CN105001651B - 一种利用多伯氨基化合物提高谷朊蛋白酶促交联改性制备蛋白膜的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用多伯氨基化合物提高谷朊蛋白酶促交联改性制备蛋白膜的方法，属于生物材料领域。旨在解决已有的单独利用酶促交联提高谷朊蛋白膜物理机械性能程度低的问题。本发明是在利用谷氨酰胺转氨酶促谷朊蛋白发生交联改性的同时，添加多伯胺化合物增强蛋白交联反应的反应能力和反应活性，通过多伯胺化合物的架桥作用显著提高了蛋白之间的酶促交联程度，进一步提高了蛋白膜的物理机械性能。(附图)本发明操作方便，反应条件温和，不存在化学试剂残留问题，可在一定程度上代替传统的化学交联改性制备蛋白膜材料，拓宽其应用领域。

Description

一种利用多伯氨基化合物提高谷朊蛋白酶促交联改性制备蛋 白膜的方法

技术领域

本发明涉及一种利用多伯氨基化合物提高谷朊蛋白酶促交联改性制备蛋白膜的方法，属于生物材料领域。

背景技术

谷朊粉是生产小麦淀粉时的副产品,来源广泛，其蛋白质含量约80％。谷朊蛋白吸水后可形成立体网络结构,具有优良的延伸性、黏弹性、吸水性等,是制备蛋白膜的理想原料，并且所得膜具有良好的生物相容性、生物可降解性和病原体传播低风险性，在医药，包装材料，食品领域具有广阔的应用前景。然而一般条件下制备得到的谷朊蛋白膜机械性能较差、在水中的溶失率较高而影响其应用效果。对蛋白进行交联改性是改善蛋白膜物理化学性能，扩大其应用领域的最常见的方法之一。传统的改性方法是利用化学交联剂，如甲醛、戊二醛等与蛋白发生交联反应，从而提高膜的机械性能及水溶稳定性。然而，化学试剂造成的毒副作用、环境污染、反应条件苛刻等很大程度限制了化学交联剂的使用。谷氨酰胺转胺酶(简称TGase)是一种可以催化蛋白质分子内或分子间、蛋白质与氨基酸之间形成ε一(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键的酶。谷朊蛋白富含谷氨酰胺残基的氨基酸组成特点为TGase酶促改性提供了条件。TGase可直接作用于面粉中的谷朊蛋白以改善面粉制品的品质，可催化水解谷朊蛋白交联提高其作为食品添加剂所需要的乳化、起泡等性能；可在一定程度上提高谷朊蛋白膜的抗张强度，降低其透水性及延伸性。

然而谷朊蛋白组成中虽然谷氨酰胺残基含量丰富，但是赖氨酸严重缺失，导致可以与谷氨酰胺发生反应的游离氨基数量少，基于TGase的酶促反应改善谷朊蛋白材料物理机械性能的程度非常有限。因此，提高谷朊蛋白TGase酶促交联改性的反应能力对实现再生蛋白材料的生物法功能化改性，具有深远的潜在应用价值和现实意义。多伯胺基化合物含有较多的游离氨基，可通过TGase的酶促反应与谷朊蛋白分子中的谷氨酰胺残基发生交联反应，以碳链将游离氨基引入蛋白分子，从而增加谷朊蛋白的反应活性，通过架桥作用很大程度提高谷朊蛋白分子之间的酶促反应，提高谷朊蛋白材料的物理机械性能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用多伯氨基化合物提高谷朊蛋白酶促交联改性制备蛋白膜的方法，以谷朊粉为原料，利用谷氨酰胺转氨酶催化谷朊蛋白与多伯胺化合物发生接枝反应，通过多伯胺化合物的架桥交联作用提高谷朊蛋白的反应活性，以获得具有较高物理机械性能的改性谷朊蛋白膜。

本发明的技术方案：

将谷朊蛋白分散于磷酸缓冲液中(pH＝7.0)，浓度为3-10％，加入0.5-1.5％(w/v)的无水亚硫酸钠溶解后，再加入一定量的多伯胺化合物，待谷朊蛋白均匀分散于缓冲液后，加入谷氨酰胺转氨酶(TGase)5-30u/g蛋白，于37℃恒温搅拌下反应2-5小时，冷冻干燥后，备用。对照样加失活酶，其他条件相同。改性后的谷朊蛋白溶于甲酸，加入一定量的甘油，40℃条件下搅拌3h，待充分溶解后，置于超声振荡器中超声5min，去除内部气泡。将溶液倒入光滑的聚四氟乙烯板上，室温晾干，然后将干燥的薄膜从板上小心剥离，制得改性谷朊蛋白膜。

对所得改性蛋白膜的物理机械性能进行测试，抗拉强度为4.82MPa，断裂伸长率为112％，与单纯TGase改性的膜材料相比，抗拉强度提高了12.61％；与未经TGase作用的蛋白膜相比抗拉强度提高了18.05％。表明多伯胺化合物可以提高谷氨酰胺转氨酶(TGase)催化谷朊蛋白发生交联反应的活性，更大程度得提高蛋白膜的机械性能。

本发明利用多伯胺化合物提高谷氨酰胺转氨酶催化谷朊蛋白交联反应活性制备蛋白膜的方法，改善单纯利用酶促反应导致的谷朊蛋白交联改性程度低的缺点，制备具有较高的物理机械性能的蛋白膜材料。该法条件温和、操作高效、环保且容易控制，具有很强的实用性，所得改性蛋白膜具有广泛应用于食品包装及医药领域的潜能。

本发明的有益效果

本发明述及的一种利用多伯氨基化合物提高谷朊蛋白酶促交联改性制备蛋白膜的方法，区别于既有单纯利用谷氨酰胺转氨酶催化谷朊蛋白交联制备蛋白膜的方法，而是采用了添加多伯胺化合物，通过酶促反应使蛋白分子中的反应基团数目增加并克服蛋白分子间的空间位阻效应，通过多伯胺化合物碳链的架桥作用提高蛋白之间的交联程度。与单独利用酶促改性的方法相比，膜的物理机械性能得到了进一步提高，扩大了谷朊蛋白膜的应用领域。

附图说明

图1TGase催化谷朊蛋白及多伯胺化合物α-聚赖氨酸交联反应的SDS-PAGE。1、2、3、4分别为谷朊蛋白+失活酶、谷朊蛋白+酶、谷朊蛋白+α-聚赖氨酸+失活酶、谷朊蛋白+α-聚赖氨酸+酶。

图2经TGase和α-聚赖氨酸处理后，谷朊蛋白中赖氨酸含量的变化。(纵坐标代表蛋白中赖氨酸含量，横坐标分别为：谷朊蛋白，谷朊蛋白+α-聚赖氨酸+失活酶，谷朊蛋白+α-聚赖氨酸+酶)

图3改性后蛋白膜的物理机械性能变化。(纵坐标代表膜的断裂强度，横坐标分别为谷朊蛋白膜，经TGase改性后的谷朊蛋白膜和经TGase和α-聚赖氨酸改性后的谷朊蛋白膜)

具体实施方式

利用SDS-PAGE凝胶电泳及氨基酸分析可以表征谷朊蛋白的酶促交联反应，证明TGase催化谷朊蛋白通过多伯胺化合物α-聚赖氨酸提高了蛋白之间的交联反应程度；以改性后蛋白膜的抗拉强度为指标，可以考察蛋白膜的机械性能变化。

实施例1 α-聚赖氨酸提高TGase催化谷朊蛋白发生交联反应的活性

称取谷朊蛋白溶解于磷酸缓冲液中(pH＝7.0)，浓度为3％，加入一定量的α-聚赖氨酸，待谷朊蛋白均匀分散于溶液后，加入一定量谷氨酰胺转氨酶(TGase)，约15u/g蛋白，(本发明使用的TGase广泛存在于植物、动物和微生物中，在本发明中任何来源的TGase都能实现相同的效果，不同来源的TGase对谷朊蛋白都有催化作用)，于37℃恒温搅拌下反应3小时。对照样加失活酶，其他条件相同。待反应结束后，冷冻干燥，备用。在冻干之前，做表征测试。取一定量反应后分散液，于4000r/min离心10min，取上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳测试，结果如图1所示，表明α-聚赖氨酸明显增加谷朊蛋白的酶促交联反应，生成了更多的蛋白质聚集体。将离心后的沉淀多次冲洗，洗去未反应的α-聚赖氨酸，干燥后，进行氨基酸分析，测定谷朊蛋白中赖氨酸含量的变化，结果如图2所示，表明谷朊蛋白在酶的作用下通过α-聚赖氨酸的架桥方式发生交联反应。

实施例2 改性后的谷朊蛋白膜

称取谷朊蛋白溶解于磷酸缓冲液中(pH＝7.0)，浓度为3％，加入一定量的α-聚赖氨酸，待谷朊蛋白均匀分散于溶液后，加入一定量谷氨酰胺转氨酶(TGase)，约15u/g蛋白，于37℃恒温搅拌下反应3小时。对照样加失活酶，其他条件相同。待反应结束后，冷冻干燥，备用。再将改性后的谷朊蛋白溶于甲酸中，加入一定量的甘油，40℃条件下处搅拌3h，待充分溶解后，置于超声振荡器中超声5min，去除内部气泡。将溶液倒入光滑的聚四氟乙烯板上，室温晾干，然后将干燥的薄膜从板上小心剥离，制得改性谷朊蛋白膜。对所得改性蛋白膜的物理机械性能进行测试，抗拉强度提高了20.61％；与未经TGase作用的蛋白膜相比抗拉强度提高了42.05％。

Claims (4)

1.一种利用多伯胺基化合物提高谷氨酰胺转氨酶(TGase)催化谷朊蛋白交联反应活性制备蛋白膜的方法，其特征在于，以谷朊蛋白为原料，利用多伯胺基化合物在TGase的作用下显著提高谷朊蛋白发生交联反应，再将其溶解于甲酸溶剂中溶解，即可获得具有较高物理机械性能的蛋白膜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)将谷朊蛋白分散于磷酸缓冲液中pH＝7.0，浓度为3-10％，加入0.5-1.5％w/v的无水亚硫酸钠溶解后，再加入多伯胺基化合物，待谷朊蛋白均匀分散于缓冲液后，加入谷氨酰胺转氨酶(TGase)5-30u/g蛋白，于37℃恒温搅拌下反应3小时，冷冻干燥后，备用；对照样加失活酶，其他条件相同；

(2)将改性后的谷朊蛋白溶于甲酸中，蛋白浓度为3-8％w/v，加入甘油浓度为0.5-3％w/v，40℃条件下处搅拌3h，待充分溶解后，置于超声振荡器中超声5min，去除内部气泡，将溶液倒入光滑的聚四氟乙烯板上，室温晾干，然后将干燥的薄膜从板上小心剥离，制得谷朊蛋白膜。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷朊蛋白为任何来源的谷朊蛋白，配置的谷朊蛋白酶促分散液浓度为3-10％w/v，多伯胺基化合物用量为制膜蛋白液浓度为3-8％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多伯氨基化合物为任何生物或化学合成来源的含有两个以上伯胺基化合物，用量为谷朊蛋白的2％。