CN109566271B - 一种用于培养野生卷边网褶菌母种的培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于培养野生卷边网褶菌母种的培养基，该培养基包括以下质量的组分：可溶性淀粉15~25 g，蛋白胨2~6 g，KH₂PO₄1~5 g，MgSO₄0.5~4.5 g，水1 L，pH 2~6。使用该培养基培养野生卷边网褶菌母种，具有菌丝体萌发早、生长速度快、长势好、菌丝生物量高和生产周期短等优点，掌握了该菌的生物学特性，为进一步开发其应用价值及人工驯化栽培奠定了基础。该菌母种的成功培养也为药用成分开发利用和教学科研提供了新的种质资源，具有很大的经济价值和社会效益。

Description

一种用于培养野生卷边网褶菌母种的培养基

技术领域

本发明属于食药用真菌培养技术领域，特别涉及一种用于培养野生卷边网褶菌母种的培养基。

背景技术

卷边网褶菌[Paxillus involutus(Batsch)Fr.]在分类学上属于担子菌门(Basidiomycota)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、网褶菌科(Paxillaceae)、网褶菌属(Paxillus)。中文别名卷边(缘)桩菇、卷伞菌、卷缘网褶菌、落褶菌等。分布于河北、北京、吉林、黑龙江、辽宁、福建、山西、宁夏、安徽、湖南、广东、四川、云南、贵州、西藏等地。单生或群生于树桩上，或由地下的树桩而破土成丛。夏、秋多生在杨树(卯晓岚,陈玉梅,何俭.呼伦贝尔采菇行[J].食用菌,1987,(3):1～2)、栎树和桦木等林下木桩上。与杨、柳、落叶松、云杉、松、桦、山毛榉、栎等树木形成菌根。在杨树林地生长卷边网褶菌之后，常伴随杨口蘑(Tricholomapopulinum J.Lange)的发生，形成卷边网褶菌在外缘，杨口蘑在内缘，不断向外扩展的蘑菇圈景观(马汝武,赵有来,刘纪书.杨口蘑病害观察[J].森林病虫通讯,1988,1:15～16)。

卷边网褶菌含褐色色素，伤处变褐棕色，虽记载有毒(刘春光.鞍山地区常见毒蘑菇分布及中毒情况分析[J].中国公共卫生,2000,16(7):632)或生吃有毒(马启明.铁岭地区的食用蘑菇[J].中国食用菌,1986,3(14):23～24,49；马庭杰,马文惠.黄山和大别山区有毒大型真菌初探[J].食用菌,1988,(1):6)，出现胃肠道病症(刘春光.鞍山地区常见毒蘑菇分布及中毒情况分析[J].中国公共卫生,2000,16(7):632)，但在我国北方不少地区却广泛采食(卯晓岚,陈玉梅,何俭.呼伦贝尔采菇行[J].食用菌,1987,(3):1～2)。此种在苏联被大量腌制后食用，在中欧、柏林附近也食用，但在德国、波兰等地曾引起食用者中毒(应建浙.菌蕈拾零[J].食用菌,1981,(2):48～49)。有的资料也把它划为食用菌(陈应山,陈国卿,李春燕.沈阳地区主要食用菌的生态观察[J].食用菌,1988,(3):5；马启明,王德源.崂山野生食菌和毒菇初报[J].食用菌,1984,(4):7)。因此，国内学者把它列入“食—毒”范围(刘春光.鞍山地区常见毒蘑菇分布及中毒情况分析[J].中国公共卫生,2000,16(7):632)。此种是“舒筋散”中药的成分之一，有治腰腿疼痛、手足麻木、祛风散寒、舒筋活络的功效。

近年来，野生食用菌以其丰富的营养物质，独特的风味特征和特殊的食药用价值受到人们的喜爱和关注，逐渐成为现代社会天然健康食品的主流(贺沛芳,杨怀民,张治家等.五台山野生食用菌资源营养价值及展望[J].中国食用菌,2010,29(3):7～9)，为了更好的了解、保护、开发野生食用菌资源，有必要对该种进行鉴定，掌握该菌的生物学特性。目前内转录间隔区ITS(internal transcribed spacer)基因序列是鉴定野生菌的有效方法。而对于卷边网褶菌的研究仅停留在八十年代对可食性、生态观察的层面上(陈应山,陈国卿,李春燕.沈阳地区主要食用菌的生态观察[J].食用菌,1988,(3):5)，偶有少量形态描述(托马斯·莱瑟斯.蘑菇[M].中国友谊出版社,2008,35)。但至今有关野生卷边网褶菌的生物学特性试验及人工驯化栽培研究尚未见报道，并且卷边网褶菌在普通培养基中生长缓慢、菌丝获得量较少，大大限制了卷边网褶菌的产业发展和教学科研，因此，对野生卷边网褶菌母种的培养基进行研究具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的空白，本发明的目的在于提供一种用于培养野生卷边网褶菌母种的培养基，解决野生卷边网褶菌不能进行人工培养，大大限制了其产业发展和教学科研的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于培养野生卷边网褶菌母种的培养基，包括以下质量的组分：可溶性淀粉15～25g，蛋白胨2～6g，KH₂PO₄1～5g，MgSO₄0.5～4.5g，水1L，pH 2～6。本发明针对卷边网褶菌在普通培养基中生长缓慢、菌丝获得量较少，无法实现人工培养的技术问题，而提供了一种用于培养野生卷边网褶菌母种的培养基，具体地，本发明培养基中矿质营养元素的种类选择更加适合于野生卷边网褶菌母种生长，更能保证野生卷边网褶菌菌丝生长需求，且本发明培养基中通过氮、磷、钾、镁之间的协同配伍作用，能够满足卷边网褶菌菌丝体生长在营养上和生理上的要求，能够促进菌丝体的生长，增加菌丝量，实现了野生卷边网褶菌菌丝体的人工培养。

采用上述的培养基对野生卷边网褶菌母种进行培养，具体包括以下步骤：

1)无菌环境下，切取野生卷边网褶菌子实体内部组织块0.3cm左右接种于PDA斜面培养基中央部位，塞好橡胶塞，标记好菌种名称、接种日期，并将其置于25～27℃的培养箱中暗光培养3～5d后，从所述组织块萌发出棕褐色绒毛状菌丝，待菌丝长到离所述组织块2～3cm时，挑取边缘菌丝转接于空白的PDA斜面培养基中，待菌丝长满试管，即获得纯化的野生卷边网褶菌母种，保存于4℃冰箱，备用；

2)将纯化的野生卷边网褶菌母种接种在PDA斜面平板培养基中，25～27℃下暗光培养，待菌丝铺满整个平板，即得到活化好的菌种；

3)用打孔器取步骤2)活化好的菌种接种到上述用于培养野生卷边网褶菌母种的培养基中，在黑暗条件下，于25～27℃，静止培养15～20d。

优选的，所述野生卷边网褶菌母种的培养温度为25℃。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的培养基用于培养野生卷边网褶菌母种，具有菌丝体萌发早、生长速度快、长势好、菌丝生物量高和生产周期短等优点，培养20d菌丝鲜重高达675mg，干重80mg，显著的提高了菌丝量，该培养基配料均为常见化合物，廉价易得，成本低，制备方法简便。本发明实现了野生卷边网褶菌菌丝体的人工培养，符合产业化生产要求，为卷边网褶菌驯化栽培及品种改良提供一条有效途径，具有良好的应用前景。

2、本发明以野生卷边网褶菌子实体为试材，经子实体组织分离、纯化培养获得母种，通过单因素试验和正交组合试验相结合的方法，对影响菌丝生长的主要营养物质种类(碳源和氮源)进行了筛选，对其添加量(碳源、氮源和无机盐)、培养基的酸碱度和培养温度进行了定量优化，开发出野生卷边网褶菌母种培养的最适培养基配方，确定了该菌的最适培养温度，该方法具有易操作，培养程序简单等优点。通过该方法掌握了该菌的生物学特性，为进一步开发其应用价值及人工驯化栽培奠定了基础，该菌母种的成功培养也为药用成分开发利用和教学科研提供了新的种质资源，具有很大的经济价值和社会效益。

附图说明

图1为不同碳源对野生卷边网褶菌菌丝生长的影响；

图2为不同氮源对野生卷边网褶菌菌丝生长的影响；

图3为不同培养温度对野生卷边网褶菌菌丝生长的影响；

图4为不同酸碱度对野生卷边网褶菌菌丝生长的影响；

图5为正交试验筛选多因素对野生卷边网褶菌菌丝生长的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。实施例中所述原料如无特殊说明，即为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

子实体组织分离纯化培养基(PDA)：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，水1L，pH自然。

无碳基础培养基：KH₂PO₄1.0g，MgSO₄0.5g，蛋白胨2g，琼脂18g，水1L，pH自然。

无氮基础培养基：葡萄糖20g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄0.5g，琼脂18g，水1L，pH自然。

本实施例中所用的野生卷边网褶菌子实体采集于黑龙江省牡丹江市黑龙江农业经济职业学院云杉(Picea asperata Mast.)树林内。

野生卷边网褶菌子实体：

菌盖半球形，平展或中央下凹近漏斗状，边缘内卷，直径4～15cm。幼菇菌盖表面微粘，成熟后干燥，中央多成龟裂状。菌盖多绒至平滑，黄至红褐色。菌肉厚，黄褐色，伤后变红变褐黑色。菌褶延生，黄褐色，伤后初转红再转黑褐色。菌柄圆柱状，上下同粗，长4～8cm，直径1～2cm，表面光滑，颜色同菌盖，实心。子实体有特异性气味。

一、分离鉴定

1、菌种分离

采用子实体组织分离方法分离菌种，分离培养8～10d后，挑取新生长出的菌丝作为接种块接种于PDA培养基中间进行纯化培养，于25℃恒温培养箱中培养2周，置于4℃冰箱保存，备用。

2、基因组DNA提取

纱布过滤收集菌丝体，并用无菌去离子水冲洗，用无菌滤纸吸掉水分。采用ZRFungal/Bacterial DNAKitTM试剂盒提取卷边网褶菌全基因组DNA。

3、检测

以卷边网褶菌全基因组DNA为模板，来扩增卷边网褶菌的rDNA ITS区序列。

PCR的扩增体系为：10×Buffer 5μL，25mmol/LMgCl₂4μL，4mmol/L dNTPs 3μL，5U/μLTaq DNApolymerase 0.5μL，10μmol/L通用引物各2μL，全基因DNA模板2μL，ddH₂O 31.5μL，反应总体积为50μL。

扩增条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30个循环；最后于72℃补平8min，终止温度为4℃。

所述采用真菌通用引物如下：

ITS5:5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′；

ITS4:5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′。

扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，产物和Marker上样量均为5μL，电泳结果于Bio-Rad凝胶成像系统成像。PCR产物送华大基因(北京)公司测序。

将测序获得的序列通过NCBI进行Blast，分析同源性。当物种的rDNAITS区序列与比对的序列同源性≥99％时，可认为相同种；同源性在95～99％为相同属；同源性≤95％为相同科(雷琼,汪俭,范晓丹,等.1株野生大型食用菌的分子鉴定与同源性分析[J].长江大学学报(自然科学版),2013,10(35):52-55,68)。

结果显示：该野生菌与卷边网褶菌(Paxillus involutus)有99％的同源性，确定该株野生菌为卷边网褶菌。

二、野生卷边网褶菌母种培养基的优化

采用Microsoft Excel 2010软件绘图，IBM SPSS软件进行方差分析。数据均为3次重复试验平均值，其中菌丝生长速度(mm/d)＝菌落半径(mm)/菌丝生长天数(d)。

1、野生卷边网褶菌菌种分离：采用子实体组织分离菌种并进行纯化培养，所用培养基为PDA。具体操作为用无菌解剖刀切取野生卷边网褶菌子实体内部无菌区域0.3cm左右大小的组织块接种于试管斜面培养基的中部，整个操作过程应严格按照无菌操作，接种后置于25℃恒温箱中培养3～5d可见从组织块萌发出棕褐色绒毛状菌丝，待菌丝长到离组织块2～3cm时，挑取边缘菌丝转接于空白的斜面培养基上，转管1～2次可获得纯化的母种。菌丝体长满斜面需15～20d，满管后将菌种置于4℃冰箱中保存，备用。

2、野生卷边网褶菌母种培养最适碳源筛选：分别以等量(wt 2％)的麦芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖和葡萄糖加入到无碳基础培养基中(KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄0.5g，蛋白胨2g，琼脂18g，水1L，pH自然)配制固体培养基，对母种培养基中碳源进行单因素筛选试验，各设4个重复，在25℃下恒温培养野生卷边网褶菌母种20d。接种2d后开始记录菌丝生长速度，观察记录菌落培养性状、生长势。结果如表1和图1所示。

表1不同碳源对卷边网褶菌菌丝生长的影响

注：+表示菌丝稀疏、生长势较弱；++表示菌丝较密、生长势较强；+++表示菌丝浓密、生长旺盛；*差异显著性(0.05)。

从图1可以看出，卷边网褶菌菌丝在不同碳源培养基上均能生长，颜色因培养基种类不同而不同，呈浅黄至黄褐色；当P值在0.05水平上，菌丝的日均生长速度差异显著(表1)，卷边网褶菌在以可溶性淀粉或葡萄糖为碳源的培养基上日均长速最快，菌丝浓密，长势强；其次是以甘露醇为碳源的培养基，菌丝浓密、生长整齐，且无污染，与以玉米粉或蔗糖为碳源的培养基上的菌丝日均长速差异不显著；而在无碳基础培养基(CK)上长速最慢，菌丝稀疏、颜色浅，长势弱。可见，卷边网褶菌菌丝生长对碳源的需求量较大，且来源广泛。在供试碳源中，菌丝生长的最适碳源为可溶性淀粉、葡萄糖，其次是甘露醇。

3、野生卷边网褶菌母种培养最适氮源筛选：分别以等量(wt 0.2％)的牛肉膏、麦麸、硫酸铵、酵母膏、黄豆粉和蛋白胨加入到无氮基础培养基中(葡萄糖20g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄ 0.5g，琼脂18g，水1L，pH自然)配制固体培养基，对母种培养基中氮源进行单因素筛选试验，各设4个重复，在25℃下恒温培养野生卷边网褶菌母种20d。接种2d后开始记录菌丝生长速度，观察记录菌落培养性状、生长势，结果如表2和图2所示。

表2不同氮源对卷边网褶菌菌丝生长的影响

注：+表示菌丝稀疏、生长势较弱；++表示菌丝较密、生长势较强；+++表示菌丝浓密、生长旺盛；*差异显著性(0.05)。

从图2可以看出，卷边网褶菌菌丝在不同氮源培养基上均能生长，颜色因培养基种类不同而呈浅黄至黄褐色，并有不同程度的褐色素分泌。当P值在0.05水平上，菌丝的日均生长速度差异显著(表2)，其中在以蛋白胨为氮源的培养基上日均长速最快，菌丝浓密，粗壮、边缘生长整齐，且整个培养过程均未感染杂菌；其次是以麦麸为氮源的培养基，菌丝日均长速为0.743mm·d^-1，但菌丝较稀疏，且有一皿感染杂菌，与以黄豆粉或牛肉膏为氮源的培养基菌丝日均长速差异不显著；在以酵母膏为氮源的培养基上菌丝生长浓密，但长速较慢，且污染严重，不适合做氮源。而在无氮基础培养基(CK)上长速最慢，菌丝稀疏、颜色浅。可见，卷边网褶菌菌丝生长对氮源的需求种类较严格。在供试氮源中，菌丝生长的最适氮源为蛋白胨。

4、野生卷边网褶菌菌丝生长最适培养温度测定：将野生卷边网褶菌母种接种于含有可溶性淀粉和蛋白胨的培养基中，接种后分别置于21℃、23℃、25℃、27℃、29℃和31℃的恒温培养箱中暗培养20d，每个处理各设4个重复，接种2d后开始记录菌丝生长速度，观察记录菌落培养性状、生长势，确定菌丝生长的最适温度，结果如表3和图3所示。

表3不同温度对卷边网褶菌菌丝生长的影响

注：+表示菌丝稀疏、生长势较弱；++表示菌丝较密、生长势较强；+++表示菌丝浓密、生长旺盛；*差异显著性(0.05)。

从图3可以看出，卷边网褶菌在21～29℃范围内均能生长，其中25℃条件下长速最快，长势最好，且与其它温度处理的菌丝日均长速差异显著(表3)。温度为31℃条件下，卷边网褶菌菌丝不生长，说明卷边网褶菌菌丝生长对温度要求严格，过高过低均不利，且适宜生长温度范围却较窄。

5、野生卷边网褶菌菌丝生长最适pH测定：采用1mol/L HCl或1mol/L NaOH溶液，将含有最适碳源(可溶性淀粉)和氮源(蛋白胨)的液体培养基调配pH为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0共12个处理，每250mL三角瓶装液量为30mL，每个处理各设4个重复，于25℃恒温培养箱中静止培养16d。测量菌丝干重并记录菌丝培养特性。结果如表4和图4所示。

表4不同酸碱度对卷边网褶菌菌丝生长的影响

注：+表示菌丝稀疏、生长势较弱；++表示菌丝较密、生长势较强；+++表示菌丝浓密、生长旺盛；*差异显著性(0.05)。

从图4可以看出，卷边网褶菌菌丝在不同pH梯度的培养基中长势差异明显，发酵液颜色变化明显；从表4可以看出，当培养基的pH在2.0～6.0范围内均能生长，以pH为4.5长势最好，菌丝干重显著高于其它处理，且与pH为3.0～5.0之间的培养基的菌丝干重差异不显著；当培养基pH大于5.0时菌丝长速逐渐减慢，菌丝生物量减少，当培养基的pH在6.5～8.0范围内菌丝基本不生长，说明卷边网褶菌菌丝喜欢偏酸性环境条件，且适宜生长的酸碱度范围较窄。

6、野生卷边网褶菌母种培养最适碳源、氮源、无机盐最佳用量确定：从碳源(可溶性淀粉)、氮源(蛋白胨)、无机盐(KH₂PO₄和MgSO₄)这4个因素中各选出3个水平，进行四因素三水平的正交试验，如表5所示。按照正交表进行不同组合培养基的制作，灭菌前用1mol/LHCl或1mol/L NaOH溶液调节培养液pH 4.5，每250mL三角瓶装液量为50mL，常规接种后于25℃恒温培养箱中培养20d，测量菌丝干重并记录菌丝培养特性，结果如图5所示。

表5正交实验表

从图5可以看出，卷边网褶菌菌丝在上述可溶性淀粉、蛋白胨、KH₂PO₄和MgSO₄各用量组合的培养基中长势良好，菌丝及发酵液颜色变化不明显。由正交试验优化的菌体培养的最佳组合为：A₂B₁C₂D₃，即可溶性淀粉20g，蛋白胨2g，KH₂PO₄ 3.0g，MgSO₄ 4.5g，水1L，pH4.5。

实施例1

本实施例用于野生卷边网褶菌母种培养的培养基：可溶性淀粉20g，蛋白胨2g，KH₂PO₄ 3.0g，MgSO₄ 4.5g，水1L，pH 4.5。

1)无菌环境下，切取野生卷边网褶菌子实体内部组织块0.3cm左右接种于PDA斜面培养基中央部位，塞好橡胶塞，标记好菌种名称、接种日期，并将其置于25℃培养箱中暗光培养3～5d后，从所述组织块萌发出棕褐色绒毛状菌丝，待菌丝长到离组织块2～3cm时，挑取边缘菌丝转接于空白的PDA斜面培养基上，待长满试管时，即获得纯化的野生卷边网褶菌母种；

2)将纯化的野生卷边网褶菌母种接种在PDA平板培养基中，25℃下暗光培养，待菌丝铺满整个平板，即得活化好的菌种；

3)用打孔器在步骤2)活化好的菌种中取一圆状菌块，并将其接种到装有本实施例培养基的三角瓶中，每250mL三角瓶装液量为50mL，设4个重复，在黑暗条件下，于25℃，静止培养20d。

采用上述培养基和条件培养野生卷边网褶菌母种，结果显示：菌丝橙黄色，长势很强，菌丝浓密，边缘生长较齐，发酵液橙黄色，菌丝鲜重为675mg，干重为80mg，实现了野生卷边网褶菌菌丝体的人工培养，符合产业化生产要求。

实施例2

本实施例用于野生卷边网褶菌母种培养的培养基：可溶性淀粉15g，蛋白胨2g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄ 0.5g，水1L，pH 4.5。

1)无菌环境下，切取野生卷边网褶菌子实体内部组织块0.3cm左右接种于PDA斜面培养基中央部位，塞好橡胶塞，标记好菌种名称、接种日期，并将其置于25℃培养箱中暗光培养3～5d后，从所述组织块萌发出棕褐色绒毛状菌丝，待菌丝长到离组织块2～3cm时，挑取边缘菌丝转接于空白的PDA斜面培养基上，待长满试管时，即获得纯化的野生卷边网褶菌母种；

2)将纯化的野生卷边网褶菌母种接种在PDA平板培养基中，25℃下暗光培养，待菌丝铺满整个平板，即得活化好的菌种；

3)用打孔器在步骤2)活化好的菌种中取一圆状菌块，并将其接种到装有本实施例培养基的三角瓶中，每250mL三角瓶装液量为50mL，设4个重复，在黑暗条件下，于25℃，静止培养20d。

采用上述培养基和条件培养野生卷边网褶菌母种，结果显示：菌丝橙黄色，长势很强，菌丝浓密，边缘生长较齐，发酵液橙黄色，菌丝鲜重为640mg，干重为42.5mg，实现了野生卷边网褶菌菌丝体的人工培养，符合产业化生产要求。

实施例3

本实施例用于野生卷边网褶菌母种培养的培养基：可溶性淀粉15g，蛋白胨4g，KH₂PO₄ 3.0g，MgSO₄ 1.5g，水1L，pH 4.5。

1)无菌环境下，切取野生卷边网褶菌子实体内部组织块0.3cm左右接种于PDA斜面培养基中央部位，塞好橡胶塞，标记好菌种名称、接种日期，并将其置于25℃培养箱中暗光培养3～5d后，从所述组织块萌发出棕褐色绒毛状菌丝，待菌丝长到离组织块2～3cm时，挑取边缘菌丝转接于空白的PDA斜面培养基上，待长满试管时，即获得纯化的野生卷边网褶菌母种；

2)将纯化的野生卷边网褶菌母种接种在PDA平板培养基中，25℃下暗光培养，待菌丝铺满整个平板，即得活化好的菌种；

3)用打孔器在步骤2)活化好的菌种中取一圆状菌块，并将其接种到装有本实施例培养基的三角瓶中，每250mL三角瓶装液量为50mL，设4个重复，在黑暗条件下，于25℃，静止培养20d。

采用上述培养基和条件培养野生卷边网褶菌母种，结果显示：菌丝橙黄色，长势很强，菌丝浓密，边缘生长较齐，发酵液橙黄色，菌丝鲜重为407.5mg，干重为42.5mg，实现了野生卷边网褶菌菌丝体的人工培养，符合产业化生产要求。

实施例4

本实施例用于野生卷边网褶菌母种培养的培养基：可溶性淀粉20g，蛋白胨4g，KH₂PO₄ 5.0g，MgSO₄ 0.5g，水1L，pH 4.5。

1)无菌环境下，切取野生卷边网褶菌子实体内部组织块0.3cm左右接种于PDA斜面培养基中央部位，塞好橡胶塞，标记好菌种名称、接种日期，并将其置于25℃培养箱中暗光培养3～5d后，从所述组织块萌发出棕褐色绒毛状菌丝，待菌丝长到离组织块2～3cm时，挑取边缘菌丝转接于空白的PDA斜面培养基上，待长满试管时，即获得纯化的野生卷边网褶菌母种；

2)将纯化的野生卷边网褶菌母种接种在PDA平板培养基中，25℃下暗光培养，待菌丝铺满整个平板，即得活化好的菌种；

3)用打孔器在步骤2)活化好的菌种中取一圆状菌块，并将其接种到装有本实施例培养基的三角瓶中，每250mL三角瓶装液量为50mL，设4个重复，在黑暗条件下，于25℃，静止培养20d。

采用上述培养基和条件培养野生卷边网褶菌母种，结果显示：菌丝橙黄色，长势很强，菌丝浓密，边缘生长较齐，发酵液橙黄色，菌丝鲜重为372.5mg，干重为52.5mg，实现了野生卷边网褶菌菌丝体的人工培养，符合产业化生产要求。

实施例5

本实施例用于野生卷边网褶菌母种培养的培养基：可溶性淀粉20g，蛋白胨6g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄ 1.5g，水1L，pH 4.5。

1)无菌环境下，切取野生卷边网褶菌子实体内部组织块0.3cm左右接种于PDA斜面培养基中央部位，塞好橡胶塞，标记好菌种名称、接种日期，并将其置于25℃培养箱中暗光培养3～5d后，从所述组织块萌发出棕褐色绒毛状菌丝，待菌丝长到离组织块2～3cm时，挑取边缘菌丝转接于空白的PDA斜面培养基上，待长满试管时，即获得纯化的野生卷边网褶菌母种；

2)将纯化的野生卷边网褶菌母种接种在PDA平板培养基中，25℃下暗光培养，待菌丝铺满整个平板，即得活化好的菌种；

3)用打孔器在步骤2)活化好的菌种中取一圆状菌块，并将其接种到装有本实施例培养基的三角瓶中，每250mL三角瓶装液量为50mL，设4个重复，在黑暗条件下，于25℃，静止培养20d。

采用上述培养基和条件培养野生卷边网褶菌母种，结果显示：菌丝橙黄色，长势很强，菌丝浓密，边缘生长较齐，发酵液橙黄色，菌丝鲜重为412.5mg，干重为52.5mg，实现了野生卷边网褶菌菌丝体的人工培养，符合产业化生产要求。

实施例6

本实施例用于野生卷边网褶菌母种培养的培养基：可溶性淀粉25g，蛋白胨4g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄ 4.5g，水1L，pH 4.5。

1)无菌环境下，切取野生卷边网褶菌子实体内部组织块0.3cm左右接种于PDA斜面培养基中央部位，塞好橡胶塞，标记好菌种名称、接种日期，并将其置于25℃培养箱中暗光培养3～5d后，从所述组织块萌发出棕褐色绒毛状菌丝，待菌丝长到离组织块2～3cm时，挑取边缘菌丝转接于空白的PDA斜面培养基上，待长满试管时，即获得纯化的野生卷边网褶菌母种；

2)将纯化的野生卷边网褶菌母种接种在PDA平板培养基中，25℃下暗光培养，待菌丝铺满整个平板，即得活化好的菌种；

3)用打孔器在步骤2)活化好的菌种中取一圆状菌块，并将其接种到装有本实施例培养基的三角瓶中，每250mL三角瓶装液量为50mL，设4个重复，在黑暗条件下，于25℃，静止培养20d。

采用上述培养基和条件培养野生卷边网褶菌母种，结果显示：菌丝橙黄色，长势很强，菌丝浓密，边缘生长较齐，发酵液橙黄色，菌丝鲜重为347.5mg，干重为45mg，实现了野生卷边网褶菌菌丝体的人工培养，符合产业化生产要求。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.一种培养基在培养野生卷边网褶菌母种方面的应用，其特征在于，所述培养基包括以下质量的组分：可溶性淀粉20~25 g，蛋白胨2~4 g，KH₂PO₄ 1~3 g，MgSO₄ 1.5~4.5 g，水1L，pH 3~5；所述野生卷边网褶菌母种以野生卷边网褶菌子实体为试材，经子实体组织分离、纯化培养获得；

具体包括以下步骤：

1）无菌环境下，切取野生卷边网褶菌子实体内部组织块0.3 cm左右接种于PDA斜面培养基中央部位，塞好橡胶塞，标记好菌种名称、接种日期，并将其置于25~27 ℃的培养箱中暗光培养3~5 d后，从所述组织块萌发出棕褐色绒毛状菌丝，待菌丝长到离所述组织块2~3cm时，挑取边缘菌丝转接于空白的PDA斜面培养基中培养，待菌丝长满试管，即获得纯化的野生卷边网褶菌母种，保存于4 ℃冰箱，备用；

2）将纯化的野生卷边网褶菌母种接种在PDA斜面平板培养基中，25~27 ℃下暗光培养，待菌丝铺满整个平板，即得到活化好的菌种；

3）用打孔器取步骤2）活化好的菌种接种到所述培养基中，在黑暗条件下，于25~27 ℃，静止培养15~20 d。

2.根据权利要求1所述培养基在培养野生卷边网褶菌母种方面的应用，其特征在于，包括以下质量的组分：可溶性淀粉20 g，蛋白胨2 g，KH₂PO₄ 3 g，MgSO₄ 4.5 g，水1 L，pH 4.5。

3.根据权利要求1所述培养基在培养野生卷边网褶菌母种方面的应用，其特征在于，所述野生卷边网褶菌母种的培养温度为25 ℃。

Images