CN107298711A - 一种柱层析方法分离牛初乳中过敏因子β‑乳球蛋白 - Google Patents

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何卫华
梅亚红
孙宾莲
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Abstract

本发明公开了一种柱层析方法分离牛初乳中过敏因子β‑乳球蛋白,包括如下步骤：S1、新鲜牛初乳去除酪蛋白，新鲜牛初乳经过1500‑2000转/分离心10‑30分钟，除去杂质、脂肪，分装保存备用；取除去杂质和脂肪的牛初乳原料，用1Mol/L的HCL调节pH值范围4.0‑5.0，离心力为1000g‑5000g，得到除去酪蛋白的乳清液；本发明柱层析方法分离牛初乳中过敏因子β‑乳球蛋白，价格低廉的工业化常用的强酸性阳离子交换树脂D72，适于大规模化生产应用；酸性乳清液直接上样，不需加碱调节pH至中性，避免盐浓度提高；用磷酸缓冲液（PB缓冲液）处理树脂，提高了对过敏因子β‑乳球蛋白的吸附专一性；提高了初乳中免疫球蛋白的纯度，提高了牛初乳的品质。

Description

一种柱层析方法分离牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白
技术领域
本发明涉及牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白分离技术领域，具体为一种柱层析方法分离牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白。
背景技术
牛初乳含有许多生理功能成分。医学及营养学研究表明，牛初乳中广谱抗体与其它免疫因子协同作用，可预防疾病、增强机休的抗病能力。初乳中的免疫因子主要包括免疫球蛋白(Ig)、乳铁蛋白(Lf)、乳过氧化物酶(Lp)、溶菌酶(Lm)等。初乳中免疫球蛋白和补体C3含量极显著高于常乳，补体c4的含量也显著高于常乳。人饮用免疫乳汁或免疫初乳，可以获得被动免疫保护，预防一种或多种不同的病原微生物所引起的疾病。牛初乳中含有的免疫球蛋白主要为IgG、IgA和IgM。其中IgG含量最高，约为免疫球蛋白总量的80%。免疫球蛋白是一种重要的免疫因子，能抵抗入侵的细菌、病毒等致病原，并刺激特殊的反应以帮助机体抵抗疾病。免疫球蛋白在增强机体的免疫能力、防止细菌和病毒入侵、活化补体、中和毒素、杀死肿瘤细胞等方面发挥重要作用。
人们对牛初乳的功能特性、分离、浓缩、活性保护技术进行了大量的研究，免疫球蛋白是牛初乳中最重要的生物活性蛋白之一，牛初乳所含免疫球蛋白成分为新生儿和成年人获得被动免疫力的重要来源之一。初乳中IgG有许多重要的生理功能，如调理胃肠道、预防过敏、提高免疫力、抗炎症、抗衰老、治疗腹泻等，研究表明这些生理功能符合消费者的需求，有着广阔的应用前景；牛初乳的不同加工过程对其中的免疫球蛋白也有一定的影响。近年来食品工程技术应用于牛初乳IgG等生物活性蛋白质的分离提取；而如何提高提取收率，有效地保持提取工艺过程中IgG的活性，降低牛初乳IgG制剂在消化吸收过程中的降解损耗，能被人体吸收利用，成为研究的热点。
根据蛋白质的分子大小、电荷多少、溶解度以及免疫学特征等,提取免疫球蛋白常用的方法有盐析法如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸钱盐析法、有机溶剂沉淀法如冷乙醇分离法、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法等。而对免疫球蛋白的纯化则选用离子交换法、凝胶过滤法和亲和层析法等,这些方法均不适合大规模的提取免疫球蛋白。并且在工业化提取牛初乳中的免疫球蛋白需要解决的问题是简化分离步骤提高免疫球蛋白纯度,建立新工艺保持免疫球蛋白活性,提高产率降低分离成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种柱层析方法分离牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白，解决了现有技术中牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白提取效率低的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种柱层析方法分离牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白,包括如下步骤：
S1、新鲜牛初乳去除酪蛋白
新鲜牛初乳经过1500-2000转/分离心10-30分钟，除去杂质、脂肪，分装保存备用；
取除去杂质和脂肪的牛初乳原料，用1mol/ L的HCL调节pH值范围4.0-5.0，离心力为1000g-5000g，得到除去酪蛋白的乳清液；
结果：调节除去杂质、脂肪的牛初乳pH值在4.2-4.6之间，1200g低速离心可以去除酪蛋白；
S2、 离子交换法除去β-乳球蛋白
强酸性阳离子交换D72树脂的清洗处理：首先用自来水浸泡D72树脂，布氏漏斗抽滤；再用自来水复悬，抽滤；直至将D72树脂清洗干净；复悬装柱，2-5倍柱床体积的0.5-3.0Mol/LHCL、5-10倍柱床体积蒸馏水、2-5倍柱床体积的0.1-0.5Mol/LNaOH、5-10倍柱床体积的蒸馏水处理离子交换树脂和层析柱；
强酸性阳离子交换树脂D72的平衡缓冲液：经过比较，采用磷酸缓冲液（PB）作为平衡缓冲液平衡D72树脂层析柱，可以提高对β-乳球蛋白的吸附作用，从而达到除去牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白，提高免疫球蛋白纯度的目的；
强酸性阳离子交换D72树脂对乳清液中免疫球蛋白IgG和β-乳球蛋白的分离效果：用上述平衡液平衡D72树脂层析柱，直接上样pH4.2-4.6的乳清液，分段收集流穿液；分析收集组份，主要成分为免疫球蛋白IgG,未检测到β-乳球蛋白，说明其被吸附在D72树脂上；
用磷酸盐缓冲液（PBSpH7.0-7.6/0.01-0.05Mol/LPB+0.2-1.2Mol/LNaCL）洗脱D72树脂吸附的蛋白质，收集洗脱液，分析收集的洗脱液主要成分为β-乳球蛋白；
结论：D72树脂经PB平衡，直接上样经等电点沉淀离心所得的牛初乳酸性乳清液，可专一性地吸附其中的过敏成分β-乳球蛋白，同时收获流穿液中纯度提高的免疫球蛋白IgG,提高了牛初乳的品质。
作为本发明的一种优选技术方案，所述平衡缓冲液为pH7.2-pH7.6、0.01-0.05Mol/LPB。
有益效果
与现有技术相比，本发明柱层析方法分离牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白，其有益效果为：1.价格低廉的工业化常用的强酸性阳离子交换树脂D72。，适于大规模化生产应用。
2.酸性乳清液直接上样，不需加碱调节pH至中性，避免盐浓度提高。
3.用磷酸缓冲液（PB缓冲液）处理树脂，提高了对过敏因子β-乳球蛋白的吸附专一性。
4.提高了初乳中免疫球蛋白的纯度，提高了牛初乳的品质。
具体实施方式
本发明提供的一种实施例：一种柱层析方法分离牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白,包括如下步骤：
S1、新鲜牛初乳去除酪蛋白
新鲜牛初乳经过1500-2000转/分离心10-30分钟，除去杂质、脂肪，分装保存备用；
取除去杂质和脂肪的牛初乳原料，用1mol/L的HCL调节pH值范围4.0-5.0，离心力为1000g-5000g，得到除去酪蛋白的乳清液。
结果：调节除去杂质、脂肪的牛初乳pH值在4.2-4.6之间，1200g低速离心可以去除酪蛋白。
S2、 离子交换法除去β-乳球蛋白
强酸性阳离子交换D72树脂的清洗处理：首先用自来水浸泡D72树脂，布氏漏斗抽滤；再用自来水复悬，抽滤；直至将D72树脂清洗干净；复悬装柱，2-5倍柱床体积的0.5-3.0Mol/LHCL、5-10倍柱床体积蒸馏水、2-5倍柱床体积的0.1-0.5Mol/LNaOH、5-10倍柱床体积的蒸馏水处理离子交换树脂和层析柱；
强酸性阳离子交换树脂D72的平衡缓冲液：经过比较，采用磷酸缓冲液（PB）作为平衡缓冲液平衡D72树脂层析柱，可以提高对β-乳球蛋白的吸附作用，从而达到除去牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白，提高免疫球蛋白纯度的目的；
强酸性阳离子交换D72树脂对乳清液中免疫球蛋白IgG和β-乳球蛋白的分离效果：用上述平衡液平衡D72树脂层析柱，直接上样pH4.2-4.6的乳清液，分段收集流穿液；分析收集组份，主要成分为免疫球蛋白IgG,未检测到β-乳球蛋白，说明其被吸附在D72树脂上；
用磷酸盐缓冲液（PBSpH7.0-7.6/0.01-0.05Mol/LPB+0.2-1.2Mol/LNaCL）洗脱D72树脂吸附的蛋白质，收集洗脱液，分析收集的洗脱液主要成分为β-乳球蛋白；
结论：D72树脂经PB平衡，直接上样经等电点沉淀离心所得的牛初乳酸性乳清液，可专一性地吸附其中的过敏成分β-乳球蛋白，同时收获流穿液中纯度提高的免疫球蛋白IgG,提高了牛初乳的品质；所述平衡缓冲液为pH7.2-pH7.6、0.01-0.05Mol/LPB。
本发明针对以上问题对牛初乳中免疫球蛋白的大规模提取方法进行了研究,以等电点沉淀法去除牛初乳中酪蛋白,得到富含免疫球蛋白的乳清液；根据蛋白质在同一条件下电荷差异,利用离子交换法去除乳清中的过敏因子β-乳球蛋白 ,纯化获得高纯度免疫球蛋白。该离子交换树脂为价格低廉的工业化常用的强酸性阳离子交换树脂D72。
本发明优势：1.价格低廉的工业化常用的强酸性阳离子交换树脂D72；适于大规模化生产应用；2.酸性乳清液直接上样，不需加碱调节pH至中性，避免盐浓度提高；3.用磷酸缓冲液（PB缓冲液）处理树脂，提高了对过敏因子β-乳球蛋白的吸附专一性；4.提高了初乳中免疫球蛋白的纯度，提高了牛初乳的品质。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下。由语句“包括一个......限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素”。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种柱层析方法分离牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白,其特征在于：包括如下步骤：
S1、新鲜牛初乳去除酪蛋白
新鲜牛初乳经过1500-2000转/分离心10-30分钟，除去杂质、脂肪，分装保存备用；
取除去杂质和脂肪的牛初乳原料，用1Mol/ L的HCL调节pH值范围4.0-5.0，离心力为1000g-5000g，得到除去酪蛋白的乳清液；
结果：调节除去杂质、脂肪的牛初乳pH值在4.2-4.6之间， 1200g低速离心可以去除酪蛋白；
S2、 离子交换法除去β-乳球蛋白
强酸性阳离子交换D72树脂的清洗处理：首先用自来水浸泡D72树脂，布氏漏斗抽滤；再用自来水复悬，抽滤；直至将D72树脂清洗干净；复悬装柱，2-5倍柱床体积的0.5-3.0Mol/LHCL、5-10倍柱床体积蒸馏水、2-5倍柱床体积的0.1-0.5Mol/LNaOH、5-10倍柱床体积的蒸馏水处理离子交换树脂和层析柱；
强酸性阳离子交换树脂D72的平衡缓冲液：经过比较，采用磷酸缓冲液（PB）作为平衡缓冲液平衡D72树脂层析柱，可以提高对β-乳球蛋白的吸附作用，从而达到除去牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白，提高免疫球蛋白纯度的目的；
强酸性阳离子交换D72树脂对乳清液中免疫球蛋白IgG和β-乳球蛋白的分离效果：用上述平衡液平衡D72树脂层析柱，直接上样pH4.2-4.6的乳清液，分段收集流穿液；分析收集组份，主要成分为免疫球蛋白IgG,未检测到β-乳球蛋白，说明其被吸附在D72树脂上；
用磷酸盐缓冲液（PBSpH7.0-7.6/0.01-0.05MOL/LPB+0.2-1.2Mol/LNaCL）洗脱D72树脂吸附的蛋白质，收集洗脱液，分析收集的洗脱液主要成分为β-乳球蛋白；
结论：D72树脂经PB平衡，直接上样经等电点沉淀离心所得的牛初乳酸性乳清液，可专一性地吸附其中的过敏成分β-乳球蛋白，同时收获流穿液中纯度提高的免疫球蛋白IgG,提高了牛初乳的品质。
2.根据权利要求1所述的一种柱层析方法分离牛初乳中过敏因子β-乳球蛋白，其特征在于：所述平衡缓冲液为pH7.2-pH7.6、0.01-0.05Mol/LPB。
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