CN1482144A

CN1482144A - 一种半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品

Info

Publication number: CN1482144A
Application number: CNA031389163A
Authority: CN
Inventors: 程显好; 高先领; 隋晓春; 侯永勤; 贺连智; 张友军; 刘刚
Original assignee: SHANDONG ZHILING BIOENGINEERING CO Ltd
Current assignee: SHANDONG ZHILING BIOENGINEERING CO Ltd
Priority date: 2003-07-25
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2004-03-17
Anticipated expiration: 2023-07-25
Also published as: CN1207310C

Abstract

一种半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品属于医药范畴。本发明是以“虫草原料”为原料，采用乙醇分级沉淀，离子交换柱层析和分子筛层析相结合的复合分离纯化技术，分离出层析纯和电泳纯半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品。本发明的产品对试验小鼠具有免疫调节作用，对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑瘤率达51％，故是治疗肿瘤病的较佳注射药物。本发明为虫草原料的应用开辟了另一条途径；为制取半乳甘露聚糖肽增加了一种原料；也为本发明产品的生产提供了优级方法。

Description

一种半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品

所属领域：本发明属于医药范畴，更确切说是一种半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品。

背景技术：经初步检索，未查到以冬虫夏草或发酵法制得的冬虫夏草菌丝体(以下统称“虫草原料”)为原料，采用乙醇分级沉淀、离子交换柱层析和分子筛层析相结合的复合分离纯化技术，分离得到层析纯和电泳纯半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品。

发明内容：本发明是一种以“虫草原料”为原料，采用乙醇分级沉淀、离子交换柱层析和分子筛层析相结合的复合纯化技术，分离得到层析纯和电泳纯半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品。本发明的产品是一种治疗肿瘤的注射用药物。现参照说明书附图将本发明内容叙述如下：

一、原料准备：

(1)、虫草原料：要求无杂质，水份含量≤8％，虫草多糖含量≥6.0％。

(2)、水：蒸馏水，无离子水。

(3)、乙醇：无水乙醇，95％乙醇。

(4)、丙酮：分析纯或分析纯以上。

二、虫草多糖I的制取：

将合格的“虫草原料”装入提取装置中，然后再按虫草原料∶水＝1∶10-20之比例(重量比)往提取设备中加入蒸馏水。料加完，安装好设备，将原料置于80°-100℃和有搅拌的条件下进行蒸馏提取1-2小时，停止提取。料温降至40℃以下时，将提取物料进行过滤，滤液保存。残渣可按上述方法再提取1次后再弃掉残渣。将两次提取液统一装入一个蒸馏设备中，在减压下，温度在60 o±5℃下进行浓缩。当提取液内的固形物≥10％时，在浓缩液中加入相当浓缩液3倍体积的95％乙醇，搅拌10分钟后静置沉淀4小时以上，再进行离心分离后收集沉淀物。在沉淀物中加入丙酮脱水，然后再进行离心分离，分离出的沉淀物在45℃-60℃的温度下进行干燥，干燥后的产品即是虫草多糖I。虫草多糖I的质量要求：糖含量≥32.5％，蛋白含量≥45.2％。

三、虫草多糖II的制取：

将合格的“虫草多糖I”放入容器中，加入无离子水并搅拌，至虫草多糖I的浓度达4-6％时，在常温(15℃-30℃)下向已配制好的含5％虫草多糖I的溶液中加入无水乙醇，同时搅拌，至乙醇在溶液中含量≥40％时止，稍静置后进行分离，去掉沉淀。在分离后的溶液中再加入无水乙醇，至乙醇在溶液中含量达63-67％时止，同时搅拌，当沉淀析出完全后进行分离，收集沉淀。在沉淀物中加入丙酮进行脱水干燥，得到的产品是虫草多糖II。虫草多糖II的质量要求：糖含量≥49.3％，蛋白含量≥23.9％。

四、半乳甘露聚糖肽的制取：

将符合质量要求的“虫草多糖II”置于容器中，在常温和搅拌下加入无离子水，将其配成0.8-1.2％浓度的水溶液。对上述0.8-1.2％虫草多糖II溶液进行DEAE-SaphedexG-50柱层析，然后进行洗脱，即：(1)、第一次洗脱用无离子水洗脱，至无紫外吸收峰出现止。(2)、第二次洗脱用0.1MNaCL溶液洗脱至没有紫外吸收峰出现止。洗脱完毕将洗脱物收集一起并放入浓缩装置中进行浓缩，至固形物含量≥10％时，再进行saphedexG-50柱层析，以280nm波长检测流出物。这时得到两个洗脱峰，收集前一个洗脱峰进行冷冻干燥，得到半乳甘露聚糖肽干粉。产品的质量标准：(1)、糖含量：45-48％，(2)、蛋白含量：48-46％，(3)、水分：7-6％，(4)、甘露糖∶半乳糖(摩尔比)＝1∶0.73。

五、半乳甘露聚糖肽的应用实验：该产品在动物试验中，对试验小鼠具有免疫调节作用，对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑瘤率为51％。由动物实验证明：本发明的产品是一种可用于治疗肿瘤病的注射用药物。

本发明的优点：

(1)、本发明是以“虫草原料”为原料制取半乳甘露聚糖肽，这为生产半乳甘露聚糖肽增加了另一种原料，也为“虫草原料”的应用开辟了另一条途径。

(2)、本发明以“虫草原料”为原料，经过采用乙醇分级沉淀、离子交换柱层析和分子筛层析相结合的复合分离纯化方法，分离得到一种层析纯和电泳纯的半乳甘露聚糖肽，此方法为半乳甘露聚糖肽的制取找到了另一种制取方法。

(3)、半乳甘露聚糖肽制品在对小鼠进行试验中证明：(A)、对试验小鼠具有免疫调节作用；(B)、对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑瘤率达51％。故制成半乳甘露聚糖肽注射剂后也为医药领域增加了一个新品种。

附图说明：说明书附图是本发明的工艺流程图。

具体实施方式：

例1：

(1)、把符合质量要求，发酵法制得的冬虫夏草菌丝体和其他原料：水、乙醇、丙酮、全部备齐待用。

(2)、制取虫草多糖I：

(A)、将冬虫夏草菌丝体1公斤置于提取装置内，再加入10公斤蒸馏水，然后将提取装置安装无误，再在85℃±2℃和搅拌下蒸馏提取1小时停机，常温下过滤，滤液保留。

(B)、在滤渣中再加入5公斤蒸馏水，在85°±2℃和搅拌下提取1小时，停止提取，过滤，滤后残渣弃去。本次滤液与上次滤液合并，在60℃±5℃温度下进行减压浓缩至固形物含量达6.0％时，停止浓缩，在浓缩后的滤液中，按滤液∶乙醇＝1∶3(体积比)，加入95％乙醇，搅10分钟，静置沉淀5小时，装入离心机以5000转/分进行离心沉淀10分钟，停机，收集沉淀物。

(C)、在沉淀物中加入分析纯丙酮进行脱水，再离心分离，收集沉淀物在52℃±2℃下进行干燥，当沉淀物干燥结束时达到：糖33.5％，蛋白45.3％。干燥后的这物质即为合格的虫草多糖I(共85克)。

(3)、制取虫草多糖II：

(A)、在已制取好的85克虫草多糖I中加入无离子水170ml并搅拌30分钟，使虫草多糖I溶于水中，然后向虫草多糖I溶液中加1133ml无水乙醇并搅拌10分钟至均匀，停搅，静置沉淀5小时，放入离心机内以5000转/分进行离心分离10分钟，停机，收取清液，沉淀弃。

(B)、在分离得到的清液中加入2024ml无水乙醇，搅均，再静置沉淀5小时后，放入离心机内以5000转/分进行离心分离，收集沉淀物，再在沉淀物中加入丙酮脱水，再干燥后，当提取物质量达到：糖含量49.3％，蛋白含量23.9％时，得到55g物质即为虫草多糖II。

(4)、半乳甘露聚糖肽的制取：

(A)、将制得的55克虫草多糖II加入到5445克无离子水中，常温下搅拌30分钟，制成1％水溶液。

(B)、利用由250克DEAE-SaphedexG-50装成的层析柱进行吸附层析，用无离子水洗脱，将非吸附物弃去。再用0.1MNaCL溶液将吸附物洗脱，用280nm紫外吸收检测器检测洗脱物，收集洗脱峰，所得液体在60°±2℃下进行减压浓缩至500ml，然后将浓缩液分5次进行由200克SaphedexG-50装成的层析柱进行层析，以280nm紫外吸收检测器检测洗脱物，得到两个洗脱峰，收集第一个洗脱峰的液体。将5次洗脱的第一个洗脱峰液体合并后，在60°±2℃减压浓缩至500ml进行冷冻干燥，得到半乳甘露聚糖肽冻干粉1.5克。该产品的质量是：(甲)、糖含量48％，(乙)、蛋白含量46％，(丙)、甘露糖∶半乳糖(摩尔比)＝1∶0.73，(丁)、水分6％。

(5)、半乳甘露聚糖肽的应用实验：

本产品在动物试验中表明：对试验小鼠具有免疫调节作用；对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑瘤率为51％。

例2：

(1)、把符合质量标准的冬虫夏草、水、乙醇和丙酮、全部原料备齐待用。

(2)、制取虫草多糖I：称取1公斤冬虫夏草放入提取设备中，再加入20公斤无离子水，在85℃±2℃和搅拌条件下蒸馏提取2小时，停机过滤，弃去滤渣。收集滤液于57°±3℃进行减压浓缩至固形物含量达10％，再加入相当浓缩液3倍体积的95％乙醇，搅拌5分钟，搅均后静置沉淀5小时，弃去上清液，将沉淀物装入离心机以5000转/分分离，收集的沉淀物为未干燥的虫草多糖I。

(3)、制取虫草多糖II：在未干燥的虫草多糖I中加入1700毫升无离子水，常温下搅拌溶解30分钟，之后再加入无水乙醇1133毫升，搅拌均匀，静置沉淀5小时，装入离心机离心沉淀，清液保存待用。在离心得的清液中再加入无水乙醇1133毫升，搅均后静置沉淀5小时，离心去沉淀，在滤液中再加入2024毫升无水乙醇，搅均，静置沉淀5小时，倾掉上清液，再以5000转/分进行离心分离，收集沉淀物为未干燥的虫草鞋多糖II。把分离得的未干燥的虫草多糖II加入到5000毫升无离子水中，搅拌30分钟，制成溶液备用。

(4)、半乳甘露聚糖肽的制取：利用由10公斤，D301大孔弱碱性苯乙烯阴离子交换树脂装成的离子交换柱进行吸附配制的虫草多糖II溶夜中的一些成分。用无离子水洗脱掉未吸咐的成分弃去。然后收集以0.1MNaCL溶液洗脱交换柱上的吸附物，用280nm紫外吸收检测器检测收集的洗脱物，洗脱物在NaCL溶液中已溶解，再在60°±2℃下进行减压液缩至500毫升停止。将浓缩液分成5份，分5次进行由200克SaphedexG-50装成的层析柱进行层析。以280nm紫外吸收检测器检测洗脱物，得到两个洗脱峰，收集第一个洗脱峰的液体，合并在一起后，在60°±2℃下进行减压浓缩至500毫升，停止浓缩。将浓缩液进行冷冻干燥，得到1.65克半乳甘露聚糖肽冻干粉。

该产品的质量为：糖45％，蛋白48％，甘露糖∶半乳糖(摩尔比)＝1∶0.73，水分7％。

(5)、半乳甘露聚糖肽的应用实验：本次制得的半乳甘露聚糖肽用于试验小鼠有免疫调节作用；对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑瘤率为51％。

Claims

1、一种半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品，包括；原料准备、有用成分提取、浓缩、离心分离、复合分离纯化及冷冻干燥、制得本发明产品，其特征在于本发明的制取方法是：

<一>、原料准备：

(1)、虫草原料：无杂质、水份≤8％、虫草多糖≥6.0％；

(2)、水：蒸馏水、无离子水；

(3)、乙醇：无水乙醇、95％乙醇；

(4)、丙酮：分析纯或纯度高于分析纯；

<二>虫草多糖I的制取：

将虫草原料装入提取装置中，再按虫草原料∶水＝1∶10-20之比例(重量比)，往提取设备中加入蒸馏水，装完料，安好设备，开始提取；在80℃-100℃和搅拌条件下，提取1-2小时，停止；待料温降至40℃以下，开始过滤；滤液保存，残渣可再按第一次提取条件再提取1次后，弃残渣，将提取液全部装入蒸馏设备中，在60°±5℃条件下进行浓缩，当提取液内固形物≥10％时，停止浓缩，在浓缩液中加入相当浓缩液3倍体积的95％乙醇，搅拌均匀，静置沉淀≥4小时，进行分离，收集沉淀物；在沉淀物中加入丙酮脱水，再分离，收集分离出的沉淀物在45℃-60℃条件下进行干燥，得到糖含量≥32.5％，蛋白蛋≥45.2％的虫草多糖I；

<三>虫草多糖II的制取：

将合格的虫草多糖I放入容器中，加入无离子水并搅拌，至虫草多糖I的浓度达4-6％时，在15℃-30℃条件下向已配制好的5％虫草多糖I的溶液中加入无水乙醇，同时搅拌至乙醇在溶液中含量≥40％时止，稍静置后进行分离，去掉沉淀，在滤液中加入无水乙醇，同时搅拌，至乙醇在滤液中含量在63-67％时停，静置到沉淀析出完全时，进行分离，收集沉淀；在沉淀物中加入丙酮进行脱水干燥，得到虫草多糖II产品，产品的质量要求：糖含量≥49.3％，蛋白含量≥23.9％；

<四>、半乳甘露聚糖肽的制取：

将制取合格的虫草多糖II置于容器中，在常温和搅拌下加入无离子水，将其配成0.8-1.2％浓度的水溶液，搅均；对上述0.8-1.2％浓度水溶液进行DEAE-Saphedex dex G-50柱层析，然后进行洗脱；第一次洗脱用无离子水洗脱，洗至没有紫外吸收峰出现止；第二次洗脱用0.1MNaCL溶液洗脱，洗至没有紫外吸收峰出现止；洗脱毕，将洗脱物收集一起并装入浓缩装置中进行浓缩，至固形物含量≥10％时，再进行Saphedex G-50柱层析，以254nm波长检测流出物，这时得到两个洗脱峰，收集前一个洗脱峰进行冷冻干燥，得到半乳甘露聚糖肽冻干粉，该种冻干粉是本发明最终产品。

2、按照权利要求1所述的一种半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品，其特征在于本发明的制取方法中的一、原料准备中的(1)虫草原料是指冬虫夏草和发酵法制得的冬虫夏草菌丝体。

3、一种半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品，其特征在于本发明的最终产品一半乳甘露聚糖肽的主要组成是：

<1>、糖含量(％)：45-48；

<2>、蛋白含量(％)：48-46；

<3>、水 (％)：7-6；

<4>、甘露糖∶半乳糖(摩尔比)＝1∶0.73。