CN103408639B

CN103408639B - 一种高纯度万古霉素的制备方法

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Publication number: CN103408639B
Application number: CN201310311871.0A
Authority: CN
Inventors: 黄志强; 吕述权; 黄娟; 林东态; 魏华; 陈秉梅
Original assignee: Livzon Group Fuzhou Fuxing Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Livzon Group Fuzhou Fuxing Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-07-23
Also published as: CN103408639A

Abstract

本发明涉及抗生素生产技术领域，具体涉及一种高纯度万古霉素的制备方法，包括以下步骤：将万古霉素脱色液在层析介质中进行柱层析，所述层析介质为UniPMM50CAR，层析的流动相中NH₄HCO₃质量体积浓度为0.2-0.7%；在检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集层析液，用盐酸将层析液pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存层析液，合并收集的层析液。本发明步技术方案不会出现碳酸盐的分解而造成柱体起泡，提高了塔板数，提高了分离的效率，并且得到的万古霉素外观大大改善，纯度高达99%，能够用于口服或注射给药。

Description

一种高纯度万古霉素的制备方法

技术领域

本发明涉及抗生素生产技术领域，具体涉及一种高纯度万古霉素的制备方法。

背景技术

万古霉素是东方诺卡氏菌在控制发酵条件下产生的一种两性糖肽类抗生素，其化学式为C₆₆H₇₅C_l2N₉O₂₄，分子量为1486。通过微生物Amycolatopisorientalis发酵制备万古霉素的方法已经在美国专利US3,067,099（1995年申请）和W091/08,300中更为详细的描述。万古霉素是目前治疗盘尼西林耐药菌感染者和β-内酰胺类抗生素过敏症的首选药，被国际抗生素专家誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”。

万古霉素最初的外号叫“密西西比污泥”，因为其早期制剂的外观呈灰褐色，纯度只有70%左右，杂质多是其不良反应比较多的原因。据研究表明纯度95%的万古霉素的红人综合征发生率为3.4%，纯度81-89%的万古霉素的红人综合征发生率为30%；高纯度的万古霉素输注后皮疹发生率为1.7%，相对的，低纯度的万古霉素输注后皮疹发生率为14.4%，因此提高万古霉素的纯度可以有效的降低不良反应的发生。随着人们对药品的安全意识的加强，药界对万古霉素的纯度要求越来越高。在万古霉素原料药市场上，价格也是与纯度呈直接的相关，纯度高的万古霉素拥有更加强竞争力。

万古霉素的纯度直接受到分离纯化工艺的影响。万古霉素的分离纯化方法主要有色谱制备法、沉淀法、亲和吸附法、反胶团萃取法、双水相萃取法等，但亲和吸附法、色谱制备法的处理规模小、生产成本较高；反胶团萃取法和双水相萃取法的影响因素复杂，提取率不高；沉淀法处理规模大、生产成本较低，但是鉴于万古霉素属于酚苷化合物，在强碱条件下不稳定，容易造成万古霉素变性。如公开号为CN1033997的中国发明专利公开了一种改进的万古霉素的沉淀法，从pH至少约为7.8的水溶液中静止沉淀万古霉素，但是该方法操作较为复杂，要求万古霉素粗品的浓度不得低于75mg/ml，并且由于在强碱条件下进行沉淀，万古霉素变色较为严重。

为了提高生产效率，降低生产成本同时得到高纯度的万古霉素，也有将两种方法组合使用的。如公开号为CN101440127A的中国发明专利将色谱纯度不低于80%的万古霉素粗品经过层析柱，然后使用沉淀法，将亲和吸附法和沉淀法结合，得到纯度高于96%的万古霉素。CN101440127A使用的是Sephadex C系列树脂为填料，用4-6%（w/v)NH₄HCO₃水溶液洗脱的方法纯化，过柱过程中NH₄HCO₃会分解起泡，从而影响分离效率。另外，CN101440127A沉淀法用的是加NaCl盐析万古霉素的方法，其盐析耗费的时间长达24-48小时（见实施例17-22），分离时间长，生产效率低。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种高纯度的万古霉素的分离提纯方法，耗时短，生产效率高，并且得到的万古霉素外观大大改善，纯度高达99%，能够用于口服或注射给药。

本发明的技术方案为提供一种高纯度万古霉素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将万古霉素脱色液在含有NH₄HCO₃流动相的层析介质中进行柱层析，所述层析介质为UniPMM50CAR，所述NH₄HCO₃流动相中NH₄HCO₃质量体积浓度为0.2-0.7%；在检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集层析液，用盐酸将层析液pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存层析液，合并收集的层析液。

优选的上述的高纯度万古霉素的制备方法中，所述流动相以流量为2.5倍柱体积/小时进行洗脱。

优选的上述的高纯度万古霉素的制备方法具体为：

S1：将万古霉素脱色液在含有NH₄HCO₃流动相的层析介质中进行柱层析，所述层析介质为UniPMM50CAR，所述NH₄HCO₃流动相中NH₄HCO₃质量体积浓度为0.2-0.7%；在检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集层析液，用盐酸将层析液pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存；

S2：将步骤S1所得分段收集的层析液合并，纳滤浓缩，用氨水调pH至6-7，加入还原剂，将pH调至8-9，搅拌4-10h后，抽滤得万古霉素；所述还原剂为亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、硫代甘油、半胱氨酸、抗败血酸、抗败血酸酯、氢醌、甘氨酸、苯丙氨酸中的一种或几种；

S3：冷冻干燥得万古霉素冻干粉。

优选的上述的高纯度万古霉素的制备方法中，所述步骤S2中所述还原剂为亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠质量体积浓度为0.6-0.8%。

优选的上述的高纯度万古霉素的制备方法包括以下具体步骤：

S1：将万古霉素脱色液在含有NH₄HCO₃流动相的层析介质中进行柱层析，所述层析介质为UniPMM50CAR，所述NH₄HCO₃流动相中NH₄HCO₃质量体积浓度为0.2-0.7%；在检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集层析液，将层析液pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存层析液；

S2：将步骤S1所得分段收集的层析液合并，纳滤浓缩，用氨水调pH至6-7，加入还原剂，将pH调至8-9，搅拌4-10h后，抽滤得万古霉素；

S3：将步骤S2得到的万古霉素溶于水，万古霉素水溶液在含有NH₄HCO₃流动相的层析介质中进行柱层析，所述层析介质为UniPMM50CAR，所述NH₄HCO₃流动相中NH₄HCO₃质量体积浓度为0.2-0.7%；检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集，将层析液pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存层析液；

S4：将步骤S3得到的收集的层析液合并，纳滤浓缩，得万古霉素水溶液在大孔吸附树脂中进行柱层析，在检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集，将层析液pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存层析液；

S5：将步骤S4分段收集液合并，纳滤浓缩，调pH至6-7，加入还原剂，将pH调至8-9，缓慢搅拌4-10h后，抽滤得万古霉素；

S6：冷冻干燥得万古霉素冻干粉。

优选的上述的高纯度万古霉素的制备方法中，所述步骤S4中分段收集液纳滤浓缩后万古霉素的浓度为60mg/mL-65mg/mL。

优选的上述的高纯度万古霉素的制备方法中，所述步骤S4中采用的大孔吸附树脂为HP20SS，流动相为质量体积浓度为1-3%的乙醇。

优选的上述的高纯度万古霉素的制备方法中，所述步骤S2和步骤S5中所述还原剂为亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠质量体积浓度为0.6-0.8%。

优选的上述的高纯度万古霉素的制备方法中，所述步骤S1和步骤S3还包括使用的层析介质的预处理，所述层析介质的预处理为，用1.3%NH₃HCO₃洗脱，洗脱速度为2.7倍柱体积/小时，然后用纯化水洗脱，洗脱速度为2.7倍柱体积/小时。

优选的上述的高纯度万古霉素的制备方法包括以下步骤：

S1：层析介质预处理：所述层析介质为UniPMM50CAR，用1.3%NH₃HCO₃洗脱，洗脱速度为2.7倍柱体积/小时，然后用纯化水洗脱，洗脱速度为2.7倍柱体积/小时；

将万古霉素的色谱纯度为80%的万古霉素脱色液pH调节至3.0-4.0，0.45μm滤膜过滤；然后在含有NH₄HCO₃流动相的经过上述层析介质预处理的层析介质中进行柱层析，所述NH₄HCO₃流动相以流量为0.5-5倍柱体积/小时进行洗脱，所述NH₄HCO₃流动相中NH₄HCO₃质量体积浓度为0.2-0.7%；

检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集层析液，将层析液用pH用盐酸调至3.0-3.5，4℃条件下保存层析液；

S2：将步骤S1所得分段收集的层析液合并，纳滤浓缩，用氨水调pH至6-7，加入还原剂，将pH调至8-9，搅拌4-10h后，抽滤得万古霉素，所述还原剂为亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠质量体积浓度为0.6-0.8%；

S3：将步骤S2得到的万古霉素溶于水，pH调节至3.0-4.0，用0.45μm滤膜过滤，万古霉素水溶液在含有NH₄HCO₃流动相的层析介质中进行柱层析，所述层析介质为步骤S1预处理过的层析介质，所述NH₄HCO₃流动相以流量为2.7倍柱体积/小时的速度进行洗脱，所述NH₄HCO₃流动相中NH₄HCO₃质量体积浓度为0.2-0.7%；

检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集，pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存层析液；

S4：将步骤S3得到的层析液合并，纳滤浓缩，纳滤浓缩后万古霉素的浓度为45mg/mL-65mg/mL，将其pH调节至3.0-4.0，用0.45μm滤膜过滤，将所得万古霉素水溶液在含有乙醇流动相的大孔吸附树脂中进行柱层析，所述大孔吸附树脂为HP20SS，所述乙醇流动相为质量体积浓度为1-3%的乙醇，检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集层析液，pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存层析液；

S5：将步骤S4分段收集的层析液合并，纳滤浓缩，纳滤浓缩后万古霉素的浓度为45mg/mL-65mg/mL，调pH至6-7，加入还原剂，将pH调至8-9，搅拌4-10h后，抽滤得万古霉素，所述还原剂为亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠质量体积浓度为0.6-0.8%；

S6：冷冻干燥得万古霉素冻干粉。

本发明有益效果：本发明技术方案中的层析柱介质使用的是粒度比Sephadex C树脂粒度小、溶胀率低的树脂，装柱后柱体紧实，并且本工艺洗脱速度较快，不会出现NH₄HCO₃洗脱过程中，出现碳酸盐的分解而造成柱体起泡，提高了塔板数，提高了分离的效率。本发明分离提纯方法，耗时短，生产效率高，并且得到的万古霉素外观大大改善，纯度高达99%，能够用于口服或注射给药。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。

本实施方式

实施例1NH₄HCO₃流动相浓度

取万古霉素色谱纯度为84%，浓度25-30g/L的脱色液2L，以30g/L承载体积量上柱，pH3.0-4.0之间，0.45μm滤膜过滤，脱色液通过装有UniPMM50CAR填料树脂的5.5mm×90cm的有机玻璃层析柱。吸附后，以流量为2.5倍柱体积/小时，2倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为2.5倍柱体积/小时，用5倍柱体积的0.3%（w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为2.5倍柱体积/小时，用5倍柱体积的0.4%NH₄HCO₃水溶液作为流动相将万古霉素洗脱下来。通过进行HPLC检测层析收集液的万古霉素纯度，检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集层析液，用盐酸将pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存，合并收集的层析液，检测其色谱纯度。

层析柱介质使用的是粒度比Sephadex C树脂粒度小、溶胀率低的树脂，装柱后柱体紧实，不会出现NH₄HCO₃洗脱过程中，不会出现碳酸盐的分解而造成柱体起泡。

表1

NH₄HCO₃流动相浓度（w/v)	色谱纯度	收率
			0.3%	94.5%	60.2%
0.4%	95.5%	78.2%
			0.5%	93.1%	82.7%
0.6%	90.4%	85.1%
			0.7%	88.9%	86.4%

表1为按实施1中万古霉素的制备方法，不同NH₄HCO₃流动相浓度对于万古霉素纯化工艺的所得的万古霉素色谱纯度和万古霉素的收率的影响，NH₄HCO₃流动相浓度为0.4%（w/v)时，万古霉素色谱纯度和万古霉素的收率最佳。

实施例2NH₄HCO₃流动相洗脱速度

取万古霉素色谱纯度为84%，浓度25-30g/L脱色液2L，以30g/L承载体积量上柱，pH3.0-4.0之间，0.45μm滤膜过滤，脱色液通过装有UniPMM50CAR树脂的5.5cm×90cm的玻璃层析柱。吸附后，以流量为2.5倍柱体积/小时，2倍柱体积的纯水冲洗。

预洗后，用5倍柱体积的0.4%（w/v）NH₄HCO₃水溶液作为流动相将万古霉素洗脱下来。进行HPLC检测层析收集液的万古霉素纯度，检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集层析液，用盐酸将pH调至3.0-3.5，4℃条件下合并收集的层析液，检测其色谱纯度。

表2

表2为按实施例2中万古霉素的制备方法，不同NH₄HCO₃流动相的洗脱速度对于万古霉素纯化工艺的所得的万古霉素色谱纯度和万古霉素的收率的影响，NH₄HCO₃流动相速度为2.5倍柱体积/小时，万古霉素色谱纯度和万古霉素的收率最佳。

实施例3

取万古霉素色谱纯度为84%，浓度25-30g/L脱色液2L，以30g/L承载体积量上柱，pH3.0-4.0之间，0.45μm滤膜过滤，脱色液通过装有UniPMM50CAR树脂的5.5cm×90cm的玻璃层析柱。吸附后，以流量为2.5倍柱体积/小时，5倍柱体积的纯水冲洗。

预洗后，以流量为2.5倍柱体积/小时，用5倍柱体积的0.4%（w/v）NH₄HCO₃水溶液作为流动相将万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并用紫外检测仪检测，检测仪波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集，并且进行HPLC检测层析收集液的万古霉素纯度，pH用盐酸调至3.0-3.5之间，4℃条件下保存。

表3

表3为按实施例3中万古霉素的制备方法，NH₄HCO₃流动相的洗脱速度为2.5倍柱体积时，NH₄HCO₃流动相的为0.4%（w/v)时，收集总量为47.13g(万古霉素B色谱纯度≥93%)，收率达到了78.4%，解析液的色谱纯度和收率都达到了较好的效果。

实施例4万古霉素的沉淀-还原剂

取实施例1-3中的分段收集液，纳滤浓缩至60-65mg/ml，用氨水调pH至6-7，加入还原剂，缓慢将pH调至8-9，缓慢搅拌5小时后，用布氏漏斗以滤纸抽滤。

表4

表4为按实施例4的万古霉素的制备方法，不同还原剂的种类对于万古霉素纯化工艺的所得的万古霉素色谱浓度、万古霉素的收率和万古霉素的颜色的影响，当使用亚硫酸氢钠作为还原剂时，万古霉素色谱浓度和万古霉素的收率最佳，万古霉素的杂色少。

实施例5万古霉素沉淀-分段收集液纳滤浓缩后万古霉素的浓度

取实施例1-3中的分段收集的层析液，纳滤浓缩，用氨水调pH至6-7，加入亚硫酸氢钠，缓慢将pH调至8-9，缓慢搅拌5小时后，用布氏漏斗以滤纸抽滤。

表5

表5为按实施例5的万古霉素的制备方法，不同纳滤浓缩后万古霉素溶液浓度对于万古霉素纯化工艺的所得的万古霉素色谱纯度、万古霉素的收率和万古霉素的颜色的影响，当纳滤浓缩后万古霉素溶液浓度为60-65mg/ml时，万古霉素色谱浓度和万古霉素的收率最佳，万古霉素的杂色少。

实施例6

取实施例3中的分段收集液，纳滤浓缩至万古霉素浓度为60-65mg/ml，用氨水调pH至6-7，加入亚硫酸氢钠，缓慢将pH调至8-9，缓慢搅拌5小时后，用布氏漏斗以滤纸抽滤。

取上述制备的万古霉素溶于纯水，搅拌得到35mg/ml的万古霉素溶液，用盐酸调节pH至3.0-3.5,0.45μm滤膜过滤，万古霉素溶液通过装有UniPMM50CAR树脂填料的5.5cm×90cm的玻璃层析柱。吸附后，以流量为2.5倍柱体积/小时，5倍柱体积的纯水冲洗。

预洗后，以流量为2.5倍柱体积/小时，用5倍柱体积的0.4%（w/v）NH₄HCO₃水溶液作为流动相将万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并用HPLC检测层析收集液的万古霉素纯度，pH用盐酸调至3.0-3.5之间，4℃条件下保存。

实施例7

取实施例6制备的万古霉素分段收集液，纳滤浓缩得到35mg/ml的万古霉素溶液，调节pH至3.0-3.5,0.45μm滤膜过滤，万古霉素溶液通过装有HP20SS树脂的5.5cm×50cm的玻璃层析柱。吸附后，纯化水预洗，洗脱速度为0.5倍柱体积/小时，用量为0.4倍柱体积。

纯水预洗后，以洗脱速度为0.5倍柱体积/小时，pH为3.2的2%乙醇洗脱。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并用紫外检测仪检测，检测仪波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集，并且进行HPLC检测层析收集液的万古霉素纯度，pH用盐酸调至3.0-3.5之间，4℃条件下保存。

实施例8

取实施例7中的分段收集液，纳滤浓缩至60-65mg/ml，用氨水调pH至6-7，加入还原剂，缓慢将pH调至8-9，缓慢搅拌5小时后，用布氏漏斗以滤纸抽滤。

表6

表6为按实施例8的万古霉素的制备方法，不同还原剂的种类对于万古霉素纯化工艺的所得的万古霉素色谱浓度、万古霉素的收率和万古霉素的颜色有着较大的影响，当使用亚硫酸氢钠作为还原剂时，万古霉素色谱浓度和万古霉素的收率最佳，万古霉素的杂色少。

实施例9万古霉素沉淀-分段收集液纳滤浓缩后万古霉素的浓度

取实施例7中的分段收集液，纳滤浓缩，用氨水调pH至6-7，加入亚硫酸氢钠，缓慢将pH调至8-9，缓慢搅拌5小时后，用布氏漏斗以滤纸抽滤。

表7

表7为按实施例9的万古霉素的制备方法，不同纳滤浓缩后万古霉素溶液浓度对于万古霉素纯化工艺的所得的万古霉素色谱浓度、万古霉素的收率和万古霉素的颜色的影响，当纳滤浓缩后万古霉素溶液浓度为60-65mg/ml时，万古霉素色谱浓度和万古霉素的收率最佳，万古霉素的杂色少。

实施例10

取实施例7中的分段收集液，纳滤浓缩至万古霉素浓度为60-65mg/ml，用氨水调pH至6-7，加入亚硫酸氢钠，缓慢将pH调至8-9，缓慢搅拌5小时后，用布氏漏斗以滤纸抽滤。冷冻干燥得万古霉素冻干粉。

实施例11

参考CN101440127A的实施例，具体步骤如下：

取万古霉素脱色液纳滤浓缩至万古霉素浓度至53mg/ml，用盐酸调节pH至5.0，得到万古霉素溶液。取万古霉素溶液150mL，万古霉素溶液通过装有葡聚糖Sephadex CM-25的20mm×60cm的玻璃层析柱。每个层析柱盐酸万古霉素的加样量为添加在层析柱中倍柱体积的4.2%(bons／L)。吸附阶段用于提高吸附效果。首先，以流量为1.0倍柱体积／小时，向葡聚糖层析柱中添加0.15倍柱体积的万古霉素溶液，然后以相同流量用0.7倍柱体积的纯水冲洗。再次加0.15倍柱体积的万古霉素溶液，并且以流量为1.0倍柱体积/时，0.7倍柱体积的纯水冲洗。吸附后，以流量为2.0倍柱体积／小时，6倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为2.5倍柱体积／小时，用16倍柱体积的0.4%(W/V)的NH₄HC0₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为1倍柱体积／小时，用4%(w/v)NH₄HC0₃水溶液将盐酸万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并且进行HPLC检测使得在有效洗脱罐收集的洗脱液中万古霉素的HPLC含量不少于90%，效价不低于2000IU/ml，用4mol/L HCL溶液酸化调整至pH=3.2。

对酸化的万古霉素洗脱液进行超滤。超滤膜采用1OOOODa，超滤的回流温度控制在10～11℃。用纯化水洗涤滤渣，并且控制滤渣的效价和体积分别不超过2000IU/ml和1OOL。

超过滤通过纳滤膜进行过滤，除去盐分并浓缩，纳滤膜采用400Da。溶液的温度控制在10～20℃。分步加入纯化水直到浓缩物效价在150，000和250，OOOIU/ml之间，电导率不超过2000Lis/cm。加入0.05%±0.Ol%的乙二胺四乙酸(W/bons)(制备乙二胺四乙酸并以(5±1)%(W／v)乙二胺四乙酸溶液加入），并通过0.45lim(PVDF)和0.22lim(PES)的滤膜过滤得到浓缩物。

取万古霉素浓缩液1.OL，通过0.45μm和0.2μm的滤芯过滤后边搅拌边加入30%的NaCl水溶液233mL，万古霉素从中析出，形成了浆状物，继续搅拌60MIN，使其混合均匀，停搅拌静置48小时，过程温度控制在10～11℃。混合物通过过滤分离并先用400mL90%乙醇项洗，顶洗结束是顶洗液电导率为345μs/cm，然后用400mL无水乙醇顶洗，得到了盐酸万古霉素湿品222.5g，湿品通过干燥去除残留乙醇后得到粉168.2g，再通过冻干后得到万古霉素成品。

表8

表8为根据实施例11制备的万古霉素原料药和本发明方法制备的万古霉素原料药的效果对比，两组万古霉素原料药稳定性试验后，颜色有些加深，但是根据实施例11制备的万古霉素原料药颜色加深程度比本发明制备的万古霉素原料药严重；根据实施例11制备的万古霉素原料药的色谱纯度在稳定性试验前就低于本发明制备的万古霉素原料药；稳定性试验后，色谱纯度都有所降低，但是根据实施例11制备的万古霉素原料药色谱纯度降低程度比本发明制备的万古霉素原料药严重。因此，根据本发明的方法制备万古霉素原料药的稳定性优于根据实施例11制备的万古霉素原料药，本发明涉及的提纯方法较优。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种高纯度万古霉素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将万古霉素脱色液在含有NH₄HCO₃流动相的层析介质中进行柱层析，所述层析介质为UniPMM50CAR，所述NH₄HCO₃流动相中NH₄HCO₃质量体积浓度为0.2-0.7％；所述流动相以流量为2.5倍柱体积/小时进行洗脱，在检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集层析液，将层析液pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存层析液；

S3：将步骤S2得到的万古霉素溶于水，万古霉素水溶液在含有NH₄HCO₃流动相的层析介质中进行柱层析，所述层析介质为UniPMM50CAR，所述NH₄HCO₃流动相中NH₄HCO₃质量体积浓度为0.2-0.7％；检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集，将层析液pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存层析液；

S5：将步骤S4分段收集液合并，纳滤浓缩，调pH至6-7，加入还原剂，将pH调至8-9，缓慢搅拌4-10h后，抽滤得万古霉素；所述步骤S2和步骤S5中所述还原剂为亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠质量体积浓度为0.6-0.8％；

S6：冷冻干燥得万古霉素冻干粉。

2.根据权利要求1所述的高纯度万古霉素的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中分段收集的层析液纳滤浓缩后，所得万古霉素水溶液的浓度为60mg/mL-65mg/mL。

3.根据权利要求1所述的高纯度万古霉素的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中采用的大孔吸附树脂为HP20SS，流动相为质量体积浓度为1-3％的乙醇。

4.根据权利要求1所述的高纯度万古霉素的制备方法，其特征在于，所述步骤S1和步骤S3还包括使用的层析介质的预处理，所述层析介质的预处理为，用1.3％NH₃HCO₃洗脱，洗脱速度为2.7倍柱体积/小时，然后用纯化水洗脱，洗脱速度为2.7倍柱体积/小时。

5.根据权利要求1所述的高纯度万古霉素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：层析介质预处理：所述层析介质为UniPMM50CAR，用1.3％NH₃HCO₃洗脱，洗脱速度为2.7倍柱体积/小时，然后用纯化水洗脱，洗脱速度为2.7倍柱体积/小时；

将万古霉素的色谱纯度为80％的万古霉素脱色液pH调节至3.0-4.0，0.45μm滤膜过滤；然后在含有NH₄HCO₃流动相的经过上述层析介质预处理的层析介质中进行柱层析，所述NH₄HCO₃流动相以流量为0.5-5倍柱体积/小时进行洗脱，所述NH₄HCO₃流动相中NH₄HCO₃质量体积浓度为0.2-0.7％；

S2：将步骤S1所得分段收集的层析液合并，纳滤浓缩，用氨水调pH至6-7，加入还原剂，将pH调至8-9，搅拌4-10h后，抽滤得万古霉素，所述还原剂为亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠质量体积浓度为0.6-0.8％；

S3：将步骤S2得到的万古霉素溶于水，pH调节至3.0-4.0，用0.45μm滤膜过滤，万古霉素水溶液在含有NH₄HCO₃流动相的层析介质中进行柱层析，所述层析介质为步骤S1预处理过的层析介质，所述NH₄HCO₃流动相以流量为2.7倍柱体积/小时的速度进行洗脱，所述NH₄HCO₃流动相中NH₄HCO₃质量体积浓度为0.2-0.7％；

S4：将步骤S3得到的层析液合并，纳滤浓缩，纳滤浓缩后万古霉素的浓度为45mg/mL-65mg/mL，将其pH调节至3.0-4.0，用0.45μm滤膜过滤，将所得万古霉素水溶液在含有乙醇流动相的大孔吸附树脂中进行柱层析，所述大孔吸附树脂为HP20SS，所述乙醇流动相为质量体积浓度为1-3％的乙醇，检测波长280nm，吸光度升至40时，开始分段收集层析液，pH调至3.0-3.5，4℃条件下保存层析液；

S5：将步骤S4分段收集的层析液合并，纳滤浓缩，纳滤浓缩后万古霉素的浓度为45mg/mL-65mg/mL，调pH至6-7，加入还原剂，将pH调至8-9，搅拌4-10h后，抽滤得万古霉素，所述还原剂为亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠质量体积浓度为0.6-0.8％；

S6：冷冻干燥得万古霉素冻干粉。