CN104530207B

CN104530207B - 一种从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法

Info

Publication number: CN104530207B
Application number: CN201410786151.4A
Authority: CN
Inventors: 华欲飞; 李兴飞; 孔祥珍; 张彩猛; 陈业明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2034-12-18
Also published as: CN104530207A

Abstract

本发明涉及一种从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，属于农产品加工及副产品综合利用领域。本发明方法包括以下步骤：（1）大豆乳清的预处理；（2）大豆乳清蛋白的初级分离；（3）大豆乳清蛋白与聚阴离子多糖复凝聚；（4）回收大豆凝集素。原料经预处理、初级分离后复凝聚得到终蛋白多糖复合物；所得终蛋白多糖复合物经超滤除糖，二次离心后即得含有纯化大豆凝集素的蛋白溶液，该蛋白溶液经过真空冷冻干燥得到大豆凝集素高纯度样品。本发明对大豆乳清综合利用，设备要求低，操作简单，无环境污染。且大豆凝集素回收率高，纯度高，蛋白活性高，仍然保持天然的生理活性。

Description

一种从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法

技术领域

本发明涉及一种从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，具体是指一种利用聚阴离子多糖回收大豆乳清中的大豆凝集素的新方法，属于农产品加工及副产品综合利用领域。

背景技术

大豆乳清蛋白是残存于大豆乳清中不能为酸所沉淀的蛋白质，在大豆乳清蛋白中2S组分所占的比重较大；乳清蛋白质中除含有球蛋白、白蛋白之外，还主要含有：①Kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI，pH3.0~10.0，20kDa)；②Bowman-Brik胰蛋白酶抑制剂(BBI，pH3.0~10.0，20KDa)；③β-淀粉酶(61.7KDa)；④凝集素（pH 2.2~10.8，120KDa）；⑤脂氧合酶（LOX，102KDa）等多种生理活性物质，约占大豆蛋白的9%-15.3%。

大豆凝集素做为大豆中的主要抗营养因子之一，在成熟种子中的含量高达蛋白质总量的 10%左右，1909年由Wienhaus首次发现，1952年由Liener和Pallansh等分离得到，1958年制备得到纯品。经过长期的研究人们发现大豆凝集素是大豆中能够特异性结合半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺的四聚体糖蛋白。虽然它的生物学活性可通过适当方法去除，但仍会有一定量的残留。大豆凝集素可以抵抗体外和胃肠道内蛋白酶的降解，因此，被动物采食后可结合到胃肠道上皮细胞表面，影响胃肠道黏膜的分泌、吸收、增生等，这是大豆凝集素引发抗营养作用的前提和必要条件。然而，现有研究表明大豆凝集素在适宜的浓度下可以表现出多种功能特性。例如，凝集素对于大鼠肠是很有效的外源生长因子，可诱导完全可逆的多胺依赖性小肠增生；低剂量的凝集素可减少身体的脂肪含量，可用于治疗肥胖和非医疗性的减肥；此外，凝集素还能够促进 F-actin 向 G-actin 的转变，影响细胞形态。

由于大豆凝集素具有上述的特性，大豆凝集素的应用范围十分广泛，动物营养学用纯品凝集素研究其对动物的抗营养作用；大豆凝集素作为识别含有半乳糖，半乳糖胺，N-乙酰氨基-D-半乳糖糖链的探针，用于细胞表面的糖基化模式的研究；以及对于标记癌症的分化程度有重要作用等多个领域。目前市场对纯化的大豆凝集素需求日益增加，大多依赖进口，价格也比较昂贵。大豆凝集素传统的纯化方法包括离子交换和磷酸钙层析。Liener和 Pallansch(1952) 采用等电点沉淀、硫酸铵分级沉淀法分离得到了纯化的大豆凝集素。Wade 等 (1958)、张洪渊等 (1991) 采用离子交换纤维素、羟基磷灰石 (HA) 柱层析等方法成功进行了大豆凝集素的分离纯化。亲和层析也被应用于大豆凝集素的纯化过程，并且纯化工艺在不断更新。由于传统的大豆凝集素纯化方法的纯化效率较低，因而人们利用大豆凝集素能与N-乙酰基-D-半乳糖胺、半乳糖等配基或配体发生特异性结合的能力制备了大豆凝集素亲和纯化体系。根据所采用亲和介质的不同，主要分为半乳糖胺-CH-Sepharose4B、N-乙酰基-D-半乳糖胺-Sepharose 6B和瓜尔胶亲和层析体系。例如CN102212112A公开了利用亲和层析填料 D-GalN-FF-sepharose 4B纯化得到大豆凝集素的方法。以上体系均存在一定的限制，瓜尔胶纯化效率和纯度较低，N-乙酰基-D-半乳糖胺-Sepharose 6B 由于配基 N-乙酰基-D-半乳糖胺成本较高限制了其大规模使用，半乳糖胺-CH-Sepharose4B 流速有一定限制，以上的分离纯化流程都具有比较繁琐复杂的程序，条件控制相对严格。本发明采用了天然可食性的聚阴离子多糖作为回收材料，充分利用蛋白与多糖的复凝聚原理，操作简单，其形成的复凝聚物既可以作为食品材料直接利用，也可以完整实现蛋白与多糖的分离。从资源回收利用的角度来看，本发明不仅可以有效降低大豆乳清的抗营养组分，还可以制备具有高纯度的大豆凝集素组分。

发明内容

本发明的目的是提供一种从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，该发明制备的大豆凝集素纯度约90%-93%，仍然保持天然的生理活性。

本发明的技术方案，一种从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，步骤如下：

（1）大豆乳清的预处理：将大豆乳清调至pH 4.5-4.8，9500rpm离心30min，除沉淀；再次调至pH 8.0-10.0，9500rpm离心30min，收集上清液，即得大豆乳清液；

用pH调节剂调节pH；

（2）大豆乳清蛋白的初级分离：取步骤（1）所得大豆乳清液，调节pH至4.5，在4-30℃下加入硫酸铵至终饱和度为50%，9500rpm离心30min，收集沉淀，继续向上清中添加硫酸铵至饱和度60%-80%，9500rpm离心30min，收集沉淀；合并两次沉淀，加入去离子水溶解，使沉淀的质量浓度为1%-10%，截留分子量3500透析脱盐36-72h，截留液用真空冷冻干燥仪进行干燥，获得含有大豆凝集素和β-淀粉酶的P-7S蛋白；

（3）大豆乳清蛋白与聚阴离子多糖复凝聚：将步骤（2）制备的P-7S蛋白，用去离子水配制终浓度为0.1%-0.4%的P-7S大豆乳清蛋白液，调节pH至7.0，待用；配制0.1%-0.4%的聚阴离子多糖溶液，调节pH至7.0；向P-7S大豆乳清蛋白液中缓慢加入按P-7S大豆乳清蛋白液体积计2.5%-8%的聚阴离子多糖溶液，调节pH至5.0-4.5，4000rpm离心20min，收集沉淀；对上清液再次重复沉淀1次，合并沉淀物，即得大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物；

（4）回收大豆凝集素：将步骤（3）所得大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物悬浮于2-3倍体积的去离子水中，调节pH至7.0-9.0，过超滤膜除糖，收集滤过液；截留分子量3000-4000超滤脱盐，截留液用真空冷冻干燥仪进行干燥，即得纯化的大豆凝集素。

步骤（1）大豆乳清的来源包括：收集常规的大豆分离蛋白生产形成的副产物，以及实验室利用脱脂豆粕经醇洗后，提取分离蛋白后的乳清液，进行预处理。大豆乳清的预处理步骤为：首先将大豆蛋白乳清液调整pH至4.5-4.8，静止1-2d，离心，除杂蛋白完全，再调节至pH8.0-10.0，9500rpm离心30min，收集上清液，即得大豆乳清液。

步骤（2）大豆乳清蛋白的初级分离，其条件为：在进行盐析处理前，优先将大豆乳清液重新调整pH至酸性4.5-4.8范围内；温度范围以低温最为适宜，包括但不限于4-30℃；，其硫酸铵饱和度需达到50%，除去杂蛋白，然后再上调其硫酸铵饱和度为60%-80%，其相应硫酸饱和度需按照硫酸铵饱和度表，根据实际温度，控制操作；沉淀溶解需加入约2-4倍体积的蒸馏水，溶解完全；脱盐处理包括但不限于透析，超滤，纳滤，需保证脱盐完全。

步骤（4）回收大豆凝集素，其条件为：超滤膜除糖截留分子量范围为100-300kD，收集滤过液。脱盐处理包括但不限于透析，超滤，纳滤，需保证脱盐完全。纯化的大豆凝集素经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及高效液相色谱SEC-HPLC检测样品纯度，经过双缩脲法测定蛋白含量，经过苯酚硫酸法（GB/T 15672-2009）测定含糖量，经过干燥法（GB/T 5497-1985）测定水分，经过灼烧重量法测定灰分。

本发明的有益效果：本发明对大豆乳清综合利用，设备要求低，操作简单，无环境污染。本发明大豆凝集素回收率高，纯度高，蛋白活性高；制备的大豆凝集素纯度约90%-93%，仍然保持天然的生理活性。

附图说明

图1 大豆凝集素的回收工艺流程图。

图2 实例2所制得大豆凝集素的纯度的SEC-HPLC检测图谱。

图3 实例2所制得大豆凝集素的纯度SDS-PAGE检测图谱。

具体实施方式

实施例1

将大豆乳清调至pH 4.5，9500rpm 离心30min，除沉淀；再次调至pH 8.0，9500rpm离心30min，弃沉淀，收集上清液。将上述上清液调节pH至4.5，量取1L溶液，在4-30℃下按照硫酸铵饱和度表加入固体硫酸铵至50%饱和度，9500rpm 离心30min，收集沉淀，上清液继续添加硫酸铵至60%饱和度，再次9500rpm 离心30min，收集沉淀，合并两次沉淀，得到含有的大豆凝集素蛋白粗品约0.65g，加入10mL去离子水溶解，截留分子量3500透析脱盐36小时，截留液真空冷冻干燥，制得含有大豆凝集素和β-淀粉酶的P-7S蛋白样品。

分别精确称取0.1g上述初级分离的P-7S蛋白样品及0.1g聚阴离子多糖粉末，分别溶解于100mL去离子水中，配制成质量浓度为0.1% 均一蛋白及多糖贮液，分别调节pH至7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中缓慢加入v/v 6.67%聚阴离子多糖溶液，磁力搅拌，调节pH至4.5，4000rpm离心20min，收集沉淀；对上清液再次重复沉淀1次，合并沉淀物，即得大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物。

将得到的大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物悬浮于2-3倍体积的去离子水中，调节pH至7.5，过截留分子量为100kD的超滤膜除糖，收集滤过液；截留分子量3000超滤脱盐，即得纯化的大豆凝集素。称取纯化的大豆凝集素 1.0mg，溶解于1.0mL超纯水中，配制成浓度为1.0mg/mL的溶液，过0.45μm微孔滤膜，SEC-HPLC检测蛋白纯度，并做SDS-PAGE电泳分析。

经测定，以上实例所得大豆凝集素，约含有蛋白94.9 %，总糖1.3%，灰分1.8%及水分2.0%。

实施例2

将大豆乳清调至pH 4.7，9500rpm 离心30min，除沉淀；再次调至pH 8.5，9500rpm离心30min，弃沉淀，收集上清液。将上述上清液调节pH至4.5，量取2L溶液，在4-30℃下按照硫酸铵饱和度表加入固体硫酸铵至50%饱和度，9500rpm 离心30min，收集沉淀，上清液继续添加硫酸铵至70%饱和度，再次9500rpm 离心30min，收集沉淀，合并两次沉淀，得到含有的大豆凝集素蛋白粗品约1.85g，加入30mL去离子水溶解，截留分子量3500透析脱盐48小时，截留液真空冷冻干燥，制得含有大豆凝集素和β-淀粉酶的P-7S蛋白样品。

分别精确称取0.3g上述初级分离的P-7S蛋白样品及0.3g聚阴离子多糖粉末，分别溶解于100mL 去离子水中，配制成质量浓度为0.3% 均一蛋白及多糖贮液，分别调节pH至7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中缓慢加入v/v 5.0%聚阴离子多糖溶液，磁力搅拌，调节pH至4.7，4000rpm离心20min，收集沉淀；对上清液再次重复沉淀1次，合并沉淀物，即得大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物。

将得到的大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物悬浮于2-3倍体积的去离子水中，调节pH至8.5，过截留分子量为200kD的超滤膜除糖，收集滤过液；截留分子量3500超滤脱盐，即得纯化的大豆凝集素。称取纯化的大豆凝集素 2.0mg，溶解于1.0mL超纯水中，配制成浓度为2.0mg/mL的溶液，过0.45μm微孔滤膜，SEC-HPLC检测蛋白纯度，并做SDS-PAGE电泳分析。

经测定，以上实例所得大豆凝集素，约含有蛋白95.5 %，总糖1.1%，灰分1.8%及水分1.6 %。

实施例3

将大豆乳清调至pH 4.8，9500rpm 离心30min，除沉淀；再次调至pH 9.0，9500rpm离心30min，弃沉淀，收集上清液。将上述上清液调节pH至4.7，量取1.5L溶液，在4-30℃下按照硫酸铵饱和度表加入固体硫酸铵至50%饱和度，9500rpm 离心30min，收集沉淀，上清液继续添加硫酸铵至80%饱和度，再次9500rpm 离心30min，收集沉淀，合并两次沉淀，得到含有大豆凝集素蛋白粗品约1.57g，加入30mL去离子水溶解，截留分子量3500透析脱盐48小时，真空冷冻干燥，制得含有大豆凝集素和β-淀粉酶的P-7S蛋白样品。

分别精确称取0.4g上述初级分离的P-7S蛋白样品及0.4g聚阴离子多糖粉末，分别溶解于100mL 去离子水中，配制成质量浓度为0.4% 均一蛋白及多糖贮液，分别调节pH至7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中缓慢加入v/v 3.3%聚阴离子多糖溶液，磁力搅拌，调节pH至5.0，4000rpm离心20min，收集沉淀；对上清液再次重复1次，合并沉淀物，即得大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物。

将得到的大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物悬浮于2-3倍体积的去离子水中，调节pH至8.0，过截留分子量为300kD的超滤膜除糖，收集滤过液；截留分子量4000超滤脱盐，即得纯化的大豆凝集素。称取纯化的大豆凝集素 3.0mg，溶解于1.0mL超纯水中，配制成浓度为3.0mg/mL的溶液，过0.45μm微孔滤膜，SEC-HPLC检测蛋白纯度，并做SDS-PAGE电泳分析。

经测定，以上实例所得大豆凝集素，约含有蛋白95.2 %，总糖1.8%，灰分1.6 %及水分1.4 %。

Claims

1.一种从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于步骤如下：

（2）大豆乳清蛋白的初级分离：取步骤（1）所得大豆乳清液，调节pH至4.5，在4-30℃下加入硫酸铵至终饱和度为50%，9500rpm离心30min，收集沉淀，继续向上清中添加硫酸铵至饱和度60%-80%，9500rpm离心30min，收集沉淀；合并两次沉淀，加入去离子水溶解，使沉淀的质量浓度为1%-10%，截留分子量3500透析脱盐36-72h，截留液用真空冷冻干燥仪进行干燥，制得含有大豆凝集素和β-淀粉酶的P-7S蛋白；

2.根据权利要求1所述的从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于：所述聚阴离子多糖包括但不限于卡拉胶，硫酸酯化多糖，阿拉伯胶，海藻酸钠或果胶；其相对分子量范围为300-2000kD。

3.根据权利要求1所述的从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于步骤（1）所述大豆乳清的来源：收集常规的大豆分离蛋白生产形成的副产物或实验室利用脱脂豆粕经醇洗后，提取分离蛋白后所得的大豆蛋白乳清液，进行预处理。

4.根据权利要求3所述的从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于大豆乳清的预处理步骤为：首先将大豆蛋白乳清液调节pH至4.5-4.8，静止1-2d，离心，除杂蛋白完全，再调节至pH 8.0-10.0，9500rpm离心30min，收集上清液，即得大豆乳清液。

5.根据权利要求1所述的从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于：步骤（4）中超滤膜除糖截留分子量范围为100-300kD；脱盐处理包括但不限于透析，超滤，纳滤，需保证脱盐完全。

6.根据权利要求1所述的从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于：所述pH调节剂为：调节酸性：有机酸：包括但不限于甲酸、乙酸；无机酸：包括但不限于盐酸，硫酸；调节碱性：包括但不限于氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸氢钠。