CN105732797A - 一种尿促性腺激素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制药领域，具体涉及一种尿促性腺激素的纯化方法。取绝经期妇女尿液超滤浓缩后，将超滤液用聚乙二醇醚?硫酸铵双水相体系萃取两次后，得含尿促性腺激素的有机相，有机相在水浴中处理后分相，离心，得含尿促性腺激素的水相，将水相过超滤膜后上羟基磷灰石层析柱收集洗脱液，在洗脱液中加乙醇溶液调酒精度，静置，过滤得沉淀物，干燥得纯化后的尿促性腺激素。本发明提供了一种尿促性腺激素的纯化方法，得到的尿促性腺激素中卵泡刺激素和黄体生成激素生物效价高、活性回收率好，而且本方法操作简单、容易工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种尿促性腺激素的纯化方法。
背景技术
尿促性腺激素(HMG)含有卵泡刺激素(FSH)和黄体生成激素(LH)两种活性成分，是由垂体产生的糖蛋白激素，都是由α-链和β-链两个亚基组成。临床上尿促性腺激素主要用于治疗不育症，它可以从垂体或绝经期妇女的尿液中提取出来，也可通过DNA重组技术而制备。
由于不同病人的内源性尿黄体生成激素水平有所不同,所以临床上需要尿促卵泡激素与尿黄体生成激素比例不同的制剂对症下药。临床上应用的尿促性腺激素主要通过色谱分离技术来实现，一方面从绝经期妇女尿中提取的尿促性腺激素粗品含有大量的杂蛋白及其他有机物质，直接通过柱吸附纯化，会增加树脂使用量，因树脂价格昂贵，造成生产成本升高，且在吸附操中杂质易堵塞柱体，甚至可能发生柱体胀裂的危险；另一方面通过多步色谱柱纯化处理的同时会破坏大量的尿促性腺激素中的活性成分，改变尿促性腺激素中卵泡刺激素和黄体生成激素的比例。
目前尿促性腺激素提纯通常都是用乙醇-乙酸铵进行抽提，然后再进行后续色谱分离纯化。中国专利申请号为201210598002.6，发明名称为乙酸铵提纯尿促性激素的方法，该申请公开了采用5％-20％乙酸铵-70％乙醇提纯体系，10℃下搅拌提取2h过滤，滤渣用5％-20％乙酸铵-70％乙醇继续提取1次，两次上清液加入95％乙醇10℃下搅拌静置过夜，过滤、洗涤、干燥得产品。实际操作中，该抽提方法所得产品活性回收率在70％-80％之间，并且最大的缺陷在于总活性损失大，产品的免疫及生物效价低，不能够有效保护产品的生物学活性。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种尿促性腺激素的纯化方法，得到的尿促性腺激素中卵泡刺激素和黄体生成激素生物效价高、活性回收率好，而且本方法操作简单、容易工业化生产。
本发明为解决上述问题提出的技术方案：
一种尿促性腺激素的纯化方法，其特征在于采用以下步骤：
(1) 聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系配制：由质量分数为10-20%聚乙二醇醚，10-15%硫酸铵，余量为水组成双水相体系1；由质量分数为10-20%聚乙二醇醚，18-24%硫酸铵，余量为水组成双水相体系2；
(2)原料液过截留分子量为10000的超滤膜，得超滤浓缩液，维持浓缩液温度为15-20℃，加入等体积的双水相体系1搅拌均匀，1000-2000 r/min离心分离2-5min，得含尿促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相；
（3）将有机相在50-70℃水浴10-30min，溶液分成两相，1000-2000 r/min离心分离2-5min，得含尿促性腺激素的水相和聚乙二醇醚有机相；
（4）步骤(3)中含尿促性腺激素的水相中加入等体积双水相体系2搅拌均匀，维持溶液温度为15-20℃，1000-2000r/min离心分离2-5min，得含有尿促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相，将有机相重复步骤（3）操作得含尿促性腺激素的水相；
（5）步骤(4)中含尿促性腺激素的水相过截留分子量为10000的超滤膜，得超滤浓缩液；
（6）步骤（5）中得到的超滤浓缩液上羟基磷灰石层析柱,依次经过PH为6.5-7.0，含乙醇5-15%(v/v)的0.4-0.6moL/L醋酸钠溶液洗涤3个柱体积，和PH为6.5-7.0，含乙醇5-15% (v/v)的0.3-0.5moL/L的氯化钠溶液洗脱操作后，检测洗脱流出液在280nm的吸光度值，当280nm处的吸光度值大于0.1时，开始收集洗脱液, 280nm处的吸光度值小于0.1时，停止收集洗脱液；
（7）步骤（6）中得到洗脱液中加入乙醇溶液调酒精度为80-85%，静置12-14h，过滤得沉淀物，沉淀干燥后即为纯化后的尿促性腺激素。
步骤（1）中所述的聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系的制备方法为：在15-20℃，向水中加入硫酸铵，制得硫酸铵溶液，再向溶液中加入聚乙二醇醚，混合均匀，制得聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系溶液；优选地，聚乙二醇醚平均分子量为2000-3000。
优选地，步骤（1）中所述的双水相体系1中聚乙二醇醚质量百分比为14%，硫酸铵的质量百分比为13%；双水相体系2中聚乙二醇醚质量百分比为17%，硫酸铵的质量百分比为20%。
优选地，步骤（2）中所述的原料液步骤（2）中所述的原料液为绝经期妇女尿液，其中卵泡激素生物效价为30-50IU/L，黄体生成激素的生物效价为6-10IU/L。
优选地，步骤（6）中所述的过羟基磷灰石层析柱中过羟基磷灰石纯度大于90%，过羟基磷灰石粒度分布为：直径小于2μm的颗粒占20%，直径为2-20μm的颗粒占75%，直径大于20μm的颗粒占5%。
优选地，步骤（7）中所述的纯化后的尿促性腺激素固体中卵泡激素生物效价为600-1000IU/mg，黄体生成激素的生物效价120-200IU/mg。
聚乙二醇醚是具有较低临界溶解温度的聚合物，当聚合物的水溶液温度高于最低临界溶解温度时，聚合物的疏水性会增强，溶液会变浑浊，形成一个由聚合物富集相与水相组成的两项体系，在聚乙二醇醚-硫酸铵双水相萃取中利用这一特点通过简单的温度引导作用，将目标产物从聚合物富集相中分离出来并且达到聚合物回收再利用的目的。该类聚合物还具有两亲性，因此由该聚合物组成的双水相体系对于亲水性与疏水性的物质都可以进行分离，在一定的温度与浓度下，该聚合物水溶液能发生自组而形成胶束，这样的结构能够将疏水性物质包覆在核内，从而增强疏水性物质的溶解性。
由于羟基磷灰石对蛋白质的特殊分离机制，能同时分离带阴阳两种电荷的蛋白质，而且对蛋白质表面电荷的密度与分布都有很好的分辨力，所以对于蛋白质、酶、核酸和其他生物大分子的分离和纯化具有良好的选择性，当其他分离技术都无效时，使用该技术往往可以呈现出意想不到的分离性能。
有益效果
1.本发明采用聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系进行两次萃取，通过调节双水相体系中硫酸铵质量百分数，实现原料液中尿促性腺素和蛋白质、核酸等杂质的分离，通过调节温度，可以使尿促性腺激素从聚乙二醇醚中分离出来，得到尿促性腺激素的同时实现聚乙二醇醚回收再利用的目的。
2.本发明不需要进行强酸、强碱或高温的处理，最大限度保存了尿促性腺激素中的活性成分，而且本发明工艺条件容易控制、成本低、操作简单，纯化后的尿促性腺激素中卵泡刺激素和黄体生成激素生物效价高、活性回收率好，不破坏原料的生物活性。
具体实施方式
下面列举实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
（1）聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系配制：在15℃水中加入硫酸铵，制得硫酸铵溶液，再向硫酸铵溶液中加入分子量为2000的聚乙二醇醚，混合均匀，制得聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系溶液，其中双水相体系1中聚乙二醇醚质量百分比为10%，硫酸铵的质量百分比为10%；双水相体系2中聚乙二醇醚质量百分比为10%，硫酸铵的质量百分比为18%；
（2）原料液100000L过截留分子量为10000的超滤膜，得超滤浓缩液，维持超滤浓缩液温度为15℃，加入等体积的双水相体系1搅拌均匀，1000r/min离心分离5min，得含尿促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相；
（3）将有机相在50℃水浴30min，溶液分成两相，1000r/min离心分离5min，得含尿促性腺激素的水相和聚乙二醇醚有机相；
（4）步骤(3)水相中加入等体积双水相体系2搅拌均匀，调节溶液温度为15℃，2000r/min离心分离2min，得含有尿促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相，将有机相重复步骤（3）操作得含尿促性腺激素的水相；
（5）步骤(4)中含尿促性腺激素的水相过截留分子量为10000的超滤膜，得超滤浓缩液；
（6）步骤（5）中得到的超滤浓缩液上羟基磷灰石层析柱，依次经过PH为6.5，含乙醇5%(v/v)的0.4moL/L醋酸钠溶液洗涤3个柱体积，和乙醇5% (v/v)的0.3moL/L的氯化钠溶液洗脱操作后，检测洗脱流出液在280nm的吸光度值，当280nm处的吸光度值大于0.1时，开始收集洗脱液， 280nm处的吸光度值小于0.1时，停止收集洗脱液；
（7）在步骤（6）中得到的洗脱液中加入95%的乙醇溶液调酒精度为80%，静置12h，压滤机过滤得滤饼，滤饼压缩空气吹干后收集沉淀物，粉碎过30目筛，收集沉淀物于22℃、真空度-90KPa真空箱内烘干6h，得纯化后的尿促性腺激素。
实施例2
（1）聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系配制：在20℃水中加入硫酸铵，制得硫酸铵溶液，再向溶液中加入分子量为2000的聚乙二醇醚，混合均匀，制得聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系溶液，其中双水相体系1中聚乙二醇醚质量百分比为20%，硫酸铵的质量百分比为15%；双水相体系2中聚乙二醇醚质量百分比为20%，硫酸铵的质量百分比为24%；
（2）原料液100000L过截留分子量为10000的超滤膜，得超滤浓缩液，维持超滤浓缩液温度为20℃，加入等体积的双水相体系1搅拌均匀，2000r/min离心分离2min，得含尿促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相；
（3）将有机相在70℃水浴10min，溶液分成两相，2000r/min离心分离2min，得含尿促性腺激素的水相和聚乙二醇醚有机相；
（4）步骤(3)水相中加入等体积双水相体系2搅拌均匀，调节溶液温度为20℃，2000r/min离心分离2min，得含有尿促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相，将有机相重复步骤（3）操作得含尿促性腺激素的水相；
（5）步骤(4)中含尿促性腺激素的水相过截留分子量为10000的超滤膜, 得超滤浓缩液；
（6）步骤（5）中得到的超滤浓缩液上羟基磷灰石层析柱，依次经过PH为7.0，含乙醇15%(v/v)的0.6moL/L醋酸钠溶液洗涤3个柱体积，和PH为7.0，含乙醇15%
(v/v)0.5moL/L的氯化钠溶液洗脱操作后，检测洗脱流出液在280nm的吸光度值，当280nm处的吸光度值大于0.1时，开始收集洗脱液，280nm处的吸光度值小于0.1时，停止收集洗脱液；
（7）在步骤（6）中得到的洗脱液中加入95%的乙醇溶液调酒精度为85%，静置14h，压滤机过滤得滤饼，压缩空气吹干后收集沉淀物，粉碎过30目筛，收集沉淀物于22℃、真空度-100KPa 真空箱内烘干8h，得纯化后的尿促性腺激素。
实施例3
（1）聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系配制：在20℃水中加入硫酸铵，制得硫酸铵溶液，再向溶液中加入分子量为2000的聚乙二醇醚，混合均匀，制得聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系溶液，其中双水相体系1中聚乙二醇醚质量百分比为14%，硫酸铵的质量百分比为13%；双水相体系2中聚乙二醇醚质量百分比为17%，硫酸铵的质量百分比为20%；
（2）原料液100000L过截留分子量为10000的超滤膜，得超滤浓缩液，维持超滤浓缩液温度为20℃，加入等体积的双水相体系1搅拌均匀，2000r/min离心分离2min，得含尿促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相；
（3）将有机相在70℃水浴10min，溶液分成两相，2000r/min离心分离2min，得含尿促性腺激素的水相和聚乙二醇醚有机相；
（4）步骤(3)水相中加入等体积双水相体系2搅拌均匀，调节溶液温度为20℃，2000r/min离心分离2min，得含有尿促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相，将有机相重复步骤（3）操作得含尿促性腺激素的水相；
（5）步骤(4)中含尿促性腺激素的水相过截留分子量为10000的超滤膜, 得超滤浓缩液；
（6）步骤（5）中得到的超滤浓缩液上羟基磷灰石层析柱，依次经过PH为7.0，含乙醇10%(v/v)的0.5moL/L醋酸钠溶液洗涤3个柱体积，和PH为7.0，含乙醇10%(v/v)的0.3moL/L的氯化钠溶液洗脱操作后，检测洗脱流出液在280nm的吸光度值，当280nm处的吸光度值大于0.1时，开始收集洗脱液，280nm处的吸光度值小于0.1时，停止收集洗脱液；
（7）在步骤（6）中得到的洗脱液中加入95%的乙醇溶液调酒精度为85%，静置14h，压滤机过滤得滤饼，压缩空气吹干后收集沉淀物，粉碎过30目筛，收集沉淀物于22℃、真空度-90KPa 真空箱内烘干8h，得纯化后的尿促性腺激素。
实施例中各指标测定、评价如下进行：
卵泡激素生物效价测定: 采用2010年版药典二部附录Ⅻ M测定；
黄体生成激素生物效价测定：采用2010年版药典二部附录Ⅻ N测定；
卵泡激素活性回收率测定：（纯化后的尿促性腺激素中卵泡激素的单位质量生物效价*纯化后的尿促性腺激素质量）/(原料液中卵泡激素的单位体积生物效价*原料液体积) *100%；
黄体生成激素活性回收率: （纯化后的尿促性腺激素中黄体生成激素的单位质量生物效价*纯化后的尿促性腺激素质量）/(原料液中黄体生成激素的单位体积生物效价*原料液体积) *100%。
对上述实施例中的指标进行检测，数据如下：
Claims (7)
1.一种尿促性腺激素的纯化方法，其特征在于采用以下步骤：
(1) 聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系配制：由质量分数为10-20%聚乙二醇醚，10-15%硫酸铵，余量为水组成双水相体系1；由质量分数为10-20%聚乙二醇醚，18-24%硫酸铵，余量为水组成双水相体系2；
(2)原料液过截留分子量为10000的超滤膜，得超滤浓缩液, 维持浓缩液温度为15-20℃，加入等体积的双水相体系1搅拌均匀，1000-2000 r/min离心分离2-5min，得含尿促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相；
（3）将有机相在50-70℃水浴10-30min，溶液分成两相，1000-2000 r/min离心分离2-5min，得含尿促性腺激素的水相和聚乙二醇醚有机相；
（4）步骤(3)中含尿促性腺激素的水相中加入等体积双水相体系2搅拌均匀，维持温度为15-20℃，1000-2000r/min离心分离2-5min，得含有尿促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相，将有机相重复步骤（3）操作得含尿促性腺激素的水相；
（5）步骤(4)中含尿促性腺激素的水相过截留分子量为10000的超滤膜，得超滤浓缩液；
（6）步骤（5）中得到的超滤浓缩液上羟基磷灰石层析柱,依次经过PH为6.5-7.0，含乙醇5-15%(v/v)的0.4-0.6moL/L醋酸钠溶液洗涤3个柱体积和PH为6.5-7.0，含乙醇5-15% (v/v)的0.3-0.5moL/L的氯化钠溶液洗脱操作后，检测洗脱液在280nm的光密度值，当280nm处的吸光度值大于0.1时，开始收集洗脱液，280nm处的吸光度值小于0.1时停止收集；
（7）步骤（6）中得到洗脱液中加入乙醇溶液调酒精度为80-85%，静置12-14h，过滤得沉淀物，沉淀物干燥后即为纯化后的尿促性腺激素。
2.根据权利要求1所述的一种尿促性腺激素的纯化方法，其特征在于步骤（1）中所述的聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系的制备方法为：在15-20℃，向水中加入硫酸铵，制得硫酸铵溶液，再向溶液中加入聚乙二醇醚，混合均匀，制得聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系溶液。
3.根据权利要求1所述的一种尿促性腺激素的纯化方法，其特征在于步骤（1）中所述的双水相体系1中聚乙二醇醚质量百分比为14%，硫酸铵的质量百分比为13%；双水相体系2中聚乙二醇醚质量百分比为17%，硫酸铵的质量百分比为20%。
4.根据权利要求1所述的一种尿促性腺激素的纯化方法，其特征在于步骤（2）中所述的原料液为绝经期妇女尿液，其中卵泡激素生物效价为30-50IU/L，黄体生成激素的生物效价为6-10IU/L。
5.根据权利要求1所述的一种尿促性腺激素的纯化方法，其特征在于步骤（6）中所述的过羟基磷灰石层析柱中所用的过羟基磷灰石纯度大于90%，过羟基磷灰石粒度分布为：直径小于2μm的颗粒占20%，直径为2-20μm的颗粒占75%，直径大于20μm的颗粒占5%。
6.根据权利要求1所述的一种尿促性腺激素的纯化方法，其特征在于步骤（7）中所述的纯化后的尿促性腺激素中卵泡激素生物效价为600-1000IU/mg，黄体生成激素的生物效价120-200IU/mg。
7.根据权利要求2所述的一种尿促性腺激素的纯化方法，其特征在于中聚乙二醇醚平均分子量为2000。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN106866812A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-06-20 | 日照岚山生化制品有限公司 | 一种从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法 |
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1634628A (zh) * | 2004-12-03 | 2005-07-06 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种聚乙二醇辛基苯基醚/硫酸铵/双水相萃取分离体系 |
| CN1749267A (zh) * | 2004-09-15 | 2006-03-22 | 王玉亭 | 一种蛋白质分离纯化方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1749267A (zh) * | 2004-09-15 | 2006-03-22 | 王玉亭 | 一种蛋白质分离纯化方法 |
| CN1634628A (zh) * | 2004-12-03 | 2005-07-06 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种聚乙二醇辛基苯基醚/硫酸铵/双水相萃取分离体系 |
| CN104961821A (zh) * | 2014-07-28 | 2015-10-07 | 厦门欧瑞捷生物科技有限公司 | 一种从人尿中提取促性腺激素的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 孙淑斌等: "人尿促性腺激素中卵泡雌激素的分离与纯化", 《曲阜师范大学学报(自然科学版)》 * |
| 顾华庆: "人尿促性腺激素提取及部分纯化", 《生化药物杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106866812A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-06-20 | 日照岚山生化制品有限公司 | 一种从妇女尿液中提取多种尿蛋白的方法 |
| CN114805542A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-29 | 江苏尤里卡生物科技有限公司 | 一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法 |
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