CN101386818B - 一种海洋真菌培养物的提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种海洋真菌培养物的提取物及其制备方法和应用，该提取物是将海洋真菌CCTCC M 208095经过种子培养，发酵培养后，收集培养发酵液，将发酵液经乙酸乙酯萃取后，浓缩挥干后制的的油状物。本发明的提取物具有抗病源细菌、抑制乙酰胆碱酯酶、抑制拓朴异构酶I、抗口腔癌细胞KB及其耐药株KBv200的活性，可以用于制备抗菌、治疗老年痴呆、抗肿瘤的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种海洋真菌培养物的提取物及其制备方法和应用。
背景技术
寻找生理活性强的物质发展成为抗癌、抗菌、治疗老年痴呆症等药物是人类攻克疾病的主要工作之一。海洋微生物代谢产物研究是近年来国际上新兴的研究课题。红树林作为生长在热带和亚热带海湾河口潮间带的生态系统，一直处于高盐、频繁的潮汐、强风、高温、强紫外辐射和缺氧污泥的海陆潮间带环境，其生境非常特殊，这也造就了红树林内生真菌具有独特的代谢途径和遗传背景，研究发现它们许多成分也具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等药用价值。
细胞培养法是筛选抗肿瘤药物比较常用的一种筛选方法，常用的有MTT法等。而真核生物DNA拓朴异构酶I和II已被确定是多种抗肿瘤药物的有效靶位。例如，抗癌药物喜树碱(camptothecin)及其衍生物拓扑特肯(topotecan)、依林诺特肯(irinotecan)的作用靶位是真核生物DNA拓扑异构酶I，吖啶类化合物(m-AMSA)、鬼臼毒素类化合物(VP-16、VM-26)、阿霉素(adriamycin)等则作用于真核生物DNA拓扑异构酶IIα。但同其它药物一样，长期使用后肿瘤细胞会出现对它们的耐药性。
因此开发新的，特别是结构新颖的，以真核生物DNA拓扑异构酶为靶位的抗肿瘤药物具有重要的意义。我们课题组使用在毕赤酵母中表达的hTopo I，建立了以该酶为靶位的抗肿瘤化合物的体外快速筛选模型，已经对一些天然产 物进行了筛选，取得了较好的结果。
二十世纪初抗生素的发现堪称为医药技术发展史上重大里程碑之一。其意义远远超过其它药物(如阿司匹林等)的发明。1929年，英国细菌学家弗莱明在其实验室中发现：点青霉(一种霉菌)分泌的一种未知物质(即“青霉素”)具有强力抑菌作用。至四十年代末，美国科学家攻克了青霉素大规模生产的技术难题(发酵罐深层通气培养法)从而奠定了抗生素工业的基础。在此后几十年里，抗生素已发展成为几大系列上百个品种的重要临床药物。近几年来细菌耐药现象已成为各国医疗界所面临的一严重问题，现在发病者众多的流感杆菌引发的肺炎与支气管炎等常见病已无良药可治。如何对付越来越普遍的耐药细菌已成为国际医学界所面临的一棘手难题。
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD，又称早老性痴呆，主要病理特征是大脑萎缩，脑组织内产生αβ蛋白沉淀物和神经原纤维缠结，导致乙酰胆碱分泌不足)。而乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE，EC3.1.1.7.)主要的生物学功能是在胆碱能神经突触处通过快速水解神经递质乙酰胆碱(ACh)，从而中止神经冲动的传递。至今，治疗AD最有效的方法仍然是应用AChE抑制剂。在大规模、多中心、双盲和安慰剂对照试验中，这类化合物对AD病人认知能力的心理测验及生活质量均有统计学上的显著改善。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋真菌培养物的提取物，该提取物同时具有抑菌、酶抑制、抗肿瘤活性等。
本发明的另一个目的在于提供上述海洋真菌培养物的提取物的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供上述海洋真菌培养物的提取物在制备抗菌、治疗老年痴呆、抗肿瘤药物中的应用。
本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：
本发明所用的海洋真菌是南海红树林内生真菌Fusarium sp.ZH116，该真菌已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学)，保藏编号为CCTCC M 208095，保藏日为2008年6月20日。该真菌以下简称海洋真菌CCTCC M 208095。
本发明的海洋真菌培养物的提取物，是海洋真菌CCTCC M208095培养物的乙酸乙酯提取物中的油状物。
本发明的海洋真菌培养物的提取物是从海洋真菌CCTCC M20809的培养物(发酵液)的乙酸乙酯萃取液中浓缩得到，其具体的制备方法包括以下步骤：
a.海洋真菌CCTCC M 208095的种子培养：
挑取海洋真菌CCTCC M 208095菌株接入斜面培养基，30～35℃培养5～7天；
b.海洋真菌CCTCC M 208095的发酵培养：
挑取上述斜面中培养好的菌株接入发酵培养基，于25～35℃静置培养1～2月；
c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；
d.将上述过滤后的发酵液，用乙酸乙酯萃取后合并上层萃取液，浓缩挥干制得的油状物即为海洋真菌CCTCC M 208095培养物的提取物。
上述种子培养时所用的培养基按重量份数，包含如下组份：葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，琼脂1～1.5，氯化钠3～5，水100。将该培养基制成试管斜面，即为斜面培养基。
上述发酵培养基按重量份数，包含如下组份：葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，粗海盐1.5，水100。
实验证明，本发明的提取物具有抗病源细菌、抑制乙酰胆碱酯酶、抑制拓朴异构酶I、抗口腔癌细胞KB及其耐药株KBv200的活性。具体效果可达到：对大肠杆菌、绿脓杆菌、八叠球菌、铜绿假单孢菌、蜡状芽孢菌、白色葡萄球菌6种菌的最小抑制浓度均小于1μg/mL，对乙酰胆碱酯酶的抑制浓度IC50为2.5μg/mL，0.5μg/mL的提取物对hTopo I具有强烈的松弛活性，对KB和KBv200细胞株的IC50为远小于11μg/mL。
与现有技术相比，本发明的优点是，本发明的提取物同时具有抑菌、乙酰胆碱酯酶酶抑制、拓朴异构酶I抑制和抗肿瘤活性，且作用效果显著，可以用于制备抗菌、治疗老年痴呆、抗肿瘤的药物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1制备海洋真菌ZH116培养物的提取物
a.真菌ZH116的种子培养
培养基(按重量份数)：葡萄糖1，酵母提取物0.1，蛋白胨0.2，琼脂1，氯化钠3，水100；
将上述培养基制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30℃培养7天；
b.真菌ZH116的发酵培养
发酵培养基：称取葡萄糖1g，酵母提取物0.1g，蛋白胨0.2g和粗海盐3g，加入1L水混匀；
将上述斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25℃静置培养1月
c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；
d.将上述过滤后的发酵液，用乙酸乙酯萃取多次，收集上层萃取液，浓缩挥干制得的油状物即为海洋真菌ZH116培养物的提取物20mg。
实施例2提取物的抗菌、抑酶和抗肿瘤活性试验
1.抗菌试验
将实施例1得到的提取物用二甲基亚砜DMSO溶解至1000μg/mL后进行系列浓度稀释，在96孔板中，每孔加入190μl细菌悬液(OD600为0.6)，然后加入前述不同浓度的提取液10μl，重复三次，空白对照加入10μL DMSO，阳性对照为氨苄西林钠溶液。37℃，培养16小时后，测定OD600。同时也目测。
最小抑制浓度为细菌几乎没有生长的浓度。
测定得到真菌ZH116培养物的提取物对6种不同的病源细菌的最小抑制浓度均小于1μg/mL。
2.乙酰胆碱酯酶抑制活性
将实施例1得到的提取物用DMSO溶解稀释至100μg/mL，取6支1.5ml装有840μL 0.1M pH＝8.0的磷酸盐缓冲溶液的梨型管，依次加入0，5，10，20，40，50μL的提取物溶液(100μg/mL)，用DMSO补齐至50μL，加入50μL4mg/ml 5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液和10μL乙酰胆碱酯酶溶液，在37℃保温15min后，立即加入50μL 2mg/ml硫代乙酰胆碱溶液，摇匀后测其在412nm处吸光度。
参比用950μL 0.1M pH＝8.0的磷酸盐缓冲溶液和50μL DMSO。
以酶的相对活力对抑制剂浓度作图，根据抑制曲线求得提取物的IC50为 2.5μg/mL。
3.DNA拓扑异构酶I(hTopo I)松弛活性抑制实验
本实施例中，各溶液配方为：
反应缓冲液：175mM Tris.HCl(pH7.5)，250mM KCl，25mM MgCl2，5mMDTT，10mM亚精胺，0.5mM EDTA，250μg/mL BSA。
反应终止液：SDS 3％，60mM EDTA，甘油50％，溴酚兰0.25％，所述各百分比为占反应终止液总质量的百分比，如SDS 3％意思为100克反应液中含SDS3克。
将实施例1得到的提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解稀释至1000μg/mL，在共20μL hTopo I样品反应体系中，加有4μL反应缓冲液，0.5μg负超螺旋pBR322、1U的hTopo I及0.5μL测试样品。
同时做空白对照，阴性对照、阳性对照以及DMSO溶剂对照。
在共20μL空白对照体系中，仅加入4μL上述反应缓冲液，0.5μg负超螺旋pBR322。
在共20μL阴性对照体系中，仅加入4μL反应缓冲液，0.5μg负超螺旋pBR322，1U的hTopo I。
在共20μL阳性对照体系中，加入4μL反应缓冲液，0.5μg负超螺旋pBR322，1U的hTopo I以及0.5μL 2mM的喜树碱溶液。
在共20μL的DMSO对照体系中，加入4μL反应缓冲液，0.5μg负超螺旋pBR322，1U的hTopo I以及0.5μL DMSO。
所有的反应体系都是用ddH2O补足20μL。
加样完成后，在37℃下恒温水浴反应30min，加入4μL hTopo I反应终止 液。
使用1％琼脂糖(含0.01％EB)(均为质量百分比，即配100ml的胶液，含琼脂糖1克，EB为0.01克)，在0.5×TBE电泳缓冲液中用约5V/cm电压于室温电泳50min。电泳完毕，用genegenius全自动凝胶成像分析系统分析测试结果。
结果表明，终浓度为25μg/mL(1000μg/mL是原始溶液浓度，取0.5μl在20μl反应体系中，所以终浓度就成为25μg/mL)的提取物对hTopo I具有强烈的松弛活性。
4.体外细胞毒测定(MTT法)
收集对数生长期的人口腔癌细胞株KB及其耐药株KBv200，接种于96孔板，每孔190μl(约1×104个细胞/孔)，24小时后加入不同浓度药物10μl，每一浓度3个重复孔。培养68小时后加入MTT 10μl(浓度为5mg/ml)。继续培养4小时后弃上清，每孔加入DMSO 100μl后用酶联免疫检测仪测定492nm处吸光度OD值，用Bliss’s software通过细胞毒曲线来计算细胞生长50％的抑制率(IC50)。测定计算结果表明提取物对KB和KBv200细胞株的IC50为远小于11μg/mL。
Claims (3)
1.南海红树林内生真菌Fusarium sp.ZH116，该海洋真菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 208095，保藏日为2008年6月20日。
2.一种海洋真菌培养物的提取物，其特征在于该提取物的提取步骤如下：
(1)海洋真菌CCTCC M 208095的种子培养：
挑取海洋真菌CCTCC M 208095菌株接入斜面培养基，斜面培养基按重量份数，由如下组份组成：葡萄糖0.5~1.5、酵母提取物0.05~0.15、蛋白胨0.1~0.3、琼脂1~1.5、氯化钠3~5、水100；30~35℃培养5~7天；
(2)海洋真菌CCTCC M 208095的发酵培养：
挑取上述斜面中培养好的菌株接入发酵培养基，发酵培养基按重量份数，由如下组份组成：葡萄糖1g、酵母提取物0.1g、蛋白胨0.2g、粗海盐3g、水1L；25~35℃静置培养1~2月；
(3)将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；
(4)将上述过滤后的发酵液，用乙酸乙酯萃取后收集上层萃取液，浓缩挥干制得的油状物即为海洋真菌CCTCC M 208095培养物的提取物。
3.权利要求2所述提取物在制备抗菌、治疗老年痴呆、抗人口腔肿瘤药物中的应用。
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