CN1663959A - 一种β－葡聚糖肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种β－葡聚糖肽，其特征是它的糖链中以β－1，6－葡聚糖为主链，β－1，3－葡聚糖为支链。制备时将灰树花菌丝体用乙醇脱脂，用热水提取，用碱提取，用酸中和，超滤浓缩脱盐，用乙醇沉淀，再经柱色谱分离，用盐溶液梯度洗脱，按洗脱峰收集合并，并超滤浓缩脱盐、干燥。本发明一次分离即可容易除去其中的杂蛋白、杂多糖和其它杂质得到高纯度β－葡聚糖肽，大大简化了操作并提高了β－葡聚糖肽的制备速度与得率，同时也避免了采用酶法容易破坏β－葡聚糖肽中肽链结构的缺点。该产品可用于制备免疫调节剂和抗癌药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种由灰树花菌丝体制备β-葡聚糖肽的方法及其在免疫调节和抗癌中的应用。
背景技术
灰树花(Grifola.frondosa)属于担子菌纲，多孔菌属，担子菌，为名贵食用和药用真菌，利用液体发酵工艺可以获得大量灰树花菌丝体。研究表明，灰树花多糖具有广泛的药理活性，但从灰树花子实体和发酵菌丝体中制备的多糖具有不同的结构，在不同的培养条件下得到的灰树花多糖的结构也有差别；结构不同，活性也不同。在一中国专利(CN1398898A)中，披露了一种灰树花子实体多糖肽的制备方法，该方法采用水提取、酸提取、碱提取以及乙醇沉淀获得多糖肽，所得到的多糖肽中杂蛋白采用氯仿-正丁醇混合溶液(Sevag)法，三氯乙酸法和酶盒法处理，其糖链以β-1，3-糖苷键为主；在另一专利(CN1398979A)中，披露了一种灰树花多糖肽的生产方法，该方法采用热水提取和乙醇沉淀得到多糖肽，该糖肽也是一种混合物，未经进一步分离，且其糖链结构不确定。目前，从灰树花中制备β-葡聚糖肽还缺乏有效的方法，并且所得到的产品纯度不高，还不能有效地用作免疫调节剂和抗癌剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种以灰树花发酵菌丝体为原料制备出一种结构上有新特点的β-葡聚糖肽，以弥补现有技术的上述不足。
一种β-葡聚糖肽，其特征是它的糖链以β-1，6-葡聚糖为主链，β-1，3-葡聚糖为支链。
一种β-葡聚糖肽的制备方法，其特征是将灰树花菌丝体用乙醇脱脂，用热水提取，用碱提取，用酸中和，超滤浓缩脱盐，用乙醇沉淀，再经柱色谱分离，用盐溶液梯度洗脱，按洗脱峰收集合并，并超滤浓缩脱盐、干燥。
β-葡聚糖肽用作免疫调节剂。
β-葡聚糖肽用作抗肿瘤剂。
本发明一次分离即可容易除去其中的杂蛋白、杂多糖和其它杂质得到高纯度β-葡聚糖肽，大大简化了操作并提高了β-葡聚糖肽的制备速度与得率，同时也避免了采用酶法容易破坏β-葡聚糖肽中肽链结构的缺点，该产品具有免疫调节和抗癌活性。
附图表说明
附图1为本发明制备的β-葡聚糖肽的红外光谱图。
附图2为本发明制备的β-葡聚糖肽的13C-NMR谱图
从图1可以看出，本发明的产品在3382cm-1处为O-H的伸缩振动吸收峰，且存在分子间氢键，2894cm-1处为糖环上C-H振动峰，1631cm-1和1413cm-1处为糖肽中酰胺(-NH-CO-)键吸收峰，1075-1180cm-1处三个峰为吡喃葡萄糖特征吸收峰，896cm-1为葡萄糖端基βC-H的变角振动特征吸收峰，由此可以证明该产品为β-葡聚糖肽。
从图2可知，所得β-葡聚糖肽中糖链的13C-NMR信号归属如下：103.6ppm和103.2ppm为βC1→取代信号峰；86.9ppm和86.3ppm为βC3→取代信号峰；70.4ppm为βC6→取代信号峰；76.5ppm，68.6ppm，和76.7ppm分别为未取代C3，C4，C5信号峰。
具体实施方式
向100克灰树花菌丝体中加入1000毫升浓度为95％的乙醇水溶液，80℃提取2小时，离心收集沉淀，然后向该沉淀中加入1500毫升蒸馏水，于100℃回流提取2小时，离心收集沉淀，然后向该沉淀中加入1000毫升5％(重量百分比，下同)NaOH水溶液，于4℃搅拌提取6小时，离心收集清液，该清液用醋酸中和并离心收集上清液，将后者超滤浓缩、脱盐，加入无水乙醇使乙醇浓度为85％，离心收集沉淀，该沉淀进一步用Q-Sepharose FF柱色谱分离，用含有氯化钠(pH7)的水溶液进行梯度洗脱，得到β-葡聚糖肽，它的分子量1万-20万道尔顿，其中总糖含量65％-98％，肽含量35-2％。
本发明中所述的95％乙醇可以是75％-95％的乙醇；所述的NaOH可该用KOH，浓度可以是2％-20％，碱液提取温度可以是-5℃-75℃，碱液提取时间可以是2-24小时。所述的醋酸中和可以用稀盐酸或者稀硫酸；所述的Q-Sepharose FF可以改用DOWEX MSA-1或者DEAE-Sephacel。
用本发明的产品按现有的方法对小鼠作了免疫调节和抗癌活性实验，结果如表1和表2所示。表1为β-葡聚糖肽对小鼠免疫器官的影响，表2为β-葡聚糖肽对小鼠抑瘤率的影响。从表1和表2实验结果可以看出，本发明的β-葡聚糖肽能明显提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数，抑瘤率达73％，具有明显的提高免疫和抗癌活性。
表1 β-葡聚糖肽对小鼠免疫器官的影响
| 组别 | 瘤株 | 给药途径和剂量 | 胸腺指数(mg/g) | 脾指数(mg/g) |
| 生理盐水组 | S180 | 7.65 | 1.97 | |
| 顺铂 | S180 | ip(2mg/kg) | 3.60 | 0.65 |
| 环磷酰胺 | S180 | ip(80mg/kg) | 3.28 | 1.54 |
| 天地欣 | S180 | ip(2mg/kg) | 6.67 | 1.83 |
| β-葡聚糖肽 | S180 | ip(1mg/kg) | 8.71 | 2.89 |
表2 β-葡聚糖肽对小鼠抑瘤率的影响
| 组别 | 瘤株 | 给药途径和剂量 | 抑瘤率，％ |
| 生理盐水组 | S180 | 0 | |
| 顺铂 | S180 | ip(2mg/kg) | 92 |
| 环磷酰胺 | S180 | Ip(80mg/kg) | 85 |
| 天地欣 | S180 | ip(2mg/kg) | 32 |
| β-葡聚糖肽 | S180 | ip(1mg/kg) | 73 |
Claims (6)
1 一种β-葡聚糖肽，其特征是它的糖链中以β-1，6-葡聚糖为主链，β-1，3-葡聚糖为支链。
2 一种β-葡聚糖肽的制备方法，其特征是将灰树花菌丝体用乙醇脱脂，用热水提取，用碱提取，用酸中和，超滤浓缩脱盐，用乙醇沉淀，再经柱色谱分离，用盐溶液梯度洗脱，按洗脱峰收集合并，并超滤浓缩脱盐、干燥。
3 如权利要求2所述的方法，其特征是所述的碱为NaOH或者KOH。碱提取浓度为2-20％，碱液提取的温度-5-75℃，碱提取的时间为2-24小时；所述的酸可以是稀醋酸，稀盐酸或稀硫酸。
4 如权利要求2所述的方法，其特征是所述的柱色谱分离填料为DOWEX MSA-1，Q-Sepharose F.F或者DEAE-Sephacel，洗脱用的盐溶液为含氯化钠的水溶液，采用梯度洗脱，并用紫外监测器检测。
5 β-葡聚糖肽用作免疫调节剂。
6 β-葡聚糖肽用作抗肿瘤剂。
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