CN114136738B - 一种用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，有效解决用光学显微镜对艾叶下表皮的气孔、表皮细胞的垂周壁式样以及腺毛和非腺毛的分布进行观察的问题，新鲜的艾叶片剪取小块，在甲醇中浸没处理，转移至盐酸浸泡，蒸馏水漂洗，用氢氧化钠和双氧水的混合液浸泡，解离叶肉组织并漂白，转至酒精中，除去叶表皮上的非腺毛；转入铬酸和硝酸的混合液中静置，解离叶肉组织，再用酒精漂洗，分离上、下表皮，除去内表皮的叶肉组织，上、下表皮用甲苯胺蓝O溶液染色，用水漂洗洗去浮色，水封片，即成，本发明操作简单，成本低，工作量小，成功率高，观察清晰，效果好，解决艾叶下表皮观察的技术难题，对操作人员技术要求不高，即可到达理想的效果。
Description
技术领域
本发明涉及植物显微鉴定观察技术领域，特别是对艾叶进行处理，从而可以对其叶表皮特征进行观察研究的一种用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法。
背景技术
艾叶为常用中药，全国大部分地区都产。艾叶晒干捣碎得“艾绒”，用于制艾条供艾灸用。腺毛是艾叶挥发油的主要来源，因而艾叶腺毛的数量和密度关系到艾叶的质量，艾叶非腺毛的数量和密度直接关系到艾绒的产率和质量，“艾绒”的主要来源为艾叶下表面的非腺毛。艾叶表皮的一些特征如毛被的类型和密度、气孔类型、气孔指数、表皮细胞的垂周壁式样等对于艾叶的鉴定有重要的参考价值，同时对研究其植物生态、植物生理及品种选育也有重要的作用。艾叶上表皮分布有腺毛和稀疏的非腺毛，用扫描电镜对上表皮进行观察比较容易；而下表皮密被非腺毛并覆盖了其下分布的腺毛、气孔和表皮细胞，因此使用扫描电子显微镜对也只能看到密集的非腺毛。用光学显微镜观察叶表皮特征通常采用的制片法有撕取表皮法、解离表皮法、透明制片法，然而，由于艾叶为纸质叶，叶片薄，其上、下表皮密布腺毛又处于凹陷处，因此撕取表皮和解离表皮都比较困难，即使能够成功分离出表皮，也会因下表皮密被非腺毛，光学显微镜下无法观察到气孔和表皮细胞等特征，同样，透明制片法也因艾叶下表皮密被的非腺毛无法看清下表皮的显微特征。由于受到现有制片技术的制约，目前无论是扫描电子显微镜还是光学显微镜都难以观察艾叶下表皮的气孔、表皮细胞的垂周壁式样以及腺毛和非腺毛的分布等显微特征，因此，至今为止，对艾叶的下表皮特征研究还不够深入。因此非常需要设计一种专门的艾叶下表皮特征的显微制片方法，来观察艾叶下表皮的特征，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，可有效解决用光学显微镜对艾叶下表皮的气孔、表皮细胞的垂周壁式样以及腺毛和非腺毛的分布进行观察的问题。
本发明解决的技术方案是，一种用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，包括以下步骤：
（1）叶片处理：取新鲜的艾叶片，剪取6—8mm小块，在甲醇中浸没处理6～10h；
（2）盐酸浸泡：将小块叶片从甲醇转移至质量浓度10%～15%的盐酸中，浸泡8～12h；
（3）分离叶肉漂白：将小块叶片取出，用蒸馏水漂洗1～3min，将小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度5%～10%氢氧化钠和2%～3%双氧水的混合液中，浸泡6～12h，解离叶肉组织，同时也将其漂白；
（4）除去非腺毛：将小块叶片转移至质量浓度28-32%的酒精中，除去叶表皮上的非腺毛；
（5）解离叶肉：再将小块叶片置入质量浓度10%铬酸和10%硝酸的混合液中（体积比1：1），静置6～10h，解离叶肉组织；
（6）分离上、下表皮：从混合液中取出小块叶片，质量浓度28-32%的酒精中漂洗1～3min，在酒精中分离上、下表皮，除去上、下表皮的内表皮的叶肉组织；
（7）染色：将上、下表皮用质量浓度40%～60%的碘化钠溶液透明0.5～1h，分别放在载玻片上，在上方滴加一滴（约0.02mL）甲苯胺蓝O溶液，染色1～3min；
所述的甲苯胺蓝O溶液为，甲苯胺蓝O用pH4.0的磷酸盐缓冲液溶解制成，甲苯胺蓝O的质量浓度0.1%～0.5%；
（8）封片：载玻片上的上、下表皮用水漂洗洗去浮色，水封片，即成用于普通光学显微观察艾叶下表皮特征的显微镜片。
本发明具有操作简单，成本低，工作量小，成功率高，观察清晰，效果好的特点。可以圆满解决艾叶下表皮观察的技术难题，对操作人员技术要求不高，即可到达理想的效果。
附图说明
图1为体视显微镜下艾叶下表面密被非腺毛观察图。
图2为本发明艾叶下表皮气孔观察图（甲苯胺蓝染色，低倍镜下用于气孔观察和计数，黑箭头示非腺毛毛基，白箭头示腺毛，亮视野下不显著）。
图3为本发明荧光显微镜下观察艾叶下表皮气孔、非腺毛毛基（黑箭头）、腺毛（白箭头）图。
图4为本发明高倍镜下观察艾叶下表面气孔、毛基（箭头）、表皮细胞图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明一种用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，包括以下步骤：
（1）叶片处理：取新鲜的艾叶片，剪取6—8mm小块，室温在甲醇中浸没处理6～10h；
（2）盐酸浸泡：用镊子将小块叶片从甲醇转移至质量浓度10%～15%的盐酸中，室温浸泡8～12h；
（3）分离叶肉漂白：将小块叶片取出，用蒸馏水漂洗1～3min，将小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度5%～10%氢氧化钠和2%～3%双氧水的混合液中，室温浸泡6～12h，解离叶肉组织，同时也将其漂白；
（4）除去非腺毛：将小块叶片转移至质量浓度28-32%的酒精中，用毛笔轻刷叶表皮，除去叶表皮上的非腺毛；
（5）解离叶肉：再将小块叶片置入质量浓度10%铬酸和10%硝酸的混合液中（体积比1︰1），室温静置6～10h，解离叶肉组织；
（6）分离上、下表皮：从混合液中取出小块叶片，质量浓度38-32%的酒精中漂洗1～3min，在酒精中用毛笔轻刷叶片表皮，分离上、下表皮，上、下表皮的内表皮分别用毛笔轻刷，除去叶肉组织；
（7）染色：将上、下表皮用质量浓度40%～60%的碘化钠溶液透明0.5～1h，分别放在载玻片上，在上方滴加一滴（约0.02mL）甲苯胺蓝O溶液，染色1～3min；
所述的甲苯胺蓝O溶液为，甲苯胺蓝O用pH4.0的磷酸盐缓冲液溶解制成，甲苯胺蓝O的质量浓度0.1%～0.5%；
（8）封片：载玻片上的上、下表皮用水漂洗洗去浮色，水封片，即成用于普通光学显微观察艾叶下表皮特征的显微镜片。
实施例2
本发明一种用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，包括以下步骤：
（1）叶片处理：取新鲜的艾叶片，剪取7mm小块，室温在甲醇中浸没处理8h；
（2）盐酸浸泡：用镊子将小块叶片从甲醇转移至质量浓度12.5%的盐酸中，室温浸泡10h；
（3）分离叶肉漂白：将小块叶片取出，用蒸馏水漂洗2min，将小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度7.5%氢氧化钠和2.5%双氧水的混合液中，室温浸泡9h，解离叶肉组织，同时也将其漂白；
（4）除去非腺毛：将小块叶片转移至质量浓度30%的酒精中，用毛笔轻刷叶表皮，除去叶表皮上的非腺毛；
（5）解离叶肉：再将小块叶片置入质量浓度10%铬酸和10%硝酸的混合液中（体积比1︰1），室温静置8h，解离叶肉组织；
（6）分离上、下表皮：从混合液中取出小块叶片，质量浓度30%的酒精中漂洗2min，在酒精中用毛笔轻刷叶片表皮，分离上、下表皮，上、下表皮的内表皮分别用毛笔轻刷，除去叶肉组织；
（7）染色：将上、下表皮用质量浓度45%的碘化钠溶液透明0.8h，分别放在载玻片上，在上方滴加一滴（约0.02mL）质量浓度0.3%甲苯胺蓝O溶液，染色2min；
（8）封片：载玻片上的上、下表皮用水漂洗洗去浮色，水封片，即成用于普通光学显微观察艾叶下表皮特征的显微镜片。
实施例3
本发明一种用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，包括以下步骤：
（1）叶片处理：取新鲜的艾叶片，剪取6mm小块，室温在甲醇中浸没处理6.5h；
（2）盐酸浸泡：用镊子将小块叶片从甲醇转移至质量浓度14%的盐酸中，室温浸泡9h；
（3）分离叶肉漂白：将小块叶片取出，用蒸馏水漂洗3min，将小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度6%氢氧化钠和2%双氧水的混合液中，室温浸泡12h，解离叶肉组织，同时也将其漂白；
（4）除去非腺毛：将小块叶片转移至质量浓度29%的酒精中，用毛笔轻刷叶表皮，除去叶表皮上的非腺毛；
（5）解离叶肉：再将小块叶片置入质量浓度10%铬酸和10%硝酸的混合液中（体积比1︰1），室温静置6.5h，解离叶肉组织；
（6）分离上、下表皮：从混合液中取出小块叶片，质量浓度29%的酒精中漂洗3min，在酒精中用毛笔轻刷叶片表皮，分离上、下表皮，上、下表皮的内表皮分别用毛笔轻刷，除去叶肉组织；
（7）染色：将上、下表皮用质量浓度50%的碘化钠溶液透明0.6h，分别放在载玻片上，在上方滴加一滴（约0.02mL）质量浓度0.2%甲苯胺蓝O溶液，染色3min；
（8）封片：载玻片上的上、下表皮用水漂洗洗去浮色，水封片，即成用于普通光学显微观察艾叶下表皮特征的显微镜片。
实施例4
本发明一种用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，包括以下步骤：
（1）叶片处理：取新鲜的艾叶片，剪取8mm小块，室温在甲醇中浸没处理9.5h；
（2）盐酸浸泡：用镊子将小块叶片从甲醇转移至质量浓度11%的盐酸中，室温浸泡12h；
（3）分离叶肉漂白：将小块叶片取出，用蒸馏水漂洗1min，将小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度9%氢氧化钠和3%双氧水的混合液中，室温浸泡6h，解离叶肉组织，同时也将其漂白；
（4）除去非腺毛：将小块叶片转移至质量浓度32%的酒精中，用毛笔轻刷叶表皮，除去叶表皮上的非腺毛；
（5）解离叶肉：再将小块叶片置入质量浓度10%铬酸和10%硝酸的混合液中（体积比1︰1），室温静置9.5h，解离叶肉组织；
（6）分离上、下表皮：从混合液中取出小块叶片，质量浓度32%的酒精中漂洗1.5min，在酒精中用毛笔轻刷叶片表皮，分离上、下表皮，上、下表皮的内表皮分别用毛笔轻刷，除去叶肉组织；
（7）染色：将上、下表皮用质量浓度55%的碘化钠溶液透明0.9h，分别放在载玻片上，在上方滴加一滴（约0.02mL）质量浓度0.4%甲苯胺蓝O溶液，染色1min；
（8）封片：载玻片上的上、下表皮用水漂洗洗去浮色，水封片，即成用于普通光学显微观察艾叶下表皮特征的显微镜片。
本发明制备方法科学合理，易操作，成功率高，观察准确，并经实验，效果非常好，以实施例2为例，经多次反复试用和实验，结果表明，先后用甲醇、盐酸以及氢氧化钠和双氧水混合液处理后，非腺毛很容易从艾叶下表皮除去，再用铬酸和硝酸混合液解离后，上、下表皮也很容易分离。碘化钠透明后再用甲苯胺蓝O染色，用普通光学显微镜可以清晰看到气孔、叶表皮和腺毛和非腺毛基细胞的分布。
在对实施例2实验的同时，对其他实施例也作出相同的实验，均取得了相同和近似的结果，这里不再一一列举。
按本发明方法对艾叶进行处理后，在光学显微镜下都能够清晰观察气孔、表皮细胞的垂周壁，用毛笔去除非腺毛的过程中，由于腺毛由于位于叶表皮的凹陷处，不会被去除掉，而非腺毛的基细胞仍然保留在表皮中，因此本制片技术也非常方便对腺毛和非腺毛的数量进行观察和统计，圆满解决了现有的技术问题，是申请人的独创。
因此，本发明建立了一种用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，解决了现有技术无法解决的制片问题，具有取材少，节约试剂，成本低，极易操作，观察清晰、可靠，一次性制片成功率可高达99%，很容易达到令人满意的观察目的，为对艾叶结构进行研究，保证艾叶生产质量和药用价值提供了可靠的技术支持，经济和社会效益显著。
Claims (4)
1.一种用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）叶片处理：取新鲜的艾叶片，剪取6-8mm小块，室温在甲醇中浸没处理6～10h；
（2）盐酸浸泡：用镊子将小块叶片从甲醇转移至质量浓度10%～15%的盐酸中，室温浸泡8～12h；
（3）分离叶肉漂白：将小块叶片取出，用蒸馏水漂洗1～3min，将小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度5%～10%氢氧化钠和2%～3%双氧水的混合液中，室温浸泡6～12h，解离叶肉组织，同时也将其漂白；
（4）除去非腺毛：将小块叶片转移至质量浓度28-32%的酒精中，用毛笔轻刷叶表皮，除去叶表皮上的非腺毛；
（5）解离叶肉：再将小块叶片置入质量浓度10%铬酸和10%硝酸体积比1：1的混合液中，室温静置6～10h，解离叶肉组织；
（6）分离上、下表皮：从混合液中取出小块叶片，质量浓度38-32%的酒精中漂洗1～3min，在酒精中用毛笔轻刷叶片表皮，分离上、下表皮，将上、下表皮的内表皮分别用毛笔轻刷，除去叶肉组织；
（7）染色：将上、下表皮用质量浓度40%～60%的碘化钠溶液透明0.5～1h，分别放在载玻片上，在上方滴加一滴甲苯胺蓝O溶液，染色1～3min；
所述的甲苯胺蓝O溶液为，甲苯胺蓝O用pH4.0的磷酸盐缓冲液溶解制成，甲苯胺蓝O的质量浓度0.1%～0.5%；
（8）封片：载玻片上的上、下表皮用水漂洗洗去浮色，水封片，即成用于普通光学显微观察艾叶下表皮特征的显微镜片。
2.根据权利要求1所述的用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）叶片处理：取新鲜的艾叶片，剪取7mm小块，室温在甲醇中浸没处理8h；
（2）盐酸浸泡：用镊子将小块叶片从甲醇转移至质量浓度12.5%的盐酸中，室温浸泡10h；
（3）分离叶肉漂白：将小块叶片取出，用蒸馏水漂洗2min，将小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度7.5%氢氧化钠和2.5%双氧水的混合液中，室温浸泡9h，解离叶肉组织，同时也将其漂白；
（4）除去非腺毛：将小块叶片转移至质量浓度30%的酒精中，用毛笔轻刷叶表皮，除去叶表皮上的非腺毛；
（5）解离叶肉：再将小块叶片置入质量浓度10%铬酸和10%硝酸体积比1：1的混合液中，室温静置8h，解离叶肉组织；
（6）分离上、下表皮：从混合液中取出小块叶片，质量浓度30%的酒精中漂洗2min，在酒精中用毛笔轻刷叶片表皮，分离上、下表皮，上、下表皮的内表皮分别用毛笔轻刷，除去叶肉组织；
（7）染色：将上、下表皮用质量浓度45%的碘化钠溶液透明0.8h，分别放在载玻片上，在上方滴加一滴质量浓度0.3%甲苯胺蓝O溶液，染色2min；
（8）封片：载玻片上的上、下表皮用水漂洗洗去浮色，水封片，即成用于普通光学显微观察艾叶下表皮特征的显微镜片。
3.根据权利要求1所述的用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）叶片处理：取新鲜的艾叶片，剪取6mm小块，室温在甲醇中浸没处理6.5h；
（2）盐酸浸泡：用镊子将小块叶片从甲醇转移至质量浓度14%的盐酸中，室温浸泡9h；
（3）分离叶肉漂白：将小块叶片取出，用蒸馏水漂洗3min，将小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度6%氢氧化钠和2%双氧水的混合液中，室温浸泡12h，解离叶肉组织，同时也将其漂白；
（4）除去非腺毛：将小块叶片转移至质量浓度29%的酒精中，用毛笔轻刷叶表皮，除去叶表皮上的非腺毛；
（5）解离叶肉：再将小块叶片置入质量浓度10%铬酸和10%硝酸体积比1：1的混合液中，室温静置6.5h，解离叶肉组织；
（6）分离上、下表皮：从混合液中取出小块叶片，质量浓度29%的酒精中漂洗3min，在酒精中用毛笔轻刷叶片表皮，分离上、下表皮，上、下表皮的内表皮分别用毛笔轻刷，除去叶肉组织；
（7）染色：将上、下表皮用质量浓度50%的碘化钠溶液透明0.6h，分别放在载玻片上，在上方滴加一滴质量浓度0.2%甲苯胺蓝O溶液，染色3min；
（8）封片：载玻片上的上、下表皮用水漂洗洗去浮色，水封片，即成用于普通光学显微观察艾叶下表皮特征的显微镜片。
4.根据权利要求1所述的用于观察艾叶下表皮特征的显微制片方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）叶片处理：取新鲜的艾叶片，剪取8mm小块，室温在甲醇中浸没处理9.5h；
（2）盐酸浸泡：用镊子将小块叶片从甲醇转移至质量浓度11%的盐酸中，室温浸泡12h；
（3）分离叶肉漂白：将小块叶片取出，用蒸馏水漂洗1min，将小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度9%氢氧化钠和3%双氧水的混合液中，室温浸泡6h，解离叶肉组织，同时也将其漂白；
（4）除去非腺毛：将小块叶片转移至质量浓度32%的酒精中，用毛笔轻刷叶表皮，除去叶表皮上的非腺毛；
（5）解离叶肉：再将小块叶片置入质量浓度10%铬酸和10%硝酸体积比1︰1的混合液中，室温静置9.5h，解离叶肉组织；
（6）分离上、下表皮：从混合液中取出小块叶片，质量浓度32%的酒精中漂洗1.5min，在酒精中用毛笔轻刷叶片表皮，分离上、下表皮，上、下表皮的内表皮分别用毛笔轻刷，除去叶肉组织；
（7）染色：将上、下表皮用质量浓度55%的碘化钠溶液透明0.9h，分别放在载玻片上，在上方滴加一滴质量浓度0.4%甲苯胺蓝O溶液，染色1min；
（8）封片：载玻片上的上、下表皮用水漂洗洗去浮色，水封片，即成用于普通光学显微观察艾叶下表皮特征的显微镜片。
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