CN101985643A

CN101985643A - 流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法

Info

Publication number: CN101985643A
Application number: CN 201010227917
Authority: CN
Inventors: 敬科举; 曾宪海; 马尼拉法沙·伊马努儿; 郝晓兵; 卢英华; 姚传义; 凌雪萍; 陈翠雪
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2010-07-13
Filing date: 2010-07-13
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2030-07-13
Also published as: CN101985643B

Abstract

流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法，涉及一种微生物发酵生产纳他霉素的工艺，提供一种流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法。将纳他霉素生产菌株褐黄孢链霉菌活化后转接至种子培养基培养后再转接至一级、二级种子罐中培养，然后接入发酵罐的发酵培养基中，并在发酵培养24～48h、60～80h、90～100h时，通过恒速流加初始培养液质量体积的5％～20％发酵培养基，培养，待发酵液呈米黄色稍深，菌丝衰老，趋于自溶，染色浅时放罐，此时发酵液中纳他霉素含量达到9.5～11.5g/L。采用底料流加方法，发酵生产纳他霉素，纳他霉素产量比传统方法提高一倍以上，具有操作简单、成本低、设备要求低，效果佳等优势。

Description

流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵生产纳他霉素的工艺，尤其是以褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)ATCC13326发酵生产纳他霉素的工艺。

背景技术

纳他霉素(Natamycin)是由纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)或塔努加链霉菌(Streptomyces chatanoogensis)或褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)发酵产生的一种二十六元多烯大环内酯类抗生素，能有效地抑制和杀死霉菌及酵母菌，是一种安全、低毒、高效、广谱的抗真菌类抗生素和天然的生物防腐剂(Pedersen JC.Natamycin as a fungicide in agarmedia[J].Applied and Environmental Microbiology，1992，58(3)：1064-1066)。与其它抗菌产品相比，纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低，可广泛应用于由真菌引起的疾病。除此之外，纳他霉素的低溶解度，可用其对食品表面进行处理以增加食品的保质期，不影响风味和口感。目前，全球有30多个国家批准将纳他霉素用于乳制品、肉制品、果汁饮料、葡萄酒等的生产和保藏。纳他霉素的需求量增加，市场前景巨大(Davidson PM，Doan CH.Natamycin[A].Antimicrobials in Foods[C].New York，Basel and Hong Kong：Marcel Dekker Inc.，1993，395-407)。

目前，国内外纳他霉素的发酵水平不一，大部分发酵法生产纳他霉素的产量为2～5g/L，应用前景受到限制(Mohamed A F，Hesham A E.Optimization of the cultivation medium fornatamycin production by Streptomyces natalensis[J].Journal of Basic Microbiology，2000，40(3)：157-166)。有报道(江正兵，宋慧婷，马立新.纳他霉素高产菌株的选育及纳他霉素高效发酵提取纯化方法。CN101307299A)通过发酵罐流加高浓度葡萄糖培养Streptomycesgilvosporeus HBJ591突变株，获得纳他霉素产量为14g/L，为迄今为止报道的最高水平，但该方法耗糖多，糖转化率也较为低下。通过流加底料或其他营养成分来增加纳他霉素产量的研究国内外并不多见。纳他霉素与其它大环内脂类抗生素的合成机理相似，都属于聚酮体途径，培养液中的一些蛋白、氨基酸、碳水化合物以及一些维生素和微量元素都可能对纳他霉素的合成有促进作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法。

本发明以褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)ATCC13326生产纳他霉素的具体方法如下：

1)摇瓶种子培养

无菌条件下，取褐黄孢链霉菌孢子涂布于高氏1号琼脂培养基斜面中，置于培养箱中培养，然后将培养好的孢子块接入盛有摇瓶种子培养基的三角瓶中，摇床培养；

2)一级种子罐培养

将种子液按5％～10％的接种量接入盛有一级种子罐培养基的种子罐中培养；

3)二级种子罐培养

将种子液按10％～30％的接种量接入盛有二级种子罐培养基的种子罐中培养；

4)底料流加发酵罐培养

将种子液按5％～10％的接种量接入盛有发酵培养基发酵罐中，培养温度28～30℃，转速为100～200rpm，发酵时间120～160h，分别在发酵培养24～48h、60～80h、90～100h时，恒速流加初始培养液质量体积的5％～20％发酵培养基，待发酵液呈米黄色稍深，菌丝衰老，趋于自溶，染色浅时放罐，得纳他霉素。

发酵液中纳他霉素的含量可达到9.5～11.5g/L。

在步骤1)中，所述培养箱中培养的温度可为28～30℃，培养的时间可为5～9d；所述摇瓶种子培养基为可溶性淀粉20.0～0.0g/L，葡萄糖8.0～15.0g/L，黄豆饼粉10.0～20.0g/L，酵母粉8.0～20g/L，蛋白胨5.0～10.0g/L，碳酸钙2.0～10.0g/L，pH 7.0；所述摇床培养的转速可为150～220rpm，摇床培养的温度可为25～30℃，摇床培养的时间可为36～48h。

在步骤2)中，所述一级种子罐培养基为可溶性淀粉50.0～100g/L，葡萄糖5.0～25.0g/L，黄豆饼粉5.0～15.0g/L，蛋白胨5.0～10.0g/L，酵母粉5.0～10.0g/L，氯化钠2.0～5.0g/L，碳酸钙5.0～15.0g/L，消泡剂1～2g/L，pH 7.0±0.5；所述种子罐中培养的转速可为200～400rpm，培养的温度可为28～30℃，种子罐的罐压可为0.03～0.05MPa，培养的时间可为24～48h。

在步骤3)中，所述二级种子罐培养基为可溶性淀粉50.0～100g/L，葡萄糖5.0～25.0g/L，黄豆饼粉5.0～15.0g/L，蛋白胨5.0～10.0g/L，酵母粉5.0～10.0g/L，氯化钠2.0～5.0g/L，碳酸钙5.0～15.0g/L，消泡剂1～2g/L，pH 7.0±0.5；所述种子罐中培养的转速可为200～400rpm，培养的温度可为28～30℃，种子罐的罐压可为0.03～0.05MPa，培养的时间可为24～48h。

在步骤4)中，所述发酵培养基为可溶性淀粉50.0～100g/L，葡萄糖5.0～25.0g/L，黄豆饼粉5.0～15.0g/L，蛋白胨5.0～10.0g/L，氯化钠2.0～5.0g/L，碳酸钙5.0～15.0g/L，消泡剂0.5～2g/L，pH 7.0±0.5。

本发明采用底料流加方法，发酵生产纳他霉素，纳他霉素产量较传统方法提高一倍以上，具有操作简单、成本低、设备要求低，效果佳等优势。

附图说明

图1为实施例1中褐黄孢链霉菌在摇瓶发酵培养基中生产纳他霉素的曲线。在图1中，横坐标为时间Time(h)，左纵坐标为发酵液中纳他霉素浓度Natamycin concentration(g/L)(■)，右纵坐标为菌体干质量Dry cell weight(DCW，g/L)(○)。

图2为实施例2中褐黄孢链霉菌在发酵罐培养基中生产纳他霉素的曲线。在图2中，横坐标为时间Time(h)，左纵坐标为发酵液中纳他霉素浓度Natamycin concentration(g/L)(■)，右纵坐标1为菌体干质量Dry cell weight(DCW，g/L)(○)，右纵坐标2为发酵液pH(…)。

图3为实施例3中褐黄孢链霉菌在发酵罐发酵培养基中流加底料生产纳他霉素的曲线。在图3中，横坐标为时间Time(h)，左纵坐标为发酵液中纳他霉素浓度Natamycin concentration(g/L)(■)；从左到右顺序，右纵坐标1为发酵液的溶氧DO(％)(-)及菌体干质量Dry cellweight(DCW，g/L)(○)，右纵坐标2为发酵液的pH(…)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作详细说明。

实施例1

1)摇瓶种子培养：无菌条件下，从～80℃超低温冰箱保藏的孢子甘油管中取200μL涂布于高氏1号琼脂培养基斜面中，置于28℃培养箱，依菌落生长情况培养5～9d。利用小铲将培养好的新鲜斜面上1cm²的孢子块接入盛有种子培养基(可溶性淀粉20.0g/L，葡萄糖8.0g/L，黄豆饼粉10.0g/L，酵母粉8.0g/L，蛋白胨5.0g/L，碳酸钙2.0g/L，pH 7.0)的三角瓶中，摇床转速200rpm、28℃、培养36h。

2)一级种子罐培养：将种子液按10％的接种量接入盛有一级种子罐培养基(可溶性淀粉100g/L，葡萄糖25.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉10.0g/L，氯化钠2.0g/L，碳酸钙15.0g/L，消泡剂2g/L，pH 7.0±0.5)的种子罐中，转速200～400rpm，培养温度28℃，罐压0.03～0.05MPa。培养24～48h。

3)二级种子罐培养：将一级种子罐的培养液按10～30％的接种量接入盛有二级种子罐培养基(可溶性淀粉100g/L，葡萄糖25.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉10.0g/L，氯化钠2.0g/L，碳酸钙15.0g/L，消泡剂2g/L，pH 7.0±0.5)的种子罐中，转速200～400rpm，培养温度28℃，罐压0.03～0.05MPa。培养24h。

4)底料流加发酵罐放大培养：将种子液按10％的接种量接入盛有发酵培养基(可溶性淀粉50.0g/L，葡萄糖5.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠2.0g/L，碳酸钙15.0g/L，消泡剂1g/L，pH 7.0)的发酵罐。培养温度28℃，转速为500～700rpm，发酵时间168h。在发酵培养开始后36h、72h、96h时，分别恒速流加培养液质量体积体积的5～20％发酵培养基，控制溶氧为30％以上。至发酵结束时发酵液中纳他霉素含量通过HPLC法测定达到11.2g/L。分析其生产曲线(图1)可知，菌体在24左右后溶氧迅速下降，表面此阶段生长迅速，在36h时溶氧上升即地物接近耗尽时流加底料，使菌体进一步增加，为后期生产纳他霉素做准备。在72h、96h时再次流加底料，促进纳他霉素产量稳步上升，使得在144h左右纳他霉素产量达到堆高11.2g/L。菌体干质量最高可达46.25g/L。

HPLC方法如下：

取1mL纳他霉素发酵液，加入9mL甲醇，充分摇匀后，超声30min，5000rpm离心10min除去菌体，取上清液1mL加入70％甲醇4mL，用0.45μm微孔滤膜过滤即得到待测液。

标准品的配制：精确称取50mg纳他霉素标准品，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成0.5g/L的标准储备液置于4℃避光保存。临用时使用70％甲醇稀释至所需浓度则得到纳他霉素标准液，经0.22μm微孔滤膜过滤后即得标准待测液。

HPLC条件：仪器为Agilent 1200series；流动相：V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)＝63∶36∶0.3；色谱柱：Agilent LC～C18(5μm；4.6mm×250mm)；柱温：室温；检测波长：303nm；流速：1.00mL/min；进样量：20μL。

实施例2

1)摇瓶种子培养到二级种子罐培养同实施例1；

2)底料流加发酵罐放大培养：将种子液按10％的接种量接入盛有发酵培养基(可溶性淀粉50.0g/L，葡萄糖5.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠2.0g/L，碳酸钙15.0g/L，消泡剂1g/L，pH 7.0)的发酵罐。培养温度28℃，转速为200rpm，发酵时间130h。在发酵培养开始后30h、68h、90h时，分别恒速流加培养液质量体积体积的20％发酵培养基，控制溶氧为30％以上。至发酵结束时发酵液中纳他霉素含量通过HPLC法测定达到10.5g/L。

实施例3

1)摇瓶种子培养到二级种子罐培养同实施例1；

2)底料流加发酵罐放大培养：将二级种子液按10％的接种量接入盛有发酵培养基(可溶性淀粉50.0g/L，葡萄糖5.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠2.0g/L，碳酸钙15.0g/L，消泡剂1g/L，pH 7.0)的发酵罐。培养温度28℃，转速为200rpm，发酵时间130h。在发酵培养开始后36h、72h、96h时，分别恒速流加培养液质量体积20％的发酵培养基，控制溶氧为30％以上。至发酵结束时发酵液中纳他霉素含量通过HPLC法测定达到9.53g/L。菌体干质量达到56.0g/L。

对比例1

1)菌种活化及摇瓶种子培养同实施例1。

2)发酵培养：将种子液按10％的接种量接入盛有发酵培养基(可溶性淀粉50.0g/L，葡萄糖10.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠2.0g/L，碳酸钙15.0g/L，pH 7.0)的三角瓶摇瓶中，摇床转速200rpm，培养温度28℃，培养时间144h。至发酵结束时通过HPLC法测定发酵液中纳他霉素含量为2.2g/L(参见图2)。

对比例2

1)菌种活化、摇瓶种子培养及一级种子罐培养同实施例1。

2)二级种子罐培养：将一级种子罐的培养液按10～30％的接种量接入盛有二级种子罐培养基(可溶性淀粉100g/L，葡萄糖25.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉10.0g/L，氯化钠2.0g/L，碳酸钙15.0g/L，消泡剂2g/L，pH 7.0±0.5)的种子罐中，转速200～400rpm，培养温度28℃，罐压0.03～0.05MPa。培养24h。

3)发酵罐培养：将二级种子罐培养液按10％的接种量接入盛有发酵培养基(可溶性淀粉50.0g/L，葡萄糖5.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠2.0g/L，碳酸钙15.0g/L，消泡剂2g/L，pH 7.0)的120L发酵罐。培养温度28℃，转速为400～600rpm，发酵时间168h。至发酵结束发酵液中纳他霉素最高含量达到6.54g/L(参见图3)。

Claims

1.流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)摇瓶种子培养

2)一级种子罐培养

3)二级种子罐培养

4)底料流加发酵罐培养

2.如权利要求1所述的流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养箱中培养的温度为28～30℃，培养的时间为5～9d。

3.如权利要求1所述的流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法，其特征在于在步骤1)中，所述摇瓶种子培养基为可溶性淀粉20.0～0.0g/L，葡萄糖8.0～15.0g/L，黄豆饼粉10.0～20.0g/L，酵母粉8.0～20g/L，蛋白胨5.0～10.0g/L，碳酸钙2.0～10.0g/L，pH 7.0。

4.如权利要求1所述的流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法，其特征在于在步骤1)中，所述摇床培养的转速为150～220rpm，摇床培养的温度为25～30℃，摇床培养的时间为36～48h。

5.如权利要求1所述的流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法，其特征在于在步骤2)中，所述一级种子罐培养基为可溶性淀粉50.0～100g/L，葡萄糖5.0～25.0g/L，黄豆饼粉5.0～15.0g/L，蛋白胨5.0～10.0g/L，酵母粉5.0～10.0g/L，氯化钠2.0～5.0g/L，碳酸钙5.0～15.0g/L，消泡剂1～2g/L，pH 7.0±0.5。

6.如权利要求1所述的流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法，其特征在于在步骤2)中，所述种子罐中培养的转速为200～400rpm，培养的温度为28～30℃，种子罐的罐压为0.03～0.05MPa，培养的时间为24～48h。

7.如权利要求1所述的流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法，其特征在于在步骤3)中，所述二级种子罐培养基为可溶性淀粉50.0～100g/L，葡萄糖5.0～25.0g/L，黄豆饼粉5.0～15.0g/L，蛋白胨5.0～10.0g/L，酵母粉5.0～10.0g/L，氯化钠2.0～5.0g/L，碳酸钙5.0～15.0g/L，消泡剂1～2g/L，pH 7.0±0.5。

8.如权利要求1所述的流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法，其特征在于在步骤3)中，所述种子罐中培养的转速为200～400rpm，培养的温度为28～30℃，种子罐的罐压为0.03～0.05MPa，培养的时间为24～48h。

9.如权利要求1所述的流加底料发酵罐生产纳他霉素的方法，其特征在于在步骤4)中，所述发酵培养基为可溶性淀粉50.0～100g/L，葡萄糖5.0～25.0g/L，黄豆饼粉5.0～15.0g/L，蛋白胨5.0～10.0g/L，氯化钠2.0～5.0g/L，碳酸钙5.0～15.0g/L，消泡剂0.5～2g/L，pH7.0±0.5。