为ELISA分析中使用的抗血清是果糖基化形式的软骨素特异的而不识别未果糖基化的软骨素。在本实验中观察到的最高水平的果糖基化的软骨素产量是约25μg/mL。在携带仅载体的质粒pDD54的对照菌株MSC204中始终未检测出果糖基化的软骨素产生。对MSC206在4hr和8hr样品的ELISA和HPLC分析测得的果糖基化的软骨素值之间存在定量的差异。这些差异可能反映了ELISA分析较低的灵敏度。通常情况下,给定样品中的果糖基化的软骨素浓度越高,ELISA和HPLC检测之间的一致性越接近。
其后进行实验以确认MSC206产生果糖基化的软骨素并测试诱导剂浓度对产生的软骨素的水平的影响。将MSC206的新鲜过夜培养物稀释到0.05ODA600并在30℃下在CYG培养基加氯霉素(20μg/mL)中生长至ODA600约0.1。然后通过加入最终浓度为0、0.5、1.0或2.0mM的间-甲苯甲酸诱导等分试样的培养物。诱导后培养物生长24小时,检测在该点的OD并将样品如上所述进行多糖分析。同样在诱导24小时后,稀释每个培养物的等分试样并铺在LB中定量总的活细胞,并在LB加氯霉素(17μg/mL)上以定量含质粒的活细胞。这些培养物的生长和软骨素产生总结于表4B中。
表4B
诱导剂浓度对MSC206生长和软骨素产生的影响。
诱导剂浓度 |
0 |
0.5mM |
1.0mM |
2.0mM |
OD A600在24hr |
3.08 |
2.99 |
2.91 |
2.29 |
cfu/mL LB |
1.77x 109 |
2.35x 109 |
1.77x 109 |
0.81x 109 |
cfu/mL LB+Cm17 |
6.55x 108 |
6.58x 108 |
5.66x 108 |
3.00x 108 |
%Cm-抗性 |
27% |
28% |
32% |
37% |
ELISA分析:软骨素 |
7.4μg/mL |
22.3μg/mL |
30.5μg/mL |
12.3μg/mL |
HPLC分析*:软骨素 |
9.7μg/mL |
25.1μg/mL |
31.1μg/mL |
17.5μg/mL |
*分析中包括的去果糖基化步骤
如表4B所示,在本实验中,只有最高水平的诱导物在24小时时对生长和活细胞数产生了负面影响。在本实验中,表达质粒pDD58不能稳定地保持,即使该菌株在选择性抗生素氯霉素的存在下生长。在24小时的时间点时似乎存在质粒显著的损失,是通过与LB平板相比,当样品铺在LB+CM17板时获得的更低的细胞集落形成单位滴度证明的。但是,含质粒细胞的部分不会受到诱导剂浓度的显著影响。ELISA分析的结果确认了MSC206中果糖基化的软骨素的产生并且与包括去果糖基化步骤时使用HPLC分析获得的结果是一致的。具有最高软骨素滴度的样品显示出ELISA和HPLC分析之间的最好的一致性。这些结果还证明了即使没有加入m-TA进行诱导,也有果糖基化的软骨素的产生。但是,所有诱导的培养物比非诱导的培养物产生了更多的果糖基化的软骨素,培养物产生的果糖基化的软骨素的最高水平是1.0mMm-TA诱导的。
实施例7
当在大肠杆菌K-12或大肠杆菌B中表达时,基因集[kpsFEDUCS+kpsMT+kfoABCFG]的表达产生未果糖基化的软骨素。kfoB和kfoG基因对于未果糖基化的软骨素的产生不是必不可少的,但kfoG是最优产生所必需的。
在此工作之前,还没有确定编码负责K4荚膜多糖果糖基化的蛋白的基因。没有确定存在于K4荚膜基因簇的区域2的许多基因:kfoB、kfoG、kfoD、kfoE、kfoH(orf1)和kfoI(orf3)编码的蛋白的功能。
存在于大肠杆菌荚膜2组的区域2的基因均通常涉及多糖或糖核苷酸前体的合成(Whitfield2006)。如上所述(实施例1),kfoB和kfoG基因编码与存在于已知产生其他糖胺聚糖荚膜的细菌的荚膜簇的基因编码的那些蛋白同源的蛋白。此间接证据表明了kfoB和kfoG在糖胺聚糖荚膜生物合成中的潜在功能。相反,在本发明之前,没有证据暗示kfoD、kfoI、kfoE和kfoH基因参与K4荚膜多糖的软骨素骨架的生物合成。本发明人假设kfoD、kfoI、kfoE和kfoH基因可能编码涉及软骨素果糖基化的蛋白,虽然其他人已经假设kfoD和kfoE基因可能不参与果糖基化(Ninomiya等,2002年和Krahulec等,Molec.Biotech.,2005;30:129-134.)。为了检验这一假设,构建了不含kfoDIEH基因集但确实包含kpsFEDUCS、kpsMT和kfoABCFG基因的重组质粒。如上述实施例4中描述的,构建了两个这样的质粒,称为pDD66和pDD67。这两个质粒还包含赋予四环素抗性的基因,使得可以在细胞培养中使用四环素选择质粒保持。还构建了一个pDD58的衍生物,称为pDD62,作为对照质粒。如在上述实施例4中详细描述的,pDD62质粒包含kpsFEDUCS、kpsMT和kfoABCDIEHFG基因,并且还包含一个赋予四环素抗性的基因。
为了确定是否缺失kfoDIEH影响果糖基化的软骨素的生物合成,将pDD62、pDD66和pDD67转化入MSC188或MSC175(以上实施例3中描述的W3110ΔwcaJ),而且培养所得的菌株并分析果糖基化的软骨素和未果糖基化的软骨素的产生。菌株MSC274(MSC175+pDD62)、MSC279(MSC188+pDD66)和MSC280(MSC188+pDD67)生长在CYG培养基中在摇瓶中在30℃用2μg/mL四环素(Tc)并如所示用1mMm-TA诱导。如上所述在诱导24小时后取样培养物、高压灭菌、离心并通过有或没有去果糖基化步骤的HPLC分析测定所得的上清。
如下文表5A中所示,所有的菌株产生软骨素,但含质粒pDD66或pDD67的菌株产生的软骨素多糖未展示出果糖基化的证据。也就是说,与不经过去果糖基化步骤的样品相比,对于经过去果糖基化步骤的样品,MSC279和MSC280样品通过HPLC测定的软骨素滴度没有显著的不同。与此相反,当未经去果糖基化步骤分析MSC274样品时,观察到很少的软骨素。仅在经过去果糖基化步骤的MSC274样品中检测到大量的软骨素。如实施例14详述的,用于HPLC测定的软骨素酶不能消化果糖基化的软骨素,而因此在该分析中无法检测果糖基化的软骨素。这些数据清楚地证明软骨素果糖基化必须需要kfoDIEH基因中的一个或多个,但这些基因均不是软骨素生物合成所必需的。这些结果再次证明在不存在m-TA诱导的情况下可以产生软骨素,但诱导培养物比非诱导培养物产生更多的软骨素。令人吃惊的是,MSC279和MSC280产生的非果糖基化的软骨素的滴度比MSC274产生的果糖基化的软骨素的滴度更高(2.5-4倍)。这一结果表明,果糖基化事件降低软骨素产生的效率。这与体外的观察是一致的,与未果糖基化的软骨素相比,果糖基化的软骨素是KkoC酶(软骨素聚合酶)的不良底物(Lidholt和Fjelstad,J.Biol.Chem.1997;272:2682-2687)。
表5A
大肠杆菌K-12中未果糖基化的软骨素的产生
a经去果糖基化处理;80°C在pH1.5进行30分钟
b未经去果糖基化处理
c未检测
与菌株MSC206相比,这些菌株显示出提高的质粒保持,即保持抗生素抗性。参见上述实施例6中表4B的MSC206质粒保持数据。这可能反映了四环素vs.氯霉素选择质粒的使用。可以进行其他实验以优化四环素或其他优选的抗生素的浓度,用以最大限度地保持质粒而不损害细胞的生长以达到最大的软骨素产量。
将质粒pDD66和pDD67转化入MSC139,大肠杆菌B(ATCC11303)并检测获得的菌株的软骨素产生。将对照质粒pDD63也转化入MSC139。如上述实施例4所描述的,该质粒是pDD54载体的衍生物,其中加入了四环素抗性基因。它不含任何K4软骨素合成基因。在摇瓶中评价了含pDD63(MSC314)、pDD66(MSC315)或pDD67(MSC316)的大肠杆菌B的软骨素产生。
在本实验中,培养物在含5μg/mL四环素(Tc5)的TB培养基中在30℃生长,如下面实施例8描述的,发现与CYG培养基相比,生长在TB培养基提高了大肠杆菌中软骨素的重组产生,并发现Tc5是一种有效的质粒保持浓度而不损害细胞生长。将培养物以0.05ODA600接种,并以0.10-0.13通过加入2mMm-TA进行诱导。诱导后,培养物在30℃生长多至3天。菌株MSC315最初比其他菌株生长得慢并且比MSC314和MSC316培养物晚诱导几个小时。在诱导后48小时(对于MSC315是诱导后42小时)取样进行四环素存在或不存在下的活细胞计数,并通过HPLC方法检测软骨素。
如下表5B所示的分析结果证明了当存在pDD66或pDD67时在大肠杆菌B中在显著水平的软骨素产生。含pDD63的菌株MSC314,“空载体”对照,未检测到软骨素。本实验中对于pDD66和pDD67的质粒保持率(%Tcr)是约50%而没有可检测的对照载体pDD63的损失。
表5B
大肠杆菌B中重组软骨素的产生
a没有去果糖基化处理的HPLC方法
大肠杆菌B不产生荚膜但包含一个隐藏的2组荚膜基因簇,其中区域2基因被插入元件破坏,而且区域1和3个基因具有功能(Andreishcheva和Vann,Gene2004;484:113-119)。为确定是否大肠杆菌K4区域2基因可以“补充”大肠杆菌B区域2的缺陷,构建了仅含kfoABCFG基因的质粒。该质粒,pCX039在实施例4中描述。将质粒pCX039转化MSC139,大肠杆菌B(ATCC11303)并在摇瓶中评价得到的菌株,命名为MSC317的软骨素产生。菌株在加5μg/mLTc的TB培养基中在30℃生长。将培养物以约0.05ODA600接种并以约0.10的OD用2mMm-TA诱导。在诱导后48小时取样进行四环素存在或不存在下的活细胞计数,并通过HPLC方法检测软骨素。
当在LB平板上检测时,获得5.9×109cfu/mL并与含5μg/mLTc的平行铺板的LB板获得的cfu滴度没有显著差异。这表明pCX039质粒在本实验中是定量保留的。未经去果糖基化步骤进行基于HPLC的软骨素分析。在此测定中测得的软骨素滴度为205μg/mL。此结果表明仅需要区域2K4基因kfoABCFG以在大肠杆菌B中完成软骨素的生物合成。在下面的实施例9中,显示大肠杆菌B的区域1和3基因与K4的区域2基因功能相协作以导致软骨素分泌,这一发现与Andreishcheva和Vann(2004)的结果相符。
如上所述,在其他糖胺聚糖产生菌的基因簇中编码KfoB和KfoG同源物,但这些蛋白的功能仍然是未知的。如实施例4所描述的,从pDD66和pDD67缺失kfoB或kfoG基因以产生质粒pCX040、pCX041、pCX042和pCX043,总结在下表5C中。将这些质粒转化到宿主菌株MSC188并将所得菌株的培养物进行软骨素生物合成测试。培养物在30℃下生长于TB培养基,在ODA600≈0.2时用2mMm-TA诱导,并在诱导后48小时取样进行活细胞计数和软骨素分析。这些分析的结果,如下所示,表明在重组大肠杆菌K-12中没有基因是软骨素生物合成绝对必不可少的。
表5C
kfoB或kfoG缺失对软骨素产生的影响。
a未经去果糖基化步骤的HPLC分析
基于这些结果,在这些菌株中在这些生长条件下KfoB蛋白活性似乎对于软骨素产生是不必要的。事实上,在此实验中携带缺失kfoB的pDD66的菌株比含pDD66菌株产生了多约20%的软骨素;参见MSC279vs.MSC322。这种差异可能是显著的,但也是在对于大肠杆菌重组软骨素产生所观察到的每日变化范围内的。在比较MSC279和MSC322的重复实验中,没有观察到kfoB缺失菌株的软骨素提高的产量。在pDD67背景下,kfoB缺失对软骨素产生很少或没有影响。
之前发表的突变失活kfoG的大肠杆菌K4菌株研究没有报道任何kfoG突变对产生的果糖基化的软骨素的水平的影响(Krahulec等,2005)。与此相反,我们的结果表明KfoG蛋白,虽然不是产生软骨素绝对必要的,似乎是在本实验的这些生长条件下在大肠杆菌中获得重组软骨素产生最佳水平所必需的。kfoG基因缺失严重降低pDD66和pDD67的软骨素产生。在pDD66背景下,缺失kfoG的菌株(MSC323)仅产生野生型对照菌株MSC279的约20%的软骨素。同样,在pDD67背景下,缺失kfoG的菌株(MSC325)仅产生野生型对照菌株MSC280的约5%的软骨素。
实施例8
本实施例证明在各种生长培养基、温度和诱导条件下软骨素的重组产生。
各种不同的生长培养基能够支持携带大肠杆菌K4软骨素生物合成基因的重组大肠杆菌菌株的软骨素产生。为了最佳的重组软骨素产生,需要对培养条件,例如培养基组成、温度、诱导剂浓度和诱导后培养持续时间进行优化。
在大肠杆菌中软骨素的重组产生的初步研究使用CYG生长培养基(20g/L酪蛋白氨基酸、5g/L酵母提取物、2g/L葡萄糖,pH7.2)。可以采用各种替代性生长培养基和培养条件来培养能够产生软骨素的重组大肠杆菌菌株和实现软骨素产生。
一种众所周知的支持大肠杆菌生长的替代培养基是TB培养基(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1989))。测试了这种培养基并发现也支持重组大肠杆菌产生软骨素。另外,还测试了延长温育时间(诱导后长达72小时)对软骨素产生的影响。此外,也测试了以1mM与2mMm-TA诱导软骨素产生的影响。
菌株MSC279和MSC280在30°C生长在含5μg/mL四环素的TB的摇瓶中。将培养物以0.05ODA600接种并以约(0.1-0.2)ODA600通过加入1mM或2mMm-TA进行诱导。在诱导后24和48小时取样培养物进行软骨素分析和活细胞计数。本实验的结果总结于下表6A中。
表6A
a小时,诱导后
b未经去果糖基化处理的HPLC分析
这些结果证明TB培养基可以支持高水平的软骨素产生。此外,延长培养时间显著增加了软骨素滴度;从诱导后24至48小时软骨素水平约翻倍。在诱导后48小时达到0.4-0.5g/L的最终软骨素滴度。这些数据还表明虽然影响幅度并不大,但更高的诱导剂浓度可导致更大的产生力。
CYG和TB均是包含水解酪蛋白产物和自溶酵母的“复合”生长培养基,其中培养基的组成没有化学定义。在某些情况下,可能希望采用基本或确定的生长培养基进行细胞培养。可能的确定的或基本的培养基的某些例子包括“2XM9”加葡萄糖或甘油和补充或不补充酵母提取物(YE)。“2XM9”的基础无机盐组分是:22.6g/LNa2HPO4·7H2O,6g/LKH2PO4,1g/LNaCl,2mMMgSO4,0.2mMCaCl2和2.0g/LNH4Cl(pH7.4)。向此配方中添加碳源,并且如所示的添加其他补充剂。菌株MSC279和MSC280在30°C生长在含10g/L葡萄糖或甘油作为碳源的2XM9的摇瓶中。也测试了为含葡萄糖的培养基补充1g/LYE的效果。在这个实验中,作为接种物的过夜培养物在LB培养基中生长。将培养物以0.05ODA600接种并通过在约0.1-0.2ODA600加入1mMm-TA诱导。在诱导后24小时和48小时取样含葡萄糖作为碳源的培养物进行活细胞计数和软骨素测定。但是,甘油培养物开始时生长相对缓慢并在诱导后24小时只有微弱的生长,所以将甘油培养物的生长延长至72小时并在48和72小时取样。下表6B总结了本实验的结果。
表6B
*未经去果糖基化的HPLC分析
两种菌株在所有三种培养基组成中均达到最终ODA600约5-6并且质粒保持比较好约75-90%。在所有测试培养基中大量产生了软骨素。在收获时的滴度范围从约100-350μg/mL。向2XM9加葡萄糖培养基添加酵母提取物对最终软骨素滴度最多有适度的影响。尽管最初生长滞后,甘油培养物生长到与用葡萄糖所观察到的培养物相似的最终细胞密度。与葡萄糖培养物相比,甘油培养物中的软骨素最终滴度更高(1.5-3倍)。这些结果提供了基本/确定的培养基可以支持高水平软骨素产生的例子。可以使用微生物发酵开发领域的技术人员熟知的标准方法进行进一步的培养基开发和优化。
另一项实验证明了生长温度和延长的生长时间诱导后时间对软骨素积累的影响。MSC280培养物生长于CYG培养基加2μg/mLTc。培养瓶在20°C、25°C、30°C和37°C温育。将培养物在约0.05ODA600接种并在所指示的温度生长到约0.1-0.2ODA600,在该点如注明的通过添加1mMm-TA诱导培养物。一个对照培养物没有在30°C诱导。在诱导后24、48、和72小时收集样品进行软骨素分析和活细胞计数。从最终收获时间点获得的结果列于下表6C。在这些条件下,在所有测试温度下实现了软骨素产生,但实现的最好软骨素滴度是在25℃和30℃。在所有测试温度下生长的第二和第三天期间软骨素积累量显著提高(数据未示出)。在37℃下,软骨素产生是与在30℃相比实质性偏低的(约10倍),而且37℃培养物的存活较差。可以通过测试在20℃-37℃范围内额外的温度精确化对优选的软骨素产生的温度范围的定义来实现进一步的优化。同样,可以通过精确化诱导后培养时间对软骨素滴度的影响来实现进一步的优化。
表6C
a小时,诱导后
b无可用数据
c未检测,在Tet板上未获得克隆
通过延长温育时间以优化温育时间的进一步研究可能会进一步提高软骨素产生。同样,可以测试额外的诱导剂浓度以确定软骨素产生最优的浓度。
实施例9
本实施例证明大肠杆菌K-12和大肠杆菌B的重组软骨素可以分泌到培养基中。本实施例进一步证明软骨素也可以高水平在细胞内产生。
当在液体培养基中培养大肠杆菌K4,据报道荚膜多糖(K4P),果糖基化的软骨素,在培养基中以无细胞形式和与细胞相关的形式积累(Manzoni等,Biotech.Lett.1996;18:383-386,Cimini等,Appl.Mocrobiol.Biotechnol.E-Publication,E-Pub.October2009)。通过类推到其他2组荚膜多糖,如由大肠杆菌血清型K1和大肠杆菌血清型K5所产生的那些,认为细胞相关形式主要是通过脂质锚的方式与细胞外膜的外叶相连(Whitfield,2006)。在结构水平上还没有定义多糖和脂质锚之间的连接的性质,也没有确定脂质锚的身份。如上文实施例6-8描述的产生和检测的重组软骨素清楚地存在于培养基中。低速离心(10分钟以3500g)足够从有待分析软骨素的样品的培养基中去除细胞,并在无细胞上清中检测到了软骨素的显著量。但是,在离心之前高压灭菌所有在上述实施例6-8中分析软骨素的样本以杀死细菌,从而利于样品处理。高压灭菌步骤可能破坏任何细胞相关软骨素的连接并导致这样的细胞相关软骨素从细胞中释放。为了确定是否以无细胞和/或细胞相关形式产生重组软骨素,进行一个实验,测试高压灭菌对将组软骨素分配到在从软骨素产生培养物离心样品后的上清和沉淀部分的影响。
菌株MSC279生长在30℃下含5μg/mLTc的TB培养基的摇瓶中。将培养物以约0.03ODA600接种并生长到约0.1-0.2A600,此时通过加入2mMm-TA诱导。在诱导后48小时取样并进行软骨素分析。在离心前高压灭菌此培养物的一个等分试样,并将得到的上清和细胞沉淀部分根据实施例14中的HPLC方法进行软骨素分析。将另一个等分试样离心而不进行高压灭菌,并将得到的上清和细胞沉淀部分根据实施例14中的HPLC方法进行软骨素分析。将从非高压灭菌样品的细胞沉淀重悬于THB(50mMTris-HCl缓冲液及50mM醋酸钠pH8.0)中并直接用软骨素酶ABC(“CHase”)(无细胞裂解)处理,并再次离心以产生上清和沉淀部分用于分析。为测试剩余培养基中携带的无细胞软骨素,在THB中轻轻洗涤来自非高压灭菌样品的另一细胞沉淀,然后重新离心。如上所述对洗涤液的上清(样品#7)和洗涤液的细胞沉淀(无裂解)(样品#8)进行软骨素测定。本实验的结果如下表7A所示。
表7A
在高压灭菌样品中,只有总软骨素的11%存在于细胞沉淀(样品#2)而离心前没有高压灭菌的样品中总软骨素的45%存在于细胞沉淀(样品#4)。此结果表明MSC279产生的软骨素的大部分仍是细胞相关的,高压灭菌步骤破坏了软骨素与细胞的关联。发现重悬细胞不经过溶解的直接CHase处理消化非高压灭菌菌株的沉淀中的细胞相关的软骨素。确定了在原始培养物中,基于释放的二糖的量计算的表面相关的软骨素的量为130-154μg/mL(样品#5和样品#8)。此值是稍小于通过实施例14的“细胞裂解”技术测定的细胞相关的软骨素滴度(178μg/mL)(样品#4),这可能反映内部软骨素聚合物(如样品#2和样品#6中测定的)。但是,两种测定方法的数据是定性一致的,表明与高压灭菌样品相比在非高压灭菌的样品中相当高部分的软骨素是细胞相关的。全细胞悬液的CHase处理将细胞相关的软骨素消化为二糖的事实表明这部分软骨素是以多糖位于细胞外和在培养基中的方式与细胞膜外部相关的。这与预期的荚膜结构相符。
这些结果表明,菌株MSC279产生的重组软骨素的相当一部分(≥50%)存在于培养基中并以细胞不相关的形式。如通过加入的CHase进行的降解证明的,MSC279产生的大量细胞相关的软骨素是与细胞附接的,但是延伸到周围培养基中。之前Manzoni等,Biotechnol.Lett.1996;18(4):383-386和Cimini等,Appl.Microbiol.Biotechnol.E-Publication,2009年10月,已经报道了天然大肠杆菌K4产生的K4P的无细胞形式和细胞相关的形式。重组产生中观察到这两种形式与MSC279中重组软骨素的合成与分泌是通过与天然菌株中操作相同的途径进行的观念是一致的。这表明所有导入MSC279的克隆基因是以在大肠杆菌K4中相同的方式发挥功能的,并在重组菌株中荚膜多糖合成和输出的完整途径是发挥功能的。
为了通过细菌发酵产生软骨素,优选使用大规模发酵,其产生的培养基体积对于作为将细胞相关的软骨素释放到培养基中的方法是可行的高压灭菌而言太大了。对于大规模操作可以采用使用升高温度联合酸或碱处理的替代处理。
产生软骨素的重组大肠杆菌B菌株也获得了软骨素分泌到培养基中的类似结果。以前我们观察到在重组大肠杆菌K-12中,kfoB基因对于软骨素产生不是必不可少的。为了测试大肠杆菌B中软骨素的分泌,在30℃TB/Tc5培养基中培养MSC347(MSC139pCX044即pCX039ΔkfoB)并用2mMm-TA在ODA600约0.15时诱导。在48小时取培养液样品并离心,在进行和不进行高压灭菌的情况下,以产生上清和细胞沉淀部分。此实验的软骨素测定结果如下表7B所示。高压灭菌导致在上清部分总可测量rCH高于90%。但是,在非高压灭菌样品中,发现只有约30%的软骨素在上清中。这些结果与如上详述的重组大肠杆菌K-12菌株的结果是一致的,这表明高压灭菌步骤(5分钟,121°C,15psi)基本上将所有rCH释放到培养基中。这些结果进一步显示当存在区域2基因时,大肠杆菌B中区域1和3的基因的功能是分泌软骨素。
表7B
软骨素分泌到细胞培养基中和释放细胞相关的软骨素到培养基中提供了一种获得无细胞的并可以通过离心或过滤并随后纯化从细胞中分离的软骨素的方法。也可以通过软骨素生物合成基因的遗传操作产生细胞内软骨素。为了消除培养基中高水平的多糖导致的发酵粘度,软骨素的胞内产生可能是理想的。此外,尚未完全理解对软骨素产生和大肠杆菌中软骨素生物合成的生物化学的内在限制。细胞内产生可比分泌获得更高水平的软骨素是可能的。因此,鉴定了不存在分泌到培养基中的情况下允许相当水平的软骨素积累的重组基因集。
在文献中有证据表明,在一定的条件下,其它大肠杆菌荚膜多糖可以在细胞内合成并积累。Bronner等(J.Bact.1993;175:5984-5992)的电子显微术(EM)结果表明通过kpsC和kpsS缺陷的突变体,存在一些大肠杆菌血清型K5荚膜多糖(肝素糖)的细胞内积累。当通过EM检测在kpsC、kpsS、kpsE或kpsT中存在缺陷的突变体时,对于大肠杆菌K1的聚唾液酸荚膜多糖,Cieslewicz和Vimr(J.Bact.1996;178:3212-3220)报道了类似的观察。在这些研究中,没有定量细胞内的K1和K5多糖水平。
为了确定区域1或区域3基因中的突变是否可以阻断大肠杆菌K-12中重组产生的软骨素的分泌,如实施例4描述的构建了缺失kpsC或kpsT基因的质粒pDD66衍生物(分别为pCX045和pCX048)。将这些质粒转化到MSC188并将所得菌株与MSC279(含有未修饰的pDD66的MSC188)平行测试产生和分泌软骨素到培养基中的能力。
培养物生长于30℃TB+Tc5培养基中,在ODA600约0.15时以2mMm-TA诱导并于48小时后取样。对于在48小时时间点的每个菌株,测定了来自高压灭菌和未高压灭菌两种样品的上清和细胞沉淀中的软骨素。如下表7C所示,在48小时的OD是等同的。在分别缺失kpsC和kpsT基因的菌株MSC356和MSC359的未高压灭菌样品中,软骨素主要定位于细胞沉淀(约85-90%)。这与野生型对照MSC279的约50%的软骨素定位于细胞沉淀和约50%存在于上清中的结果是相反的。
表7C
如上所述(表7C)在MSC279菌株中,在MSC279培养物的未高压灭菌样品中大多数软骨素定位到细胞沉淀可能是与细胞外膜外叶中的脂质锚共价连接。可能是高压灭菌破坏了细胞膜和软骨素的关联,其在未高压灭菌时与细胞关联,但仍不能完全理解细胞高压灭菌处理的影响。这些数据无法解决细胞和定位到kpsC或kpsT缺陷菌株的细胞沉淀的软骨素之间的关联的性质。原则上,这种软骨素可存在于细胞的细胞质中,在周质空间中或仍与细胞外膜连接。但是,这些突变菌株的结果与在kpsC和kpsT中的突变阻断了软骨素的分泌并导致软骨素在细胞内的积累的观念是一致的。可以通过重悬未高压灭菌的细胞沉淀,CHase消化重悬细胞并测试软骨素特异性二糖的产生来检测这种软骨素在细胞表面上的存在。另外,可以使用电子显微术以确定MSC356和MSC359产生的细胞相关的软骨素的细胞定位。
如下面详述的,设计了另外一个实验以用野生型菌株MSC279确认高压灭菌在软骨素从细胞释放中的作用,并确定是否仅含K4区域2基因的大肠杆菌K-12(MSC346;MSC188pCX039)可以产生细胞内软骨素。菌株MSC279和MSC346在30℃生长于TB/Tc5培养基中,并在ODA600约0.15时用2mMm-TA诱导。48小时后,取一式两份培养液样品以通过离心前进行或不进行高压灭菌产生上清和细胞沉淀部分。从这些样品的软骨素测定结果如下表7D所示。在来自包含完整的软骨素生物合成基因集的菌株MSC279的未高压灭菌样品中,软骨素大约均匀分布于上清(55%)和沉淀(45%)之间。与此相反,在仅包含区域2基因的菌株MSC346的未高压灭菌沉淀中包括培养物产生的软骨素的约98%,上清中发现很少。对于这两种菌株,高压灭菌导致CH主要(>90%)分到上清中。
表7D
这些结果证明高压灭菌(5分钟,121℃,15psi)释放了几乎所有的细胞相关的软骨素到培养基中。因此,在MSC279未高压灭菌的细胞沉淀中检测到的软骨素原则上可结合到外膜上或具有胞内定位。在未高压灭菌的情况下,菌株MSC346培养物的上清中很少发现软骨素。这样的结果是与缺失全部区域1和区域3的功能,只产生细胞内软骨素的MSC346一致的。虽然与MSC279相比,MSC346产生较少量的软骨素,产生的软骨素的量仍然是显著的并证明在重组大肠杆菌K-12中仅使用克隆基因kfoABCFG即可以成功地产生软骨素。这些结果也证明通过高压灭菌可以从细胞释放软骨素,在离心以去除细胞碎片后可以在高压灭菌培养物的上清中获得软骨素。或者,可以使用各种公知的方法(例如均质化、洗涤剂和/或酶裂解、机械破坏、超声等)裂解MSC346细胞而且通过这些方法释放的软骨素也可以在离心后在上清中回收。可以通过本领域公知的方法,如醇沉淀进一步纯化这样回收的软骨素。
实施例10
本实施例描述了包含插入染色体的软骨素生物合成基因的大肠杆菌K-12菌株的构建并证明了在这些菌株中软骨素的产生。
上面的实施例6-9描述了使用质粒载体将克隆的编码软骨素合成蛋白的基因引入异源宿主菌在重组大肠杆菌菌株中产生软骨素。在某些情况下,可能希望将克隆的软骨素的生物合成基因引入到受体宿主菌株的染色体中。将克隆的基因置于染色体中消除了为保持携带软骨素的生物合成基因的质粒而保持选择压力的需要,并从而有可能提供更稳定的表达菌株或在无选择压力的情况下是稳定的表达菌株。因此,构建了大肠杆菌K-12菌株,其中将大肠杆菌K4的软骨素生物合成基因稳定整合到宿主染色体中。这些“染色体表达菌株”利用来自pDD66和pBR1052整合在可拉酸生物合成基因座的Pm启动子和K4基因集。也已在单独的基因座,fhuA基因座,将xylS调节基因整合到染色体中。显示所得的构建体在摇瓶和发酵罐中产生高水平的软骨素(实施例14和15)。
表达质粒pDD66和pBR1052描述于实施例4中。将来自pDD66和pBR1052K4的软骨素的生物合成基因克隆到实施例3也描述了的pMAKCL替代载体中。在图8L中图解的这种载体包含克隆的可拉酸(CA)基因簇的上游和下游DNA区域和在这些区域的接合处的唯一AscI克隆位点。如实施例3中详述的,该载体用于构建在大肠杆菌K-12W3110中整个CA基因簇的缺失以产生菌株MSC188。从pDD66和pBR1052切出K4基因表达盒并根据制造商的方案使用QIAEXII凝胶提取试剂盒(QIAGENInc,Valencia,CA)凝胶纯化约19kb的AscI片段,并将这些片段与AscI消化的、磷酸酶处理的和凝胶纯化的pMAKCLDNA连接。选择对四环素抗性的转化体,四环素抗性携带在pDD66和pBR1052的AscI片段上,与Pm启动子及上游和下游的转录终止子一起。鉴定包含pBR1052或pDD66的AscI片段的pMAK-CL衍生物并分别命名为pDD74和pDD76。这些质粒在图8L中图解。
分别将质粒pDD74和pDD76转化到MSC188以产生菌株MSC373和MSC377,如下获得K4基因集整合入染色体中的这些菌株的衍生物。MSC373和MSC377在30℃下在LB+5μg/mL的四环素(TC5)中生长过夜,约20μL的等分试样点样并划线接种到LB+TC5板,其在41℃下温育过夜。挑取在此板上出现的菌落并在43℃重新划线接种于LB+TC5板。在高温下保持质粒携带的抗生素抗性的筛选选择质粒插入染色体的重组,因为pDD74和pDD76质粒,作为pMAK705载体的衍生物,对复制是温度敏感的(Hamilton等,JBact.1989;171:4617-4622)。将能够在43°C在四环素上生长的MSC373和MSC377衍生物在LB+TC5液体培养基中在30℃传代培养过夜一次,随后在30℃下在LB液体培养基(无四环素)中传代培养过夜一次。然后稀释这些过夜培养物并在30℃铺于LB平板上并用牙签将分离的菌落挑到30℃下的LB、LB+TC5、和LB+34μg/mL氯霉素(Cm34)。从MSC377和MSC373每个中确定了一种四环素抗性(TcR)、氯霉素敏感(CmS)的衍生物。这些TcR、CmS衍生物,分别称为MSC391和MSC392,是推定的替代菌株,其按以下方式发生重组:K4DNA序列在CA基因座保持在染色体中而剩余的质粒序列已通过同源重组切出,而且质粒随后丢失。这些分离株的PCR分析表明相对于可拉酸基因座侧翼的染色体DNA序列,约19kb的K4DNA片段的5'和3'端存在于预期的位置。
如实施例4中详述的,通过PCR克隆了大肠杆菌fhuA基因的上游和下游的DNA区域,组装和测序并将此缺失片段移入pMAK705自杀质粒以构建用于fhuA基因座的替代载体,称为pMAK705-ΔfhuA,或pDD73(图8M)。将xylS调节基因如下克隆到这种替代载体。作为一个PstI片段从pDD42切出xylS基因并克隆到pDD73的PstⅠ位点以产生pDD77,其在图8N中图解。pDD77的PstI片段与存在于表达质粒pDD66和pBR1052和亲本pDD54载体中的含xylS的PstI片段是相同的。用pDD77转化如上所述的K4基因簇替代菌株MSC391和MSC392。从MSC391和MSC392的pDD77转化中各选择两个分离株并命名如下:
MSC402≡MSC391pDD77“分离株A”
MSC403≡MSC391pDD77“分离株B”
MSC404≡MSC392pDD77“分离株A”
MSC405≡MSC392pDD77“分离株B”
在摇瓶中测验所有这些菌株的软骨素生成。菌株在TB培养基在30°C+Cm34上生长以选择保持pDD77质粒的菌株。在ODA600约0.2,通过加入2mM的m-甲苯甲酸(m-TA)诱导培养物。在诱导后24小时和48小时取样并进行软骨测定素。所有四个菌株产生软骨素。这些测定的结果如下表8A所示。诱导的MSC404和MSC405的软骨素水平约2.5倍高于MSC402和MSC403。在此实验中,MSC404和MSC405产生在这些培养条件下在摇瓶中以MSC279(MSC188pDD66)通常观察到的量的约65-70%,约0.5g/L。这些结果表明包含K4软骨素生物合成基因单一染色体拷贝的重组大肠杆菌能够产生大量的软骨素。
表8A
样品 |
菌株描述 |
CHμg/mL |
ODA600 |
#1MSC402未诱导24h |
MSC391pDD77分离株A |
11 |
11.6 |
#2MSC402+mTA 24h
|
MSC391pDD77分离株A |
47 |
10.2 |
#3MSC403未诱导24h |
MSC391pDD77分离株B |
7 |
11.2 |
#4MSC403+mTA 24h
|
MSC391pDD77分离株B |
47 |
10.0 |
#5MSC404未诱导24h |
MSC392pDD77分离株A |
64 |
11.4 |
#6MSC404+mTA 24h
|
MSC392pDD77分离株A |
114 |
9.4 |
#7MSC405未诱导24h |
MSC392pDD77分离株B |
16 |
11.7 |
#8MSC405+mTA 24h
|
MSC392pDD77分离株B |
137 |
9.7 |
样品 |
菌株描述 |
CHμg/mL |
ODA600 |
#9MSC402未诱导48h |
MSC391pDD77分离株A |
29 |
15.9 |
#10MSC402+mTA 48h
|
MSC391pDD77分离株A |
152 |
15.7 |
#11MSC403未诱导48h |
MSC391pDD77分离株B |
23 |
15.6 |
#12MSC403+mTA 48h
|
MSC391pDD77分离株B |
111 |
15.6 |
#13MSC404未诱导48h |
MSC392pDD77分离株A |
142 |
15.7 |
#14MSC404+mTA 48h
|
MSC392pDD77分离株A |
344 |
14.9 |
#15MSC405未诱导48h |
MSC392pDD77分离株B |
33 |
15.3 |
#16MSC405+mTA 48h
|
MSC392pDD77分离株B |
329 |
15.4 |
源自pBR1052的菌株(MSC404和MSC405)似乎比源自pDD66的菌株更具生产力,但两种染色体基因集均充分发挥功能以产生软骨素。来自pBR1052的染色体K4基因集包含插入kpsF基因紧邻上游的Pm启动子的第二拷贝。这一添加的启动子显示出相对于在pDD66中表达,在质粒pBR1052中增强下游基因(kpsFEDUCS)的表达。可能额外的Pm启动子也增加在染色体背景中下游基因的表达,而这些基因增强的表达可以显著增加CH产生。
获得了MSC403和MSC405的衍生物,其中使用如下两个步骤的“pop-in/pop-out”方法在fhuA基因座将pDD77的质粒携带的xylS基因整合到染色体中。MSC403和MSC405在30℃在LB+Cm34生长过夜。这些培养物稀释104倍并将0.1mL的等分试样在43℃铺在LB+Cm34。过夜温育后,获得大小不等的约100个菌落。挑取分离的菌落划线接种到LB+Cm34板上并在43℃生长过夜。从这些板挑取分离的菌落并用于接种无任何抗生素的5mLLB培养物。这些培养物在30℃生长过夜,并随后1000倍稀释传代两次并在30℃在LB中生长过夜。然后将该第三次传代稀释106倍并将0.1mL等分试样在30℃和37℃铺在LB。用牙签从这些铺板挑取单个菌落到LB和LB+Cm34上测试质粒的丢失。容易地获得氯霉素敏感的分离株(CMS),并通过PCR筛选这些分离株以确定所需的“pop-out”取代株,其中发生以下方式的重组:含xylSDNA序列在fhuA基因座保持在染色体中,而其余部分的质粒序列被切出并随后丢失了质粒。此事件还导致大肠杆菌的染色体中整个fhuA基因的缺失。这些分离株的PCR分析表明现在xylSDNA片段的5'和3'端存在于相对fhuA基因座侧翼的染色体DNA序列预期的位置。得到的菌株,来自MSC403的MSC410和来自MSC405的MSC411,包含插入在fhuA基因座的xylS基因并保留了插入在可拉酸基因座的K4基因。
测试MSC410和MSC411的软骨素生物合成。菌株在30℃生长在TB培养基中并在ODA600约0.2时通过添加2mMm-TA诱导培养物。在诱导后24小时和48小时取样并测定软骨素。如下表8B所示,所有这些菌株产生了非常低水平的软骨素。
表8B
样品 |
CH μg/mL |
ODA600 |
MSC410未诱导24h |
1.5 |
10.8 |
MSC410+mTA24h |
2.4 |
9.3 |
MSC411未诱导24h |
2.0 |
11.6 |
MSC411+mTA24h |
5.9 |
10.7 |
MSC410未诱导48h |
3.7 |
16.5 |
MSC410+mTA48h |
5.2 |
14.7 |
MSC411未诱导48h |
4.4 |
15.4 |
MSC411+mTA48h |
12.2 |
16.1 |
这种低产生力是出乎意料的,因为紧接的前身菌株在相当的细胞密度在相同培养条件下产生了大量的软骨素。据推测,这些结果可能表明即使在诱导剂m-TA的存在下,xylS基因的染色体插入不能产生足够量的XylS蛋白来激活Pm启动子。或者,这些菌株中插入的K4和/或xylS基因假定的DNA结构可能是不正确的。通过PCR验证了两个片段的5'和3'末端的相对于同源可拉酸基因座和fhuA基因座序列侧翼的染色体序列的连接关系。但是,这些数据本身不能确认插入这些菌株的DNA的精确结构和序列。在从各自的产CH亲本(MSC403和MSC405)衍生MSC410和MSC411的过程中可能发生了在K4或xylSDNA片段中的重排、缺失或突变并可能造成了CH生物合成的损伤。
进行实验来验证这些假设。将质粒pDD77转化到MSC410和MSC411以测试染色体K4基因集在这两个菌株中的功能。将得到的菌株命名为MSC436(MSC410pDD77“分离株A”)、MSC437(MSC410pDD77“分离株B”)、MSC438(MSC411pDD77“分离株A”)和MSC439(MSC411pDD77“分离株B”)。这些菌株在30℃生长在TB培养基中并在ODA600约0.2时通过添加2mMm-TA诱导培养物。在诱导后24小时和48小时取样并测定软骨素。如下表8C所示,这四种菌株产生的软骨素高滴度与他们的祖先菌株MSC403和MSC405的滴度非常相似并远高于它们的紧接的前身菌株MSC410和MSC411。这些结果表明MSC410和MSC411株中的软骨素生物合成缺陷不是K4软骨素合成基因本身的缺陷导致的。
表8C
这些结果表明在菌株MSC410和MSC411中软骨素生物合成可能很低,原因是XylS蛋白功能上的缺陷,其是在MSC410和MSC411的生成中(分别来自MSC403和MSC405)可能已经发生的基因编码序列中的一些结构错误导致的,或者,xylS基因序列可能是正确的,但在这些构建体中的染色体xylS基因的表达水平可能不足以达到K4基因的最佳表达。
测序了在MSC410和MSC411染色体上的xylS基因以测试这些假设。通过使用整合位点侧翼的引物的PCR扩增了包含xylS基因插入的大肠杆菌染色体区域并测序了所扩增的DNA片段。xylS启动子和编码区的序列与期望的序列完全匹配。这一结果表明在MSC410和MSC411中xylS功能的缺陷是由于XylS蛋白从染色体基因的表达不足。因此,进行实验以增强xylS基因的表达。为此,设计并合成了一种合成的xylS基因启动子、核糖体结合位点和5′非翻译区(UTR)的优化版本,并将这些修饰序列引入xylS替代载体pDD77并随后引入到染色体中。
合成的片段包含与pDD77的BlpI-PstI序列相匹配的134bp,接着是xylSATG起始密码子的合成序列的86bp并通过唯一的BglⅡ位点进一步延伸37bp到xylS编码序列中。从ATG到BglⅡ位点的序列与pDD77中存在的序列相匹配。BlpI-BglⅡ片段可以容易地引入pDD77因为在该质粒中这些限制性位点是特有的。86bp的合成序列(如下所示)(SEQIDNO:98)包括一个共有的大肠杆菌启动子(基于Hawley和McClure,Gene1983;11:2237-2255)和一个共有的Shine-Dalgarno(SD)序列(Shine和DalgarnoProc.Natl.Acad.Sci.USA.1974;71:1342-6)。该序列也在预测的mRNA的5'末端纳入了一个茎环结构(以带下划线的文本表示)。预期所有这些特征提高XylS蛋白的有效表达。
由商业供应商(DNA2.0)合成了BlpI-BglⅡ片段(SEQIDNO:140)并将包含修饰的序列的合成的DNA克隆到xylS替代载体pDD77,作为BlpI-BglⅡ片段代替含有天然xylS调节序列的天然BlpI-BglⅡ片段。将含有修饰的xylS的质粒,称为pDD79(图8N),转化到MSC392以测试修饰的xylS基因激活Pm启动子和驱动软骨素产生的能力。挑取了三个包含pDD79的MSC392转化体并命名为MSC458、MSC459和MSC460。在标准摇瓶实验中与MSC392亲本一起测试这些菌株的软骨素产生。菌株在30℃生长于TB培养基(MSC392),或TB+Cm34(MSC458-460),并在ODA600约0.2时通过加入2mMm-TA诱导培养物。在诱导后24小时、48小时和72小时取样。对48小时的样品进行了软骨素检测。所有的含pDD79菌株在诱导和未诱导培养物中均产生了约300μg/mL。相反,缺失xylS基因的MSC392在诱导和未诱导培养物中仅产生了4μg/mL的软骨素。这些结果如下表8D所示。
表8D
约300μg/mL的软骨素观察值与在包含质粒pDD77上的天然xylS基因的MSC405和MSC438的诱导培养物观察到的滴度是相似的。但是,MSC458、MSC459和MSC460的未诱导和诱导培养物均产生了基本相等的CH滴度。此结果与pDD79的修饰的xylS基因增加的XylS产量是一致的,因为已经报道在没有任何添加的诱导剂时,XylS的过度产生激活Pm启动子(Dominguez-Cuevas等,J.Bact.2008;190:3118-3128)。
为了测试当被插入到染色体中时修饰的xylS基因的功能,获得了MSC459的衍生物,在其中使用上述实施例3详述的两步骤的“pop-in/pop-out”方法在fhuA基因座将pDD79的质粒携带的xylS基因整合到染色体中。MSC459在30℃下在LB+34μg/mL氯霉素(Cm34)上生长过夜并在43℃下铺于LB+Cm34。温育过夜后,挑取分离的菌落并划线接种到LB++Cm34板并在43℃下再次生长过夜。挑取来自这些铺板的分离菌落并通过菌落PCR测试以确认质粒整合到染色体中。
将PCR检测阳性的两个菌落用于接种5mL无任何抗生素的LB培养物。这些培养物于30℃生长过夜并随后通过1000倍稀释传代并在30℃在LB中生长过夜。然后将这些培养物稀释106倍并将0.1mL等分试样在37℃铺在LB上。用牙签将来自这些板的单个菌落挑到LB和LB+Cm34以测试质粒的丢失。容易地获得氯霉素敏感的分离株(CmS)并PCR筛选来自每种培养物的6个这样的分离株以确定所需的“pop-out”替代株,其中发生如下方式的重组:含xylSDNA序列保留在染色体中的fhuA基因座处,而其余部分的质粒序列被切出并且随后该质粒丢失。此事件还导致整个fhuA基因从大肠杆菌染色体的缺失。这些分离株的PCR分析表明现在xylSDNA片段的5'和3'端存在于相对fhuA基因座侧翼的染色体DNA序列预期的位置。来自MSC459的两个这样的菌株,MSC466和MSC467,现在应携带插入在fhuA基因座的xylS基因(带有合成的启动子)和插入在可拉酸基因座的K4基因。
在摇瓶中测试MSC466和MSC467的软骨素生物合成。菌株在30℃生长于TB培养基中,并在ODA600约0.2时通过添加0、1、2或4mMm-TA诱导培养物。在诱导后24小时、48小时和72小时取样。48小时样品的软骨素测定数据如下表8E所示。当用1或2mMm-TA诱导时,两菌株产生了相当的软骨素滴度(>400μg/mL)。用4mMm-TA诱导的培养物产生有所降低的软骨素滴度。未诱导的培养物产生了较少量的软骨素,约160-170μg/mL。这些结果与具有合成的启动子、优化的核糖体结合位点和5'UTR发夹结构的修饰的xylS基因比天然xylS基因更有效地表达和因此在刺激由Pm启动子的K4软骨素生物合成基因的转录是更有效的假设是一致的。染色体的菌株MSC467和MSC466不含任何携带K4软骨素生物合成基因或调节xylS基因的质粒并且均能够产生相当量的软骨素。
表8E
MSC467包含插入染色体在染色体K4基因簇的kpsS基因的紧接下游(3')的来自pDD74(参见图8L)的四环素抗性基因(参见图8T)。为了允许使用质粒携带的基因编码的四环素抗性作为对导入和保持某些质粒的选择,使用实施例3所述的“popin/popout”的方法从下面详述的MSC467的染色体中缺失该染色体的四环素抗性基因。将所得的四环素敏感的MSC467衍生物命名为MSC561。MSC561的构建按如下完成。
使用pDD74DNA作为模板和引物BLR476和BLR478扩增MSC467和pDD74中tetR基因紧邻上游的约900个碱基对的染色体序列:
BLR4765>CGTCAAGCTTGTGAACGCCTATAGCAGCTTG>3(SEQIDNO:101)
BLR4785>CAGTGGCGCGCCGAGCGATGATAAGCTGTC>3(SEQIDNO:102)
用HindⅢ和AscI消化所得的PCR产物并根据制造商的方案与用HindIII和AscI消化过并使用南极磷酸酶(NewEnglandBioLabs,Ipswich,MA)进行处理的pMAK-CL(描述于实施例3和图8L)质粒DNA连接。将连接产物转化入大肠杆菌NEB5α(NewEnglandBioLabs,Ipswich,MA),并通过诊断性限制性内切核酸酶消化,对来自得到的转化体的质粒DNA筛选克隆的PCR片段的存在。将来自一个这样的转化体的重组质粒命名为pBR1087并用于基因替代实验以从MSC467染色体缺失tetR基因。pBR1087的结构如图8U图解。将该质粒转化入MSC467,在基于pMAK705的复制子的复制允许温度30℃对氯霉素抗性进行选择。生长在30℃的培养物随后在43℃铺入存在34μg/mL(Cm34)氯霉素的平板,并挑取所得克隆并在43℃划线接种到LB+Cm34板。通过PCR筛选所得克隆中pBR1087在目标基因座的整合,并确定含有在此基因座整合的质粒序列的分离株在30℃无氯霉素的情况下传代培养在LB液体培养基中。随后,将如此传代培养的分离株在30℃无氯霉素的情况下铺在LB平板上,并测试所得克隆对氯霉素和四环素的敏感性。获得了氯霉素敏感、四环素敏感的衍生物,即作为切出整合的质粒的结果其中已经缺失tetR基因的推定的基因替代菌株,并将其通过PCR筛选确认此推定的染色体结构。
将如此确定为已经缺失tetR基因的一个菌株命名为MSC561,而MSC561的染色体K4基因簇的结构如图8T所示。缺失从kpsS编码序列下游71bp延伸到可拉酸基因座下游序列的5'端的AscI位点。缺失包括整个tetR基因。
实施例11
本实施例证明了提高K4区域2基因(kfoABCFG)相对于区域1和3基因的基因剂量导致在大肠杆菌K-12摇瓶培养物中显著更高的软骨素产生。
大肠杆菌K-12菌株MSC467(实施例10)包含在Pm启动子控制下的在可拉酸基因座的区域1、2和3和在合成的共有启动子控制下的在fhuA基因座的xylS。质粒pCX039(实施例4)包含Pm启动子控制下的区域2kfoABCFG基因并且也包含天然xylS基因。将pCX039转化入MSC467以构建菌株MSC499。通过转化pDD63(实施例4)到MSC467中构建对照菌株MSC498。确定了这两个菌株在可变的诱导物浓度下在摇瓶培养中(TB/Cm34培养基,30℃,72小时)的软骨素产量。(表9A)。
表9A
通过将区域2基因呈现在质粒上表达其增加剂量清楚地导致较高的软骨素产量。在菌株MSC499未诱导时观察到相对高水平的产量。这可能是由于MSC499染色体中存在的修饰的xylS基因的增强表达导致的K4基因的未诱导表达。如上所述,甚至在未加入诱导剂的情况下高水平的XylS蛋白能够激活Pm启动子(Dominguez-Cuevas等,2008)是已知的。为确定是否在此质粒系统中额外的质粒编码的XylS是最佳的软骨素产生所必需的,构建了缺失xylS基因的质粒pDD63和pCX039的衍生物。这些质粒在整个xylS基因编码序列侧翼的1049bp片段内各包含两个NsiI限制性位点(参见实施例4)。用NsiI消化这些质粒的样品,热处理以使酶失活,然后用T4DNA连接酶处理以生成缺失xylS基因片段的环形质粒。先将pDD63ΔNsi转化入大肠杆菌MSC188(实施例3)。将表征的pDD63ΔxylS质粒命名为pCX069。随后将该质粒转化入大肠杆菌MSC467(实施例10)以构建菌株MSC510。将pCX039ΔNsi样品直接转化到MSC467,并将表征的ΔxylS质粒命名为pCX074。如本实施例先前所述的确定了这些菌株加上MSC498和MSC499对照菌株的软骨素产生,其结果如表9B所示。
表9B
从pCX039缺失xylS没有降低软骨素产生的最大量,但需要更高的诱导剂水平以达到最大水平,参见表9B中MSC511vs.MSC499。这个结果示例了XylS水平、诱导剂水平、K4基因补充和软骨素产生力的相关性。
上述实施例4描述了质粒pDD80,一个设计用于将均表达自合成共有启动子的xylS和区域2kfoABCFG基因在fhuA基因座插入到大肠杆菌染色体中的基于pMAK705的替代质粒的衍生化。下面表9C描述了在包含pDD80作为染色体外元件的MSC467(染色体xylS)和MSC392(无xylS)菌株(实施例10)中的软骨素产生。
表9C
与pCX039的情况相似,质粒pDD80增强了在包含K4软骨素生物合成基因(区域1、2和3)整个互补体的染色体拷贝的大肠杆菌宿主菌株中软骨素的产生。在包含pDD80的菌株中诱导对软骨素产生的影响不大,无论在染色体中存在或不存在xylS拷贝。这可能是这些菌株中相对高水平的XylS的结果,其原因是表达来自多拷贝质粒的由强合成启动子驱动的、并包含优化的核糖体结合位点和添加到mRNA5’端的发夹结构的修饰的xylS基因。
实施例12
本实施例证明向菌株MSC467染色体添加kfoABCFG基因的单一额外拷贝增加了软骨素产生。
上述实施例11证明当将Pm启动子控制下的K4区域2基因kfoABCFG的额外拷贝在质粒pCX039上引入MSC467时,在摇瓶中菌株MSC467的软骨素产量大大提高。将质粒pDD80引入MSC467时获得相似的结果。如实施例4描述的质粒pDD80携带在上述实施例10描述的合成的xylS启动子的转录控制下的kfoABCFG基因。这些结果表明,增加一个或多个kfoABCFG基因编码的蛋白的水平显著增加软骨素的产量。在多拷贝质粒上克隆这些基因提供了一种增加这些蛋白质产量的方法。不采用质粒表达平台,另一种增加这些蛋白产量的方法是将这些基因的多个拷贝插入到宿主生物的染色体中。
将kfoABCFG基因集的第二拷贝在fhuA基因座,在修饰的xylS基因的紧邻下游插入到MSC467的染色体中,在合成的xylS启动子的转录控制下。为此目的,通过将在从pCX039切出的PstI片段上的kfoABCFG基因克隆到实施例4详述的pDD79兼容的NsiI位点构建了替代载体。在得到的质粒pDD80中,kfoABCFG基因由设计为强组成型启动子的合成xylS启动子转录。将pDD80转化入MSC467产生上述实施例10所示的菌株MSC522以在摇瓶中产生约1g/L的软骨素。通过如实施例3和实施例10详述的基于pMAK705的质粒替代方法,从MSC522衍生替代菌株(MSC537)。该菌株携带一个额外的插入在MSC467染色体中在fhuA基因座,紧接xylS基因下游的kfoABCFG基因的拷贝。
与MSC467平行测试了MSC537的软骨素产生。将培养物以ODA600约0.01在30℃接种于TB培养基中。在OD为约0.10时,通过加入1mMm-TA诱导培养物并额外培养72小时。在诱导后48小时和72小时取样进行软骨素检测。在诱导后72小时,MSC537产生了0.57g/L的软骨素,而MSC467产生0.45g/L;MSC537与MSC467相比增加约25%。在进一步的实验中,当在摇瓶中平行测试MSC537和MSC467的软骨素产生时,MSC537持续产生比MSC467更多的软骨素(20-30%)。这一结果表明,虽然与kfoABCFG基因多个拷贝的加入在菌株MSC499和MSC522中增加软骨素产生不是相同的程度,在MSC467染色体中加入K4区域2的kfoABCFG基因的单一额外拷贝可以增加软骨素产生。这两个在多拷贝质粒上携带克隆的kfoABCFG基因的菌株比MSC467多产生约2倍的软骨素(参见实施例10)。将质粒pCX039转化入MSC537以构建菌株MSC551。
像MSC467一样,MSC537菌株包含来自于pDD74(参见图8L),插入在存在于MSC537的染色体K4基因簇的kpsS基因的染色体紧接下游(3′)的四环素抗性基因。如上所述,在一些实施例中,需要的是菌株对四环素敏感。因此,为从MSC467的染色体缺失tetR基因,使用相同的方法和如上述实施例10描述的替代质粒(pBR1087),从MSC537染色体上缺失tetR基因。将所得的MSC537的四环素敏感衍生物命名为MSC562。在摇瓶实验中,MSC562和MSC537在30℃生长于TB培养基中并通过加入1mMm-TA诱导。测定了诱导后72小时收获的培养样品的软骨素滴度并发现互相是相当的;MSC562的0.51g/L和MSC537的0.57g/L。
将如图8Q所示的包含kfoABCFG基因的质粒pCX039和如图8I所示的仅含载体的对照质粒pDD63分别转化入菌株MSC562以构建菌株MSC564和MSC563。在摇瓶实验中,MSC563和MSC564在30℃生长于含四环素(5μg/mL)的TB培养基进行质粒选择,并用1mMm-TA诱导。在诱导后72小时,MSC564和MSC563的培养物分别产生了滴度0.81g/L和0.29g/L的软骨素。
在本实验中,其中培养物生长在存在四环素的条件下,在MSC564中pCX039的质粒保留是非常有效的。稀释MSC564的72小时培养物的样品并铺于LB平板和含5μg/mL四环素的LB平板。在这两个铺板条件下,菌落形成单位(CFU)滴度并没有显著差异;LB的1.16×109CFU/mL与LB+四环素的1.28×109CFU/mL。因此,在本实验的条件下,未检测到质粒的丢失。
预期的是,随后更多个kfoABCFG基因拷贝加入到MSC537的染色体中能够进一步增加在此菌株中的软骨素产生。可以使用实施例3详述的基因打靶方法将这些基因的额外拷贝插入在其他染色体基因座上。可以作为整合这些基因的额外的位点的各种非必需位点在大肠杆菌中是已知的。此外,可以在基因置换质粒上构建由kfoABCFG基因集的两个或更多个拷贝组成的串联排列,并作为单一的基因置换事件引入染色体。
此外,增加kfoABCFG基因编码的蛋白的产量的其他方法包括蛋白编码序列的密码子优化,和启动子序列、核糖体结合位点和这些基因的mRNA的5’端非翻译区的优化。可以将这样的序列优化应用于质粒载体表达的基因和插入到染色体中的基因。
实施例13
本实施例描述了使用质粒载体和染色体整合将软骨素生物合成基因引入野油菜黄单胞菌,并证明了在摇瓶中在野油菜黄单胞菌中重组DNA介导的软骨素生物合成。
具体地,本文描述的是包含K4生物合成基因组合的质粒的构建和将它们导入野油菜黄单胞菌菌株MSC255。进一步描述的是质粒pKM001和pKM002(实施例3描述的)的衍生物的用途,用于将软骨素生物合成基因和它们的子集稳定插入到野油菜黄单胞菌菌株MSC255的染色体在黄原胶的操纵子的缺失的位点。
作为染色体外元件将软骨素合成基因引入野油菜黄单胞菌。
本发明人发现,将大质粒从大肠杆菌供体直接引入到野油菜黄单胞菌(例如通过三亲本杂交)或作为从大肠杆菌菌株纯化的质粒引入(例如,通过电穿孔–参见下面)可以导致在野油菜黄单胞菌中得到的质粒的结构异常。相对较小的质粒显得对这种现象不那么敏感,可能是由于对较大的DNA分子有相对较大的影响的野油菜黄单胞菌天然的限制系统(Feyter和Gabriel,J.Bact.1991;173:6421-6427,daSilva等,Nature2002;417:459,Roberts等,Nuc.AcidRes.2010;38:D234)。本发明人已经使用了两种方法成功克服了这种影响。在一种方法中,从纯化自野油菜黄单胞菌转化体的较小质粒重新构建包含区域1、2和3基因的大质粒。在第二种方法中,将区域1、2和3基因分入两个(较小的)兼容的质粒中。
电穿孔用于将质粒引入到野油菜黄单胞菌细胞(Oshiro等,J.Microbiol.Method65:171-179,2006)。用限制性酶BamHI和RsrII(结合区域2的基因)消化质粒pDD67(实施例4中描述的),接着是用T4DNA聚合酶(以产生平端)的反应和连接反应。将所得混合物转化入大肠杆菌,并表征四环素抗性分离株。然后将得到的包含Pm驱动的区域1和区域3基因的质粒pKM005,如图10A所示,通过电穿孔转化入野油菜黄单胞菌以构建菌株MSC338。同样,将pCX039(实施例4)转化入野油菜黄单胞菌以构建MSC326。从MSC338纯化的质粒pKM005和从MSC326纯化的pCX039,分别用HindIII加AvrII消化,并将来自pKM005的区域1、3片段与pCX039的载体/区域2片段连接。将所得的混合物直接转化入MSC255,并选择四环素抗性。一个野油菜黄单胞菌转化体MSC348,显示含有质粒pKM007(图10A),其通过已转回大肠杆菌的质粒的限制性消化而与pDD67没有区别。出于对照的目的,用pDD63载体转化野油菜黄单胞菌菌株MSC255以构建菌株MSC397。
质粒pJAK15(ATCC77290,获得自ATCC)属于IncQ不相容组并编码卡那霉素抗性。将来自pKM005(包含Pm驱动的区域1和3,参见上文)的HindIII/AvrII片段与来自pJAK15的载体/卡那霉素抗性HindⅢ/XbaI片段连接。所得的质粒pKM006,如图10B所示,包含在与各种pBHR1衍生质粒兼容的载体上的可诱导的区域1和3基因。用pKM006转化菌株MSC326(MSC255pCX039),同时进行卡那霉素和四环素抗性选择以构建菌株MSC350。
首先通过将携带AscI、SbfI、SwaI和XhoI克隆位点的一个短的DNA寡核苷酸接头引入限定pKM001和pKM002中同源的上游和下游区域连接处的NotI限制性位点来修饰敲除载体pKM001和pKM002。接头是由退火的寡核苷酸prKM015和prKM016制备的,由此存在与NotI消化pKM001和pKM002产生的单链粘端兼容的单链粘端。将所得的质粒,分别命名为pKM008和pKM009,包含接头,其定向使得AscI限制性位点接近上游区域。
AscISwaIXhoI
prKM015(5′-3′)GGCCGCGGCGCGCCTGCAGGATTTAAATCTCGAGGC(SEQIDNO:99)
prKM016(3′-5′)CGCCGCGCGGACGTCCTAAATTTAGAGCTCCGCCGG(SEQIDNO:100)
SbfI
如下构建了仅具有K4区域2基因(kfoA、kfoB、kfoC、kfoF和kfoG)的替代载体:用SbfI-XhoI或AscI-XhoI消化pKM008和用SbfI-SalI或AscI-SalI消化pCX039。SbfI-SalI处理从pCX039产生含kfoABCFG片段而AscI-SalI处理产生含Pm启动子-kfoABCFG片段。将这些片段克隆到先用SbfI-XhoI或AscI-XhoI消化的pKM008以分别产生质粒pKM010(kfoABCFG:Pm-)和pKM011(kfoABCFG:Pm+)。质粒pKM010(SEQIDNO:145)和pKM011(SEQIDNO:146)用于构建也整合了K4区域3(kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC和kpsC)和区域1(kpsM和kpsT)基因的其他替代载体。用SbfI-AvrII消化pKM010和pKM011并将这些线性化载体与通过SbfI-AvrII消化pDD67产生的含kpsFEDUCSMT片段连接。将所得的质粒命名为pKM012(Pm-)和pKM013(Pm+)。质粒pKM010(SEQIDNO:145)和pKM012(SEQIDNO:147)的衍生化如图10C图解。质粒pKM011(SEQIDNO:146)和pKM013(SEQIDNO:148)的衍生化如图10D图解。
据报道,克隆在所有pKM008-pKM013构建体中的黄原胶基因簇的上游区域包括gum基因簇启动子(Federico等,J.Bact.1996;178:4313-4318)。因此,包含源自pKM010或pKM012重组到染色体中的序列的野油菜黄单胞菌菌株预期从内源性gum启动子转录K4基因。与此相反,pKM011和pKM013具有位于gum启动子和Pm启动子之间的终止子序列(来自pDD67)。因此,在含有pKM011或pKM013序列的重组野油菜黄单胞菌中K4基因的表达预期受到Pm/XylS系统的调控。
对于这些替代质粒中的每一个,“pop-in/pop-out”方法(上文详述的)用于在(缺失的)gum基因座将各K4基因簇重组到野油菜黄单胞菌菌株MSC255的染色体。通过电穿孔和四环素抗性选择将质粒导入MSC255。中间和最终菌株如下表10A所示。通过PCR鉴定了在gum基因座已经发生“pop-in”的重组体。通过在无抗生素选择下培养允许整合体消除的发生,并随后确定了四环素敏感的(“pop-out”)衍生物。然后用PCR确定各K4基因簇按所需的方向已经成功整合到gum基因座的“pop-out”衍生物。然后将质粒pDD63(携带xylS诱导基因)转化到Pm启动子驱动K4基因集的重组体中。四个关键的野油菜黄单胞菌的染色体插入菌株的遗传结构(含有非质粒编码的K4基因),MSC480、MSC469、MSC461和MAC494总结于表10A。
表10A
重组野油菜黄单胞菌在摇瓶中的软骨素产生。
除非另有说明,为评价软骨素产生,野油菜黄单胞菌菌株在摇瓶中的生长在YMG培养基(5g/Lproteose蛋白胨、3g/L酵母提取物、25g/L麦芽提取物、10g/L葡萄糖)中进行。培养物在30℃在250mL培养烧瓶中的50ml培养基中,以所需的抗生素进行选择(例如,2-5μg/mL四环素、10μg/mL卡那霉素)以200-225rpm常规生长48小时。为诱导Pm驱动的基因集,当培养物密度达到约OD600=0.5时加入2mMm-TA。
具有染色体外K4生物合成基因的菌株。通过如上所述的培养和测定确定了用各种质粒转化的野油菜黄单胞菌菌株MSC255(ΔgumB-gumM)的软骨素产生。结果如表10B所示。
表10B
*未检测到
含空载体的对照菌株MSC397,没有产生可检测的软骨素。在这些条件下,包含的区域1、2和3基因的菌株MSC348和MSC350产生约40μg/mL的软骨素。仅包含区域2基因的菌株MSC326产生约100μg/mL的软骨素。
在另一个实验中,包含kfoABCFG基因的菌株MSC326(MSC255pCX039)中的软骨素产生为48小时后166μg/mL;对照菌株MSC397(MSC255pDD63–质粒对照)没有产生可检测的软骨素。在MSC326培养物未高压灭菌样品的各部分中,无细胞上清和细胞沉淀部分分别含有100μg/mL和71μg/mL的软骨素。这些结果表明K4区域2基因(除去那些引导果糖基化的)对于在野油菜黄单胞菌中产生软骨素是充分的并进一步表明软骨素是通过某些未表征的内源性机制或通过细胞破碎或裂解从细胞中运出的。
具有染色体编码的K4生物合成基因的菌株。上述的染色体外质粒,会以不同的频率从培养基中的细菌细胞丢失,其通过抗生素抗性的损失来定义。将K4生物合成基因整合到野油菜黄单胞菌染色体应减少这种不稳定性,以及利于这些菌株的大规模培养。包含染色体整合的K4基因(见上文)的4个菌株的软骨素产生如下表10C所示。菌株在改进的YMG培养基(YMGM(5):80mMMOPS(pH7.0)缓冲的YMG,5g/L葡萄糖)中或TB培养基中生长48小时。在含pDD63的菌株中四环素以5μg/mL存在。从两种启动子并在两种培养基中均产生软骨素。值得注意的是,只有存在区域2基因时产生软骨素。参见表10C。
表10C
*未测定
在另一实验中,选择的菌株生长于不同的葡萄糖水平的YMGM培养基中。在所有葡萄糖浓度下在携带生物合成基因集的菌株(而不是缺乏这些基因的对照菌株)中产生了软骨素。在这些条件下的最高产量为仅包含Pm/xylS诱导控制下的区域2基因的菌株MSC469中的390μg/mL。MSC469的YMGM+10g/L葡萄糖培养物的未高压灭菌的无细胞上清和细胞沉淀的检测分别存在167μg/mL和150μg/mL软骨素。与之前一样,这些结果表明软骨素是从细胞中运出。参见表10D。
表10D
*未检测到
实施例14
本实施例描述了测定果糖基化的和未果糖基化的软骨素的方法
从细菌制备软骨素
使用阴离子交换剂DEAE-纤维素DE52柱捕获重组软骨素(rCH)。用5倍体积的100mMNaCl洗涤后,用5倍体积的300mMNaCl洗脱柱。浓缩洗脱液并针对10倍体积的蒸馏水透析。将透析过的溶液冻干。将冻干粉末用作rCH。
根据Manzoni,M.等的方法(BiotechnologyLetters1996;18:383-386)从菌株U1-41(大肠杆菌O5:K4:H4)的培养物中纯化果糖基化的软骨素荚膜多糖(K4P)。根据Lidholt,K.等的方法(J.Biol.Chem.1997;272:2682)从K4P制备去果糖基化的K4P(DFK4P)。
样品制备和软骨素的HPLC测定
摇瓶培养样品(通常5mL)在121℃在>15psi高压灭菌5分钟,并使其冷却。然后视需要用水将样品重新调整至原体积,以补偿在高压过程中的损失。离心(对于较低细胞密度摇瓶培养物通常为3500g10分钟;对于发酵或更高密度的培养物为12000g5分钟)样品(1.5-5mL)以产生上清和沉淀部分。在某些情况下,如所示的,离心样品而不进行在先的高压灭菌。通常将培养物样品或分离的上清和沉淀存放于-20°C直至检测。
为了分析细胞相关的软骨素,将细胞沉淀重悬于初始体积的50mM磷酸钠缓冲液pH7.2并用5-10mg/mL溶菌酶(SigmaL-7651)和60U/ml脱氧核糖核酸酶I(SigmaD-4527)在37℃下水解2小时,然后由200μg/mL蛋白酶K(PromegaV3021)在37℃下水解1小时。终止反应(90℃,5分钟)后,将溶液离心以除去细胞碎片。
为分析果糖基化的软骨素荚膜多糖(K4P),将样品(摇瓶/发酵液上清或澄清的水解细胞沉淀)先用温和的酸水解去果糖基化,即用HCl调节pH至1.5,在80℃温育30分钟,然后用0.5M碳酸钠中和。在冻干之前,DFK4P样品和非果糖基化的rCH样品(发酵液上清、水解的细胞沉淀或重构的沉淀)针对去离子水透析过夜(PierceBiotechnologymolecularweightcut-off7kD)或通过离心超滤(AmiconUltra-0.5CentrifugalFilterDevice,10kD名义上的分子量截留值)与去离子水洗脱进行部分地纯化。
命名为软骨素酶ABC(SeikagakuBiobusiness,Japan)的软骨素-降解酶可以将未果糖基化的软骨素完全水解为不饱和的非硫酸化二糖,2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-(β-D-葡萄糖-4-烯吡喃糖基糖酮酸)-D-半乳糖(Δdi-0S)。因此,可以通过使用HPLC系统定量这种从多糖酶法产生的二糖确定样品溶液中未果糖基化的软骨素的量。
冻干后的残余物溶于THB(50mMTris-HCl缓冲液加50mM醋酸钠pH8.0)并用软骨素酶ABC(2单位/mL,37℃3小时)水解。通过在90℃加热5分钟终止酶反应后,将混合物在10000rpm下离心5分钟以除去不溶性沉淀物。使用Microcon离心式过滤器(UltracelYM-10;Millipore)过滤上清以除去酶和非软骨素多糖。通过反相离子对HPLC(SenshuPakDocosil,4.6x150mm;粒径,5μm)分离所得的不饱和二糖(2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-(β-D-葡萄糖-4-烯吡喃糖基糖酮酸)-D-半乳糖;Δdi-0S),过柱后用2-氰基乙酰胺标记,以荧光检测(Toyoda,H.等,J.Biol.Chem.,2000;275:2269),并相对从市售的软骨素(SeikagakuBiobusiness,Japan)或rCH制备的外部标准进行定量。典型的二糖校准曲线如图11B所示。用于二糖的校准曲线在2-200μg/mL范围内是线性的,且二糖的检测限为1μg/mL。软骨素多糖的浓度可以使用下面的公式计算,
浓度;μg/mL=[A]/[S]×[D],
其中[A]表示样品层析图中Δdi-0S的峰面积,[S]表示Δdi-0S浓度的校准曲线的斜率,而[D]表示的稀释因子。
定量果糖基化的软骨素的ELISA方法
根据Osmond,R.I.W.等,AnalyticalBiochemistry2002;310:199-207)的方法,通过K4P的羧基进行生物素偶联。在室温将100μl生物素化的K4P(1μg/ml)与链亲和素包被的96孔微滴定板(ThermoScientific,Japan)连接30分钟。用补充以0.05%20和0.05%Proclin(pH7.5)的50mMTris-HCl缓冲盐水(NaCl100mM)洗板后,向孔中加入50μl的培养上清或标准K4P溶液,和50μl2.5×106稀释的抗K4P血清(StatensSerumInstitut,Denmark)并温育60分钟。再次洗孔后,加入2000倍稀释的HRP-标记的抗兔免疫球蛋白(P0448,DAKOJAPAN,Japan)并温育60分钟。再次洗孔后,作为底物加入含有H2O2的TMB溶液(TMBW-1000-01,BioFXLaboratoriesInc.,OwingsMills,MD)并在室温温育30分钟。加入50mL终止试剂(STRP-1000-01,BioFXLaboratoriesInc.,OwingsMills,MD)并测定450nm处的吸光度。在这些测定条件下,其他多糖,如未果糖基化的软骨素、肝素糖和DFK4P不与K4P竞争。典型的标准曲线如图11A所示。
rCH、K4P和DFK4P的SEC-HPLC分析
通过使用配备折射率检测器和TSK-gelPWXL-4000、PWXL-3000和PWXL-2500(TOSOH,Japan)串联柱的TOSOHHLC-8220GPC系统在SEC-HPLC上用0.2MNaCl以0.6mL/min的恒定流速分析来确定了多糖的重均分子量(“分子量”)和软骨素酶消化率。以1mg/mL的浓度将50μL多糖溶液注入到柱上。柱和检测器室保持在40℃。分子量确定的硫酸软骨素(Mw:52.2、31.4、20.0、10.0、6.6、和1.0kDa)用作分子量标准。
软骨素酶ABC消化之前和之后的rCH(未果糖基化的)典型的洗脱概貌如图12所示。计算的rCH的重均分子量是120kDa。
K4P和DFK4P的软骨素酶消化率测定按如下进行。K4P和DFK4P溶于50mMTHB(含50mM醋酸钠的Tris-HCl,pH8.0)至终浓度为1mg/mL并分成若干等份。一部分溶液直接如上所述在SEC-HPLC上分析。另一部分在同一系统上分析,接着在37℃用软骨素酶ABC(终浓度;2单位/mL)处理3小时。结果如图13所示。从大肠杆菌K4U1-41培养物制备的K4P和DFK4P的分子量分别为33kDa和28kDa。通过软骨素酶处理,DFK4P完全消化为二糖,Δdi-0S,而酶部分消化了K4P(图13)。这些结果表明如上所述的去果糖基化过程将K4P转换为去果糖基化的形式而不影响K4P的软骨素骨架结构。因此,当样品在酶消化前在去果糖基化过程中加工时,也可以通过使用软骨素酶/HPLC方法定量从多糖酶法产生的二糖来确定样品中K4P的量。
实施例15
本实施例示例软骨素的硫酸化。
将实施例14制备的软骨素进行部分解聚以获得分子量约30kDa的软骨素。在60℃搅拌下将30mg这种软骨素溶解到0.6mL无水甲酰胺(FA)中。当溶液变为完全均匀时,加入固体的三氧化硫-TEA复合物(软骨素二糖单元的5倍当量),并持续搅拌120分钟。通过加入3倍体积的1M醋酸钠溶液终止硫酸化反应,并在室温下再静置30分钟。该溶液针对蒸馏水透析3天,用NaOH中和并冻干为白色粉末(32mg,107%)。重组硫酸软骨素的进一步分析表明分子量为29kDa,5.2%的硫。
在另一个实验中,在环境温度下将上面提到的软骨素(50mg)溶于1.0mL的无水甲酰胺(FA)。当溶液变清,缓慢加入氯磺酸(CH二糖单元的5倍当量)并保持连续搅拌20分钟。通过加入3倍体积的1M醋酸钠溶液终止硫酸化反应并让其在室温下再静置10分钟。该溶液针对蒸馏水透析3天,用NaOH中和并冻干得到白色粉末(47mg,94%)。重组的硫酸软骨素的分析表明Mw为33kDa,5.2%的硫。
实施例16
本实施例示例软骨素生物合成区域2基因集(kfoABCFG)对于最大地提高大肠杆菌菌株MSC562中的软骨素产生是足够的。
从pBR1052(图8K)和pDD67(图8J)制备了包含区域1、2和3(R1、R2和R3)基因集的组合的一组质粒。如上所述,通过用特定的限制性酶消化起始质粒,产生平端,例如,用T4聚合酶,并连接所得的载体片段来缺失基因集。用连接反应物转化大肠杆菌菌株MSC188(实施例3)并对所选的抗生素抗性转化体的所需特性进行评价。由于pBR1052包含一个在区域1基因集之前的第二Pm启动子这样的事实,本文描述的一些质粒还包含第二Pm启动子。所有这些描述的质粒包含xylS。在下表11中,R1=kpsFEDUCS,R2=kfoABCFG,和R3=kpsMT。注意“Pm:R2”质粒是之前构建的(pCX039;实施例4)。质粒pCX096(SEQIDNO:149)、pCX097、pCX100、pCX101(SEQIDNO:150),和pCX102的DNA图谱分别如图14A、14B、14C、14D和14E所示。分别使用质粒pCX097和pCX101作为pCX100和pCX102的起始质粒。
表11
保留的基因集 |
起始质粒 |
使用的酶 |
质粒名 |
kfo基因结构 |
R1,R2 |
pBR1052 |
MluI+SbfI |
pCX096 |
Pm:R2/Pm:R1 |
R1,R3 |
pBR1052 |
AvrII+NheI |
pCX097 |
Pm:R3/Pm:R1 |
R1 |
pCX097 |
PacI+SbfI |
pCX100 |
Pm:R1 |
R2,R3 |
pDD67 |
PacI+PmeI |
pCX101 |
Pm:R3,R2 |
R3 |
pCX101 |
AvrII+NheI |
pCX102 |
Pm:R3 |
将最终质粒中的每个转化到宿主菌株MSC562中,所得的菌株列于下表12。这些菌株和预先存在的对照菌株在含2xM9/tet5培养基的摇瓶中培养,用1mM间甲苯甲酸在OD600值约0.1-0.12时诱导,并评价72小时后的生长(OD600)和rCH产量。
表12
在具有仅携带区域2的质粒(MSC564)或区域2和1的组合的质粒(MSC683)的菌株中观察到最大生产率。区域2和3的组合(MSC688)导致较低的生产率。事实上,质粒携带的区域3的存在在其他相关菌株的比较中也表现为抑制性的(例如,MSC683vs.MSC690)。这些发现支持在菌株MSC562中通过只增加区域2的拷贝数增加rCH生产力的方法。
实施例17
本实施例示例软骨素生物合成基因区域2的拷贝数正效应需要全部5个kfoABCDG基因。
当存在于宿主大肠杆菌菌株MSC562中时,质粒pCX039(图8Q;包含区域2基因kfoABCFG)(与包含空载体pDD63的MSC562相比)在rCH产量上带来大幅提高(8-10倍)。使用上述从pDD66和pDD67缺失基因的方法(参见实施例4),从pCX039衍生了两组质粒以证明单独的区域2基因在刺激pCX039的rCH产生中的作用。
设计一组五个质粒以评估去除区域2基因之一的影响。在大肠杆菌宿主如MSC562中,这些基因的一个拷贝将依然存在(整合到染色体中)。这组质粒包括从中单独缺失kfoABCFG中的每一个的pCX039衍生物。下表13列出了用于缺失kfo基因的限制性酶和所得质粒的名称。上述实施例4详细描述了pCX044的衍生化。所有质粒包含xylS。
表13
缺失的基因 |
使用的酶 |
质粒名 |
kfo基因 |
kfoA |
RsrII |
pCX082(SEQ ID NO:152)
|
kfoBCFG |
kfoB |
BstBI |
pCX044(SEQ ID NO:43)
|
kfoACFG |
kfoC |
SpeI |
pCX075(SEQ ID NO:153)
|
kfoABFG |
kfoF |
AflII |
pCX081(SEQ ID NO:151)
|
kfoABCG |
kfoG |
NheI |
pCX092(SEQ ID NO:154)
|
kfoABCF |
将这些质粒转化到宿主菌株MSC562(区域1、2和3的染色体拷贝加xylS)中以产生下表14中所示的菌株。培养物在30℃生长于2xM9培养基(含10g/L甘油和2μg/mL四环素),用1mMmTA在OD600值约0.1时诱导,并测定生长72小时后的rCH产生。
表14
这些结果表明所有五个区域2基因(kfoABCFG)是在这些条件下达到最大生产力所必需的。MSC563的结果还表明来自染色体插入的kfoABCFG基因的表达足以在不存在质粒携带的基因拷贝的情况下支持大量的rCH产生。
设计第二组pCX039衍生物以评估存在单一质粒携带的区域2基因对宿主菌株MSC562中提高rCH滴度的影响。作为一种保持产生的质粒中相当的表达水平的手段,在所有构建体中保留启动子近端的kfoA基因。虽然这种设计策略不能完全独立(incompleteisolation)评价质粒编码的kfoB、C、F、或G基因,但是期望在所有这些质粒中保留kfoA基因和所得的Pm启动子和第一阅读框之间的固定关系可使得从Pm启动子的表达水平相当。使用与如上所述的相同的策略,进行以下衍生化(表15)。所有质粒包含xylS。
表15
将最后一组质粒中的每一个转化入宿主菌株MSC562,产生的菌株列于下表16中。这些菌株和MSC563和MSC564对照在摇瓶中培养于2xM9/tet2培养基中,用1mM间-甲苯甲酸在OD600值为0.08-0.18时诱导,并在68小时后评估生长(OD600)和rCH产生。
表16
这些数据证明K4区域2基因(kfoABCFG)中的每一个单独均不足以在MSC562宿主菌株中最大限度地刺激rCH产生。结合如上所述(例如,实施例16)的发现,显然包括所有区域2基因集的5个基因导致rCH产生的最大增强。
实施例18
本实施例示例用于增加软骨素生物合成基因区域2的染色体拷贝数以获得更高的软骨素产量的构建体。
实施例12证明了在已经包含区域1、2和3的单一的染色体拷贝的大肠杆菌宿主中加入区域2基因集(kfoABCFG)的单一染色体拷贝导致rCH产量显著的20%-30%的增加。实施例11证明了相似的含有携带区域2基因集的多拷贝质粒的宿主导致rCH产量2-300%的增加。为了产生高产、无质粒的菌株,本实施例说明了经设计以通过将它们插入各种特别选择的易于确定这类插入的非必要的染色体基因中来增加区域2拷贝(Pm启动子驱动)的染色体互补物的质粒的构建及用途。值得注意的是,当使用同源性驱动的“pop-in/pop-out”方法(参见实施例4和12)连续地将区域2基因集的拷贝插入到宿主大肠杆菌染色体的不同的基因座时,存在逐渐增加的不期望的靶向(同源驱动的重组)到预先存在的区域2插入中而非期望的基因座处的竞争。因此,具有通过简单的菌落筛选代替更费力和费时的PCR初始确定包含在所需的基因座的插入的菌株的手段随着宿主菌株中区域2拷贝数的增加而变得更加有利。
在此实施例中,描述了3个大肠杆菌靶基因座。它们是基因lacZ、mtlA和fruBKA操纵子(在某些情况下为简单起见称为“fruA”),它们分别是在作为糖的乳糖、甘露醇和果糖上生长所必需的,但不是在其他碳源,如葡萄糖或甘油上生长必需的。破坏了这些基因的菌株的菌落可以在指示琼脂,例如MacConkey’s(Miller,JH,ExperimentsinMolecularGenetics,1972)上根据菌落颜色差异视觉鉴定:粉色/红色为能够利用掺入的糖的菌株,而白/浅粉色为基因破坏的菌株(例如插入)。或者,LB/Xgal/IPTG琼脂培养基(同上)可用于检测乳糖代谢中的缺陷:蓝色菌落为菌株能够利用乳糖,而白/浅黄色菌落为无法利用乳糖的菌株(例如在lacZ基因中有插入的菌株)。例如这些使用颜色差异的方法允许从在其他地方有插入的菌落群中视觉鉴定出可能在所需的基因座有插入的菌株。本领域的技术人员将认识到,大肠杆菌中的其他靶基因座将允许筛选或选择所需的插入事件,非限制性的例子包括pepP、pepQ、feuA(cirA)、malB(lamB)、nupA(tsx)。
为了便于使用质粒pMAK705将区域2(“R2”)插入到fruBKA、lacZ、和mtlA基因,先开发了包含多克隆位点的pMAK705衍生物。引物DHD266c和DHD267c包含多限制性(克隆)位点(NotI、XhoI、AscI、SalI、BglⅡ、HindⅢ)的一条链(one-strandhalves)并且是互补的,除了2-碱基的单链末端,其(退火时)与AseI和ClaI消化pMAK705产生的粘端相容。AseI和ClaI限制性位点在相容末端连接后均不会再生。
DHD266c
TAGCGGCCGCATACTCGAGCATGGCGCGCCTAACGTCGACTAAGATCTCTAAGCTT(SEQIDNO:155)
DHD267c
CGAAGCTTAGAGATCTTAGTCGACGTTAGGCGCGCCATGCTCGAGTATGCGGCCGC(SEQIDNO:156)
用AseI和ClaI消化质粒pMAK705,并凝胶纯化载体片段。磷酸化的寡核苷酸DHD266c和DHD267c进行退火(各200nM的寡核苷酸,90℃5分钟后,缓慢冷却至50℃保持30分钟),然后将其与pMAK705载体片段连接。将连接反应物转化到大肠杆菌NEB10β中并选择氯霉素抗性。通过PCR筛选分离的转化体中的质粒,然后筛选MCS限制性酶位点的存在。测序MCS区域确定了具有所需结构的质粒。将该质粒命名为pMAK705pl(SEQIDNO:157;图14Q)。
R2插入fruBKA、lacZ和mtlA基因座的三种载体的构建均采取了相同的两步法。在第一步骤中,使用允许在PCR产物的“内部”末端之间退火的PCR引物为每个靶基因座生成具有同源性的上游和下游区域。该同源区域包含多个之后用于加入R2的限制性位点。在第二步骤中,将每个基因座的上游和下游PCR产物与含有最初用于合成单个模板成员的两个“外部”引物的PCR反应混合。由于设计到上游和下游PCR产物(现在在步骤2中的模板)的末端同源性,步骤2反应的结果是包含多克隆位点侧翼上游和下游区域的合适方向的DNA片段。用识别序列被设计到“外部”引物中的酶:用于下游端的NotI和用于上游端的HindⅢ消化步骤2的PCR产物。然后将这些片段分别克隆到用NotI和HindIII消化的pMAK705pl(SEQIDNO:157)。3个所得的质粒包含约900-1000bp正确方向的用于接受R2拷贝的多克隆位点(MCS)侧翼的上游(UP)和下游(DN)区域。对于pBR1093,MCS取代了约20bp的lacZ编码区。对于pBR1094,MCS插入到mtlA编码区。对于pBR1095,MCS取代了fruB的3’端、所有fruK和fruA的5’端。用于制备这些中间构建体的引物列于下表25。
为了制备区域2基因集以克隆入pBR1093、pBR1094和pBR1095,用PacI+ClaI从pCX074(参见实施例11)切出kfoABCFG基因(不含Pm启动子)。然后将纯化的R2片段克隆到用相同的酶消化的pJ201:11352(参见图8B)中。这产生质粒pBR1096,其中kfoABCFG基因再次定向在Pm启动子的后面。但是现在Pm:R2可以作为XhoI/AscI片段从pBR1096分离出来用于克隆到pBR1093(图14S)、pBR1094(图14V)和pBR1095(图14W)中。表17提供了最终取代基于pMAK705的Pm:R2插入的质粒的命名pBR1100(对于lacA基因座),pBR1101(对于mtlA基因座)、pBR1102(对于fruBKA基因座)。引物DHD280c、DHD281c、DHD283、DHD285、DHD268c、DHD269c、DHD271、DHD273、DHD274c、DHD275c、DHD277、和DHD279的序列分别如SEQIDNO:158-169所示。
表17
用质粒pBR1100(SEQIDNO:171;图14T)、pBR1101(SEQIDNO:172;图14V)、pBR1102(SEQIDNO:170;图14X)使用之前描述的“pop-in/pop-out”方法将额外的PM:R2拷贝赋予选择的大肠杆菌菌株。在30℃用pBR1100、pBR1101或pBR1102转化菌株并选择氯霉素抗性。然后将转化体在43℃铺于MacConkey/果糖/Cm琼脂(对于pBR1102转化体)、MacConkey/甘露醇/Cm琼脂(对于pBR1101转化体)、或LB/Xgal/IPTG/Cm琼脂(对于pBR1100转化体)。选择明显着色少的菌落用于进一步分析。在这些中,通过PCR鉴定具有整合到目标基因座的质粒的菌株。然后具有成功整合的质粒的菌株在不存在氯霉素选择下生长多个(例如,20-30)世代。筛选源自这些培养物的菌落的氯霉素敏感性(反映质粒的切出)和糖代谢缺陷(反映目标Pm:R2插入的保留)。通过PCR评价具有所需表型的分离株以获得正确的染色体结构。图15图解利用本实施例或其他实施例描述的方法进行菌株衍生化的多个步骤。作为一个说明和总结,菌株MSC702包含以下关键元件:Pm[kpsMTkfoABCFG]Pm[kpsFEDUCS]插入在可拉酸基因座,Psyn[xylS]插入在fhuA基因座,Pm[kfoABCFG]插入在fruBKA、lacZ和mtlA基因座,和(假设由于源自MSC691,参见实施例19)leuB基因内的8个碱基对的改变。
实施例19
本实施例示例了大肠杆菌菌株中自发性营养缺陷的鉴定和校正。
在基本生长培养基中评估重组大肠杆菌菌株rCH产生的过程中,发现某些菌株不生长。其后确定只有当补充亮氨酸源时,菌株MSC561才能生长于基本培养基上,也就是说,该菌株是亮氨酸营养缺陷型。测序MSC561中亮氨酸生物合成操纵子leuABCD发现该菌株已在其从亮氨酸原养型MSC467(参见实施例10)衍生过程中在leuB基因编码区(在编码区383位的C/G碱基对)自发获得了单碱基对的缺失。此缺失导致阅读框发生移码和提早出现(pre-mature)的翻译终止。此缺陷最初未检测到,因为遗传操作和早期的产生测试是在复杂培养基中进行的。这种突变不太可能是之前在fhuA和可拉酸基因座的靶向重组的结果,因为它们不是与leuB密切连锁的fhuA与leuB相距约85Kb,可拉酸操纵子与leuB相距约2Mb)。通过加入R2拷贝直接或顺次源自MSC561的所有菌株(如MSC627、MSC650、MSC646、MSC679和MSC700;参见图15)也是亮氨酸营养缺陷型的并包含相同的在leuB序列中的缺失。在一个MSC467的分离系中的菌株(MSC537、MSC562和MSC619)是亮氨酸原养型。(参见图15)。
两种方法用于转化选择的亮氨酸营养缺陷型到原养型(因此允许在不加亮氨酸的基本培养基中生长)。在一种方法中,将大量营养缺陷型菌株的细胞(约106-107)加到基本培养基琼脂平板上,随后在30℃温育3-7天。通常在这些条件下形成几个菌落。将分离自这些菌落的菌株(“自发回复”)重复生长于没有亮氨酸的固体和液体基本培养基中。选择的回复突变体的leuB基因的序列分析表明(在大多数情况下)在原单碱基对缺失位点附近的小的插入或缺失导致了正确leuB阅读框的恢复。下表18提供了相对于leuB编码区的坐标核苷酸改变的位置。在这些自发回复突变体中的LeuB酶在此区域具有改变的氨基酸序列,但是天然结构的变化似乎允许足够的功能以支持在无亮氨酸的培养基中生长。在自发回复突变体MSC692中,没有检测到leuB中的补偿性核苷酸改变。该菌株中遗传改变的性质是未表征的。
在将亮氨酸营养缺陷型转化为原养型的第二种方法中,将所选菌株的leuB自发突变特异性地校正为天然序列。使用来自野生型大肠杆菌W3110的gDNA作为模板,PCR引物BLR513(SEQIDNO:173)和BLR516(SEQIDNO:174)用于扩增天然leuB基因646个碱基对的区域。发现MSC561中缺失的碱基对的位点为距该PCR片段上游端的288bp处,并且PCR引物生成了HindIII和XhoI末端以克隆到pMAK705pl(实施例18,SEQIDNO:157;图14Q)中产生pBR1103(SEQIDNO:175;图14R)。在pBR1103中的leuB基因片段从SEQIDNO:175的bp=5059-5064的HindⅢ限制性位点延伸到SEQIDNO:175的bp=5712-5717的XhoⅠ限制性位点。这些限制性位点不是天然leuB序列的一部分,而是出于克隆目的通过用引物BLR513和BLR516的PCR引入的。
然后使用标准的“pop-in/pop-out”方法用于替换营养缺陷型菌株MSC650、MSC679、和MSC700中天然区域的有缺陷的leuB区域,分别获得原养型菌株MSC722、MSC723和MSC724。简言之,MSC650、MSC679和MSC700的初始pBR1103转化体在30℃在LB/Cm34板上选择。选定的转化体在43℃下铺于LB/Cm34,并通过PCR确认分离的存活株以具有在leuB基因座整合的pBR1103。选定的整合体在30℃在LB(无Cm)上生长约10代,然后在2xM9培养基(无Cm,无亮氨酸)上生长约15代。对于从分离自这些培养物的LB平板上的菌落衍生的菌株筛选氯霉素敏感性和原养型。源自三个起始亲本菌株中每一个的原养型氯霉素敏感菌株的leuB基因的DNA测序确认了原始的野生型序列的恢复。图15显示了与本文描述的其他菌株相关的这些菌株的衍生。
表18
*从leuB起始密码子上游约200bp(即,leuA的3-’端)至leuB终止密码子上游约200bp(即,leuB坐标1至leuB编码区全部1089个碱基对的约850)没有检测到leuB区域的补偿性变化。
将菌株MSC722、MSC723和MSC724(特异校正的Leu+原养型)中的rCH产生与具有相同K4基因补体(complement)和安排但分别自发转化为原养型衍生化的菌株:MSC677、MSC692和MSC702中的产生进行了比较(见图15)。6个菌株在30℃一式两份生长在2xM9培养瓶并在OD600值约0.1时用1mMmTA诱导。如上所述的,测定诱导71小时后的培养液样品的rCH含量。平均OD600和rCH浓度如表19所示。
表19
3个菌株对中的2个,rCH产量高于具有对leuB的特异性校正的菌株,但最终的细胞密度(由终OD600测定)是类似的。这些结果证明了特异性校正大肠杆菌菌株开发过程中发现的自发突变对于rCH产生的好处。
实施例20
本实施例描述了发酵罐中大肠杆菌中重组DNA介导的软骨素产生。
1.大肠杆菌(MSC537)的10-L发酵
使用10升的发酵罐在典型的发酵条件下,使用甘油作为碳源培养大肠杆菌菌株MSC537的培养物。发酵罐分批投入(batchwith)下述培养基(表20A),使用去离子水至6升的体积:
表20A
含有上述培养基的发酵罐高压灭菌后,无菌条件下加入下列组分(表20B):
表20B
组分 |
用量 |
甘油(加热灭菌) |
32.0g |
盐酸硫胺素(过滤灭菌) |
320μg |
痕量金属溶液(过滤灭菌,配方如下) |
24mL |
用典型的种子培养物接种发酵罐并在4.25小时后用2mMm-TA诱导,然后培养69小时并在培养过程中补入碳补料(由625g/L的甘油溶液组成)。69小时后,高压灭菌发酵罐并通过离心收获。发酵控制条件和产物产率分别如表20C和20D所示。
表20C
表20D
2.大肠杆菌(MSC564)的2-L发酵
使用2升的发酵罐在典型的发酵条件下,使用甘油作为碳源培养大肠杆菌菌株MSC564的培养物。发酵罐分批投入下述培养基(表21A),使用去离子水至1.5升的体积:
表21A
含有上述培养基的发酵罐高压灭菌后,无菌条件下加入下列组分(表21B):
表21B
组分 |
量 |
甘油(加热灭菌) |
6.4g |
盐酸硫胺素(过滤灭菌) |
64μg |
四环素 |
8.0mg |
痕量金属溶液(过滤灭菌,配方如下) |
4.8mL |
用典型的种子培养物接种发酵罐,然后培养66小时并在培养过程中补入170mL碳补料(由625g/L的甘油溶液组成)。培养5小时后用2mMm-TA诱导。控制发酵pH值、溶解氧、温度、甘油浓度和乙酸浓度(碳代谢的副产物)。以<2g/L乙酸为目标根据乙酸浓度调节甘油补料速率。目标甘油浓度是<5g/L。发酵进行66小时,此时甘油消耗量下降到<1.5g/L/小时。由于取样和蒸发,终体积为1.35L。控制条件和产物产率如下表所列。66小时后,高压灭菌发酵罐并通过离心收获。离心后回收的体积约为1L上清。发酵控制条件和产物产率分别如表21C和21D所示。
表21C
表21D
接着的三个发酵(3-5)来自一个实验,其中3个10L反应器在相同的条件下并列运行以比较在宿主染色体中包含不同数目和排列的区域2基因集的菌株MSC619、MSC677、MSC702(参见实施例19,图15)。简言之,MSC619和MSC677各具有3个区域2的完整拷贝,但在MSC619中1个拷贝由Psyn启动子驱动而不是Pm启动子。菌株MSC702含有4个区域2基因集的拷贝,均由Pm驱动。
3.大肠杆菌(MSC619)的10-L发酵
使用10升的发酵罐在典型的发酵条件下,使用甘油、酪蛋白水解物和氢氧化铵分别作为主要的碳源和氮源培养大肠杆菌菌株MSC619的培养物。发酵罐分批投入下述培养基(表22A),使用去离子水至6升的体积:
表22A
含有上述培养基的发酵罐高压灭菌后,无菌条件下加入下列组分(表22B):
表22B
组分 |
量 |
甘油(加热灭菌) |
48.0g |
KH2PO4 |
48.0g |
盐酸硫胺素(过滤灭菌) |
320μg |
痕量金属溶液(过滤灭菌,配方如下) |
24mL |
用典型的种子培养物接种发酵罐,并在4.2小时后用2mMm-TA诱导,然后培养80小时并补入碳补料(由625g/L的甘油溶液组成)和4N的氢氧化铵形式的氮补料。根据NOVA300A生物分析仪的样品读数手动调整碳和氮补料。目标甘油浓度是保持小于1g/L并且在存在乙酸积累情况下进一步降低补料率。氨浓度的目标是发酵液中的氨为100mg/L或更低。在培养过程中自动加入2N硫酸形式的酸和4N氢氧化钠形式的碱以控制pH。将消泡剂也自动加入到发酵罐以控制发酵液的泡沫。发酵控制条件和产物产率分别如表22C和22D所示。
表22C
表22D
4.大肠杆菌(MSC677)的10-L发酵
使用10升的发酵罐在典型的发酵条件下,使用甘油、酪蛋白水解物和氢氧化铵分别作为主要的碳源和氮源培养大肠杆菌菌株MSC677的培养物。发酵罐分批投入下述培养基(表23A),使用去离子水至6升的体积:
表23A
含有上述培养基的发酵罐高压灭菌后,无菌条件下加入下列组分(表23B):
表23B
组分 |
量 |
甘油(加热灭菌) |
48.0g |
KH2PO4 |
48.0g |
盐酸硫胺素(过滤灭菌) |
320μg |
痕量金属溶液(过滤灭菌,配方如下) |
24mL |
用典型的种子培养物接种发酵罐,并在4.2小时后用2mMm-TA诱导,然后培养80小时并补入碳补料(由625g/L的甘油溶液组成)和4N的氢氧化铵形式的氮补料。根据获得自NOVA300A生物分析仪的样品读数手动调整碳和氮补料。目标甘油浓度是保持小于1g/L并且在存在乙酸积累情况下进一步降低补料率。氨浓度的目标是发酵液中的氨为100mg/L或更低。在培养过程中自动加入2N硫酸形式的酸和4N氢氧化钠形式的碱以控制pH。将消泡剂也自动补料到发酵罐以控制发酵液的泡沫。发酵控制条件和产物产率分别如表23C和23D所示。
表23C
表23D
5.大肠杆菌(MSC702)的10-L发酵
使用10升的发酵罐在典型的发酵条件下,使用甘油、酪蛋白水解物和氢氧化铵分别作为主要的碳源和氮源培养大肠杆菌菌株MSC702的培养物。发酵罐分批投入下述培养基(表24A),使用去离子水至6升的体积:
表24A
含有上述培养基的发酵罐高压灭菌后,无菌条件下加入下列组分(表24B):
表24B
组分 |
量 |
甘油(加热灭菌) |
48.0g |
KH2PO4 |
48.0g |
盐酸硫胺素(过滤灭菌) |
320μg |
痕量金属溶液(过滤灭菌,配方如下) |
24mL |
用典型的种子培养物接种发酵罐,并在4.2小时后用2mMm-TA诱导,然后培养80小时并补入碳补料(由625g/L的甘油溶液组成)和4N的氢氧化铵形式的氮补料。根据获得自NOVA300A生物分析仪的样品读数手动调整碳和氮补料。目标甘油浓度是保持小于1g/L并且在存在乙酸积累情况下进一步降低补料率。氨浓度的目标是发酵液中的氨为100mg/L或更低。在培养过程中自动加入2N硫酸形式的酸和4N氢氧化钠形式的碱以控制pH。将消泡剂也自动加入到发酵罐以控制发酵液的泡沫。发酵控制条件和产物产率分别如表24C和24D所示。
表24C
表24D
总结实验3-5,菌株MSC619、MSC677和MSC702分别产生3.45、4.3和5.3g/L软骨素,证明了区域2排列(背景)和拷贝数对增强软骨素生产力的影响。
6.大肠杆菌(MSC702)的10-L发酵
使用10升的发酵罐在典型的发酵条件下,使用甘油、酪蛋白水解物和氢氧化铵分别作为主要的碳源和氮源培养大肠杆菌菌株MSC702的培养物。发酵罐分批投入下述培养基(表25A),使用去离子水至6升的体积:
表25A
含有上述培养基的发酵罐高压灭菌后,无菌条件下加入下列组分(表25B):
表25B
组分 |
量 |
甘油(加热灭菌) |
48.0g |
KH2PO4 |
48.0g |
盐酸硫胺素(过滤灭菌) |
320μg |
痕量金属溶液(过滤灭菌,配方如下) |
24mL |
用典型的种子培养物接种发酵罐,并在4小时后用2mMm-TA诱导,然后培养82小时并补入碳补料(由625g/L的甘油溶液组成)和4N的氢氧化铵形式的氮补料。根据获得自NOVA300A生物分析仪的样品读数手动调整碳和氮补料。目标甘油浓度是保持小于1g/L并且在存在乙酸积累情况下进一步降低补料率。氨浓度的目标是发酵液中的氨为100mg/L或更低。在培养过程中自动加入2N硫酸形式的酸和4N氢氧化钠形式的碱以控制pH。将消泡剂也自动加入到发酵罐以控制发酵液的泡沫。发酵控制条件和产物产率分别如表25C和25D所示。
表25C
表25D
该运行是设计作为发酵实验5(上述)的重复,但在软骨素产量上取得了显著的增加。至少部分地认为产量上的差异是由于在实验5中使用的过量消泡剂以及乙酸积累水平的增加,两者均被视为对软骨素产量有不利影响。
7.大肠杆菌(MSC702)的50-L发酵
使用50升的发酵罐在典型的发酵条件下,使用甘油和氢氧化铵分别作为主要的碳源和氮源的限定培养基中培养大肠杆菌菌株MSC702的培养物。发酵罐分批投入下述培养基(表26A),使用去离子水至40升的体积:
表26A
含有上述培养基的发酵罐高压灭菌后,无菌条件下加入下列组分(表26B)。
表26B
组分 |
量 |
甘油(加热灭菌) |
300g |
Na2HPO4 |
240g |
KH2PO4 |
120g |
盐酸硫胺素(过滤灭菌) |
2mg |
痕量金属溶液(过滤灭菌,配方如下) |
150mL |
用典型的种子培养物接种发酵罐,并在4小时后用2mMm-TA诱导,然后培养91小时并补入碳补料(由625g/L的甘油溶液组成)和4N的氢氧化铵形式的氮补料。根据获得自NOVA300A生物分析仪的样品读数手动调整碳和氮补料。目标甘油浓度是保持小于1g/L并且在存在乙酸积累情况下进一步降低补料率。氨浓度的目标是发酵液中的氨为100mg/L或更低。在培养过程中自动加入3N硫酸形式的酸和4N氢氧化钠形式的碱以控制pH。将消泡剂也自动补料到发酵罐以控制发酵液的泡沫。发酵控制条件和产物产率分别如表26C和26D所示。
表26C
表26D
此发酵实验证明在限定(基础)生长培养基中在中等发酵规模获得了高软骨素产量。
接着的2个发酵(8-9)来自一个实验,其中2个10L反应器在相同的条件下并列运行以比较菌株MSC702和MSC724。
8.大肠杆菌(MSC702)的10-L发酵
使用10升的发酵罐在典型的发酵条件下,使用甘油、酪蛋白水解物和硫酸铵分别作为主要的碳源和氮源培养大肠杆菌菌株MSC702的培养物。发酵罐分批投入下述培养基(表27A),使用去离子水至6升的体积:
表27A
含有上述培养基的发酵罐高压灭菌后,无菌条件下加入下列组分(表27B):
表27B
组分 |
量 |
甘油(加热灭菌) |
48.0g |
KH2PO4 |
48.0g |
盐酸硫胺素(过滤灭菌) |
320μg |
痕量金属溶液(过滤灭菌,配方如下) |
24mL |
用典型的种子培养物接种发酵罐,并在4小时后用2mMm-TA诱导,然后培养92小时并补入碳补料(由625g/L的甘油溶液组成)和硫酸铵形式的氮补料。根据获得自NOVA300A生物分析仪的样品读数手动调整碳和氮补料。目标甘油浓度是保持小于1g/L并且在存在乙酸积累情况下进一步降低补料率。氨浓度的目标是发酵液中的氨为100mg/L或更低。在培养过程中自动加入2N硫酸形式的酸和4N氢氧化钠形式的碱以控制pH。将消泡剂也自动补料到发酵罐以控制发酵液的泡沫。发酵控制条件和产物产率分别如表27C和27D所示。
表27C
表27D
9)大肠杆菌(MSC724)的10-L发酵
使用10升的发酵罐在典型的发酵条件下,使用甘油、酪蛋白水解物和硫酸铵分别作为主要的碳源和氮源培养大肠杆菌菌株MSC724的培养物。发酵罐分批投入下述培养基(表28A),使用去离子水至6升的体积:
表28A
含有上述培养基的发酵罐高压灭菌后,无菌条件下加入下列组分(表28B):
表28B
组分 |
量 |
甘油(加热灭菌) |
48.0g |
KH2PO4 |
48.0g |
盐酸硫胺素(过滤灭菌) |
320μg |
痕量金属溶液(过滤灭菌,配方如下) |
24mL |
用典型的种子培养物接种发酵罐,并在4小时后用2mMm-TA诱导,然后培养92小时并补入碳补料(由625g/L的甘油溶液组成)和硫酸铵形式的氮补料。根据获得自NOVA300A生物分析仪的样品读数手动调整碳和氮补料。目标甘油浓度保持小于1g/L并且在存在乙酸积累情况下进一步降低补料率。氨浓度的目标是发酵液中的氨为100mg/L或更低。在培养过程中自动加入2N硫酸形式的酸和4N氢氧化钠形式的碱以控制pH。将消泡剂也自动补料到发酵罐以控制培养液的泡沫。发酵控制条件和产物产率分别如表28C和28D所示。
表28C
表28D
本实施例中发酵8和9证明在复杂培养基中菌株MSC724比MSC702增加的rCH产量。这可能是MSC724中天然LeuB酶比MSC702中有功能但改变的LeuB酶(参见实施例19)具有更高的代谢效率的结果。
实施例21
本实施例描述了发酵罐中野油菜黄单胞菌中重组DNA介导的软骨素产生。
野油菜黄单胞菌(MSC480)的10-L发酵
使用10升的发酵罐在典型的发酵条件下,使用葡萄糖作为碳源培养野油菜黄单胞菌菌株MSC480的培养物。发酵罐分批投入下述培养基(表29A),使用去离子水至7.5升的体积:
表29A
含有上述培养基的发酵罐高压灭菌后,无菌条件下加入60g葡萄糖(加热灭菌)。
用典型的种子培养物接种发酵罐,然后培养70小时并在培养过程中补入碳补料(由871g/L葡萄糖溶液组成)。70小时后高压灭菌发酵罐并通过离心收获。发酵控制条件和产物产率分别如表29B和29C所示。
表29B
表29C
实施例22
本实施例示例改进的大肠杆菌培养基。
上面的实施例4、7和8描述了使用复杂TB培养基进行rCH-产生重组大肠杆菌K-12菌株的生长。如通常配制的,TB培养基包含5g/L甘油作为主要碳源。本实施例说明改进TB培养基以在摇瓶中提高rCH体积生产力和比生产力。
将在30°C在TB/Tc5培养基中形成菌株MSC564的小量培养物作为接种物。用0.1MMOPS缓冲液(4-吗啉丙磺酸;从1.0M贮液制备,用NaOH调pH值到7.2)、10vg/L甘油(2X普通TB配方)或两者改良标准TB培养基(Sambrook等,1989;Difco“TerrificBroth”)。含有50mL每种培养基的锥形摇瓶(250mL)中接种MSC564培养物至达到OD600=0.03。将培养瓶在30°C振荡(225rpm)直到OD600值达到约0.125,此时加入1mM间甲苯甲酸诱导rCH产生。持续振荡72小时后,进行pH和OD600测量,并将5mL等分试样高压灭菌5-7分钟,冷却并冷冻贮存。如实施例14所述确定rCH含量。最终的OD600和rCH浓度如表30所示。
表30
培养基 |
终pH |
终OD600 |
rCH(ug/mL) |
TB |
8.3 |
13.4 |
1017 |
TB/0.1M MOPS pH 7.2
|
8.1 |
8.53 |
1244 |
TB/2x甘油(10g/L) |
6.0 |
9.64 |
676 |
TB/MOPS/甘油 |
7.4 |
12.2 |
1592 |
用额外的甘油(2X正常)缓冲和改进的TB培养基导致>50%rCH滴度的(更大的体积生产力)增加而没有额外的细胞密度(更大的比生产力)。2X甘油而没有缓冲液的培养基中的生长和生产力导致降低的生产力可能是由于从甘油产生的多余的酸。这说明在重组菌株中提高了生产能力并提供了更高生产力的生长条件,在此条件下可以评估新的大肠杆菌菌株。
本发明的上述描述已经达到说明和描述的目的。此外,上述描述并不意在将本发明限制在本发明所公开的形式。
本文所述的各个方面、实施例和选项均可以与任何和所有的变化相结合。
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