CN111521472A - 一种检测叶片病原真菌的染色方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测叶片病原真菌的染色方法，包括前处理、固定脱色、抽滤染色和制片观察。本发明的方法方便快捷、经济实惠、绿色安全、效果好、适应性强，解决了目前常规的真菌染色研究中存在的染色层次不清、图像模糊、操作时间过长等问题，实现病原菌快速高效染色，为真菌病害研究提供一种行之有效的染色方法，具有较强的实用价值和科研理论价值。

Description

一种检测叶片病原真菌的染色方法

技术领域

本发明涉及真菌检测技术领域，具体涉及一种检测叶片病原真菌的染色方法。

背景技术

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)栽培起源于亚马孙河流域，后成功引进我国，成为国内天然橡胶的唯一来源，是我国一种重要的战略资源。然而在橡胶生产过程中，病害一直是影响橡胶产量的重要制约因素。其中炭疽病一种由炭疽菌(Colletotrichum)引起的严重影响胶乳产量和品质的橡胶树病害。

炭疽菌属(Colletotrichum)真菌是一类重要的植物病原真菌，具有适生能力强、寄主多、地理分布广等特点。炭疽菌是一种半活体营养寄生菌，在浸染寄主植物过程中往往形成特殊的浸染结构——附着孢，附着孢的形成对炭疽菌成功穿透寄主表皮形成寄生关系具有重要作用，炭疽菌能浸染橡胶树嫩叶、叶柄、嫩梢等多个部位，可危害苗圃小苗、大田幼树直至成龄开割胶树，引起嫩叶脱落、嫩枝干枯等，导致开割延迟，造成重大产量损失。

橡胶树炭疽病潜伏期长，不易被发现，在气候条件适宜的情况下，极短的时间内即可爆发成灾，预测难度大。病原真菌早期检测技术有传统定量法、酶联免疫吸附法、分子检测技术等，这些早期检测技术特异性相对较差，灵敏度不高，容易受到植物因素干扰，且试剂耗材昂贵，操作繁琐费时。

对于叶部真菌病害的组织病理学侵染过程的研究，传统的研究方法有很多，在显微镜下观察寄主组织中真菌结构是研究植物病原菌致病机制的重要方法。杨树黑斑病、苹果褐斑病、芒果炭疽病等许多典型的植物病原菌组织染色方法已有报道，但是，这些方法在橡胶树叶片真菌病害研究中，有一定的局限性。在橡胶树炭疽病的研究过程中，由于叶片自身含有较厚的蜡质层，通过传统浸泡染色的方法，叶片浮于染色剂上方，染色剂不能渗入植物组织内部，对植物叶片内部真菌染色不够清晰，无法完成预期结果，没能解决实际科研问题。

常用的真菌染色方法有台酚蓝染色、苏木素—伊红染色、高碘酸－无色品红染色、六胺银染色、改良革兰氏染色等，这些染色方法染色时间不易把控，容易过染，病原菌与叶片组织对比不明显且切片固定等操作繁琐。荧光染料Hoechst/Propidiumide双荧光染色法，虽然能够直接观察病原菌在寄主组织中的位置，还能提供寄主细胞活力等信息，但荧光染色的高昂费用限制了其在田间病原菌检测的大规模应用。另外，荧光染色剂存在荧光淬灭现象，荧光强度降低持续时间不长，植物的自发荧光也影响染色效果。

本发明能够很好地弥补这些不足，且染色剂刚果红无毒，具有方便快捷、经济实惠、绿色安全、适应性强的特点，对橡胶树炭疽病菌组织病理学进程的研究及流行病学预测预警具有重大意义。为该病害的有效防控提供科学依据，同时为其他叶部真菌病害的观察奠定良好基础，在其他经济林木重要病害的早期检测中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种方便快捷、经济实惠、绿色安全、效果好、适应性强的检测叶片病原真菌的染色方法，通过本发明中所述的染色方法能够清楚地观察到叶片内部的真菌结构，解决了目前常规的真菌染色研究中存在的染色层次不清、图像模糊、操作时间过长等问题，实现病原菌快速高效染色，为真菌病害研究提供一种行之有效的染色方法，具有较强的实用价值和科研理论价值。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种检测叶片病原真菌的染色方法，它包括以下步骤：

S1.前处理：选择被病原真菌侵染的叶片作为处理材料，剪成块状；

S2.固定脱色：将块状样品浸泡在脱色液中进行脱色，所述脱色液为三氯乙酸、乙醇与氯仿的混合溶液，脱色时间为10～15h；

S3.真空抽滤：将固定脱色好的样品进行真空抽滤，抽滤至叶片不悬浮于染色剂表面；

S4.染色：将抽滤后的样品浸泡在刚果红染色剂中常温避光放置2～4h；

S5.制片观察：染色处理后的样品直接用蒸馏水冲洗脱色，制片镜检。

进一步地，所述病原真菌为炭疽病菌。

进一步地，所述病原真菌为麻点病菌。

进一步地，所述病原真菌来源于橡胶树。

进一步地，步骤S1中所述块状的大小为1.5cm×1.5cm。

进一步地，步骤S2所述固定脱色液中的三氯乙酸醇溶液与氯仿的体积比为4～6:1，其中三氯乙酸醇溶液的质量体积比为0.15％。

进一步地，步骤S3中所述真空抽滤是在0.09MPa下抽滤5～15min。

进一步地，步骤S4中所述刚果红的质量体积比为1％。

本发明中再固定脱色之后，滤纸吸干样品表面的脱色液，加入染色剂，用真空泵抽滤排去叶片组织内的气体，真空抽滤能排掉叶肉细胞间隙中的气体，便于橡胶树叶片中炭疽菌的着色。

便于橡胶树叶片中炭疽菌附着孢和菌丝着色，减短染色时间。

本发明中，所述透明染色剂采用包括以下步骤的方法配制：

采用Solarbio刚果红染色液(1％)。

本发明涉及的试剂配方：

固定脱色液的配制：0.15g三氯乙酸溶于100mL 95％的乙醇溶液中，再与氯仿溶液混合均匀，配置固定脱色液中的三氯乙酸醇溶液与氯仿的体积比为4～6:1保存在棕色瓶内。

本发明，在制片观察时，将处理好的样品压片，片子不要有气泡，在普通光学显微镜下压片观察。

本发明具有以下优点：

本发明中的染色方法能够有效地应用于橡胶炭疽病组织病理学研究，将寄主组织内部的真菌结构清晰地着色显示，能通过染色明显地区分开寄主同病原菌的结构；

本发明中的染色方法有广泛的通用性，可以应用在大部分叶部真菌病害的组织病理学过程的研究工作中，如橡胶白粉病、麻点病害等均有较好的效果；

本发明没有繁琐的固定过程，以蒸馏水冲洗脱色，简化了传统的操作步骤，节约了时间，对叶片内部的真菌有特异的染色效果；

本发明中的染色剂，操作简单、成本低廉、绿色安全，更适用于橡胶炭疽病的快速检测；

本发明能够清楚的观察橡胶树炭疽菌潜伏侵染过程中菌丝形态的变化，能够为橡胶树的早期检测提供理论依据；

本发明针对传统方法无法解决的科研问题，以常规试剂为基础，反复试验，通过自主创新设计，将抽滤与染色结合在一起，蒸馏水冲洗脱色，成功完成了清晰度高和对比效果强的染色工作。无染色液堆积、操作简单、成本低廉、绿色安全等优点，本发明便捷性高、通用性强，在植物叶部病害的研究领域提供有效的技术支持，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是不同脱色液的脱色效果比较图；

图2是不同比例的脱色液脱色效果比较图；

图3是不同浓度染色剂的染色效果比较图；

图4是不同处理时间的染色效果比较图；

图5是橡胶树炭疽菌潜伏侵染过程中菌丝形态的变化图；

图6是接种的叶片有无真空抽滤染色效果对比图；

图7是本发明在橡胶树其它叶部真菌病害的染色效果图，其中A、B分别是本发明对橡胶树白粉病和橡胶树麻点病的染色效果图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

实施例1：一种检测叶片病原真菌的染色方法，它包括以下步骤：

S1.前处理：选择被炭疽病菌侵染的橡胶树叶片作为处理材料，剪成1.5cm×1.5cm的块状；

S2.固定脱色：将块状样品浸泡在脱色液中进行脱色，所述脱色液为三氯乙酸、乙醇与氯仿的混合溶液，三氯乙酸醇溶液与氯仿的体积比为4:1，其中三氯乙酸醇溶液的质量体积比为0.15％，脱色时间为10h；

S3.真空抽滤：将固定脱色好的样品在0.09MPa下真空抽滤5min，抽滤至叶片不悬浮于染色剂表面；

S4.染色：将抽滤后的样品浸泡在质量体积比为1％的刚果红染色剂中常温避光放置2h；

S5.制片观察：染色处理后的样品直接用蒸馏水冲洗脱色，制片镜检。

实施例2：一种检测叶片病原真菌的染色方法，它包括以下步骤：

S1.前处理：选择被麻点病菌侵染的橡胶树叶片作为处理材料，剪成1.5cm×1.5cm的块状；

S2.固定脱色：将块状样品浸泡在脱色液中进行脱色，所述脱色液为三氯乙酸、乙醇与氯仿的混合溶液，三氯乙酸醇溶液与氯仿的体积比为6:1，其中三氯乙酸醇溶液的质量体积比为0.15％，脱色时间为15h；

S3.真空抽滤：将固定脱色好的样品在0.09MPa下真空抽滤15min，抽滤至叶片不悬浮于染色剂表面；

S4.染色：将抽滤后的样品浸泡在质量体积比为1％的刚果红染色剂中常温避光放置4h；

S5.制片观察：染色处理后的样品直接用蒸馏水冲洗脱色，制片镜检。

实施例3：一种检测叶片病原真菌的染色方法，它包括以下步骤：

S1.前处理：选择被炭疽病菌侵染的橡胶树叶片作为处理材料，剪成1.5cm×1.5cm的块状；

S2.固定脱色：将块状样品浸泡在脱色液中进行脱色，所述脱色液为三氯乙酸、乙醇与氯仿的混合溶液，三氯乙酸醇溶液与氯仿的体积比为5:1，其中三氯乙酸醇溶液的质量体积比为0.15％，脱色时间为12h；

S3.真空抽滤：将固定脱色好的样品在0.09MPa下真空抽滤10min，抽滤至叶片不悬浮于染色剂表面；

S4.染色：将抽滤后的样品浸泡在质量体积比为1％的刚果红染色剂中常温避光放置3h；

S5.制片观察：染色处理后的样品直接用蒸馏水冲洗脱色，制片镜检。

以下通过实验说明本发明的有益效果：

实验1：不同脱色方法在橡胶树炭疽病中应用比较

采集健康的橡胶树嫩绿期叶片，用蒸馏水冲洗干净，无菌水漂洗3次。将已经过分子鉴定的橡胶树炭疽菌的分生孢子以10⁶个/mL的浓度接种到叶片上，在人工气候培养箱中培养，培养条件为湿度100％，28℃培养。用酒精消毒的刀片或者手术刀，将接种8h的叶片剪成1.5cm×1.5cm左右的小块样品。分别对材料进行以下处理：

方法1：酒精透明法

将材料放入≥99.7％的酒精中固定脱色12h，然后移到抽滤瓶中，在0.09MPa下抽滤10min，后在刚果红染色剂中浸泡染色，使用水作为浮载剂，在普通光学显微镜下压片观察。

方法2：本发明所采用的透明法

将材料放入0.15％三氯乙酸酒精氯仿溶液中固定脱色12h，然后移到抽滤瓶中，在0.09MPa下抽滤10min，后在刚果红染色剂中浸泡染色，使用水作为浮载剂，在普通光学显微镜下压片观察。

所述试剂采用包括以下步骤的方法配制：

脱色剂的配置：

0.15g三氯乙酸溶于100mL≥99.7％的乙醇溶液中，再与20mL氯仿溶液混溶，保存在棕色瓶内。

实验结果如图1所示，图1中的A、B依次为以上两种处理的结果照片，从图1A可以看出经过方法1的处理，叶片组织背景脱色不彻底，有残留的色素，整体颜色泛黄，干扰真菌结构观察。图1B为本发明的脱色效果，橡胶树叶片细胞中的炭疽菌结构被刚果红染色液有效地染色，跟背景的对比非常明显，能够清晰地展示完整的真菌孢子、牙管、附着孢、菌丝等结构特征，图片质量更高，很好地解决了常规染色方法不能解决的问题。

实验2：不同的处理条件对染色效果的影响

前期处理同实验1，将接种的叶片切成1.5cm×1.5cm左右的小块样品，浸泡在三氯乙酸酒精氯仿固定脱色液中不同时间，然后将样品放入含不同刚果红浓度的染色液中进行染色，具体的配制比例如表1所示。通过不同的梯度处理浓度与处理时间进行染色，具体的处理浓度和时间，如表所1示。最后，使用水作为浮载剂，在普通光学显微镜下压片观察，结果分别如图2、图3、图4所示。

表1不同的脱色液比例、染色液浓度、染色时间

图2中的A-D使用的脱色液比例(0.15％三氯乙酸的酒精溶液:氯仿)分别为3:1、4:1、5:1、6:1，比例为3:1时，叶片组织背景脱色不彻底，如图2A所示，4:1、5:1、6:1都有较好的脱色效果，考虑到氯仿属于易制毒试剂，6：1时脱色时间较长，考虑时效性，故最优脱色液比例为5:1。脱色时间在10～15h的时候都能达到理想效果，12h最佳，叶绿素完全脱去叶片呈白色。5h时还有叶绿素的残留，不利于染色观察。20h后由于脱色液含有大量褪去的叶绿素，使得脱色的叶片泛黄，底色不清，不利于染色观察。未经真空抽滤的样品染色效果不佳。对于古铜期的叶片，抽滤5min就能排掉细胞间隙的气泡，而相对成熟期叶片，由于蜡质层较厚，所需时间在10～15min，故抽滤时间在5～15min能达到排除叶肉细胞间隙中的气体的效果。叶片完全沉浸于染色剂中，染色剂充分进入植物组织内部对病原真菌进行染色。图3中的A-D的染色液浓度分别为0.1％、0.5％、1％、2％，在处理浓度低于1％时，样品的着色比较浅，如图3A和图3B所示，真菌与叶片组织的对比度不高，染色浓度到1％以上，菌丝的着色效果就开始明显，如图3C和图3D所示，并且着色效果增强不明显，所以选择染色浓度为1％较为合理。图4中的A-F分别是刚果红染色处理0.5h、1h、1.5h、2h、3h和4h的染色结果，从图中可以看出前3个处理时间着色效果较差，如图4A、4B、4C所示，颜色较浅，随着染色时间的增加，着色变深，在2h时有较好的染色效果(图4D)，染色3h就已达到理想效果(4E)、4h以后，着色没有明显的变化(4F)，考虑时效性，确定3h染色效果最佳，如图4E所示。综合考虑到时间成本、金钱成本、毒性安全等因素，在橡胶树炭疽病的组织病理学研究中，本发明的几个主要变量，即脱色液比例、脱色时间、真空抽滤时间、染色液浓度以及染色时间，分别优选在5:1、12h、10min、1％、3h。

实验3：利用本发明的染色方法观察橡胶树炭疽菌侵染过程中菌丝形态变化

制备浓度为10⁶个/mL的分生孢子悬浮液，均匀地喷洒在橡胶树叶片上，在28℃，湿度≥90％，自然光照的条件下培养。侵染2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h后，将接种的叶片切成1.5cm×1.5cm的小块样品，用评鉴的最优脱色方案：0.15％三氯乙酸(W/V)酒精溶液:氯仿(V/V)＝5:1脱色12h后，用刚果红染色剂，在压强为0.09MPa的条件下抽滤10min染色3h，制片镜检，观察潜伏侵染时菌丝形态变化，结果如图5所示。

图5A-H为观察到接种后未发病时分生孢子的菌丝形态。孢子在0-2h开始萌发(图5B)随着接种时间的增加牙管生长(图5C)，12h后逐渐形成附着孢(图5D)而后附着孢颜色变深(图5E)，36h后伴随次生菌丝(SH)、附着孢(AP)的形成，附着孢顶端再次萌发产生次级附着孢(SA)；附着孢形成过程伴随分生孢子梗(CPs)及次级分生孢子(SC)的产生(图5H)。图5I为发病时的菌丝形态，可清楚的观察到菌丝聚集成束等特殊的变态结构。本发明能够清楚的观察橡胶树炭疽菌潜伏侵染过程中菌丝形态的变化，为橡胶树炭疽病的早期检测和病害预测预警奠定良好的基础。

实验4：真空抽滤对染色效果的影响

前处理同实验3，脱色后的叶片做真空抽滤染色和直接染色处理，每个处理3次重复，实验结果如图6所示。

未经真空处理的染色效果不佳，观察到刚果红染色剂处理4h的菌丝(HY)未被着色，处理24h观察到的菌丝颜色较浅(图6A)，而真空抽滤的样品在染色3h就能清楚的观察到病原菌孢子(C)和菌丝(HY)，且底色干净，对比度高(图6B)。由此可见，真空抽滤排掉了叶肉细胞间隙中的气体，便于橡胶树叶片中炭疽菌的着色，大大缩短染色时间。

实验5：利用本发明中的染色方法对橡胶树其他叶部病害进行染色观察

在海南儋州橡胶苗圃采集具有典型症状的叶部病害病叶，包括橡胶树白粉病、橡胶树麻点病等，自来水冲洗后用滤纸擦干叶面，用酒精消毒的刀片或者手术刀将叶片剪成1.5cm×1.5cm左右的小块样品，将样品浸泡在0.15％三氯乙酸乙醇溶液：氯仿＝5:1的固定脱色液12h，后将样品放入1％的刚果红染色液中真空抽滤10min，浸泡染色3h，然后将样品放到载玻片上，制片镜检，结果如图7所示。

从图7可以看出，本发明的染色方法在橡胶树其他叶部病害如橡胶树白粉病(图7A)、麻点病(图7B)的应用中，取得了非常好的染色效果，可以很好地观察到该病原菌在叶片中的形态特征，染色质量高，图片中的色差大，将寄主同病原菌很明显地区分开，说明本染色方法通用性较为广泛。

综上所述结果可以看出，本发明的真空抽滤染色方案在真菌组织学染色应用效果非常好，最终获得的图片质量很高，染色剂绿色安全，且本发明的通用性很广泛，一般情况下，任何叶部病害都可采用本方法进行病原真菌组织病理学研究的染色观察，能够为相关领域的科研工作提供很大的便利。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测叶片病原真菌的染色方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1.前处理：选择被病原真菌侵染的叶片作为处理材料，剪成块状；

S2.固定脱色：将块状样品浸泡在脱色液中进行脱色，所述脱色液为三氯乙酸、乙醇与氯仿的混合溶液，脱色时间为10～15h；

S3.真空抽滤：将固定脱色好的样品进行真空抽滤，抽滤至叶片不悬浮于染色剂表面；

S4.染色：将抽滤后的样品浸泡在刚果红染色剂中常温避光放置2～4h；

S5.制片观察：染色处理后的样品直接用蒸馏水冲洗脱色，制片镜检。

2.根据权利要求1所述的一种检测叶片病原真菌的染色方法，其特征在于：所述病原真菌为炭疽病菌。

3.根据权利要求1所述的一种检测叶片病原真菌的染色方法，其特征在于：所述病原真菌为麻点病菌。

4.根据权利要求2或3所述的一种检测叶片病原真菌的染色方法，其特征在于：所述病原真菌来源于橡胶树。

5.根据权利要求1所述的一种检测叶片病原真菌的染色方法，其特征在于：步骤S1中所述块状的大小为1.5cm×1.5cm。

6.根据权利要求1所述的一种检测叶片病原真菌的染色方法，其特征在于：步骤S2所述固定脱色液中的三氯乙酸醇溶液与氯仿的体积比为4～6:1，其中三氯乙酸醇溶液的质量体积比为0.15％。

7.根据权利要求1所述的一种检测叶片病原真菌的染色方法，其特征在于：步骤S3中所述真空抽滤是在0.09MPa下抽滤5～15min。

8.根据权利要求1所述的一种检测叶片病原真菌的染色方法，其特征在于：步骤S4中所述刚果红的质量体积比为1％。

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