CN105505833A - 一种万古霉素培养基及制备万古霉素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种万古霉素培养基及制备万古霉素的方法，包括如下重量份数的组分：碳源1.5-5份氮源0.05-0.15份无机盐0.15-0.45份水90-110份无机盐包括硫酸镍、硝酸铁和氯化钠，按照重量份，硫酸镍：硝酸铁：氯化钠=0.5-2:0.5-2:1。本发明的有益效果：提高万古霉素的收率和纯度。

Description

一种万古霉素培养基及制备万古霉素的方法
技术领域
本发明涉及药物生产领域，特别涉及一种万古霉素培养基及制备万古霉素的方法。
背景技术
近年来，由于青霉素的广泛的运用造成了大量的青霉素抗性革兰氏阳性感染，万古霉素就成为了对细菌作战的最后的防线。随着万古霉素的需求的增加，如何改进现有的万古霉素生产工艺提升万古霉素的产量便成为研究的热点。
在现有的万古霉素的生产工艺中，普遍采用控制放线菌属东方拟无枝酸菌在发酵条件下产生万古霉素，再经过分离纯化后得到万古霉素纯品的方法。由此可见，万古霉素的发酵步骤在整个生产工艺中对产量能够产生至关重要的影响。因此如何改进现有的发酵工艺便成为如何提升万古霉素产量的重点。
而在现有的发酵工艺中，培养基对发酵过程起着关键的作用。在现有菌种的情况下，万古霉素的产量和质量的提高，只能通过工艺的优化从而改变产量及质量。而培养基的优化也就成为重点的研究对象。
发明内容
本发明的目的是提供一种万古霉素培养基，该培养基能够显著提高万古霉素在发酵步骤的收率。本发明的另一个发明目的是提供一种制备万古霉素的方法。该方法应用万古霉素培养基，从而提高万古霉素的收率和纯度。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种万古霉素培养基，其特征是：包括如下重量份数的组分：
所述无机盐包括硫酸镍、硝酸铁和氯化钠，按照重量份，硫酸镍∶硝酸铁∶氯化钠＝0.5-2∶0.5-2∶1。
还包括重量份为0.04-0.06份的pH调节剂，所述pH调节剂包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，按照摩尔比，磷酸二氢钠∶磷酸氢二钠＝0.15-0.19∶1。
还包括甘氨酸、色氨酸、酪氨酸组成的重量份为0.05-0.1份的氨基酸复合物，按照重量份，甘氨酸∶色氨酸∶酪氨酸＝3-8∶1∶3-5。
所述碳源选自可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖中的一种。
所述氮源由尿素、棉籽饼粉和乙酸铵混合而成，按照重量份，尿素∶棉籽饼粉∶乙酸铵＝3-5∶1∶2-4。
一种应用万古霉素培养基的万古霉素制备方法，包括如下步骤：摇瓶种子接种、种子罐万古霉素培养基培养、发酵罐万古霉素培养基培养、预发酵液预处理、陶瓷膜过滤、一次纳滤、草酸沉淀、一次板框过滤、一次过柱纯化、二次纳滤、一次结晶、二次板框过滤、活性炭脱色、脱色板框过滤、二次过柱纯化、超滤、三次纳滤、二次结晶、真空抽滤、晶体溶解、冷冻干燥、打粉包装，其中
①发酵液的预处理：按照发酵液体积的0.1-0.5％往万古霉素发酵液加入质量分数为10-20％的盐酸进行成盐，搅拌30min得到预处理液；
②草酸沉淀：将一次纳滤得到的浓缩液加入草酸沉淀罐，再加入一次纳滤得到的浓缩液重量的0.001-0.004％的固体草酸钠，搅拌30-50min后静置；
③活性炭脱色：将二次板框过滤得到的一次结晶体加入活性炭脱色罐，加入去离子水溶解，搅拌并加热，待一次结晶体的溶液沸腾时加入一次结晶体重量的3-6％的活性炭进行脱色30min。
所述板框过滤中，过滤介质为滤板，所述滤板上预涂有2mm的助滤剂，所述助滤剂为活性炭。
所述一次结晶和二次结晶过程中均加入晶体重量10倍的有机溶剂进行结晶，所述有机溶剂选用乙醇、丙酮和乙醚中的其中一种，所述一次结晶和二次结晶的起始温度为35-45℃，终点温度为0-15℃，降温速度为1-3℃/min。
所述晶体溶解步骤为：将真空抽滤得到的二次结晶体加入溶解罐中，加入二次结晶体重量8-12倍的去离子水，搅拌30min至二次结晶体完全溶解形成溶解液。
所述一次过柱纯化采用SP825树脂，所述二次过柱纯化采用HP20SS树脂。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
(1)在培养基中加入包括硫酸镍、硝酸铁和氯化钠的无机盐，补充微量元素，起到提高万古霉素的产量作用；
(2)氨基酸复合物可作为氮源补充物；相比于尿素和棉籽饼粉等需要经过代谢后才能得以吸收利用，甘氨酸、色氨酸、酪氨酸可直接被菌体吸收利用，提高吸收效率，提高万古霉素产量；
(3)加入pH调节剂，调节培养基的pH至7.2左右，提供菌体合适的酸碱度环境有利于菌体的生长和生命活动。同时本发明人意外地发现同时加入包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的pH调节剂和包括硫酸镍、硝酸铁和氯化钠的无机盐比单独加入包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的pH调节剂或者包括硫酸镍、硝酸铁和氯化钠的无机盐能够提高万古霉素的产量和纯度；
(4)选用尿素、棉籽饼粉和乙酸铵三种含氮物质作为氮源，其中尿素和棉籽饼粉中的氮以有机物形式存在，而乙酸铵作为有机盐，乙酸铵中的氮比有机物中的氮更容易吸收，且本发明人意外发现相比于其他铵盐，乙酸铵能够显著提高万古霉素的产率和纯度；而乙酸铵中的NH4+和无机盐中氯化钠中的Cl-结合形成氯化铵，在氯化铵被菌体吸收后留下氯化氢，能够减少后期盐酸的使用；
(5)由于草酸钠中的C2O4 2-能够与钙、镁、铬、锰等多种金属离子进行结合，而在发酵液中存在着多种金属离子，因此通过草酸钠能够除去发酵液中存在的金属离子，提高产物纯度，增强安全性和有效性；
(6)在板框的过滤介质上预涂活性炭，从而起到助滤的作用，避免因待过滤的悬浮液中颗粒太小将滤板的空隙堵住，从而影响正常过滤。在过滤过程中，在一次板框上预涂的活性炭和二次板框上预涂的活性炭会有部分进入后续步骤中，但是由于需要采用活性炭进行脱色，因此不会对产物的纯度造成影响，反而能够助滤提高产物的收率和纯度；
(7)对培养基的组分的选择和比例进行优化设计，并通过工艺控制使各个组分之间发挥协同作用，提高万古霉素的收率和纯度。
附图说明
图1为工艺流程图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
表1实施例1-6为培养基的组分表
将实施例1-5的培养基均按照如下的制备方法进行制备：
步骤1：按照重量份，称取或者量取各组分；
步骤2：量取用水量的2/3，加热至沸腾。将碳源和剩余的1/3水混合搅拌，然后倒入上述沸水，继续加热，至碳源完全溶化，降到室温下加入氮源、无机盐和氨基酸复合物，搅拌溶解；
步骤3：加入pH调节剂，调节pH至7.2。
实施例6的培养基的制备方法与实施例1-5的培养基区别在于步骤2中未加入氨基酸复合物，步骤3中不加入pH调节剂调节pH。
参照图1，实施例7-9为万古霉素的制备
实施例7
选用按照实施例1制备的培养基。
步骤1：摇瓶种子接种、种子罐万古霉素培养基培养、发酵罐万古霉素培养基培养得到万古霉素发酵液。将万古霉素发酵液置于预处理罐中，控制转速为80rad/min，温度为25℃，加入发酵液体积的0.1％的质量分数为10％的盐酸进行成盐，搅拌30min得到预处理液。
步骤2：陶瓷膜过滤，选用多通道陶瓷膜，通道数为10，其膜材质为二氧化硅，孔径为0.2μm。采用错流模式进行循环过滤，压力控制为0.1MPa。
步骤3：经过陶瓷膜过滤后进入一次纳滤机组，纳滤采用孔径为0.5nm的芳香聚酰胺复合纳滤膜；纳滤过程中，压力控制在2.2MPa，滤液温度控制在25℃，纳滤的流速控制在400L/h，纳滤的浓缩体积倍数为4倍，纳滤结束，采用纯化水顶洗10min。
步骤4：经过一次纳滤后进入草酸沉淀罐，再加入一次纳滤得到的浓缩液重量的0.001％的固体草酸钠，搅拌时间50min后静置。
步骤5：进入一次板框过滤除去草酸沉淀罐中的沉淀，板框中过滤介质为滤板，滤板上预涂有2mm的助滤剂活性炭。
步骤6：进入一次过柱纯化，一次过柱纯化采用SP825树脂。
步骤7：将一次过柱纯化得到的洗脱液进入二次纳滤机组，纳滤采用孔径为0.5nm的芳香聚酰胺复合纳滤膜；纳滤过程中，压力控制在2MPa，滤液温度控制在25℃，纳滤的流速控制在400L/h，纳滤的浓缩体积倍数为4倍，纳滤结束，采用纯化水顶洗10min。
步骤8：进入一次结晶罐中进行一次结晶，加入二次纳滤得到的浓缩液的重量10倍的乙醇，起始温度控制为45℃，终点温度为15℃，降温速度为3℃/min。
步骤9：进入二次板框过滤得到一次结晶体，板框中过滤介质为滤板，滤板上预涂有2mm的助滤剂活性炭。
步骤10：将二次板框过滤得到的一次结晶体加入活性炭脱色罐，加入去离子水溶解，搅拌并加热，待一次结晶体的溶液沸腾时加入一次结晶体重量的6％的活性炭进行脱色30min。
步骤11：进入脱色板框进行脱色，脱色板框中过滤介质为滤板，滤板上预涂有2mm的助滤剂活性炭。
步骤12：将脱色板框中得到的过滤液进入二次过柱纯化，二次过柱纯化采用HS20SS树脂。
步骤13：进入超滤机组，超滤采用中空纤维超滤膜组件，超滤时，控制压力0.1MPa。
步骤14：进入三次纳滤机组，纳滤采用孔径为0.5nm的芳香聚酰胺复合纳滤膜；纳滤过程中，压力控制在2MPa，滤液温度控制在25℃，纳滤的流速控制在400L/h，纳滤的浓缩体积倍数为4倍，纳滤结束，采用纯化水顶洗10min。
步骤15：进入二次结晶罐中进行二次结晶，加入三次纳滤得到的浓缩液的重量10倍的乙醇，起始温度控制为45℃，终点温度为15℃，降温速度为3℃/min。
步骤16：真空抽滤至干燥。
步骤17：将真空抽滤得到的二次结晶体加入溶解罐中，加入二次结晶体重量12倍的去离子水，搅拌30min至二次结晶体完全溶解形成溶解液。
步骤18：置于冷冻干燥机内，-45℃冷冻4h，开启真空至15Pa以下进行升华，并升温至-10℃，在此温度保持真空10h，随后继续升温到0℃并保持真空5h。最后升温至30℃保持真空3h，打粉包装。
表2实施例7的HPLC数据表
实施例8
实施例8与实施例7的区别在于：
选用按照实施例2制备的培养基。
步骤1中，加入发酵液体积的0.5％的质量分数为12％的盐酸进行成盐；步骤2中，陶瓷膜过滤，选用多通道陶瓷膜，通道数为8；步骤3、7和14中，压力控制在2MPa，滤液温度控制在21℃，纳滤的流速控制在320L/h，纳滤的浓缩体积倍数为4倍，纳滤结束，采用纯化水顶洗8min；步骤4中，经过一次纳滤后进入草酸沉淀罐，再加入一次纳滤得到的浓缩液重量的0.002％的固体草酸钠，搅拌时间30min后静置；步骤8和15中，进入一次结晶罐中进行一次结晶，加入二次纳滤得到的浓缩液的重量10倍的乙醚，起始温度控制为37℃，终点温度为5℃，降温速度为2℃/min；步骤10中，待一次结晶体的溶液沸腾时加入一次结晶体重量的4％的活性炭进行脱色30min；步骤13中，超滤时，控制压力0.1MPa；步骤17中，加入二次结晶体重量9倍的去离子水。
实施例9
实施例9与实施例7的区别在于：
选用按照实施例3制备的培养基。
步骤1中，加入发酵液体积的0.2％的质量分数为16％的盐酸进行成盐；步骤2中，陶瓷膜过滤，选用多通道陶瓷膜，通道数为12；步骤3、7和14中，压力控制在2MPa，滤液温度控制在21℃，纳滤的流速控制在320L/h；纳滤的浓缩体积倍数为4倍，纳滤结束，采用纯化水顶洗8min；步骤4中，经过一次纳滤后进入草酸沉淀罐，再加入一次纳滤得到的浓缩液重量的0.002％的固体草酸钠，搅拌时间30min后静置；步骤8和15中，进入一次结晶罐中进行一次结晶，加入二次纳滤得到的浓缩液的重量10倍的乙醚，起始温度控制为37℃，终点温度为5℃，降温速度为2℃/min；步骤10中，待一次结晶体的溶液沸腾时加入一次结晶体重量的4％的活性炭进行脱色30min；步骤13中，超滤时，控制压力0.1MPa；步骤17中，加入二次结晶体重量9倍的去离子水。
表3实施例9的HPLC数据表
实施例10
实施例10与实施例7的区别在于：
选用按照实施例4制备的培养基。
步骤1中，加入发酵液体积的0.3％的质量分数为18％的盐酸进行成盐；步骤2中，陶瓷膜过滤，选用多通道陶瓷膜，通道数为14；步骤3、7和14中，压力控制在2.1MPa，滤液温度控制在22℃，纳滤的流速控制在360L/h；纳滤的浓缩体积倍数为5倍，纳滤结束，采用纯化水顶洗8min；步骤4中，经过一次纳滤后进入草酸沉淀罐，再加入一次纳滤得到的浓缩液重量的0.001％的固体草酸钠，搅拌时间35min后静置；步骤8和15中，进入一次结晶罐中进行一次结晶，加入二次纳滤得到的浓缩液的重量10倍的乙醇，起始温度控制为40℃，终点温度为0℃，降温速度为1℃/min；步骤10中，待一次结晶体的溶液沸腾时加入一次结晶体重量的5％的活性炭进行脱色30min；步骤13中，超滤时，控制压力0.2MPa；步骤17中，加入二次结晶体重量10倍的去离子水。
实施例11
实施例11与实施例7的区别在于：
选用按照实施例5制备的培养基。
步骤1中，加入发酵液体积的0.4％的质量分数为20％的盐酸进行成盐；步骤2中，陶瓷膜过滤，选用多通道陶瓷膜，通道数为16；步骤3、7和14中，压力控制在2.2MPa，滤液温度控制在23℃，纳滤的流速控制在340L/h；纳滤的浓缩体积倍数为4倍，纳滤结束，采用纯化水顶洗9min；步骤4中，经过一次纳滤后进入草酸沉淀罐，再加入一次纳滤得到的浓缩液重量的0.003％的固体草酸钠，搅拌时间45min后静置；步骤8和15中，进入一次结晶罐中进行一次结晶，加入二次纳滤得到的浓缩液的重量10倍的乙醚，起始温度控制为43℃，终点温度为12℃，降温速度为2℃/min；步骤10中，待一次结晶体的溶液沸腾时加入一次结晶体重量的4％的活性炭进行脱色30min；步骤13中，超滤时，控制压力0.1MPa；步骤17中，加入二次结晶体重量11倍的去离子水。
表4实施例11的HPLC数据表
实施例12
实施例12与实施例7的区别在于：
选用按照实施例6制备的培养基。
步骤1中，加入发酵液体积的0.2％的质量分数为16％的盐酸进行成盐；步骤2中，陶瓷膜过滤，选用多通道陶瓷膜，通道数为12；步骤3、7和14中，压力控制在2MPa，滤液温度控制在21℃，纳滤的流速控制在320L/h；纳滤的浓缩体积倍数为4倍，纳滤结束，采用纯化水顶洗8min；步骤4中，经过一次纳滤后进入草酸沉淀罐，再加入一次纳滤得到的浓缩液重量的0.002％的固体草酸钠，搅拌时间30min后静置；步骤8和15中，进入一次结晶罐中进行一次结晶，加入二次纳滤得到的浓缩液的重量10倍的乙醚，起始温度控制为37℃，终点温度为5℃，降温速度为2℃/min；步骤10中，待一次结晶体的溶液沸腾时加入一次结晶体重量的4％的活性炭进行脱色30min；步骤13中，超滤时，控制压力0.1MPa；步骤17中，加入二次结晶体重量9倍的去离子水。
表5对比例1-5数据表
表6实施例7-11和对比例1-5的收率和纯度表
注：说明书中只给出实施例7、9和11的HPLC表格，其余实施例8、10和12和对比例1-5的HPLC表格与之类似，此处便不详细描述，只给出最终的纯度数值。
从表6中可以看出：
对比实施例7-11和对比例1和2可得，当各组分的用量多于或者少于本发明给出的用量范围时，在收率和纯度上都有所降低，但多于本发明给出的用量范围时的收率和纯度均优于少于本发明给出的用量范围时的收率和纯度。
对比实施例7-11和对比例3-5可得，缺少pH调节剂和无机盐均会降低产品的收率和纯度，且同时缺少pH调节剂和无机盐对收率和纯度的影响要比单独缺少pH调节剂或者无机盐对收率和纯度的影响要大。同时可以看出，缺少无机盐对收率的影响大于缺少pH调节剂对收率的影响，缺少无机盐对纯度的影响小于缺少pH调节剂对纯度的影响。
对比实施例7-11和对比例6可得，虽然硝酸铵中的氮含量高于乙酸铵，但是将乙酸铵换成硝酸铵却导致收率和纯度均有所下降，可见乙酸铵在本发明中起到的作用不仅仅是作为氮源。
对比实施例7-11和实施例12可得，虽然实施例12对纯度和收率有一定的提升作用，但是当加入pH调节剂和氨基酸络合物后能够进一步提升纯度和收率。

Claims (10)

1.一种万古霉素培养基，其特征是：包括如下重量份数的组分：
碳源1.5-5份
氮源0.05-0.15份
无机盐0.15-0.45份
水90-110份
所述无机盐包括硫酸镍、硝酸铁和氯化钠，按照重量份，硫酸镍：硝酸铁：氯化钠=0.5-2:0.5-2:1。
2.根据权利要求1所述的万古霉素培养基，其特征是：还包括重量份为0.04-0.06份的pH调节剂，所述pH调节剂包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，按照摩尔比，磷酸二氢钠：磷酸氢二钠=0.15-0.19：1。
3.根据权利要求1所述的万古霉素培养基，其特征是：还包括甘氨酸、色氨酸、酪氨酸组成的重量份为0.05-0.1份的氨基酸复合物，按照重量份，甘氨酸：色氨酸：酪氨酸=3-8：1:3-5。
4.根据权利要求1所述的万古霉素培养基，其特征是：所述碳源选自可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖中的一种。
5.根据权利要求1所述的万古霉素培养基，其特征是：所述氮源由尿素、棉籽饼粉和乙酸铵混合而成，按照重量份，尿素：棉籽饼粉：乙酸铵=3-5:1:2-4。
6.一种应用万古霉素培养基的万古霉素制备方法，其特征是：包括如下步骤：摇瓶种子接种、种子罐万古霉素培养基培养、发酵罐万古霉素培养基培养、预发酵液预处理、陶瓷膜过滤、一次纳滤、草酸沉淀、一次板框过滤、一次过柱纯化、二次纳滤、一次结晶、二次板框过滤、活性炭脱色、脱色板框过滤、二次过柱纯化、超滤、三次纳滤、二次结晶、真空抽滤、晶体溶解、冷冻干燥、打粉包装，其中
①发酵液的预处理：按照发酵液体积的0.1-0.5%往万古霉素发酵液加入质量分数为10-20%的盐酸进行成盐，搅拌30min得到预处理液；
②草酸沉淀：将一次纳滤得到的浓缩液加入草酸沉淀罐，再加入一次纳滤得到的浓缩液重量的0.001-0.004%的固体草酸钠，搅拌30-50min后静置；
③活性炭脱色：将二次板框过滤得到的一次结晶体加入活性炭脱色罐，加入去离子水溶解，搅拌并加热，待一次结晶体的溶液沸腾时加入一次结晶体重量的3-6%的活性炭进行脱色30min。
7.根据权利要求6所述的万古霉素制备方法，其特征是：所述板框过滤中，过滤介质为滤板，所述滤板上预涂有2mm的助滤剂，所述助滤剂为活性炭。
8.根据权利要求6所述的万古霉素制备方法，其特征是：所述一次结晶和二次结晶过程中均加入晶体重量10倍的有机溶剂进行结晶，所述有机溶剂选用乙醇、丙酮和乙醚中的其中一种，所述一次结晶和二次结晶的起始温度为35-45℃，终点温度为0-15℃，降温速度为1-3℃/min。
9.根据权利要求6所述的万古霉素制备方法，其特征是：所述晶体溶解步骤为：将真空抽滤得到的二次结晶体加入溶解罐中，加入二次结晶体重量8-12倍的去离子水，搅拌30min至二次结晶体完全溶解形成溶解液。
10.根据权利要求6所述的万古霉素制备方法，其特征是：所述一次过柱纯化采用SP825树脂，所述二次过柱纯化采用HP20SS树脂。
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