CN104893994A - 长孢娄徳酵母及其富硒培养方法和应用 - Google Patents

长孢娄徳酵母及其富硒培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015301。该长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法，包括以下步骤：将上述的长孢娄徳酵母接种于所述YEPD培养基中培养，5％-10％接种量；于对数期6h，9h，12h时分3次加硒，硒在培养基中的终浓度为10-20μg/mL，培养24h-48h。本发明所述的长孢娄徳酵母，富硒效率高，富硒性能良好，具有生产有机硒的可行性，可作为富硒酵母菌株，在有机硒动物饲料添加剂的产品开发中具有良好应用前景。

Description

长孢娄徳酵母及其富硒培养方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种长孢娄徳酵母及其富硒培养方法和应用。
背景技术
硒是水产动物的必需微量元素之一，具有抗氧化，增强机体免疫能力，调节机体代谢，增强繁殖能力，降低某些重金属中毒等功能。硒缺乏会造成鱼的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性降低，机体抗氧化能力减弱，致使机体自由基堆积，防病抗病能力下降。硒能显著提高水产动物的生长，增强水产动物的抵抗力，并且有机硒的效果要优于无机硒。
酵母因为其生长速度快，培养方便，含有高达50％以上的蛋白质，更富含丰富的B族维生素(尤其是Bl，B2)和众多对人体有益的矿物质，而成为了应用最广泛最安全的营养微生物。对于一些微量营养元素，酵母还具有很强的富集作用，更能将有毒无机硒转化为被无毒易吸收的有机硒，与其他的一些无机硒相比，富硒酵母存在以下几点优势：1.利用率高；2.毒性低；3.营养价值高；4.硒含量高；5.生理活性高。因此利用酵母来富集硒是一个安全又高效的办法，所以富硒酵母渐渐成为了目前科研中的研究热点之一，目前实验室应用较多的有：假丝酵母、裂殖酵母和一些酿酒酵母。而针对宿主动物筛选的内源益生菌可以更好地竞争宿主肠道中的黏附位点，成为优势菌群并在停止摄入后具有持续定植功能。
作为富硒酵母，富硒效率是评价其富硒性能的基本指标，包括酵母的生物 量及有机硒的转化率，而从原料利用与转化上来看，富硒条件是直接影响酵母富硒效率的重要因素，因此确定富硒的最优发酵条件，可以有效地提高酵母的生物量及有机硒的转化率，综合提高富硒效率，对富硒酵母的产品开发及生产应用具有实际指导意义。
目前国内外常见的富硒酵母有酿酒酵母、汉逊酵母、假丝酵母等，细胞含硒量在650～2050μg/g之间。未见有关长孢娄徳酵母作为富硒酵母的相关研究的公开报导。
发明内容
基于此，本发明需要解决的技术问题之一是提供一种新的富硒长孢娄徳酵母。
解决上述技术问题的技术方案如下。
一种长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015301。
本发明需要解决的另一技术问题是提供上述长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法。
解决上述技术问题的技术方案如下。
长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法，包括以下步骤：
将长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)接种于所述YEPD培养基中培养，体积比百分比5％-10％的接种量；于对数期6h，9h，12h时分3次加硒，添加量分别为20-30％，20-30％，40-60％，使硒在YEPD培养基中终浓度为10-20μg/mL，28-37℃振荡培养24h-48h，得到富硒的长孢娄徳酵母 (Lodderomyces elongisporus)。
在其中一个实施例中，接种量为10％，培养时间为36h。
在其中一个实施例中，于对数期6h，9h，12h时分3次梯度加硒，添加量分别为25％，25％，50％，使硒在YEPD培养基中终浓度为20μg/mL。
本发明需要解决的另一技术问题是提供上述长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)的应用。
解决上述技术问题的技术方案如下。
上述保藏编号为CCTCC NO：M 2015301的长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)或者富硒的长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)在制备水产动物有机硒饲料添加剂中的应用。
在其中一个实施例中，所述水产动物为日本鳗鲡。
一种水产动物有机硒饲料添加剂，其活性物质含有上述长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)。
本发明所述的长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)已于2015年5月15日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection,简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，武汉大学)，保藏日期2015年5月15日，保藏编号CCTCC NO：M 2015301。
本发明提供了一种新的长孢娄徳酵母，富硒效率高，富硒性能良好，具有生产有机硒的可行性，可作为富硒酵母菌株，在有机硒动物饲料添加剂的产品开发中具有良好应用前景。
附图说明
图1加硒方式对SCLE01富集硒的影响的结果示意图；
图2为接种量对SCLE01富集硒的影响的结果示意图；
图3为培养时间对SCLE01富集硒的影响结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例1
实材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌种
本发明由发明人利用选择性培养基筛选分离自淡水鱼类肠道的长孢娄徳酵母，对其进行ITS序列和hsp78基因分析，鉴定结果表明该菌属于长孢娄德酵母，是一株新的长孢娄德酵母，其分类命名为Lodderomyces elongisporus，编号为SCLE01，并已于2015年5月15日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 2015301。
本发明所述的长孢洛德酵母SCLE01(L.elongisporus SCLE01，保藏号为CCTCC NO：M 2015301)菌株的形态学特征为：菌落呈乳白色，略粗糙，固 体培养基过夜培养后，菌落小0.5-1mm，表面比较光滑，边缘整齐，菌落隆起，致密度较高；在液体培养基中静置培养后，培养液澄清且有沉淀，并有菌蹼出现；显微镜观察显示菌体呈椭圆形。
以下保藏号为CCTCC NO：M 2015301的长孢娄徳酵母简称为SCLE01。
1.1.2培养基
YEPD：酵母粉(YE)1％,蛋白胨(P)2％,葡萄糖(D)2％。固体培养基添加1.5％的琼脂粉。
麦芽汁培养基(ME)：购自环凯微生物有限公司，固体培养基添加1.5％的琼脂粉。
1.1.3试剂与设备 
亚硒酸钠、变色酸、盐酸苯肼、高氯酸、氯化钾、盐酸、EDTA-2Na均为分析纯。
紫外-可见分光光度计(上海精科，UV 759)，洁净工作台(苏州安泰，SW-CJ)，台式高速离心机(德国Sigma，3-18K)，恒温鼓风干燥箱(上海齐欣，DHG-9070A)，调温电热板(常州澳华，DB-3C)，振荡培养箱(哈尔滨东联，HZQ-F160)。
1.2试验方法
1.2.1菌种活化
SCLE01菌株保种菌液2％接种量接种于YEPD液体培养基中，30℃，190rpm，24h，活化3次后备用。
1.2.2菌株鉴定
将SCLE01菌株纯化后富集，用生理盐水洗去培养基，加入小钢珠，用新芝高通量组织研磨机进行研磨破碎后利用天根细菌基因组试剂盒进行DNA提取，将提取的DNA进行ITS序列及hsp78序列扩增，并对扩增产物进行检测，将扩 增成功的PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果用NCBI-BLAST软件在GenBank数据中进行同源性检索。对测序结果进行分析。
ITS PCR扩增引物序列如下：
ITS1：5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3’(SEQ ID NO.1)
ITS4：5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3’(SEQ ID NO.2)
Hsp78PCR扩增引物序列如下：
LEhsp78-F：5’—TTGCTCCTCCAAGTGCT—3’(SEQ ID NO.3)
LEhsp78-R：5’—CAACCCAAACATCTCCC—3’(SEQ ID NO.4)。
长孢娄德酵母SCLE01经ITS1和ITS4引物扩增、测序、鉴定后获得了495bp的扩增产物，序列结果为(SEQ ID NO.5)：
CTTACTGCACTTTTCTTATCTACACACGTGTTTTTGTTTTATTCTTAAAACTTGCTTTGGCAGTGGCTGCTTAATTGCTCTGCTGCCAGAGGATAAACTCAACCTAAATTTTTTATTTTAAACTAGTCAACTGATTATATTTATTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGATGAGCAATACGCCAGGTTTGCTTGAAAGTTAGGAGGAGTATTTATAACAATGTATTAGGTCTAACCACTCCATTGTGCTTAATAAAAAGCTCCAATCTATATTTCAAACTTCGACCTCAAATCAGGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAA。
长孢娄德酵母SCLE01经LEhsp78-F和LEhsp78-R引物扩增、测序、鉴定后获得了453bp的扩增产物，序列结果为(SEQ ID NO.6)
ACAAGATTGATTTCAAAAACACAATTATTGTTCTTACATCGAATTTGGGACA ACAAATATTGTTTGATGATCCAAATGCTAGAGAAGACGGCAAAATTAATAAAGAGGTTAAAGACGCGGTATTGGAAAATCTCAAAAACCATTACCCACCCGAATTTCTCAATCGTTTAGACGAATGCCTTGTCTTTAACAGGTTATCTAAGCATTCACTTCGTGAGATTCTTGCCATCAAGTTAAGAGAGATTGACGATAGATTATCACTGAAACGTATTGTACTCGATGTTTCCGAAAAAGCAAAGAAGATTCTTACTCAAAAGGGTTATGATCCAGCGTATGGTGCAAGACCATTGAATCGTGTATTGGCCAAGGAGGTGTTGAACCCATTGGCCAGAATGTTGATTAGTGGACAAATCCAAGAAGGTGAAACAGCAAAAATTGTAGATAAAAGGGGAG。
实施例2
本实施例通过研究淡水鱼源长孢娄徳酵母的耐硒能力、富硒发酵条件以评价其富硒性能，通过单因素试验得出培养基加硒浓度、加硒方式、接种量和培养时间4因素的水平范围，为评价淡水鱼源长孢娄徳酵母作为富硒酵母菌株的可行性提供依据。
2.1生物量及硒含量测定方法
2.1.1生物量测定 
振荡培养完成后取培养液，6000rpm离心5min，菌体沉淀用蒸馏水洗涤3次，收集菌体，90℃干燥至恒重后称量。
2.1.2硒含量的测定 
Se(Ⅳ)能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子,继而与变色酸偶合成红色偶氮染料,生成的红色偶氮染料的吸光度与一定含量范围的硒成正比,利用紫外-可见分光光度计在520波长下测定其吸光度，用标准曲线法便可求得的硒酵母中的硒含量。
2.2耐硒性能的确定
向YEPD液体培养基中加入已灭菌的浓度为1mg/mL的Na2SeO3溶液，使培养基中的Na2SeO3浓度分别为0、10、20、30、40、50、90μg/mL。将实施例1所述活化好的SCLE01菌种按3％接种量接种，用装液量为50mL的250mL摇瓶，30℃振荡培养(190rpm)30h，观察菌体颜色，并测定SCLE01生物量及菌体硒含量，考察SCLE01的耐硒性能，初步确定最适加硒浓度。结果请参见表2-1
表2-1 SCLE01菌株的耐硒性能
硒浓度(μg/mL) 0 10 20 30 50 90
生物量(g/L) 11.22 6.72 6.09 2.51 1.37 0.91
硒含量(μg/g) 8.92 813.27 1103.69 932.58 918.61 963.19
菌体颜色 － － － + + +
注：+为红色，代表有红色单质硒出现；－为白色，代表无红色单质硒出现。
从表2-1可以看出，随着硒浓度的升高，SCLE01的生物量逐渐减少，当培养基硒浓度达到30μg/mL生物量只有2.51g/L，并且开始出现单质硒，因此，长孢娄徳酵母SCLE01的最大耐硒浓度为20μg/mL，为保证其生长不受抑制，同时获得较高的菌体硒含量，确定培养基中硒的终浓度在10-20μg/mL为适宜。
2.3硒添加方式的选择
根据初步确定的加硒浓度，设计5种硒添加方式，分别是方式1：培养初期(0h)一次性添加，方式2：对数生长期(6h)一次性添加，方式3：对数生长期(6h，12h)两次等量添加(50％，50％)，方式4：对数生长期(6h，9h，12h)三次添加(25％，25％，50％)，以及方式5：稳定期(20h)一次性添加。按3％接种量接种，用装液量为50mL的250mL摇瓶，30℃振荡培养(190rpm)30h， 测定SCLE01生物量及菌体硒含量，考察硒添加方式对SCLE01的生长及富硒过程的影响，初步确定最适加硒方式。实验结果参见图1。
由图1可看出，在对数生长期(6、8、12h)分3次加硒的方式，SCLE01的生物量最高，同时菌体硒含量也最高，达到700μg/g以上，因此，确定长孢娄徳酵母SCLE01的加硒方式为对数生长期(6、8、12h)3次添加。
2.4接种量的选择 
根据SCLE01菌株耐硒性能及硒添加方式的初步确定，以体积百分比为1％、2％、4％、5％、8％、10％的接种量接种，30℃振荡培养(190rpm)30h，测定SCLE01生物量及菌体硒含量，考察接种量对SCLE01的生长及富硒过程的影响，初步确定最适接种量。实验结果参见图2。
由图2可看出，接种量为1％时，生物量较低，不利于酵母对硒的吸收与转化，所以硒含量也较低。与前面两个因素相比，接种量对SCLE01的硒含量影响较小，2％-10％的接种量硒含量都在600μg/g以上，其中5％、8％和10％的接种量SCLE01的生物量较高，因此，长孢娄徳酵母SCLE01的接种量适宜范围是5％-10％。
2.5培养时间的选择
根据初步确定的加硒浓度、加硒方式、接种量，将SCLE01菌株分别培养24h、36h、48h、60h，测定SCLE01生物量及菌体硒含量，考察培养时间对SCLE01的生长及富硒过程的影响，初步确定最适培养时间。实验结果参见图3。
由图3可知，随着培养时间的增加，SCLE01的生物量和富硒量都逐渐升高。培养至36h时酵母的硒含量和生物量最高，随后继续培养开始降低。因此，长孢娄徳酵母SCLE01的培养时间范围确定为24-48h。
2.6富硒最优组合验证试验
根据上述实验确定的长孢娄徳酵母SCLE01最优发酵条件进行验证试验。
根据单因素试验对SCLE01菌株的富硒培养条件进行优化，用优化后的条件(50mL/250mL装液量，30℃，190rpm振荡频率，10％接种量，加硒浓度20μg/mL，于对数期分3次(6h，9h，12h时)添加，每次添加量为25％，25％，50％，培养36h)进行发酵培养，结果见表4。
表2-2 SCLE01最优组合验证试验结果(均值±标准误，n＝3)
实施例3
3.1试验材料
本试验所用酵母菌为已经分离、鉴定的淡水鱼类肠道源菌株：长孢娄徳酵母(SCLE01，保藏号CCTCC NO.M 2015301)。日本鳗鲡幼鱼及全价饲料(作为基础饲料)购自东莞市银华鳗鱼养殖有限公司。溶菌酶(LZM)购自南京建成生物工程研究所。
3.2试验方法
3.2.1富硒酵母制备 
根据前期试验结果制备富硒酵母，具体条件如下：10％接种量，加硒浓度20μg/mL(在培养基中的终浓度)，于对数期分3次(6h，9h，12h时)加入，依次加入的量为25％，25％，50％，30℃，190rpm振荡培养36h,得到富硒长孢娄徳酵母。然后测定富硒酵母的生物量及菌体硒含量，并计算转化率。生物量测定方法为：培养完成后取培养液，6000rpm离心5min，菌体沉淀用蒸馏水 洗涤3次，收集菌体，90℃干燥至恒重后称量。硒含量的测定根据Se(Ⅳ)能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子,继而与变色酸偶合成红色偶氮染料,生成的红色偶氮染料的吸光度与一定含量范围的硒成正比的原理利用紫外-可见分光光度计在520波长下测定其吸光度，用标准曲线法便可求得的硒酵母中的硒含量。
3.2.2养殖试验设计 
240尾鳗鲡，随机分为4个试验组，分别为低硒酵母组、高硒酵母组、空白组和酵母对照组，每组3个平行，每平行20尾。其中低硒酵母组投喂添加富硒酵母，使最终有机硒含量为0.21mg/kg的基础饲料；高硒酵母组投喂添加富硒酵母，使最终有机硒含量为0.42mg/kg的基础饲料；空白组仅投喂基础饲料；酵母对照组投喂添加终浓度为109cfu/g普通长孢娄德酵母的基础饲料。每日投喂2次(9:00和17:00)，日投喂量控制在体重的2～4％，根据上次摄食情况进行调整。试验持续60天，试验期间,每天换水一次，换水量1/6，水温在20～22℃，全天充气，溶氧含量在5.00mg/L以上，pH 7.5-8.5之间，总氨氮小于0.5mg/L。
3.2.3生长性能分析 
分别于试验开始时和第60天称量鳗鲡体重，计算增重率计算公式如下：
增重率(WGR,％)＝(Wt－W0)×100/W0
式中，Wt为终末体质量(g)，W0为初始体质量(g)，。
3.2.4溶菌酶活性检测
于试验的第60天随机抽取3尾鳗鲡，采集血液，室温放置1h，1500×g 4℃离心10min分离血清，-80℃保存。采用南京建成生物工程研究所试剂盒检测上述样品的溶菌酶活性水平。
3.2.6数据处理
试验数据采用SPSS l3.0软件分析，方差齐性时进行Duncan多重比较，方 差非齐性则采用Tamhane’S T2法进行方差分析。
3.2结果
3.2.1富硒酵母发酵结果
本实施例制备的富硒酵母的生物量为7.02±0.18g/L，菌体硒含量为1632μg/g，其中有机硒含量为1566μg/g，有机硒转化率为95.96±0.22％。
3.2.2长孢娄德酵母、富硒酵母对鳗鲡生长性能的影响
饲料中添加较高硒含量的富硒长孢娄德酵母会显著提价鳗鲡的增重率，提高百分比为134.88％，但是，饲料中添加较低硒含量的娄德酵母和无硒的娄德酵母喂养鳗鲡，在60天的试验期内，不会显著影响鳗鲡的增重率。(表3.1)。
表3.1富硒益生菌对鳗鱼生长性能的影响
注：数据为平均值±标准误，同列比较，上标字母不同表示有显著差异，(P＜0.05)。
3.3.3娄德酵母、富硒娄德酵母对鳗鲡血清溶菌酶水平的影响
投喂高硒含量富硒酵母60天后鳗鲡血清溶菌酶活性提高了129.63％，与低硒酵母组和空白组，无硒酵母对照组相比，具有统计学上的显著性，而饲料添加低硒含量酵母和无硒酵母则对鳗鲡血清溶菌酶活性无显著影响。(表3.2)。
表3.2
  低硒酵母组 高硒酵母组 空白组 酵母对照组
溶菌酶活性 257.51±45.58a 350.92±35.40b 270.70±39.15a 264.10±48.06a
[0110] 注：数据为平均值±标准误，同行比较，上标字母不同表示有显著差异，(P＜0.05)。
实施例4
4.1试验材料
本试验所用酵母菌为淡水鱼类肠道源菌株：长孢娄徳酵母(SCLE01，保藏号CCTCC NO：M 2015301)。吉富罗非鱼幼鱼购自罗非鱼良种场，基础饲料配方见表4.1。
表4-1 基础饲料组成(风干基础)
每千克基础饲粮中硒的实测值Measured value of selenium content of per kg basal diets：0.250mg。
4.2试验方法
4.2.1富硒酵母制备 
同实施例3。
4.2.2养殖试验设计 
吉富罗非鱼600尾，平均体重11.8±0.22g，暂养7d后开始饲养实验，实验共70d。按照硒添加量不同，试验分5组，分别为0.0mg/kg(0)、酵母菌(A)、0.4mg/kg(B)、0.6mg/kg(C)、0.8mg/kg(D)，每组3个重复，每个重复40尾鱼。其中，0组饲喂基础饲料，A、B、C、D各组饲喂基础饲料中添加总菌数相同，但娄德酵母和富硒娄德酵母比例不同的饲料。试验在1m×0.6m×0.8m网箱中进行，每组网箱置于2m×2m×1m的室外水泥池，总水体量为3.5m3。每日投喂2次(9:00和17:00)，，饱饲量投喂。试验期隔日每池换水1/10，用电加热棒控温，保持水温25℃左右，24h气泵充气，使溶氧含量在5.00mg/L以上，pH 7.5-8.5之间，总氨氮小于0.5mg/L。
4.2.3生长性能分析 
分别于试验开始时和第70天称量罗非鱼体重，计算特定生长率公式如下：
特定生长率(SGR,％)＝(lnWt－lnW0)×100/t
式中，Wt为终末体质量(g)，W0为初始体质量(g)，t为饲养天数。
4.2.4数据处理
试验数据采用SPSS l3.0软件分析，方差齐性时进行Duncan多重比较，方 差非齐性则采用Tamhane’S T2法进行方差分析。
4.3试验结果
由表4-2可知：饲养70d后，添加酵母、0.4mg/kg、0.6mg/kg组的特定生长率均显著高于0.0mg/kg和0.8mg/kg组(P<0.05)，其中以0.6mg/kg组最高，表明在饲养罗非鱼时使用0.6mg/kg硒的添加量较适合，只添加娄德酵母对罗非鱼的生长也有一定的促进作用。
表4-2 罗非鱼特定生长率
注：同列中数值中无相同字母表示存在显著差异(P<0.05)。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015301。
2.一种长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)的富硒培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述的长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)接种于所述YEPD培养基中培养，体积百分比5％-10％的接种量；于对数期6h，9h，12h时分3次加硒，添加量分别为20-30％，20-30％，40-60％，使硒在YEPD培养基中终浓度为10-20μg/mL，28-37℃振荡培养24h-48h，得到富硒的长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)。
3.根据权利要求2所述的富硒培养方法，其特征在于，接种量为10％，培养时间为36h。
4.根据权利要求2或3所述的富硒培养方法，其特征在于，于对数期6h，9h，12h时分3次加硒，添加量分别为25％，25％，50％，使硒在YEPD培养基中终浓度为20μg/mL。
5.由权利要求2-4任一项所述富硒培养方法得到的富硒的长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)。
6.权利要求1所述的长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)或权利要求5所述的富硒的长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)在制备水产动物有机硒饲料添加剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水产动物为鳗鲡或罗非鱼。
8.一种水产动物有机硒饲料添加剂，其特征在于，其活性物质含有权利要求书1所述的长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)或权利要求5所述的富硒的长孢娄徳酵母(Lodderomyces elongisporus)。
9.根据权利要求8所述的水产动物有机硒饲料添加剂，其特征在于，所述水产动物为鳗鲡或罗非鱼。
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