CN103555649B

CN103555649B - 一种海带配子体的固相保存方法

Info

Publication number: CN103555649B
Application number: CN201310600181.7A
Authority: CN
Inventors: 李言; 罗世菊; 王娜; 王利芹; 赵聚萍; 赛珊; 钱瑞; 武瑞娜; 陈书秀; 崔翠菊
Original assignee: SHANDONG ORIENTAL OCEAN SCI-TECH Co Ltd
Current assignee: SHANDONG ORIENTAL OCEAN SCI-TECH Co Ltd
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2033-11-25
Also published as: CN103555649A

Abstract

本发明公开了一种海带配子体的固相保存方法，其步骤是：孢子囊海带块的获取及擦拭；孢子囊海带块的无菌处理；海带孢子的放散、附着及萌发；海带单个配子体的分离与接种；海带配子体在固体培养基中的培养及后期保存。本发明将海带配子体的无菌采集和固相保存结合起来,本发明从源头就抑制细菌的污染，降低了海带配子体污染细菌的机会，也大大简化了海带配子体固相保存前期的无菌处理流程，降低固相培养处理海带配子体所附带细菌的难度，容易得到污染较轻甚至无污染的海带配子体，降低了液相保存海带配子体后期更换培养液的工作量并节省有限的保存空间，同时便于固相保存方法的推广应用。

Description

一种海带配子体的固相保存方法

技术领域

本发明涉及一种固相保存方法，尤其涉及一种海带配子体的固相保存方法，属于海洋生物技术领域。

背景技术

海带是中国重要的经济海藻，20世纪70年代建立了海带配子体的采集和克隆技术，为海带的种质保护奠定了基础。利用传统方法采集的配子体一般要分离到试管中并用棉花塞封口保存，通常每月更新一次培养液，工作量大，操作繁琐，增加了细菌污染和种质丢失、混杂的机会；2005年山东东方海洋科技股份有限公司和烟台大学合作开发了海带配子体固相保存技术，但由于实验室原有配子体克隆保存时间的延长、外界环境及海区水质的变化及液相培养开放性操作等诸多因素的影响，至2008年底保存的海带配子体克隆多有细菌污染，部分甚至出现真菌，并且污染菌的组成复杂，不是单一的一种菌，采用固相培养方法处理污染较重的海带雌雄配子体克隆，海带雌雄配子体克隆往往很难达到无菌状态，接种后极易长菌，导致固相培养失败，影响了固相保存技术的推广应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种无污染的海带配子体的固相保存方法。

本发明的技术解决方案是：一种海带配子体的固相保存方法，其步骤是：

（1）孢子囊海带块的获取及擦拭：在海区选取性状优良的种海带，在海带孢子囊区剪取孢子囊海带块，用灭菌脱脂棉蘸取冷却的煮沸海水反复擦拭孢子囊海带块，以去除孢子囊海带块表面附着物；

（2）孢子囊海带块的无菌处理：在移入无菌室前，利用灭菌脱脂棉蘸取高压灭菌的冷却海水再次擦拭孢子囊海带块，将擦拭后的孢子囊海带块移入无菌室超净工作台，首先用浓度为100 ppm（质量体积比，克/立方米）的阿奇霉素和浓度为100 ppm的环丙沙星的双抗无菌海水浸泡孢子囊海带块20分钟，再用浓度为1.5% 碘化钾无菌海水浸泡孢子囊海带块10分钟，最后用抽滤海水浸泡孢子囊海带块5分钟，重复一次用抽滤海水浸泡孢子囊海带块5分钟；

（3）海带孢子的放散、附着及萌发：将无菌处理后的孢子囊海带块放入血清瓶，加抽滤的高压灭菌的冷却海水进行海带孢子放散，海带孢子放散到抽滤的高压灭菌的冷却海水成为海带孢子水，使用灭菌的筛绢过滤海带孢子水中的粘液及杂质，最后将海带孢子水倒入装有载玻片的立式染色缸中，海带孢子在载玻片上进行附着和萌发，发育为海带配子体；

（4）海带单个配子体的分离与接种：在超净工作台内，在显微镜下，在附有海带配子体的载玻片上选取状态优良、特征明显的海带配子体，利用毛细玻璃管将选取的海带配子体先转移到盖玻片上，镜检确保是一个海带配子体，再利用毛细玻璃管植入培养皿中的固体培养基中，以完成海带配子体接种，接种后的培养皿合上皿盖并用封口膜密封；

（5）海带配子体在固体培养基中的培养及后期保存：将接种海带配子体的培养皿放入光照培养箱中固相培养4个月，培养条件是持续24小时光照，光照强度1300～2000 lux ，温度4～10℃，然后将固相培养后的培养皿转入光照强度0～100 lux, 温度为4℃的冷藏柜中保存，使海带配子体进入休眠状态即可实现长期保存，根据培养基表面干燥程度添加培养液。

上述步骤（4）所述固体培养基的配制方法是：

（1）配制PⅡ金属液：称取乙二胺四乙酸二钠0.1克、三氯化铁0.001克、硼酸0.02克、氯化锰0.004克、氯化锌0.0005克、氯化钴0.0001克溶于去离子水中并定容至100 mL ；

（2）配制PESI母液：硝酸钠0.35克、乙二胺四乙酸铁钠盐0.0025克、甘油磷酸钠0.05克、PⅡ金属液 25 mL、 Tris 0.5克，碘化钾 0.0001克，利用去离子水定容至100mL；

（3）配制PESI液体培养基：每100 mL煮沸海水中添加2 mL的 PESI母液，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌条件121℃，0.1MPa ，30min，灭菌完毕后使用；

（4）配制固体培养基：每100 mL的PESI液体培养基中添加0.6～0.8g琼脂粉，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌条件121℃，0.1MPa，30min，高压灭菌完毕后，冷却至60 ℃后分别添加阿奇霉素、利福平、制霉菌素，使固体培养基中的阿奇霉素、利福平、制霉菌素浓度都达到10ppm，然后分装倒入培养皿。

上述步骤（5）的暗光低温的条件是光照强度0～100 lux, 温度4℃。

本发明的技术效果是：本发明将海带配子体的无菌采集和固相保存结合起来，即对种海带进行擦洗，并立即进行无菌采克隆，待海带游孢子附着萌发转为海带配子体，当海带配子体大小适中，密度均匀，雌雄可辨时，分离单个配子体并进行固相保存。本发明从源头就抑制细菌的污染，降低了海带配子体污染细菌的机会，也大大简化了海带配子体固相保存前期的无菌处理流程，降低固相培养处理海带配子体所附带细菌的难度，容易得到污染较轻甚至无污染的海带配子体，同时降低了液相保存海带配子体后期更换培养液的工作量并节省有限的保存空间，同时便于固相保存方法的推广应用。本发明具有如下优点：

1. 节省空间，利用现有方法试管保存新分离的配子体克隆，占用光照培养箱较大面积，而固相保存，可大大节省空间面积，并且没有试管液体保存出现的皮筋老化，试管液体倒、洒等问题。

比液相保存更省时省力，保存可长达三年，不用添加培养基或更换培养基，而液相培养一般一个月更换一次培养液，并且操作比较开放，种质污染、混杂机会增加，同时倾倒培养液的过程也是散播污染菌的过程，也会造成不同种污染菌之间的交叉污染。

将海带配子体的无菌采集和固相保存结合起来，通过无菌采集海带配子体，在源头就抑制细菌的污染，降低了海带配子体污染细菌的机会，也大大简化了海带配子体固相保存前期的无菌处理流程，降低固相培养前期处理海带配子体所附带细菌的难度。

现有方法液相保存有可能会造成种质本身的老化，固相保存可使克隆进入休眠状态，减缓海带配子体克隆的新陈代谢，延长保存时间。

另外，本发明所采用的阿奇霉素和环丙沙星对所能分离出的菌株都有效，且多为高敏或极高敏，二者结合抑菌效果更好。本发明海带配子体接种是在无菌操作台中的显微镜下利用毛细玻璃管挑取状态优良，特征明显的配子体，利用毛细玻璃管将选取的海带配子体先转移到盖玻片上，镜检确保是一个海带配子体，再利用毛细玻璃管重新吸入，植入培养皿中的固体培养基中，而不是放入海水培养液中，使海带配子体接种成功率更高。

附图说明

、图1为本发明附着海带配子体的载玻片照片。

、图2为本发明固相保存3个月后长出海带雌配子体的照片。

、图3为本发明固相保存3个月后长出海带雄配子体的照片。

、图4为本发明从载玻片上分离的海带雌配子体照片。

、图5为本发明图4的海带雌配子体在固体培养基中培养3个月，肉眼可见后，

用牙签挑出并在无菌海水中洗涤后的状态照片。

、图6为本发明图4的海带雌配子体在固体培养基中培养3个月后，在无菌的PESI培养液中复苏64天的状态照片。

、图7为本发明从载玻片上分离的海带雄配子体照片。

、图8为本发明图7的海带雄配子体在固体培养基中培养3个月，肉眼可见后，用牙签挑出并在无菌海水中洗涤后的状态照片。

、图9为本发明图7的海带雄配子体在固体培养基中培养3个月后，在无菌的PESI培养液中复苏60天的状态照片。

、图10为2216E培养液添加有细菌后海带克隆体上附着的细菌菌膜的照片。

、图11为本发明沙堡培养液添加有霉菌后海带克隆体上附着的霉菌菌丝的照片。

、图12为本发明固相保存海带配子体克隆系的无菌检测对比照片。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明：

本发明实施例用到如下溶液、试剂和器材：

（1）煮沸海水，天然海水利用燃气灶大火将海水煮沸，后用小火保持沸腾5分钟，即可获得煮沸海水，然后用冷藏箱冷却至4～12℃作为冷却煮沸海水备用，用来擦洗刚从海区采集来的海带时使用。

（2）抽滤海水，在煮沸海水中加入已使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌的氮和磷营养盐（KH ₂ PO ₄ -P:1ppm和NaNO ₃ -N:10ppm），混匀后使用立式不锈钢抽滤器过滤除菌，在无菌室的超净工作台中处理准备放散的海带孢子囊块时使用。

（3）高压灭菌的冷却海水，煮沸海水在温度121℃，压力0.1MPa条件下灭菌时间30分钟，然后冷却至4～12℃；在无菌室外间擦洗海带时使用。

（4）抽滤的高压灭菌冷却海水，对高压灭菌的冷却海水使用立式不锈钢抽滤器过滤除菌；在无菌室的超净工作台中海带孢子囊放散时使用。

（5）灭菌脱脂棉：脱脂棉先利用牛皮纸包装好，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌条件：温度121℃，压力0.1MPa，灭菌时间30分钟，灭菌完毕后使用鼓风干燥箱在温度120℃下烘干2 小时。

（6）配制100 ppm的阿奇霉素和100 ppm的环丙沙星的双抗无菌海水：

a、配制浓度为10000 ppm的阿奇霉素母液，配制方法是称取1克阿奇霉素，溶于100 mL去离子水中，获得浓度为10000 ppm的阿奇霉素母液，然后利用5 mL的一次性无菌注射器和一次性抽滤器抽滤除菌，分装每管5 mL；

b、配制浓度为10000 ppm的环丙沙星母液，配制方法是称取1克环丙沙星，溶于100 mL去离子水中，获得浓度为10000 ppm的环丙沙星母液，然后利用5 mL的一次性无菌注射器和一次性抽滤器抽滤除菌，分装每管5 mL；

c、向煮沸海水中加入20 mL浓度为10000 ppm的阿奇霉素母液和20 mL浓度为10000 ppm的环丙沙星母液，定容至2000mL，混匀，使用立式不锈钢抽滤器中的0.22 μm的滤菌膜过滤除菌，接入规格为250mL灭菌的蓝盖血清瓶中，得到的即为100 ppm的阿奇霉素和100 ppm的环丙沙星的双抗无菌海水。

（7）配制硝酸钠母液：称取242.4克硝酸钠，溶于1000 mL去离子水中，氮元素母液浓度为4×10 ⁴ ppm，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌条件121℃，0.1MPa ，30分钟，冷却至室温，每4000 mL的煮沸海水中加入1mL硝酸钠母液，氮元素浓度为10 ppm。

（8）配制磷酸二氢钾母液：称取17.5g磷酸二氢钾，溶于1000 mL去离子水中，磷元素母液浓度为4.5×10 ³ ppm，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌条件121℃，0.1MPa ，30分钟，冷却至室温，每4000 mL的煮沸海水中加入1mL磷酸二氢钾母液，磷元素浓度为1 ppm。

（9）配制5%碘化钾的无菌海水：称取1.5克碘化钾 KI溶于100 mL煮沸的海水中，溶解后使用立式不锈钢抽滤器过滤除菌。

（10）配制0.6～0.8 % 琼脂的PESI固体培养基：

a、配制PESI母液配方：称取硝酸钠0.35克、乙二胺四乙酸铁钠盐0.0025克、甘油磷酸钠0.05克，量取PⅡ金属液 25 毫升，称取Tris 0.5克，碘化钾 0.0001克，去离子水100毫升，混匀备用；

b、配制PESI液体培养基，量取2mL 的PESI母液，利用未加营养盐的煮沸海水定容至100 mL，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌条件121℃，0.1MPa ，30分钟，灭菌完毕后使用；

c、配制PESI固体培养基，每100 mL的PESI液体培养基中添加0.6～0.8克琼脂粉，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌条件121℃，0.1MPa ，30分钟，灭菌完毕后分装到培养皿中冷凝后使用。

其中PⅡ金属液配制方法：称取乙二胺四乙酸二钠0.1克、三氯化铁0.001克、硼酸0.02克、氯化锰0.004克、氯化锌0.0005克、氯化钴0.0001克溶于去离子水中并定容至100 mL 。

（11）配制2216E培养液：称取酵母浸粉 1.0g，蛋白胨 5.0g，磷酸铁0.1g，量取煮沸未加营养盐的海水1000 mL，若为固体培养基应加入1.5%琼脂粉，pH 7.6～7.8，如果pH值不符合要求，加浓度为1mol/L的盐酸或浓度为1mol/L的氢氧化钠来调节，本实验中由于用的煮沸海水配制培养液， pH在要求范围内，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌条件121℃，0.1MPa，30分钟。

（12）沙堡培养液：称取无水葡萄糖40克，蛋白胨10克，量取煮沸未加营养盐的海水1000 mL，若为固体培养基应加入1.5%琼脂粉，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌条件121℃，0.1MPa，30分钟。

（13）立式染色缸：玻璃材质，可放5片载玻片，50~60ml的容量。

（14）立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂，型号为LDZX-75KB。

（15）超净工作台：苏州净化设备有限公司，型号为SW-CJ-ID。

（16）0.22um滤膜：上海市新亚净化器件厂，混合纤维膜。

（17）筒式正压过滤器：上海市新亚净化器件厂，规格为1升，直径100mm，材质为不锈钢。

（18）鼓风干燥箱，即电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司，型号为OHG-924385-Ⅲ。

（19）阿奇霉素，大连美仑生物技术有限公司生产，产品编号MB1024，分子量785.01，945-1030 ug /mg，二水物。

（20）环丙沙星，大连美仑生物技术有限公司生产，产品编号MB1283，分子量331.34，含量99% 。

（21）硝酸钠，分析纯，分子量84.99，纯度≥99.0%，国药集团化学试剂有限公司生产。

（22）磷酸二氢钾，分析纯，分子量136.09，纯度≥99.5%，国药集团化学试剂有限公司生产。

（23）碘化钾，分析纯，分子量166.00，纯度≥99.0%，国药集团化学试剂有限公司生产。

（24）乙二胺四乙酸铁钠盐，分子量367.05，纯度≥ 99.0%，青岛生工生物科技有限公司（MDBio）生产。

（25）甘油磷酸钠，成都科龙化学试剂厂生产。

（26）乙二胺四乙酸二钠，分析纯，分子量372.24，纯度≥ 99.0%，天津市大茂化学试剂厂。

（27）Tris（三羟甲基氨基甲烷），C ₄ H ₁₁ NO ₃ ,分子量121.1，纯度≥ 99.5%，厦门兴隆达化学试剂有限公司。

（28）三氯化铁，分析纯，分子量270.29，纯度≥ 99.0%，天津市红岩化学试剂厂。

（29）硼酸，分析纯，分子量61.83，纯度≥ 99.5%，天津市瑞金特化学品有限公司。

（30）氯化锰，分析纯，分子量197.91，纯度≥ 99.0%，天津市博迪化工有限公司。

（31）氯化锌，分析纯，分子量136.30，纯度≥ 98.0%。

（32）氯化钴，分析纯，分子量237.93，纯度≥ 99.0%，天津市红岩化学试剂厂。

（33）琼脂粉，北京康倍斯科技有限公司。

（34）利福平，大连美仑生物技术有限公司，产品编号MB1769，含量不小于98.5%，分子量822.95。

（35）制霉菌素，大连美仑生物技术有限公司，产品编号MB1170，4400u/mg，含量不小于98.5%，分子量926.10。

（36）酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司生产。

（37）磷酸铁，上海润捷化学试剂有限公司生产，分子量222.87，纯度≥ 98.0%。

（38）无水葡萄糖，天津市东丽区天大化学试剂厂生产，分子量180.16。

（39）蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司生产。

（40）滤膜：上海新亚净化器件厂，混合纤维素微孔滤膜，水系，直径100mm，孔径0.22μm。

（41）去离子水，通过青岛紫泉仪器有限公司购买的FMN1001-RO型纯水机制备。

（42）配制利福平母液：称取1克利福平，溶解于100 mL 甲醇中，配制成浓度为10000 ppm的母液。

（43）配制霉菌素母液：称取0.5克制霉菌素，溶解于100 mL 二甲基亚砜中，配制成浓度为5000 ppm的母液。

（44） parafilm封口膜，美国BEMIS公司生产，货号PM-996。

（45）光照培养箱，宁波江南仪器厂，型号GXZ-280B，容积300L。

（46）pH计：厂家Sartorius,德国赛多利斯公司，型号PB-100。

（47）一次性抽滤器：一次性针头过滤器，混合纤维素膜，水系，直径25mm，孔径0.22μm，上海市新亚净化器件厂。

本发明实施例海带配子体的固相保存方法步骤如下：

1、孢子囊海带块的获取及洗刷：在海区选取性状优良，具有成熟孢子囊的种海带运回实验室，在海带孢子囊区剪取2cm×3cm左右的长条，利用冷却的煮沸海水和灭菌脱脂棉反复擦拭，去除藻体上所附着的杂藻、附泥及粘液。

、孢子囊海带块的无菌处理：在无菌室外间，海带块利用高压灭菌的冷却海水（高压灭菌海水可以杀死海水中所有的藻类、细菌和真菌）和灭菌脱脂棉再次擦拭后，移入无菌室超净工作台内，首先利用含有100 ppm的阿奇霉素和100 ppm的环丙沙星的双抗无菌海水浸泡20 分钟，再利用浓度为1.5% 碘化钾KI的无菌海水浸泡10分钟，抽滤海水浸泡5分钟，重复一次抽滤海水浸泡5分钟。

经试验对比，阿奇霉素和环丙沙星对所能分离出的菌株都有效，且多为高敏或极高敏。

、海带孢子的放散、附着及萌发：将无菌处理的海带块直接放入蓝盖血清瓶，加抽滤的高压灭菌的冷却海水进行孢子放散，成熟度差的海带块需在8～10 ℃的冰箱中阴干2 小时，再放散；如果海带成熟度好，直接放入蓝盖血清瓶中放散，不需要阴干。取6～8滴海带孢子水在显微镜下观察，看海带游孢子的活力和数量，海带孢子体活力较强，一个视野下的游孢子数在8～10个，密度过大，加抽滤的煮沸海水稀释，直至一个视野下的海带游孢子数在3～5个，本实施例海带游孢子密度每视野（160倍镜下）达5个左右时，移出海带块，停止放散。镜检合格后，使用300目筛绢过滤海带孢子液中的粘液及杂质，将海带孢子水倒入装有载玻片的立式染色缸中，海带孢子水要覆盖过载玻片，不要溢满，然后将装有海带孢子水的立式染色缸放入培养箱进行海带孢子体的附着、萌发，培养条件：光照强度控制在1200~1500 lux，24小时光照，温度10～12 ℃，待48小时海带孢子体附着牢靠后，更换染色缸中的抽滤的高压灭菌的冷却海水，5～7天镜检一次。培养7～10天，在显微镜下雌雄配子体可辨时，可行单个配子体的分离。在显微镜下，海带孢子体转化为海带配子体雌雄可辨时，即可挑取分离海带雌雄配子体。从染色缸中挑选形态规整，大小适中，色素优良，密度均匀的附有海带配子体的载玻片，放入事先备好的培养皿中备用，海带配子体培养24天左右即可分离挑取，采集时密度比较合适也可等海带配子体再长大些挑取，这样可增加海带配子体成活率。

固相培养基的配制：配制0.6～0.8 %琼脂的PESI培养基。

首先，配制PESI母液，称取硝酸钠0.35g、乙二胺四乙酸铁钠盐0.0025 g、甘油磷酸钠0.05 g、PⅡ金属液 25 mL、 Tris 0.5g，碘化钾 0.0001g，去离子水100mL，混匀装至200 mL蓝盖瓶中；

其次，配制PESI液体培养基，量取 2 mL PESI母液，利用未加营养盐的煮沸海水定容至100 mL，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌条件121℃，0.1MPa ，30分钟，灭菌；

再次，配制PESI固体培养基，每100 mL的PESI液体培养基中添加0.6～0.8g琼脂粉，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，在121℃，0.1MPa，30分钟条件下高温灭菌；

最后，PESI固体培养基高温灭菌后冷却至60 ℃后分别添加阿奇霉素、利福平、制霉菌素，使PESI固体培养中的阿奇霉素浓度为10ppm、利福平浓度为10ppm、制霉菌素浓度为10ppm（即抗生素的最终浓度），混匀后分装入9 cm直径的培养皿中作为PESI固体培养板，即用9 cm直径的培养皿倒平板，冷凝备用。

经试验对比，阿奇霉素和利福平对95 %以上的海带配子体污染菌都有效；对污染的真菌也进行了分离纯化，制霉菌素比较好用；为了防止周围环境中的真菌尤其是夏天培养箱潮湿环境中的真菌污染，本发明在培养基中添加制霉菌素。

单个配子体的分离与接种：在超净工作台内进行；在显微镜下，在事先备好的附有海带配子体的载玻片上挑取状态优良，特征明显的配子体；海带雌配子体细胞大，由细胞分裂形成的分支少；海带雄配子体细胞明显小，分支多；利用毛细玻璃管将挑取的海带配子体先移到盖玻片上，镜检确保是一个雌配子体或是一个雄配子体后，再利用毛细管重新吸入植入固体培养基中，完成此操作后需要镜检盖玻片和毛细玻管，看是否有海带配子体残留，每个PESI固体培养板接10～15个海带配子体，接种后利用parafilm封口膜密封。

固相保存的培养：将接种的PESI固体培养板放入光照培养箱中培养，24小时光照，光强1200~1500 lux ，10 ℃左右，保存2个月左右，可见培养基中长出的海带配子体克隆系藻斑1.0～1.5 毫米左右，肉眼可见，此时将其转入暗光低温冷藏柜中保存（光照强度0～100 lux, 4℃左右），使海带配子体细胞进入休眠状态，进行长期保存，根据培养基表面干燥程度添加一次灭菌的PESI培养液（一般是一年添加一次灭菌的PESI培养液）。

固相保存海带克隆的复苏：用灭菌牙签从PESI固体培养板上挑取肉眼可见的海带配子体克隆系藻斑接种于灭菌的PESI培养液，在温度8～12 ℃，在光照强度1000～1500 lux，24小时光照，50～60天即可长成簇状的海带配子体克隆系。本实施例灭菌的PESI培养液使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌条件121℃，0.1MPa ，30min，灭菌完毕后冷却至4～10℃。

固相保存配子体克隆系的无菌检测，即固相保存海带配子体克隆系是否为细菌或真菌污染的检测：在超净工作台中按下面附表设置检验， 28 ℃摇菌培养3天，看各个培养液是否浑浊、澄清。

检测目的是利用本发明方法进行配子体保存以及其后所进行的固相保存海带配子体的复苏过程是否会造成海带配子体为细菌和真菌所污染，因为海带配子体保存根本不可能达到食品级别的无菌，采用摇菌的方法进行初步判定。检测方法是设置阳性和阴性对照，阳性对照即为已分别接种细菌的细菌液体培养基—2216E培养液和已接种真菌的真菌液体培养基—沙堡培养液，阳性对照28℃在摇床中摇菌，培养液肯定会变浑浊；阴性对照即为未添加任何污染物的细菌培养液---2216E培养液和真菌培养液—沙堡培养液，阴性对照28℃在摇床中摇菌，正常操作下培养液是澄清的；将被检测物分别加入细菌培养液和真菌培养液中，和阳性、阴性对照在相同条件下摇菌，看浑浊或澄清状况来判断是否为细菌或真菌污染，在此实验中被检测物为雌性海带配子体♀、雄性海带配子体♂复苏培养液，如果摇菌结果浑浊表明海带配子体有菌污染，如果摇菌结果澄清表明海带配子体无菌污染。本发明海带配子体是否为细菌或真菌污染的检测实验结果见如下附表：

图12为本发明固相保存海带配子体克隆系的无菌检测对比照片，其中

a图为细菌阳性对照照片，b图为真菌阳性对照，c图为细菌阴性对照，d图为真菌阴性对照，e 图为雌性海带配子体细菌培养液照片， f 图为雌性海带配子体真菌培养液照片， g 图为雄性配子体细菌培养液照片， h 图为雄性配子体真菌培养液照片。

附表

。

Claims

1.一种海带配子体的固相保存方法，其步骤是：

(1)孢子囊海带块的获取及擦拭：在海区选取性状优良的种海带，在海带孢子囊区剪取孢子囊海带块，用灭菌脱脂棉蘸取冷却后的煮沸海水反复擦拭孢子囊海带块，以去除孢子囊海带块表面附着物；

(2)孢子囊海带块的无菌处理；在移入无菌室前，利用灭菌脱脂棉蘸取高压灭菌的冷却海水再次擦拭孢子囊海带块，将擦拭后的孢子囊海带块移入无菌室超净工作台，首先用浓度为100ppm的阿奇霉素和浓度为100ppm的环丙沙星的双抗无菌海水浸泡孢子囊海带块20分钟，再用浓度为1.5％碘化钾无菌海水浸泡孢子囊海带块10分钟，最后用抽滤海水浸泡孢子囊海带块5分钟，重复一次用抽滤海水浸泡孢子囊海带块5分钟；

(3)海带孢子的放散、附着及萌发：将无菌处理后的孢子囊海带块放入血清瓶，加抽滤的高压灭菌冷却海水进行海带孢子放散，海带孢子放散到抽滤的高压灭菌冷却海水成为海带孢子水，使用灭菌的筛绢过滤海带孢子水中的粘液及杂质，最后将海带孢子水倒入装有载玻片的立式染色缸中，海带孢子在载玻片上进行附着和萌发，发育为海带配子体；

(4)海带单个配子体的分离与接种：在超净工作台内，在显微镜下，在附有海带配子体的载玻片上选取状态优良、特征明显的海带配子体，利用毛细玻璃管将选取的海带配子体先转移到盖玻片上，镜检确保是一个海带配子体，再利用毛细玻璃管重新吸入，植入培养皿中的固体培养基中，以完成海带配子体接种，接种后的培养皿合上皿盖并用封口膜密封，所述固体培养基的配制方法是：

a、配制PⅡ 金属液：称取乙二胺四乙酸二钠0.1克、三氯化铁0.001克、硼酸0.02克、氯化锰0.004克、氯化锌0.0005克、氯化钴0.0001克溶于去离子水中并定容至100mL；

b、配制PESI母液：硝酸钠0.35克、乙二胺四乙酸铁钠盐0.0025克、甘油磷酸钠0.05克、PⅡ 金属液25mL、Tris 0.5克，碘化钾0.0001克，利用去离子水定容至100mL；

c、配制PESI液体培养基：每100mL煮沸海水中添加2mL的PESI母液，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌温度121℃，灭菌压力0.1MPa，灭菌时间30分钟，灭菌完毕后使用；

d、配制固体培养基：每100mL的PESI液体培养基中添加0.6～0.8g琼脂粉，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌，灭菌温度121℃，灭菌压力0.1MPa，灭菌时间30分钟，高压灭菌完毕后，冷却至60℃后分别添加阿奇霉素、利福平、制霉菌素，使固体培养基中的阿奇霉素浓度为10ppm、利福平浓度为10ppm、制霉菌素浓度为10ppm，然后分装倒入培养皿；

(5)海带配子体在固体培养基中的培养及后期保存：将接种海带配子体的培养皿放入光照培养箱中固相培养4个月，培养条件是持续24小时光照，光照强度1300～2000lux，温度4～10℃，然后将固相培养后的培养皿转入暗光低温保存，使海带配子体进入休眠状态即可实现长期保存，根据培养基表面干燥程度添加培养液，暗光低温的条件是光照强度0～100lux，温度4℃。