CN1616358A - 由节杆菌制备生物絮凝剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种由节杆菌制备生物絮凝剂的方法，包括菌种发酵培养和生物絮凝剂的制备，选用节杆菌为生物絮凝剂菌种，经发酵培养和提取制得水处理生物絮凝剂。该方法与现有技术相比具有生产周期短、絮凝效率高、使用无二次污染、能够适应大规模生产及工业应用等特点，具有很好的推广应用价值。

Description

由节杆菌制备生物絮凝剂的方法

                  一、技术领域

本发明涉及一种水处理用絮凝剂的制备方法，具体地说是一种利用节杆菌制备生物絮凝剂的方法。

                   二、技术背景

现在在给水及污水处理中使用的絮凝剂有以铝系为代表的无机高分子类，以聚丙烯酰胺为代表的合成有机高分子类，研究表明，饮用水摄入过多的铝离子的人群中，老年性痴呆的比例较高，聚丙烯酰胺单体具有强烈的神经毒素和致癌作用。从甲壳素中提取的壳聚糖虽然可以作为絮凝剂，但是生产工艺复杂，资源非常有限。微生物絮凝剂是利用生物工程技术通过菌种发酵而生产的新型、高效水处理剂。除具备传统化学合成絮凝剂的作用外，微生物絮凝剂还具有无毒无害、使用安全、具有生物可降解性、生产原料易得、可大规模生产等优点。就目前科技发展趋势看，微生物絮凝剂具有替代化学合成同类产品的趋势。已经报导的微生物絮凝剂产生菌涉及到细菌、放线菌、霉曲和酵母菌，发酵生产都存在着原料成本高、发酵周期长、絮凝效率低的不足。

                     三、发明内容

本发明的目的是克服以上絮凝剂制备方法的不足，提供一种生产周期短、絮凝效率高、能够适应大规模生产及工业应用的由节杆菌制备生物絮凝剂的方法。

四、实施方式

本发明的目的是按以下方式实现的，选用节杆菌为生物絮凝剂菌种，经发酵培养和提取制得水处理生物絮凝剂，该生物絮凝剂的制备采用以下步骤：

a)菌种的制备

节杆菌(Arthrobacter Sp.)LF-Tou2，由土壤采样、分离获得。选择性的培养基重量组成(g/L)：

环己烷  5-15    (NH₄)₂SO₄   2-7      K₂HPO₄ 1-5   KH₂PO₄   1-4

MgSO₄  0.1-0.4 NaCl           0.05-0.3  琼脂粉   10-20   pH7.0-7.4。复筛培养基的重量组成(g/L)：

葡萄糖     7-12    (NH₄)₂SO₄ 2-5        K₂HPO₄ 1-5

KH₂PO₄  1-4     MgSO₄        0.1-0.5    NaCl     0.1-0.3

用作固体培养时加琼脂粉10-20       pH     7.0-7.4

接种后培养条件为170转/分，30℃摇床培养1-2天，测定发酵液的絮凝活性。

初选方法：用选择性筛选培养基制作平板，用土壤浸液涂布接种。30℃温箱培养1-7天，挑取生长快、透明圈大的菌落转于固体斜面、30℃温箱培养1-3天，4℃保存。

节杆菌的生理生化特征为：

能消解七叶灵，还原硝酸盐，有葡萄糖苷酶活性，能利用无机氮、柠檬酸、葡萄糖、木糖、蔗糖、纤维二糖、果糖、半乳糖等营养成分生长繁殖。不能水解淀粉、纤维素。

b)菌种发酵培养将节杆菌菌种按培养液总重量的1-2％的比例接种于配有液体发酵培养基的发酵罐中搅拌发酵，发酵温度为24-32℃，鼓入空气量为0.25-1.5L/L.分钟，pH＝7.0-7.4，搅拌培养1-2天备用；

液体发酵培养基是由以下重量配比原料组成：

葡萄糖8-15份，(NH₄)₂SO₄ 1-5份，K₂HPO₄ 0.1-1份，KH₂PO₄ 0.05-1份，MgSO₄ 0.1-1份，NaCl 0.2-1.5份，CaCl 0.2-1.5份，水1000份。

c)生物絮凝剂的制备：

(1)发酵液通过离心机离心分离10-40分钟，除去沉淀，取上清液备用；

(2)向上清液中加入0.05-0.15％钙离子和2.5倍体积的无水乙醇，室温静置30-60分钟，再用离心机离心分离10-20分钟，得絮凝剂粗品沉淀物备用；

(3)沉淀物用0.5-3.0％，pH＝5-6的氯化钠溶液溶解，用0.3-1倍沉淀物体积的十六烷基三甲基溴化铵吸附，再经离心分离得沉淀物备用；

(4)将沉淀用5-15％的氯化钠溶解搅拌6-18小时，加入2.5-3.5倍体积的乙醇，搅拌均匀，静置20-30分钟，离心得沉淀物，把沉淀物用无水乙醇醇洗和真空干燥得生物絮凝剂产品。

液体发酵培养基原料组成的优选重量配比为：

葡萄糖10-12份，(NH₄)₂SO₄ 2-3份，K₂HPO₄ 0.3-0.8份，KH₂PO₄ 0.1-0.6份，MgSO₄ 0.3-0.6份，NaCl 0.5-1份，CaCl 0.5-1份，水1000份。

液体发酵培养基原料组成的最佳重量配比为：

葡萄糖11份，(NH₄)₂SO₄ 2.5份，K₂HPO₄ 0.6份，KH₂PO₄ 0.4份，MgSO₄ 0.5份，NaCl 0.7份，CaCl 0.8份，水1000份。

使用离心机分离时转速控制在5000-10000转/分。

本发明的由节杆菌制备生物絮凝剂的方法与现有技术中各种絮凝剂的制备方法相比具有原料成本低、工艺简单、发酵周期短、生成的絮凝剂絮凝效率高、无毒无害、使用无二次污染、适应大规模生产及工业应用等特点，具有很好的推广使用价值。

四、实施例：

菌种的制备

由土壤采样、分离获得节杆菌(Arthrobacter Sp.)LF-Tou2

菌种筛选：

选择性菌种培养基配方(g/L)：

环己烷 10 (NH₄)₂SO₄  5  K₂HPO₄  3  KH₂PO₄  2

MgSO₄  0.2  NaCl  0.1琼脂粉  15 pH  7.0-7.4。

复选菌种培养基配方(g/L)：

葡萄糖   10    (NH₄)₂SO₄  3    K₂HPO₄    3

KH₂PO₄ 2    MgSO₄         0.2  NaCl        0.1

用作固体菌种培养时加琼脂粉15 pH 7.0-7.4

接种后菌种的培养条件为170转/分，30℃摇床培养1-2天，测定发酵液絮凝活性。

菌种的初选：

用选择性筛选培养基制作平板，用土壤浸液涂布接种。30℃温箱培养1-7天，挑取生长快、透明圈大的菌落转于固体斜面、30℃温箱培养1-3天，4℃保存。

菌种的复选：

从斜面上挑取菌苔接种于内有复选培养基的三角瓶，30℃，170转/分摇床培养I一2天，检测发酵液的活性，选出生物絮凝剂高产生菌株。

絮凝活性的检测：

在100ml刻度量筒内加入0.4％高岭土悬液97ml，5％CaCl2 2ml，用5％NaOH调pH为7.5，再加发酵液0.3ml，用蒸馏水补足为100ml，往复混匀30秒钟，静置沉淀5分钟，取刻度为50ml处的上清测定光密度。

生物絮凝剂的制备

取葡萄糖14kg、(NH₄)₂SO₄ 2kg、K₂HPO₄ 0.4kg、KH₂PO₄ 0.3kg、MgSO₄ 0.4kg、NaCl 0.3kg、CaCl 0.5kg置于水1000kg水中配成液体发酵培养基。按照培养液总重量2％的比例将节杆菌菌种接种于盛有上述液体发酵培养基的发酵罐中在28℃下搅拌发酵，培养1-2天。发酵过程中控制鼓入空气量在0.75L/L.min，pH＝7.0。

将前面得到的发酵液通过离心机离心分离30分钟，取上清液并向清液中加入0.10％钙离子和2.5倍体积的无水乙醇，室温静置30分钟，再用离心机离心分离15分钟，得絮凝剂粗品沉淀物。沉淀物用1.5％，pH＝5.5的氯化钠溶液溶解后，用0.6倍沉淀物体积的十六烷基三甲基溴化铵吸附，再经离心分离得沉淀物，再将该沉淀物用10％的氯化钠溶解搅拌12小时，加入3倍体积的乙醇，搅拌均匀，静置20分钟，离心得沉淀物，把沉淀物用无水乙醇醇洗和真空干燥得生物絮凝剂产品。

离心分离过程中离心机转速均控制在5000-7000转/分。

由本发明的方法生产的生物絮凝剂适用于各种含颗粒状杂质或污染物的污水处理，例如生活污水、食品工业排放的污水、地表水的净化处理，尤其对PH值在6-9范围内的污水有较好的处理效果。使用方法与其它水处理絮凝剂的使用方法相同。

Claims (3)

1、一种生物絮凝剂的制备方法，其特征在于选用节杆菌为生物絮凝剂菌种，经发酵培养和提取制得水处理生物絮凝剂，该生物絮凝剂的制备采用以下步骤：

a)菌种的制备

由土壤采样、分离获得节杆菌(Arthrobacter Sp.)LF-Tou2。选择性的培养基重量组成(g/L)：

环己烷    5-15         (NH₄)₂SO₄  2-7         K₂HPO₄   1-5     KH₂PO₄   1-4

MgSO₄     0.1-0.4      NaCl       0.05-0.3    琼脂粉   10-20   pH       7.0-7.4复筛培养基的重量组成(g/L)：

葡萄糖   7-12   (NH₄)₂SO₄  2-5         K₂HPO₄   1-5

KH₂PO₄   1-4    MgSO₄      0.1-0.5     NaCl     0.1-0.3

用作固体培养时加琼脂粉     10-20       pH       7.0-7.4

接种后培养条件为170转/分，30℃摇床培养1-2天，测定发酵液的絮凝活性。

初选方法：用选择性筛选培养基制作平板，用土壤浸液涂布接种。30℃温箱培养1-7天，挑取生长快、透明圈大的菌落转于固体斜面、30℃温箱培养1-3天，4℃保存。

b)菌种发酵培养

将初选出节杆菌菌种按培养液总重量的1-2％的比例接种于配有液体发酵培养基的发酵罐中搅拌发酵，发酵温度为24-32℃，鼓入空气量为0.25-1.5L/L分钟，pH＝7.0-7.4，搅拌培养1-2天备用；

c)生物絮凝剂的制备：

液体发酵培养基是由以下重量配比原料组成：

葡萄糖8-15份，(NH₄)₂SO₄ 1-5份，K₂HPO₄ 0.1-1份，KH₂PO₄ 0.05-1份，MgSO₄ 0.1-1份，NaCl 0.2-1.5份，CaCl 0.2-1.5份，水1000份。

(1)发酵液通过离心机离心分离10-40分钟，除去沉淀，取上清液备用；

(2)向上清液中加入0.05-0.15％钙离子和2.5倍体积的无水乙醇，室温静置30-60分钟，再用离心机离心分离10-20分钟，得絮凝剂粗品沉淀物备用；

(3)沉淀物用0.5-3.0％，pH＝5-6的氯化钠溶液溶解，用0.3-1倍沉淀物体积的十六烷基三甲基溴化铵吸附，再经离心分离得沉淀物备用；

(4)将沉淀用5-15％的氯化钠溶解搅拌6-18小时，加入2.5-3.5倍体积的乙醇，搅拌均匀，静置20-30分钟，离心得沉淀物，把沉淀物用无水乙醇醇洗和真空干燥得生物絮凝剂产品。

2、根据权利要求1所述的由节杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于液体发酵培养基是由以下重量配比原料组成：

葡萄糖10-12份，(NH₄)₂SO₄ 2-3份，K₂HPO₄ 0.3-0.8份，KH₂PO₄ 0.1-0.6份，MgSO₄ 0.3-0.6份，NaCl 0.5-1份，CaCl 0.5-1份，水1000份。

3、根据权利要求1所述的由节杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于离心机的转速控制在5000-10000转/分。