CN107629070B - 一种氨基甲酸酯类化合物及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抑菌剂领域，具体地说是一种海藻内生真菌来源的天然氨基甲酸酯类化合物及其制备方法和在抑菌方面的应用。具体结构式如(I)所示，其制备方法为将海藻内生真菌杂色曲霉(Aspergillus versicolor)DL‑29接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物经分离纯化后，即为式(I)所示的氨基甲酸酯类化合物。本发明获得的生物碱类化合物，经抑菌活性实验得出化合物的最小抑菌浓度可达4微克/毫升。

Description

一种氨基甲酸酯类化合物及其制备和应用

技术领域

本发明涉及抑菌剂领域，具体地说是一种海藻内生真菌来源的天然氨基甲酸酯类化合物及其制备方法和在抑菌方面的应用。

背景技术

水产养殖业在国民经济中占有重要的比重，目前水产养殖种类多样，但几乎所有养殖品种都受到疾病威胁。水产养殖病害频发，不仅造成重大的经济损失，也为水产品质量安全埋下了隐患。据水产养殖动物病害监测结果显示，近年来水产养殖病害种类高达200余种，其中细菌性疾病占48.0％以上。在细菌性水产动物疾病中，由弧菌属细菌引起的弧菌病是最主要的细菌性疾病，该病发生范围广、致死率高，且能够引起人畜共患，是水产养殖病害防治领域的主要难题之一。

近年来，随着水产养殖规模的发展和水产养殖过程中传统型抗生素的大量使用，水产养殖动物病原菌和养殖环境中细菌的多重耐药现象日趋普遍，并且化学合成药物的大量使用对水体和土壤带来了严重的污染，对生物和人类健康都造成了直接和潜在的危害。

与水产养殖业中使用的传统抗生素和化学合成药物相比，海洋生物源天然药物具有安全性高、针对性强、活性显著、对环境友好且能够解决目前大部分水产病害细菌对传统抗生素的耐药性问题，为解决目前水产养殖过程中的细菌性病害防治问题提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种氨基甲酸酯类化合物及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种氨基甲酸酯类化合物，氨基甲酸酯类化合物结构如式(I)所示

一种氨基甲酸酯类化合物的制备方法，将杂色曲霉(Aspergillusversicolor)DL-29接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物纯化后，即为式(I)所示的氨基甲酸酯类化合物；所述的杂色曲霉(Aspergillusversicolor)DL-29于2011年11月25日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2011421；

具体制备步骤：

1)将杂色曲霉(Aspergillus versicolor)DL-29接种于真菌培养基中静止发酵5-100天，而后经有机溶剂提取并浓缩，即为粗提物；

2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂洗脱体系进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；

3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和薄层层析分离纯化，纯化收集Rf值为0.5－0.6的组分，即得如式(I)所示的氨基甲酸酯类化合物。

所述步骤1)中真菌培养基为大米固体培养基、马铃薯葡萄糖液体培养基、麦芽汁培养基或菊芋葡萄糖液体培养基。有机溶剂提取液为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中一种或几种。

步骤2)中的有机溶剂洗脱体系为石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、石油醚-丙醇、石油醚-异丙醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、二氯甲烷-丙醇、二氯甲烷-异丙醇中的一种或几种；其中，有机溶剂洗脱体系内两有机溶剂的体积比均为50-0:1。

所述步骤3)中收集步骤2)中以洗脱液体积比20-0:1梯度的洗脱组分，而后进行纯化；其中所述反相硅胶柱层析洗脱液为体积比4-0:1的水-甲醇或水-乙醇；凝胶柱层析洗脱液为体积比2-0:1的二氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇；薄层层析展开剂为体积比为2-0:1的石油醚-乙酸乙酯或二氯甲烷-乙酸乙酯。

一种氨基甲酸酯类化合物的应用，所述式(I)所示的氨基甲酸酯类化合物用于制备细菌的抑菌剂。

所述细菌为水产病害细菌的溶藻弧菌、藤黄微球菌或铜绿假单胞菌。

本发明具有以下优点：本发明通过分离于海洋绿藻刺松藻的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)DL-29发酵经提取、分离获得的氨基甲酸酯类化合物，经抑菌活性实验得出化合物对水产病害细菌-溶藻弧菌的最小抑菌浓度为4微克/毫升，同时该化合物还对水产病害细菌-藤黄微球菌和铜绿假单胞菌具有抑菌活性。

具体实施方式：

下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。

实施例1

海藻内生真菌来源的氨基甲酸酯类化合物结构如式(I)所示。

实施例2

如式(I)所示的生物碱类化合物的制备方法：

取平板上生长良好的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)DL-29菌种，切成小块并接种于大米固体培养基中，每1升三角瓶中放100毫升培养基，共50瓶，室温静止发酵30天，而后用乙酸乙酯提取三次，减压浓缩，浓缩后得粗提物102克。

所述大米固体培养基组成为每升含大米1000克，蛋白胨6克，色氨酸0.5克，陈海水1000毫升。

杂色曲霉(Aspergillus versicolor)DL-29菌种于2011年11月25日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2011421,分类命名为Aspergillus versicolor，株号为DL-29。

将粗提物经100-200目的硅胶柱层析，依次用石油醚-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯以体积比50:1、20:1、10:1、5:1、2:1到1:1和二氯甲烷-甲醇20:1、10:1、5:1、2:1到1:1的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测(石油醚-乙酸乙酯20-0：1(v/v)，茴香醛-硫酸作为显色剂),根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得7个组分(1-7)。

将组分4即以二氯甲烷-甲醇20:1梯度洗脱下的组分再依次经进行反相C₁₈硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱和薄层层析分离。反相C₁₈硅胶柱层析洗脱液为体积比2:3的水-甲醇，TLC检测(乙酸乙酯，硫酸-茴香醛显色)，收集淡黄色斑点的组分；收集组分经SephadexLH-20凝胶柱层析时洗脱液为甲醇，TLC检测(乙酸乙酯，硫酸-茴香醛显色)，收集淡黄色斑点的组分；收集组分再经薄层层析，用乙酸乙酯为展开剂，收集Rf值为0.5－0.6的组分，即为式(I)所示化合物(246.5毫克)，经TLC检测(乙酸乙酯，硫酸-茴香醛显色)，呈单个、均匀淡黄色斑点，确定为纯化合物。经波谱分析，其结构鉴定为一种新的生物碱类化合物，结构式如(I)所示。

该化合物具有以下理化和波谱特性：

无色晶体；熔点183-185℃；比旋光度[α]²⁰ _D–57(c 0.55,MeOH)；核磁共振氢谱(溶剂为氘代二甲亚砜)δ_H 1.54(dd,12.5,2.7),1.84(m),1.45(q,12.8),1.84(m),1.85(m),1.46(m),1.76(m),1.66(m),2.96(td,8.5,1.7),2.05(q,8.7),2.90(d,10.8),2.09(d,10.8),2.44(d,13.7),1.78(d,13.6),7.53(d,7.0),7.29(td,7.5,0.8),7.44(td,7.7,1.0),7.53(d,7.7),1.10(s),1.34(s),6.75(br s)；核磁共振碳谱(溶剂为氘代二甲亚砜)δ_C 186.8(C),38.9(C),51.8(CH),27.0(CH₂),63.5(CH),29.8(CH₂),21.3(CH₂),52.6(CH₂),61.4(CH₂),52.6(C),36.8(CH₂),85.8(C),136.4(C),123.2(CH),126.2(CH),130.4(CH),120.5(CH),152.7(C),21.5(CH₃),26.9(CH₃),151.2(C)；高分辨质谱[M]⁺m/z 351.1945,计算值351.1947。

实施例3

与实施例2不同之处在于

取平板上生长良好的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)DL-29菌种接种于马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基中，每1升三角瓶中放300毫升培养基，共50瓶，室温静止发酵30天，过滤并分别收集菌丝体和发酵液。所述PDB液体培养基组成为每升含马铃薯汁200毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母膏3克，陈海水500毫升，蒸馏水300毫升。

收集发酵液约15升，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩；菌丝体干燥并粉碎后用乙酸乙酯提取三次，减压浓缩；浓缩物经薄层层析(TLC)检测(石油醚-乙酸乙酯20-0：1(v/v)，硫酸-茴香醛显色)其结果相似，合并发酵液和菌丝体两部分的浓缩物为粗提物29克。

将粗提物经100-200目的硅胶柱层析，用石油醚-乙醇以50:1、20:1、10:1、5:1、1:1到0:1(v/v)的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析检测(石油醚-乙酸乙酯20-0：1(v/v)，硫酸-茴香醛显色),根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得10个组分(1-10)。

将组分5即以石油醚-乙醇10:1梯度洗脱下的组分再依次经反相C₁₈硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱和薄层层析分离。反相C₁₈硅胶柱层析洗脱液为体积比1:1的水-乙醇，TLC检测(乙酸乙酯，硫酸-茴香醛显色)，收集淡黄色斑点的组分；收集的组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析时洗脱液用体积比1：1的二氯甲烷-甲醇，TLC检测(乙酸乙酯，硫酸-茴香醛显色)，收集淡黄色斑点的组分；收集的组分再经薄层层析，用乙酸乙酯为展开剂，收集Rf值为0.5－0.6的组分，得式(I)所示的生物碱类化合物。

实施例4

抑菌活性实验：

具体为:供试细菌接种于LB培养基，并于37℃培养24小时，而后吸取4毫升无菌的0.85％NaCl溶液进行洗涤培养物，并用玻璃刮刀将菌轻轻刮下，用移液枪吸取适量菌悬液于无菌试管中，然后用0.85％NaCl溶液将菌悬液调至0.5麦氏浊度(相当于1.5×10⁸CFU/毫升)。其中，供试菌株分别为：溶藻弧菌、鳗弧菌、藤黄微球菌、迟缓爱德华氏菌、铜绿假单胞菌和副溶血性弧菌。

分别取1毫克左右待测样品(式(I)所示的生物碱类化合物)和阳性对照氯霉素，溶解于100微升左右二甲亚砜(DMSO)中，充分混匀后调整其最终浓度为2560微克/毫升。吸取50微升样品溶液到另一只离心管中，接着加入50微升DMSO，得到浓度减半的样品溶液，按照此方法，总共得到11组浓度依次减半的样品溶液(2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5微克/毫升)。采用无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔板中，第1至第11孔加样品溶液，每孔5微升，第12孔不加样品作为生长对照。将相当于0.5麦氏浊度的菌悬液经液体培养基稀释1000倍，而后取95微升依次加入到96孔板中，使得第1至第11孔的样品终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125微克/毫升。轻轻震荡混匀后，将96孔板密封置于37℃培养箱中培养24小时。在600纳米波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值，以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的最小抑菌浓度(MIC)。

实验结果：上述获得的氨基甲酸酯类化合物对水产病害细菌-溶藻弧菌、藤黄微球菌和铜绿假单胞菌的最小抑制浓度分别为4微克/毫升、8微克/毫升和32微克/毫升，具有抑制溶藻弧菌、藤黄微球菌和铜绿假单胞菌的活性。

Claims (6)

1.一种氨基甲酸酯类化合物，其特征在于：氨基甲酸酯类化合物结构如式(I)所示

2.一种权利要求1所述的氨基甲酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：将杂色曲霉(Aspergillus versicolor)DL-29接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物纯化后，即为式(I)所示的氨基甲酸酯类化合物；所述的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)DL-29于2011年11月25日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2011421；

具体制备步骤：

1)将杂色曲霉(Aspergillus versicolor)DL-29接种于真菌培养基中静止发酵5-100天，而后经有机溶剂提取并浓缩，即为粗提物；

2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂洗脱体系进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；

3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和薄层层析分离纯化，收集薄层层析分离纯化Rf值为0.5－0.6的组分，即得如式(I)所示的氨基甲酸酯类化合物；

所述薄层层析分离纯化展开剂为乙酸乙酯。

3.按权利要求2所述的氨基甲酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：步骤1)中有机溶剂提取液为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中一种或几种。

4.按权利要求2所述的氨基甲酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：步骤2)中的有机溶剂洗脱体系为石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、石油醚-丙醇、石油醚-异丙醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、二氯甲烷-丙醇、二氯甲烷-异丙醇中的一种或几种；其中，有机溶剂洗脱体系体积比均为50-0:1。

5.按权利要求2所述的氨基甲酸酯类化合物的制备方法，其特征在于：步骤3)所述反相硅胶柱层析洗脱液为体积比4-0:1的水-甲醇或水-乙醇；凝胶柱层析洗脱液为体积比2-0:1的二氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇。

6.一种权利要求1所述的氨基甲酸酯类化合物的应用，其特征在于：所述式(I)所示的氨基甲酸酯类化合物用于制备细菌的抑菌剂；

所述细菌为水产病害细菌的溶藻弧菌、藤黄微球菌或铜绿假单胞菌。