CN102911879B - 一种球毛壳菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种球毛壳菌WFWML-4（Chaetomium globosum），已于2012年9月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.6571。本发明筛选的毛壳菌的次生代谢产物中具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的单体化合物或活性部位，可以作为天然药物或功能性食品加以开发利用，替代化学药物，降低其毒副作用，同时利用微生物发酵生产，可以很大程度的降低生产成本，具有很好的市场应用前景。

Description

一种球毛壳菌及其应用

技术领域

本发明属于产乙酰胆碱酯酶抑制微生物菌株筛选技术领域，具体涉及一种球毛壳菌及其应用。

背景技术近年来，随着全世界人口老龄化时代的到来，老年痴呆已成为目前老年医学面临的最严峻的问题之一。因此，如何防治老年痴呆症已成为全人类的关注焦点之一。研究发现乙酰胆碱酯酶(acetylchlinesterase,AchE)存在于中枢突出间隙中，能够催化降解神经递质乙酰胆碱，从而阻止了神经信号的传递，引起老年痴呆疾病，即阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease,AD)。因此，乙酰胆碱酯酶是一个酶抑制剂作用靶点，可以用于治疗阿尔茨海默氏病。乙酰胆碱酯酶抑制剂是美国FDA唯一允许作为治疗老年痴呆症的药物，且只有4种药物获得FDA许可，分别为：Tacrine(他克林)、Donepezil(多奈哌齐)、Rivastigmine(利斯的明)、Galantamine(加兰他敏)。目前防治老年痴呆的药物价格昂贵，且具有一定的副作用，不宜长期服用，加之化学合成新的药物难度较大，故天然AchE抑制剂的研究与开发成为研究的重点。

大自然资源丰富，是开发乙酰胆碱酯酶抑制剂的宝库，现已报道有很多种植物中具有抑制AChE的活性成分，并且有望用来治疗AD。20世纪90年代后期，在合成抑制剂和植物来源的抑制剂开发的同时，微生物来源的抑制剂的研究也在不断进步中。筛选出能够合成乙酰胆碱酯酶抑制剂的海洋菌株具有重要的经济和社会意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种球毛壳菌及其应用，即从牡蛎中纯化出的一种高产抑制AchE活性的菌株，从而弥补现有技术的不足。

本发明分离的球毛壳菌(Chaetomium globosum)WFWML-4，已于2012年9月11日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.6571。

本发明的球毛壳菌WFWML-4用于制备菌液制剂，所制得的菌液制剂可以用来分离乙酰胆碱酯酶抑制物。

本发明菌株的培养基含有如下质量体积百分比的组分：20%马铃薯，2%蔗糖，0.3%KH₂PO₄，0.15%MgSO₄·7H₂O，0.001%VB₁；pH为6.0。

本发明筛选的毛壳菌的次生代谢产物中具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的单体化合物或活性部位，可以作为天然药物或功能性食品加以开发利用，替代化学药物，降低其毒副作用，同时利用微生物发酵生产，可以很大程度的降低生产成本，具有很好的市场应用前景。

具体实施方式

下面对本发明进行详细的描绘：

一、菌株的筛选

用于分离菌株的牡蛎(Concha Ostreae)采自黄渤海交界(长岛)海域。将牡蛎去壳后用75%酒精浸泡5min进行表面消毒，剪碎后加3mL无菌水研磨，然后将原液进行梯度稀释，分别涂布于分离培养基上(分离用培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA，加入终浓度为200U/mL的青霉素钾和150U/ml硫酸链霉素)。将所有的平板放置于恒温培养箱中，25℃倒置培养。为了验证表面消毒是否彻底，设计对照实验：对照1，用清水冲洗后但未进行表面消毒未切割的完整牡蛎；对照2，进行表面消毒但未切割未研磨的完整牡蛎。然后将所有平板放置在培养箱内，25℃避光培养15d，结果发现对照1的材料周围长出很多不同的菌落，而对照2无菌落生长，说明表面消毒非常彻底。待培养至实验组长出菌丝时，采用菌丝尖端切割法对内生真菌进行分离纯化，将纯化好的真菌转于斜面，于4℃冰箱保存备用。

将牡蛎中分离获得的株真菌接种到马铃薯蔗糖液体培养基中(培养基含有如下质量体积百分比的组分：20%马铃薯，2%蔗糖，0.3%KH₂PO₄，0.15%MgSO₄·7H₂O，0.001%VB₁；pH为6.0。)，于25℃，120rpm培养10天。四层纱布过滤，分离发酵液和菌丝体。将发酵液用乙酸乙酯萃取3次，将3次乙酸乙酯相合并，然后减压浓缩得到发酵液粗萃取物。将粗萃取物用DMSO溶解成5mg/L，采用Ellman法测定所得真菌的发酵液萃取物的AchE抑制活性，从中筛选出一株高产抑制AchE活性的菌株。

Ellman法是一种快速测定乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法。其原理为：乙酰胆碱酯酶水解底物丁酰硫代胆碱(acetylthiocholine)，生成的产物硫代胆碱再与显色剂二硫二硝基苯甲酸(DTNB)[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)]反应生成在412nm处有特征吸收的化合物2-硝基-5-巯基苯甲酸(5-thio-2-nitrobenzoic acid)，通过测定410nm处的吸光度的增量可以间接测定乙酰胆碱酯酶的活性。

Ellman法测定乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法：将提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成浓度为50mg/mL的溶液。取4支10mL的试管(1～4)分别标注为空白、对照、样品、本底放于37℃的恒温水浴中，向这4支试管中分别添加pH=8.0磷酸缓冲液(2950μL、2880μL、2880μL、2950μL)、乙酰胆碱碘代物20μL、显色剂DTNB100μL；然后向1、2号试管中各加入DMSO100μL，3、4号试管中各加入待测样品溶液100μL，2、3号试管中再各加入70μL的乙酰胆碱酯酶后混匀、在水浴中反应4min 20s后再向各试管中分别添加40%的SDS终止剂100μL终止反应；最后在412nm下测其OD值，通过计算公式计算出样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率：

结果发现WFWML-4菌株的发酵液萃取物对AchE的抑制率最高，5mg/ml时抑制率可达到47.8%。将分离筛选出的WFWML-4菌株进行形态学鉴定，分别对该菌的菌落形态、菌丝体、子囊果、子囊孢子进行观察。菌株WFWML-4菌株在PDA平板上形成白色绒毛状疏松菌落，边缘不整齐。约7天首先在中心位置出现黄色颗粒，黄色颗粒为未成熟的子囊果；约10天黄色颗粒变为黑色；培养基背面逐渐呈琥珀色。丝状真菌，菌丝体分支分隔。子囊果肉眼所见为小黑点，镜下呈深棕色至黑色，卵圆形，外有浓密的棕色附属丝，内含8个子囊孢子。孢子为浅褐色，柠檬状。这些形态学特征与文献中报道的球毛壳菌的形态学特征相一致。

将球毛壳菌WFWML-4(Chaetomium globosum)，已于2012年9月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为号：CGMCCNO.6571。

二、WFWML-4菌株的发酵及性质鉴定

1、WFWML-4菌株的培养

将4℃冰箱保存的WFWML-4菌株转接到PDA(海水配置)平板上活化，25℃培养5天；然后转接到马铃薯蔗糖液体培养基中，25℃，120rpm，培养3天；将种子液按10%的接种量扩大培养，25℃，120rpm，培养10天。发酵完毕后，四层纱布过滤，分离发酵液和菌丝体。将发酵液用乙酸乙酯萃取3次，将3次乙酸乙酯相合并，然后减压浓缩得到发酵液粗萃取物。将粗萃取物用DMSO溶解成5mg/mL，采用Ellman法测定所得真菌的发酵液萃取物的AchE抑制活性，抑制率可达47.8%。

2、抑制AChE的活性成分的分离

将该真菌的次生代谢产物的乙酸乙酯相进行分离，获得乙酰胆碱酯酶抑制活性为30～80％的极性段。具体操作如下：

将真菌WFWML-4大量液体发酵，经乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯相10.2g。所得产物采用硅胶柱(100g硅胶，200-300目)进行分离，采用氯仿/甲醇体系(氯仿∶甲醇＝100∶0，100∶1，100∶2，100∶4，100∶8，100∶16)进行梯度洗脱，获得6个极性段，分别测定每个极性段对AchE的抑制率，其抑制率达30％～80％。其中氯仿：甲醇段100：4活性最强，可达60～80％。

将获得的提取物用真空旋转蒸发仪去掉提取液，最终得到具有抑制AChE的活性成分。

Claims (3)

1.一种球毛壳菌，其特征在于，所述的球毛壳菌（Chaetomium globosum）的保藏编号为：CGMCC NO.6571。

2.一种菌液制剂，其特征在于，所述的菌液为权利要求1所述的球毛壳菌的活菌菌液；其培养基含有如下质量体积百分比的组分： 20%马铃薯，2%蔗糖，0.3% KH₂PO₄ ，0.15% MgSO₄·7H₂O ，0.001%VB₁；pH为6.0。

3.权利要求2所述的菌液制剂在制备乙酰胆碱酯酶抑制物中的应用。