JP2003530114A - アンサミトシンの製法 - Google Patents
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Abstract
Description
サミトシンの製法に関する。
その治療用途が記載されている。これらの薬物はアクチノシンネマ(Actinosynn
ema)などの微生物を発酵させることで産生されるアンサミトシン先駆体から調
製することができる。 アクチノシンネマ・プレチオサム(Actinosynnema pretiosum)などのアクチ
ノシンネマ種は、所定の培養条件下で、多くの関連するアンサミトシンを産生す
る。主たる産物はC−3位にイソブチリル基を有するアンサミトシンP−3であ
る。C−3アシル側鎖においてのみ異なる他のアンサミトシン、P−1(エチオ
ニル基)、P−2(プロピオニル基)、P−3’(ブチリル基)、P−4(イソ
バレリル基)およびP−4’(バレリル基)も、副産物として産生される。これ
らの化合物はすべて還元的切断を受けて共通の産物であるマイタンシノール(形
態P−0)を産生する。加えて、その分子の別の部位が修飾されている(ヒドロ
キシル化または脱メチル化されている)他の多くのアンサミトシンも低レベルで
産生される。これらは脱アシル化で所望のP−0を産生しない。
4162940号;第4228239号;第4356265号;および第445
0234号に記載されている。一般に、これらの方法は、濾過助剤および水混和
性溶媒を全発酵ブロスに加え、固体を除去し、水性フラクションを水不混和性溶
媒で抽出し、濃縮し、石油エーテルを用いて沈殿させ、その沈殿物をシリカクロ
マトグラフィーを用いて精製し、結晶化させ、つづいてさらにクロマトグラフィ
ーまたは再結晶に付す必要がある。別法はシリカクロマトグラフィーの代わりに
ダイアイオンHP−10吸着を利用し、つづいてさらに溶媒抽出および結晶化を
行う。 これらの方法により、アンサミトシンP−3を許容される収率で得ることがで
きるが、特にアンサミトシン化合物は極めて毒性であり、該工程に従事している
者の安全を確保する必要があるため、該方法は大規模な生産工程において多くの
制限のある段階を含むこととなる。かくして、多少の制限を含む段階を利用する
としても、より安全な別の利用可能な方法に対する要求がある。
願を含むすべての刊行物を、たとえ本発明が十分に開示されているとしても、そ
の出典を明示することにより本明細書の一部とする。 濾過工程のない、精製されたアンサミトシンを調製する方法が提供される。該
方法は、アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し、その培地を処理してア
ンサミトシンを微生物から培地中に放出させ、それにより溶媒抽出を促進させ、
芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその処理培地から抽出し、抽出さ
れたアンサミトシンを濃縮し、結晶化によりアンサミトシンを精製する、工程を
含む。また、処理工程を省くこともできる。 精製されたアンサミトシンはマイタンシノールに還元することができ、それは
アンサミトシンP−3、P−1、P−2、P−3’、P−4およびP−4’を包
含する。精製されたアンサミトシンは分子中の別の部位が修飾された望ましくな
いアンサミトシンを極めて低いレベルで含有するだけである。アンサミトシン産
生微生物はアクチノシンネマ種(Actinosynnema spp.)であることが好ましい
。アクチノシンネマ・プレチオサム(Actinosynnema pretiosum)ATCC31
565であることが特に好ましい。アクチノシンネマ・プレチオサムATCC3
1281であることも好ましい。微生物は、米国特許第4450234号に開示
される方法のような、当業者に周知の発酵培養技法により増殖させることができ
る。
ンの放出を助け、細胞結合したアンサミトシンを溶媒抽出に対してより敏感にす
ることである。例えば、処理方法として、音波、高圧または高温処理が挙げられ
る。好ましくは、その処理は熱処理である。その熱処理は約60℃ないし約80
℃で行うことができる。好ましくは熱処理工程を、微生物が死滅し、アンサミト
シンの溶媒抽出を容易にする、約75℃で行う。もう一つ別の具体例においては
、全体の約60%のアンサミトシンを培地中に見つけることができるため、抽出
前に処理工程を用いないものである。
。芳香族炭化水素は他のブロス成分に比べてアンサミトシンに対して特に選択性
を有し、純粋な生成物を単離するのに、下流において簡単な工程を必要とするだ
けである。好ましくは、芳香族炭化水素溶媒はトルエンまたはキシレンである。
これは低温蒸発の影響を受けやすいため、トルエンが特に好ましい。トルエンお
よびキシレンの特性は、機械的分離を必要とせず溶媒および水層が重力で容易に
分離することであり、したがって含有量が大きな工程で利用することができ、従
事者のより高い安全性が得られる。抽出は約20℃ないし約60℃で行うことが
できる。好ましくは、抽出を約45℃で行う。抽出前の水性溶液のpHは3ない
し9の範囲内になければならない。好ましくは、そのpHは中性付近、すなわち
、pH6ないし8である。
しい。2:1ないし1:4の別の比率を用いることもできる。該溶液は、一般に
、ゆっくりと攪拌しながら混合され、約>80%のアンサミトシンが有機層中に
抽出されるまで混合物を攪拌する。該混合物は15℃ないし50℃の温度で重力
下で放置することが好ましい。放置する好ましい温度は約45℃である。 有機層を取りだし、溶媒の容量の減少による抽出液の濃縮を、真空下で、また
は当業者に周知の他の方法により行ってもよい。容量が減少した後、濃縮した抽
出液を所望により極性溶媒、例えば、メタノールに溶かしてもよく、PTFEな
どの膜フィルターまたはシリカもしくはアルミナなどの厚みのあるフィルターを
用いて浄化してもよい。
ミトシン、特にP−3を精製するのに、結晶化操作を利用する。結晶化に用いる
好ましい溶媒混合液は酢酸エチルとヘプタンである。結晶化のための固体の溶解
を助成するために、少量のメタノールまたは類似する極性溶媒を酢酸エチルを添
加する前に加え、ついで所望により攪拌および冷却しながら多量のヘプタンを用
いて処理し、結晶化した生成物を得る。同じ操作に従って生成物を再結晶しても
よい。 別法として、結晶化の前に、発酵ブロスから抽出された不純なアンサミトシン
をシリカゲルを用いて、例えば、溶媒抽出液の溶液をセライト床を介することに
より精製してもよい。クロマトグラフィーに用いる溶媒はトルエンおよびトルエ
ン−メタノール混合液であってもよい。当業者に知られている別の溶媒を用いる
こともできる。アンサミトシンP−3を含有するフラクションをプールし、減圧
下で濃縮する。
ミトシンP−3の定量およびアンサミトシン比の分析が行われる。これらの方法
を下記の実施例において用いた。 ブロスおよび抽出サンプル中のアンサミトシンP−3の定量は、10mmガー
ドカラムを用いて、C19ウォーターQスフェリソルブS5 ODS2カラム、
4.6x250mmで測定することができる。UV検出は252nmおよび20
5nmで行う。1ml/分の水(0.05%TFA)中60%MeCN(0.0
5%TFA)のイソクラティック移動相および20μlの注入容量を用いる。 下流の工程サンプル中のアンサミトシン比の分析は、ガードカラムなしで、C
8ウォーターシンメトリーシールドカラム、3.9x150mmで測定すること
ができる。UV検出は252nmおよび205nmで行う。40℃で10分間の
平衡処理に付し、30分間にわたる1ml/分の水(0.05%TFA)中35
−45%MeCN(0.05%TFA)の勾配移動相および10μlの注入容量
を用いる。
析は、ガードカラムなしで、LC−MS検出系、常圧電子噴射イオン化、+ve
イオンモードを備えたC8ウォーターシンメトリーシールドカラム、3.9x1
50mmを用いて測定することができる。ピークを明確に同定するために30V
円錐状電圧質量検出をフルスキャンMS(quad1で600−700amuをスキ
ャン)で行う。アンサミトシンの種類を決定するためのMS−MS分画化を同じ
勾配系を用いて行う。40℃で10分間の平衡処理に付し、30分間にわたる1
ml/分の水(0.05%TFA)中35−45%MeCN(0.05%TFA
)の勾配移動相および10μlの注入容量を用いる。 高感度を必要とする除去液中のアンサミトシンP−3および低レベルのサンプ
ルの定量を、10mmガードカラムおよびLC−MS−MS常圧電子噴射イオン
化検出系、+veイオンモード、30V円錐状電圧を用いて、C18ウォーター
QスフェリソルブS5 ODS2カラム、4.6x250mmで測定することが
できる。構造型を測定するために、主たる種類の分子イオンを選択し、分画パタ
ーンを観察し、547イオンが優勢であればN−メチル化であり、533イオン
が優勢であればN−脱メチル化である。1ml/分の水(0.05%TFA)中
60%MeCN(0.05%TFA)のイソクラティック移動相および20μl
の注入容量を用いる。
剤/マイタンシノイド複合体を製造することができる。本発明の方法により調製
されたアンサミトシンは還元的切断を受け、米国特許第5208020号に記載
されているように、マイタンシノイド誘導体を含有するN−メチル−L−アラニ
ンを製造するのに用いることができる、マイタンシノールとすることができる。
ついで、これらの誘導体を、ジスルフィド結合などの種々のリンカーを介して、
細胞結合剤、好ましくは抗体と接合させる。 一例としての細胞結合剤/マイタンシノイド複合体は、以下の工程: (1)本発明の方法により調製されたアンサミトシンをマイタンシノールに還
元し; (2)マイタンシノールをN−メチル−L−アラニン誘導体でエステル化して
ジスルフィド含有のマイタンシノイドエステルを形成し; (3)工程(2)で調製されたジスルフィド含有のマイタンシノイドエステル
をチオール含有のマイタンシノイドに還元し; (4)ジチオピリジル基を細胞結合剤に導入し;および (5)工程(3)で産生したチオール含有のマイタンシノイドを工程(4)の
ジチオピリジル細胞結合基にジスルフィド結合により結合させる ことを含む方法により調製することができる。
。 実施例1 アクチノシンネマ・プレチオサム培養ブロスの抽出およびアンサミトシン精製 産生菌アクチノシンネマ・プレチオサムATCC31565を含有する37L
の全ブロス(アンサミトシンP−3の力価、86.3mg/L)を75℃で60
分間系内で加熱処理して微生物を死滅させ、アンサミトシンの溶媒抽出を容易に
した。40Lのトルエンを加え、その混合物を45℃に加温した。上相のトルエ
ンの渦巻きが下相のブロスに引き込まれるが、乳化または相が完全に均一となら
ないように、相を攪拌した。抽出を16時間以内に終え、重力下、2時間以内に
分離が生じた。 80mg/LのP−3を含有する39Lのトルエンをサイホンにより回収し、
20Lのロータリーエバポレーター(浴温度40−45℃、速度約9L/時間)
を用いて蒸発させた。蒸発後に、3.1gのP−3(27.6%w/w)を含有
する11.2gの移動油を得た。トルエンに溶かし、再び蒸発させることで得ら
れた抽出物をフラスコに移した。(抽出段階の収率=97%) その抽出物を120mlのトルエンに溶かし、375mlのトルエン(3bv
)のシリカカラム(キーゼルゲル60、トルエンをパックした125mlの床容
量、4cm径x10cm)にローディングした。該カラムを2bvのトルエンで
洗浄し、ついで4x2bvのトルエン中2%MeOHで溶出し、つづいて12x
1bvのトルエン中4%MeOHで溶出した。該カラムを40ml/分で溶出し
、有色のタイトなバンドを得た。アンサミトシンP−3を含有するフラクション
7−10をまとめ、蒸発させて、P−3を2.5g含有する油状固体3.2gを
得た。この物質をLC−MSおよびMS−MSで分析した。
3.9%の所望のアンサミトシンを含有した(カラム段階収率=80.6%)。 シリカカラムからの生成物を40℃に加温した200mLのEtOAcに溶か
した。ヘプタン(200mL)を加え、該溶液を冷却した。該溶液に1mgの純
粋なP−3結晶を接種した(結晶化はまたフラスコの他の部位でも同時に起った
)。外界温度で4時間経過後、上澄をHPLCにより分析し、0.8gのP−3
(30%)がまだ溶液中にあると測定された。さらにヘプタン(150ml)を
加え、該フラスコをさらに3時間放置して、再び分析した。この分析は0.4g
のP−3(16%)が溶液中に残っていることを示した。該フラスコを4℃で一
夜放置した。その後の分析で、わずかに70mgのP−3(3%)だけが溶液中
に残っていることがかわった。焼結フィルターラインアセンブリーを用いて吸引
して、母液を除去した。白色針状晶をEtOAc:ヘプタン(1:3)(2x1
5ml)で洗浄した。結晶を、ロータリーエバポレーター中、30℃で10時間
、真空下で系内乾燥に付した。2.5gの結晶を得た(結晶化収率=86%)。 最終生成物は86%のアンサミトシンP−3を含有し、合計98.4%の所望
のアシル化アンサミトシン(P−1、P−2、P−3、P−3’、P−4、P−
4’)を含有した。
0Lの全ブロス(アンサミトシンP−3の力価、75.1mg/L、82.6g
のP−3)を75℃で60分間系内で加熱処理して微生物を死滅させ、アンサミ
トシンの溶媒抽出を容易にした。加熱死滅工程の後に、77.6gのP−3が残
った。予め45℃に加温した等容量のトルエンを加え、その混合物を45℃に維
持した。上相のトルエンの渦巻きが下相のブロスに引き込まれるが、乳化または
相が完全に均一とならないように、相を攪拌した。抽出を45時間行い、つづい
て重力下で30分以内に分離が生じた。(抽出段階の収率=90.3%)。 アンサミトシン含有の1127Lのトルエン抽出物を流下フィルムエバポレー
ター(FFE)を用いて22Lに濃縮した。その濃縮物を50Lのロータリーエ
バポレーターに移し、低容量にまで蒸発させた(蒸留速度14.6L/時間)。
FFEを2x2Lのトルエンですすぎ、そのリンス液を該エバポレーターに通し
、生成物を完全に移した。その濃縮物を蒸発乾固させた。
ム(キーゼルゲル60、トルエン中4%メタノールをパックした4.8Lの床容
量、15.0cm径x27.0cm、ローディング速度120mL/分)にロー
ディングした。該カラムを、トルエン中4%メタノールを用い、227−384
mL/分の流速でイソクラティックに溶出させ、有色のタイトなバンドを得た。
最初のフラクションは1床容量であった;フラクション3ないし6は1/2床容
量で集めた。フラクションをTLC(キーゼルゲル60 F254プレート、ジ
クロロメタン中5%メタノールで操作、254nmでUVにより可視化)により
モニターし、アンサミトシンを含有するフラクションをHPLCおよびLC−M
Sでモニターした。結晶化のためのフラクションの選択はフラクションのHPL
CおよびLC−MS分析に基づいており、アンサミトシンP−3回収を最適化し
、望ましくないアンサミトシンを最小とした。アンサミトシンP−3を含有する
フラクション5ないし10をまとめ、蒸発させて、P−3を54.6g含有する
固体を得た。この段階で、該生成物は77.1%のアンサミトシンP−3を含有
し、合計96.1%の所望のアンサミトシンを含有した(カラム段階の収率=9
2.5%)。
かし、つづいて同じ温度に加温した546mlの酢酸エチルに溶かした。さらに
メタノールのアリコートを加え、固体の溶解を助成した。合計166mLのメタ
ノールを該混合物に加えた。50℃に加温したヘプタン(100mL)を最初の
混濁の徴候のあるまで加え、ついで結晶化が生じるように、溶液を外界温度に冷
却した。4時間後、さらに1324mLのヘプタン(外界温度)を加えた。上澄
をHPLCで分析し、6.6gのP−3がまだ溶液中にあると測定された。混合
物を氷冷し、さらなるアリコートのヘプタン(200および400mL)を3.
9gのP−3(6.8%)が母液中に残るまで加えた。焼結フィルターラインア
センブリーを用いて吸引して、母液を除去した。結晶をEtOAc:ヘプタン(
1:3)(2x150ml)で洗浄した。結晶を、ロータリーエバポレーター中
、30℃で88.5時間、最初は低真空下、つづいて高真空下(1.0−1.3
ミリバール)で系内乾燥に付した。76.4gの結晶を得た。 最終生成物は74.5%のアンサミトシンP−3(56.9g)を含有し、合
計97.8%の所望のアシル化アンサミトシンを含有した(全収率=69%)。
ンネマ・プレチオサム全ブロスを、本質的に実施例1に記載されるように、熱処
理し、トルエンで抽出して蒸発させた。 34.5gのアンサミトシンP−3を含有する濃縮物を3Lのトルエンに溶か
し、シリカカラム(キーゼルゲル60、トルエンをパックした3.0Lの床容量
、13.8cm径x16.6cm)にローディングした。該カラムを4cmの砂
床で頂部を覆った。該カラムを5Lのトルエンで洗浄し、つづいて20Lのトル
エン中2%MeOHで洗浄し、それを5Lのフラクションで集めた。ついで、該
カラムをトルエン中4%MeOHで溶出し、2.5Lのフラクションで集めた。
アンサミトシンはフラクション9ないし15で溶出した。結晶化のためにフラク
ションの選択はフラクションのHPLCおよびLC−MS分析を基礎とし、アン
サミトシンP−3回収を最適とし、望ましくないアンサミトシンを最小とした。
フラクション10ないし12をまとめ、蒸発乾固させて、32.5gのアンサミ
トシンP−3を含有する油を得た。 この段階の生成物は91.8%のアンサミトシンP−3を含有し、合計95.
3%の望ましいアシル化アンサミトシンを含有した(カラム段階の収率=94.
2%)。
量の加温メタノール/酢酸エチル(50℃)に溶かした。まず、60mLのメタ
ノールを加え、つづいて300mLの酢酸エチルをゆっくりと添加した。さらに
200mLの温メタノールを添加し、その時点で濃縮物は完全に溶解した。20
0mLの温ヘプタン(50℃)を加え、水浴を結晶化溶液から取り外した。結晶
化が始まり、総容量800mLのヘプタンが添加されるまで、さらにヘプタンを
200mLのアリコートで添加した。その混合物を氷浴中で18時間冷却した。
母液をHPLC分析に付すことで結晶化をモニターした。18時間の時点で、6
.3%のアンサミトシンP−3が母液中に残っていた。さらに200mLのヘプ
タンを添加し、混合物をさらに5時間冷却した。HPLC分析は4.0%のアン
サミトシンが母液中に残っていることを示した。 暗褐色母液を吸引することで結晶を回収した。該結晶を50mlのヘプタン:
酢酸エチル(3:1)で3回洗浄し、真空下(0.8ミリバール)で一夜乾燥さ
せた。該結晶は28.2gのアンサミトシンP−3を含有する均一な細かい灰白
色針状晶であった。(結晶化段階の回収率=86.9%) 最終生成物は93.1%のアンサミトシンP−3を含有し、合計98.4%の
望ましいアシル化アンサミトシンを含有した。
ンネマ・プレチオサム全ブロスを、本質的に実施例1に記載されるように、熱処
理し、トルエンで抽出して蒸発させ、54.7gのアンサミトシンP−3を含有
する9.5Lの濃縮抽出物を得た。 その濃縮物を45℃に加熱し、14.5Lのヘプタンを33分間にわたって添
加し、アンサミトシンを沈殿させた。その混合物を氷冷した。さらに5Lのヘプ
タンを加え、混合物を一夜放置した。吸引により母液を取りだし、沈殿物をトル
エン:ヘプタン(1:1)で洗浄した。HPLC分析は母液が6.5%のアンサ
ミトシンP−3を含有することを、そして洗液が1.8%のP−3を含有するこ
とを示した。沈殿物を2Lのメタノールに溶かし、0.2ミクロンフィルターを
介して濾過した。
かした。510mLの酢酸エチルを該溶液に溶かし、つづいて200mLのヘプ
タンを添加した。該混合物を外界温度にまで冷却し、結晶化が始まるように、さ
らに900mLのヘプタンをゆっくりと添加した。4.14gのアンサミトシン
P−3が母液中に残った。さらに400mLのヘプタンを添加し、混合物を氷冷
した。2.7gのアンサミトシンP−3が母液中に残った。 吸引により母液を取りだし、結晶を50℃の110mLのメタノールおよび5
20mLの酢酸エチルに溶かした。ヘプタンを2回の75mLのアリコートにて
添加し、その混合物を外界温度にまで冷却し、別の900mLを加えた。さらに
400mLのヘプタンを加え、混合物を氷冷し、結晶化させるのに一夜放置した
。HPLC分析は2.3gのアンサミトシンP−3が母液中に残っていることを
示した。その母液を吸引により取りだし、結晶をヘプタン:酢酸エチル(3:1
)で洗浄し、真空下(0.6ミリバール)で一夜乾燥させた。47.8gの結晶
は84.3%のアンサミトシンP−3を含有し、合計97.0%の望ましいアシ
ル化アンサミトシンを含有した。
サミトシン精製 44μg/mlの力価のアンサミトシンP−3を含む、熱処理した220mL
のアクチノシンネマ・プレチオサムを45℃の水浴中に置き、等容量のキシレン
を加えた。キシレンの渦巻きが下相ブロスに引き込まれるが、エマルジョンを形
成しないように、相を混合した。20時間後には、64%のアンサミトシンP−
3がキシレン相に抽出された。 重力で混合物を分離し、170mLのキシレンを取り出した。キシレン抽出液
を蒸発乾固させた。キシレン抽出物をシリカクロマトグラフィーを用いて精製し
た。抽出物を2mLのトルエン中4%メタノールに溶かしてローディングし、同
じ溶媒混合液を用いて溶出させた。フラクション(0.5mL)を集め、TLC
(キーゼルゲル60F254プレートをジクロロメタン:メタノール(20:1
)中で取り扱う)でアッセイした。アンサミトシンP−3を含有するフラクショ
ンを上記した実施例に記載の操作を用いて結晶化させた。その結晶性生成物は、
色相および純度の点で、発酵ブロスをトルエン抽出することで得られたものに匹
敵する特性であった。
て具現化することができ、したがって、本発明の範囲を示すものとして、明細書
の記載よりもむしろ特許請求の範囲を参考とすべきである。
Claims (16)
- 【請求項1】 精製されたアンサミトシンの製法であって、 a.アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し; b.その培地を処理してアンサミトシンの溶媒抽出を容易にし; c.芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその培地から抽出し; d.その抽出されたアンサミトシンを濃縮し; e.結晶化によりアンサミトシンを精製する 工程を含む、方法。
- 【請求項2】 精製されたアンサミトシンの製法であって、 a.アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し; b.芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその培地から抽出し; c.その抽出されたアンサミトシンを濃縮し; d.結晶化によりアンサミトシンを精製する 工程を含む、方法。
- 【請求項3】 アンサミトシン産生微生物がアクチノシンネマ種である、請
求項1または2記載の方法。 - 【請求項4】 アクチノシンネマ種がアクチノシンネマ・プレチオサムAT
CC31565である、請求項3記載の方法。 - 【請求項5】 アクチノシンネマ種がアクチノシンネマ・プレチオサムAT
CC31281である、請求項3記載の方法。 - 【請求項6】 上記した処理が約75℃で加熱することである、請求項1記
載の方法。 - 【請求項7】 溶媒がトルエンである、請求項1または2記載の方法。
- 【請求項8】 トルエンの熱処理した培地に対する割合が約1:1である、
請求項7記載の方法。 - 【請求項9】 抽出温度が約45℃である、請求項8記載の方法。
- 【請求項10】 溶媒がキシレンである、請求項1または2記載の方法。
- 【請求項11】 キシレンの熱処理した培地に対する割合が約1:1である
、請求項10記載の方法。 - 【請求項12】 抽出温度が約45℃である、請求項11記載の方法。
- 【請求項13】 アンサミトシンが還元的切断を受けてマイタンシノールを
形成することができるアシル化アンサミトシンを含む、請求項1または2記載の
方法。 - 【請求項14】 請求項1または2に記載の方法により調製されたアンサミ
トシン。 - 【請求項15】 請求項1または2に記載の方法により調製されたアンサミ
トシンを細胞結合剤−マイタンシノイド複合体に変えることにより調製される細
胞結合剤−マイタンシノイド複合体。 - 【請求項16】 細胞結合剤が抗体である、請求項15記載の細胞結合剤−
マイタンシノイド複合体。
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