JP2003530114A - アンサミトシンの製法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
アンサミトシンの改良された精製方法を記載する。
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明はアンサミトシン、特にマイタンシノールに変換することができるアン
サミトシンの製法に関する。
サミトシンの製法に関する。
【０００２】
（従来技術）
米国特許第５２０８０２０号には、細胞毒性の高いマイタンシノイド薬および
その治療用途が記載されている。これらの薬物はアクチノシンネマ（Actinosynn
ema）などの微生物を発酵させることで産生されるアンサミトシン先駆体から調
製することができる。 アクチノシンネマ・プレチオサム（Actinosynnema pretiosum）などのアクチ
ノシンネマ種は、所定の培養条件下で、多くの関連するアンサミトシンを産生す
る。主たる産物はＣ−３位にイソブチリル基を有するアンサミトシンＰ−３であ
る。Ｃ−３アシル側鎖においてのみ異なる他のアンサミトシン、Ｐ−１（エチオ
ニル基）、Ｐ−２（プロピオニル基）、Ｐ−３’（ブチリル基）、Ｐ−４（イソ
バレリル基）およびＰ−４’（バレリル基）も、副産物として産生される。これ
らの化合物はすべて還元的切断を受けて共通の産物であるマイタンシノール（形
態Ｐ−０）を産生する。加えて、その分子の別の部位が修飾されている（ヒドロ
キシル化または脱メチル化されている）他の多くのアンサミトシンも低レベルで
産生される。これらは脱アシル化で所望のＰ−０を産生しない。
その治療用途が記載されている。これらの薬物はアクチノシンネマ（Actinosynn
ema）などの微生物を発酵させることで産生されるアンサミトシン先駆体から調
製することができる。 アクチノシンネマ・プレチオサム（Actinosynnema pretiosum）などのアクチ
ノシンネマ種は、所定の培養条件下で、多くの関連するアンサミトシンを産生す
る。主たる産物はＣ−３位にイソブチリル基を有するアンサミトシンＰ−３であ
る。Ｃ−３アシル側鎖においてのみ異なる他のアンサミトシン、Ｐ−１（エチオ
ニル基）、Ｐ−２（プロピオニル基）、Ｐ−３’（ブチリル基）、Ｐ−４（イソ
バレリル基）およびＰ−４’（バレリル基）も、副産物として産生される。これ
らの化合物はすべて還元的切断を受けて共通の産物であるマイタンシノール（形
態Ｐ−０）を産生する。加えて、その分子の別の部位が修飾されている（ヒドロ
キシル化または脱メチル化されている）他の多くのアンサミトシンも低レベルで
産生される。これらは脱アシル化で所望のＰ−０を産生しない。
【０００３】
アクチノシンネマ種からアンサミトシンＰ−３を産生する方法は、米国特許第
４１６２９４０号；第４２２８２３９号；第４３５６２６５号；および第４４５
０２３４号に記載されている。一般に、これらの方法は、濾過助剤および水混和
性溶媒を全発酵ブロスに加え、固体を除去し、水性フラクションを水不混和性溶
媒で抽出し、濃縮し、石油エーテルを用いて沈殿させ、その沈殿物をシリカクロ
マトグラフィーを用いて精製し、結晶化させ、つづいてさらにクロマトグラフィ
ーまたは再結晶に付す必要がある。別法はシリカクロマトグラフィーの代わりに
ダイアイオンＨＰ−１０吸着を利用し、つづいてさらに溶媒抽出および結晶化を
行う。 これらの方法により、アンサミトシンＰ−３を許容される収率で得ることがで
きるが、特にアンサミトシン化合物は極めて毒性であり、該工程に従事している
者の安全を確保する必要があるため、該方法は大規模な生産工程において多くの
制限のある段階を含むこととなる。かくして、多少の制限を含む段階を利用する
としても、より安全な別の利用可能な方法に対する要求がある。
４１６２９４０号；第４２２８２３９号；第４３５６２６５号；および第４４５
０２３４号に記載されている。一般に、これらの方法は、濾過助剤および水混和
性溶媒を全発酵ブロスに加え、固体を除去し、水性フラクションを水不混和性溶
媒で抽出し、濃縮し、石油エーテルを用いて沈殿させ、その沈殿物をシリカクロ
マトグラフィーを用いて精製し、結晶化させ、つづいてさらにクロマトグラフィ
ーまたは再結晶に付す必要がある。別法はシリカクロマトグラフィーの代わりに
ダイアイオンＨＰ−１０吸着を利用し、つづいてさらに溶媒抽出および結晶化を
行う。 これらの方法により、アンサミトシンＰ−３を許容される収率で得ることがで
きるが、特にアンサミトシン化合物は極めて毒性であり、該工程に従事している
者の安全を確保する必要があるため、該方法は大規模な生産工程において多くの
制限のある段階を含むこととなる。かくして、多少の制限を含む段階を利用する
としても、より安全な別の利用可能な方法に対する要求がある。
【０００４】
（発明の開示）
本発明の一の態様は、精製されたアンサミトシンの製法であって、
ａ．アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し；
ｂ．その培地を処理してアンサミトシンの溶媒抽出を容易にし；
ｃ．芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその培地から抽出し；
ｄ．その抽出されたアンサミトシンを濃縮し；
ｅ．結晶化によりアンサミトシンを精製する
工程を含む、方法にある。
本発明のもう一つ別の態様は、精製されたアンサミトシンの製法であって、
ａ．アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し；
ｂ．芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその培地から抽出し；
ｃ．その抽出されたアンサミトシンを濃縮し；
ｄ．結晶化によりアンサミトシンを精製する
工程を含む、方法にある。
【０００５】
本明細書中に引用されている、限定されるものではないが、特許および特許出
願を含むすべての刊行物を、たとえ本発明が十分に開示されているとしても、そ
の出典を明示することにより本明細書の一部とする。 濾過工程のない、精製されたアンサミトシンを調製する方法が提供される。該
方法は、アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し、その培地を処理してア
ンサミトシンを微生物から培地中に放出させ、それにより溶媒抽出を促進させ、
芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその処理培地から抽出し、抽出さ
れたアンサミトシンを濃縮し、結晶化によりアンサミトシンを精製する、工程を
含む。また、処理工程を省くこともできる。 精製されたアンサミトシンはマイタンシノールに還元することができ、それは
アンサミトシンＰ−３、Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３’、Ｐ−４およびＰ−４’を包
含する。精製されたアンサミトシンは分子中の別の部位が修飾された望ましくな
いアンサミトシンを極めて低いレベルで含有するだけである。アンサミトシン産
生微生物はアクチノシンネマ種（Actinosynnema spp．）であることが好ましい
。アクチノシンネマ・プレチオサム（Actinosynnema pretiosum）ＡＴＣＣ３１
５６５であることが特に好ましい。アクチノシンネマ・プレチオサムＡＴＣＣ３
１２８１であることも好ましい。微生物は、米国特許第４４５０２３４号に開示
される方法のような、当業者に周知の発酵培養技法により増殖させることができ
る。
願を含むすべての刊行物を、たとえ本発明が十分に開示されているとしても、そ
の出典を明示することにより本明細書の一部とする。 濾過工程のない、精製されたアンサミトシンを調製する方法が提供される。該
方法は、アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し、その培地を処理してア
ンサミトシンを微生物から培地中に放出させ、それにより溶媒抽出を促進させ、
芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその処理培地から抽出し、抽出さ
れたアンサミトシンを濃縮し、結晶化によりアンサミトシンを精製する、工程を
含む。また、処理工程を省くこともできる。 精製されたアンサミトシンはマイタンシノールに還元することができ、それは
アンサミトシンＰ−３、Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３’、Ｐ−４およびＰ−４’を包
含する。精製されたアンサミトシンは分子中の別の部位が修飾された望ましくな
いアンサミトシンを極めて低いレベルで含有するだけである。アンサミトシン産
生微生物はアクチノシンネマ種（Actinosynnema spp．）であることが好ましい
。アクチノシンネマ・プレチオサム（Actinosynnema pretiosum）ＡＴＣＣ３１
５６５であることが特に好ましい。アクチノシンネマ・プレチオサムＡＴＣＣ３
１２８１であることも好ましい。微生物は、米国特許第４４５０２３４号に開示
される方法のような、当業者に周知の発酵培養技法により増殖させることができ
る。
【０００６】
本発明の方法の一の具体例は、微生物の処理を用いて、細胞内のアンサミトシ
ンの放出を助け、細胞結合したアンサミトシンを溶媒抽出に対してより敏感にす
ることである。例えば、処理方法として、音波、高圧または高温処理が挙げられ
る。好ましくは、その処理は熱処理である。その熱処理は約６０℃ないし約８０
℃で行うことができる。好ましくは熱処理工程を、微生物が死滅し、アンサミト
シンの溶媒抽出を容易にする、約７５℃で行う。もう一つ別の具体例においては
、全体の約６０％のアンサミトシンを培地中に見つけることができるため、抽出
前に処理工程を用いないものである。
ンの放出を助け、細胞結合したアンサミトシンを溶媒抽出に対してより敏感にす
ることである。例えば、処理方法として、音波、高圧または高温処理が挙げられ
る。好ましくは、その処理は熱処理である。その熱処理は約６０℃ないし約８０
℃で行うことができる。好ましくは熱処理工程を、微生物が死滅し、アンサミト
シンの溶媒抽出を容易にする、約７５℃で行う。もう一つ別の具体例においては
、全体の約６０％のアンサミトシンを培地中に見つけることができるため、抽出
前に処理工程を用いないものである。
【０００７】
アンサミトシンは芳香族炭化水素溶媒を用いて培地から抽出することができる
。芳香族炭化水素は他のブロス成分に比べてアンサミトシンに対して特に選択性
を有し、純粋な生成物を単離するのに、下流において簡単な工程を必要とするだ
けである。好ましくは、芳香族炭化水素溶媒はトルエンまたはキシレンである。
これは低温蒸発の影響を受けやすいため、トルエンが特に好ましい。トルエンお
よびキシレンの特性は、機械的分離を必要とせず溶媒および水層が重力で容易に
分離することであり、したがって含有量が大きな工程で利用することができ、従
事者のより高い安全性が得られる。抽出は約２０℃ないし約６０℃で行うことが
できる。好ましくは、抽出を約４５℃で行う。抽出前の水性溶液のｐHは３ない
し９の範囲内になければならない。好ましくは、そのｐHは中性付近、すなわち
、ｐH６ないし８である。
。芳香族炭化水素は他のブロス成分に比べてアンサミトシンに対して特に選択性
を有し、純粋な生成物を単離するのに、下流において簡単な工程を必要とするだ
けである。好ましくは、芳香族炭化水素溶媒はトルエンまたはキシレンである。
これは低温蒸発の影響を受けやすいため、トルエンが特に好ましい。トルエンお
よびキシレンの特性は、機械的分離を必要とせず溶媒および水層が重力で容易に
分離することであり、したがって含有量が大きな工程で利用することができ、従
事者のより高い安全性が得られる。抽出は約２０℃ないし約６０℃で行うことが
できる。好ましくは、抽出を約４５℃で行う。抽出前の水性溶液のｐHは３ない
し９の範囲内になければならない。好ましくは、そのｐHは中性付近、すなわち
、ｐH６ないし８である。
【０００８】
抽出は、一般に、溶媒が全ブロスに対して等容量（１：１）であることが好ま
しい。２：１ないし１：４の別の比率を用いることもできる。該溶液は、一般に
、ゆっくりと攪拌しながら混合され、約＞８０％のアンサミトシンが有機層中に
抽出されるまで混合物を攪拌する。該混合物は１５℃ないし５０℃の温度で重力
下で放置することが好ましい。放置する好ましい温度は約４５℃である。 有機層を取りだし、溶媒の容量の減少による抽出液の濃縮を、真空下で、また
は当業者に周知の他の方法により行ってもよい。容量が減少した後、濃縮した抽
出液を所望により極性溶媒、例えば、メタノールに溶かしてもよく、ＰＴＦＥな
どの膜フィルターまたはシリカもしくはアルミナなどの厚みのあるフィルターを
用いて浄化してもよい。
しい。２：１ないし１：４の別の比率を用いることもできる。該溶液は、一般に
、ゆっくりと攪拌しながら混合され、約＞８０％のアンサミトシンが有機層中に
抽出されるまで混合物を攪拌する。該混合物は１５℃ないし５０℃の温度で重力
下で放置することが好ましい。放置する好ましい温度は約４５℃である。 有機層を取りだし、溶媒の容量の減少による抽出液の濃縮を、真空下で、また
は当業者に周知の他の方法により行ってもよい。容量が減少した後、濃縮した抽
出液を所望により極性溶媒、例えば、メタノールに溶かしてもよく、ＰＴＦＥな
どの膜フィルターまたはシリカもしくはアルミナなどの厚みのあるフィルターを
用いて浄化してもよい。
【０００９】
望ましくないアンサミトシンのレベルを減少させることにより、所望のアンサ
ミトシン、特にＰ−３を精製するのに、結晶化操作を利用する。結晶化に用いる
好ましい溶媒混合液は酢酸エチルとヘプタンである。結晶化のための固体の溶解
を助成するために、少量のメタノールまたは類似する極性溶媒を酢酸エチルを添
加する前に加え、ついで所望により攪拌および冷却しながら多量のヘプタンを用
いて処理し、結晶化した生成物を得る。同じ操作に従って生成物を再結晶しても
よい。 別法として、結晶化の前に、発酵ブロスから抽出された不純なアンサミトシン
をシリカゲルを用いて、例えば、溶媒抽出液の溶液をセライト床を介することに
より精製してもよい。クロマトグラフィーに用いる溶媒はトルエンおよびトルエ
ン−メタノール混合液であってもよい。当業者に知られている別の溶媒を用いる
こともできる。アンサミトシンＰ−３を含有するフラクションをプールし、減圧
下で濃縮する。
ミトシン、特にＰ−３を精製するのに、結晶化操作を利用する。結晶化に用いる
好ましい溶媒混合液は酢酸エチルとヘプタンである。結晶化のための固体の溶解
を助成するために、少量のメタノールまたは類似する極性溶媒を酢酸エチルを添
加する前に加え、ついで所望により攪拌および冷却しながら多量のヘプタンを用
いて処理し、結晶化した生成物を得る。同じ操作に従って生成物を再結晶しても
よい。 別法として、結晶化の前に、発酵ブロスから抽出された不純なアンサミトシン
をシリカゲルを用いて、例えば、溶媒抽出液の溶液をセライト床を介することに
より精製してもよい。クロマトグラフィーに用いる溶媒はトルエンおよびトルエ
ン−メタノール混合液であってもよい。当業者に知られている別の溶媒を用いる
こともできる。アンサミトシンＰ−３を含有するフラクションをプールし、減圧
下で濃縮する。
【００１０】
ＨＰＬＣによるアンサミトシンの分析方法も提供される。該方法によりアンサ
ミトシンＰ−３の定量およびアンサミトシン比の分析が行われる。これらの方法
を下記の実施例において用いた。 ブロスおよび抽出サンプル中のアンサミトシンＰ−３の定量は、１０ｍｍガー
ドカラムを用いて、Ｃ１９ウォーターＱスフェリソルブＳ５ ＯＤＳ２カラム、
４．６ｘ２５０ｍｍで測定することができる。ＵＶ検出は２５２ｎｍおよび２０
５ｎｍで行う。１ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中６０％ＭｅＣＮ（０．０
５％ＴＦＡ）のイソクラティック移動相および２０μｌの注入容量を用いる。 下流の工程サンプル中のアンサミトシン比の分析は、ガードカラムなしで、Ｃ
８ウォーターシンメトリーシールドカラム、３．９ｘ１５０ｍｍで測定すること
ができる。ＵＶ検出は２５２ｎｍおよび２０５ｎｍで行う。４０℃で１０分間の
平衡処理に付し、３０分間にわたる１ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中３５
−４５％ＭｅＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）の勾配移動相および１０μｌの注入容量
を用いる。
ミトシンＰ−３の定量およびアンサミトシン比の分析が行われる。これらの方法
を下記の実施例において用いた。 ブロスおよび抽出サンプル中のアンサミトシンＰ−３の定量は、１０ｍｍガー
ドカラムを用いて、Ｃ１９ウォーターＱスフェリソルブＳ５ ＯＤＳ２カラム、
４．６ｘ２５０ｍｍで測定することができる。ＵＶ検出は２５２ｎｍおよび２０
５ｎｍで行う。１ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中６０％ＭｅＣＮ（０．０
５％ＴＦＡ）のイソクラティック移動相および２０μｌの注入容量を用いる。 下流の工程サンプル中のアンサミトシン比の分析は、ガードカラムなしで、Ｃ
８ウォーターシンメトリーシールドカラム、３．９ｘ１５０ｍｍで測定すること
ができる。ＵＶ検出は２５２ｎｍおよび２０５ｎｍで行う。４０℃で１０分間の
平衡処理に付し、３０分間にわたる１ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中３５
−４５％ＭｅＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）の勾配移動相および１０μｌの注入容量
を用いる。
【００１１】
クロマトグラフィーフラクションおよび最終生成物中のアンサミトシン比の分
析は、ガードカラムなしで、ＬＣ−ＭＳ検出系、常圧電子噴射イオン化、＋ｖｅ
イオンモードを備えたＣ８ウォーターシンメトリーシールドカラム、３．９ｘ１
５０ｍｍを用いて測定することができる。ピークを明確に同定するために３０Ｖ
円錐状電圧質量検出をフルスキャンＭＳ（quad１で６００−７００ａｍｕをスキ
ャン）で行う。アンサミトシンの種類を決定するためのＭＳ−ＭＳ分画化を同じ
勾配系を用いて行う。４０℃で１０分間の平衡処理に付し、３０分間にわたる１
ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中３５−４５％ＭｅＣＮ（０．０５％ＴＦＡ
）の勾配移動相および１０μｌの注入容量を用いる。 高感度を必要とする除去液中のアンサミトシンＰ−３および低レベルのサンプ
ルの定量を、１０ｍｍガードカラムおよびＬＣ−ＭＳ−ＭＳ常圧電子噴射イオン
化検出系、＋ｖｅイオンモード、３０Ｖ円錐状電圧を用いて、Ｃ１８ウォーター
ＱスフェリソルブＳ５ ＯＤＳ２カラム、４．６ｘ２５０ｍｍで測定することが
できる。構造型を測定するために、主たる種類の分子イオンを選択し、分画パタ
ーンを観察し、５４７イオンが優勢であればＮ−メチル化であり、５３３イオン
が優勢であればＮ−脱メチル化である。１ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中
６０％ＭｅＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）のイソクラティック移動相および２０μｌ
の注入容量を用いる。
析は、ガードカラムなしで、ＬＣ−ＭＳ検出系、常圧電子噴射イオン化、＋ｖｅ
イオンモードを備えたＣ８ウォーターシンメトリーシールドカラム、３．９ｘ１
５０ｍｍを用いて測定することができる。ピークを明確に同定するために３０Ｖ
円錐状電圧質量検出をフルスキャンＭＳ（quad１で６００−７００ａｍｕをスキ
ャン）で行う。アンサミトシンの種類を決定するためのＭＳ−ＭＳ分画化を同じ
勾配系を用いて行う。４０℃で１０分間の平衡処理に付し、３０分間にわたる１
ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中３５−４５％ＭｅＣＮ（０．０５％ＴＦＡ
）の勾配移動相および１０μｌの注入容量を用いる。 高感度を必要とする除去液中のアンサミトシンＰ−３および低レベルのサンプ
ルの定量を、１０ｍｍガードカラムおよびＬＣ−ＭＳ−ＭＳ常圧電子噴射イオン
化検出系、＋ｖｅイオンモード、３０Ｖ円錐状電圧を用いて、Ｃ１８ウォーター
ＱスフェリソルブＳ５ ＯＤＳ２カラム、４．６ｘ２５０ｍｍで測定することが
できる。構造型を測定するために、主たる種類の分子イオンを選択し、分画パタ
ーンを観察し、５４７イオンが優勢であればＮ−メチル化であり、５３３イオン
が優勢であればＮ−脱メチル化である。１ｍｌ／分の水（０．０５％ＴＦＡ）中
６０％ＭｅＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）のイソクラティック移動相および２０μｌ
の注入容量を用いる。
【００１２】
本発明の方法を用いて、腫瘍活性化プロドラッグとして有用である、細胞結合
剤／マイタンシノイド複合体を製造することができる。本発明の方法により調製
されたアンサミトシンは還元的切断を受け、米国特許第５２０８０２０号に記載
されているように、マイタンシノイド誘導体を含有するＮ−メチル−Ｌ−アラニ
ンを製造するのに用いることができる、マイタンシノールとすることができる。
ついで、これらの誘導体を、ジスルフィド結合などの種々のリンカーを介して、
細胞結合剤、好ましくは抗体と接合させる。 一例としての細胞結合剤／マイタンシノイド複合体は、以下の工程： （１）本発明の方法により調製されたアンサミトシンをマイタンシノールに還
元し； （２）マイタンシノールをＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体でエステル化して
ジスルフィド含有のマイタンシノイドエステルを形成し； （３）工程（２）で調製されたジスルフィド含有のマイタンシノイドエステル
をチオール含有のマイタンシノイドに還元し； （４）ジチオピリジル基を細胞結合剤に導入し；および （５）工程（３）で産生したチオール含有のマイタンシノイドを工程（４）の
ジチオピリジル細胞結合基にジスルフィド結合により結合させる ことを含む方法により調製することができる。
剤／マイタンシノイド複合体を製造することができる。本発明の方法により調製
されたアンサミトシンは還元的切断を受け、米国特許第５２０８０２０号に記載
されているように、マイタンシノイド誘導体を含有するＮ−メチル−Ｌ−アラニ
ンを製造するのに用いることができる、マイタンシノールとすることができる。
ついで、これらの誘導体を、ジスルフィド結合などの種々のリンカーを介して、
細胞結合剤、好ましくは抗体と接合させる。 一例としての細胞結合剤／マイタンシノイド複合体は、以下の工程： （１）本発明の方法により調製されたアンサミトシンをマイタンシノールに還
元し； （２）マイタンシノールをＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体でエステル化して
ジスルフィド含有のマイタンシノイドエステルを形成し； （３）工程（２）で調製されたジスルフィド含有のマイタンシノイドエステル
をチオール含有のマイタンシノイドに還元し； （４）ジチオピリジル基を細胞結合剤に導入し；および （５）工程（３）で産生したチオール含有のマイタンシノイドを工程（４）の
ジチオピリジル細胞結合基にジスルフィド結合により結合させる ことを含む方法により調製することができる。
【００１３】
本発明を次の具体的な、限定するものではない、実施例を参考にして説明する
。 実施例１ アクチノシンネマ・プレチオサム培養ブロスの抽出およびアンサミトシン精製 産生菌アクチノシンネマ・プレチオサムＡＴＣＣ３１５６５を含有する３７Ｌ
の全ブロス（アンサミトシンＰ−３の力価、８６．３ｍｇ／Ｌ）を７５℃で６０
分間系内で加熱処理して微生物を死滅させ、アンサミトシンの溶媒抽出を容易に
した。４０Ｌのトルエンを加え、その混合物を４５℃に加温した。上相のトルエ
ンの渦巻きが下相のブロスに引き込まれるが、乳化または相が完全に均一となら
ないように、相を攪拌した。抽出を１６時間以内に終え、重力下、２時間以内に
分離が生じた。 ８０ｍｇ／ＬのＰ−３を含有する３９Ｌのトルエンをサイホンにより回収し、
２０Ｌのロータリーエバポレーター（浴温度４０−４５℃、速度約９Ｌ／時間）
を用いて蒸発させた。蒸発後に、３．１ｇのＰ−３（２７．６％ｗ／ｗ）を含有
する１１．２ｇの移動油を得た。トルエンに溶かし、再び蒸発させることで得ら
れた抽出物をフラスコに移した。（抽出段階の収率＝９７％） その抽出物を１２０ｍｌのトルエンに溶かし、３７５ｍｌのトルエン（３ｂｖ
）のシリカカラム（キーゼルゲル６０、トルエンをパックした１２５ｍｌの床容
量、４ｃｍ径ｘ１０ｃｍ）にローディングした。該カラムを２ｂｖのトルエンで
洗浄し、ついで４ｘ２ｂｖのトルエン中２％ＭｅＯＨで溶出し、つづいて１２ｘ
１ｂｖのトルエン中４％ＭｅＯＨで溶出した。該カラムを４０ｍｌ／分で溶出し
、有色のタイトなバンドを得た。アンサミトシンＰ−３を含有するフラクション
７−１０をまとめ、蒸発させて、Ｐ−３を２．５ｇ含有する油状固体３．２ｇを
得た。この物質をＬＣ−ＭＳおよびＭＳ−ＭＳで分析した。
。 実施例１ アクチノシンネマ・プレチオサム培養ブロスの抽出およびアンサミトシン精製 産生菌アクチノシンネマ・プレチオサムＡＴＣＣ３１５６５を含有する３７Ｌ
の全ブロス（アンサミトシンＰ−３の力価、８６．３ｍｇ／Ｌ）を７５℃で６０
分間系内で加熱処理して微生物を死滅させ、アンサミトシンの溶媒抽出を容易に
した。４０Ｌのトルエンを加え、その混合物を４５℃に加温した。上相のトルエ
ンの渦巻きが下相のブロスに引き込まれるが、乳化または相が完全に均一となら
ないように、相を攪拌した。抽出を１６時間以内に終え、重力下、２時間以内に
分離が生じた。 ８０ｍｇ／ＬのＰ−３を含有する３９Ｌのトルエンをサイホンにより回収し、
２０Ｌのロータリーエバポレーター（浴温度４０−４５℃、速度約９Ｌ／時間）
を用いて蒸発させた。蒸発後に、３．１ｇのＰ−３（２７．６％ｗ／ｗ）を含有
する１１．２ｇの移動油を得た。トルエンに溶かし、再び蒸発させることで得ら
れた抽出物をフラスコに移した。（抽出段階の収率＝９７％） その抽出物を１２０ｍｌのトルエンに溶かし、３７５ｍｌのトルエン（３ｂｖ
）のシリカカラム（キーゼルゲル６０、トルエンをパックした１２５ｍｌの床容
量、４ｃｍ径ｘ１０ｃｍ）にローディングした。該カラムを２ｂｖのトルエンで
洗浄し、ついで４ｘ２ｂｖのトルエン中２％ＭｅＯＨで溶出し、つづいて１２ｘ
１ｂｖのトルエン中４％ＭｅＯＨで溶出した。該カラムを４０ｍｌ／分で溶出し
、有色のタイトなバンドを得た。アンサミトシンＰ−３を含有するフラクション
７−１０をまとめ、蒸発させて、Ｐ−３を２．５ｇ含有する油状固体３．２ｇを
得た。この物質をＬＣ−ＭＳおよびＭＳ−ＭＳで分析した。
【００１４】
この段階で、該生成物は８５．１％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９
３．９％の所望のアンサミトシンを含有した（カラム段階収率＝８０．６％）。 シリカカラムからの生成物を４０℃に加温した２００ｍＬのＥｔＯＡｃに溶か
した。ヘプタン（２００ｍＬ）を加え、該溶液を冷却した。該溶液に１ｍｇの純
粋なＰ−３結晶を接種した（結晶化はまたフラスコの他の部位でも同時に起った
）。外界温度で４時間経過後、上澄をＨＰＬＣにより分析し、０．８ｇのＰ−３
（３０％）がまだ溶液中にあると測定された。さらにヘプタン（１５０ｍｌ）を
加え、該フラスコをさらに３時間放置して、再び分析した。この分析は０．４ｇ
のＰ−３（１６％）が溶液中に残っていることを示した。該フラスコを4℃で一
夜放置した。その後の分析で、わずかに７０ｍｇのＰ−３（３％）だけが溶液中
に残っていることがかわった。焼結フィルターラインアセンブリーを用いて吸引
して、母液を除去した。白色針状晶をＥｔＯＡｃ：ヘプタン（１：３）（２ｘ１
５ｍｌ）で洗浄した。結晶を、ロータリーエバポレーター中、３０℃で１０時間
、真空下で系内乾燥に付した。２．５ｇの結晶を得た（結晶化収率＝８６％）。 最終生成物は８６％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９８．４％の所望
のアシル化アンサミトシン（Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３、Ｐ−３’、Ｐ−４、Ｐ−
４’）を含有した。
３．９％の所望のアンサミトシンを含有した（カラム段階収率＝８０．６％）。 シリカカラムからの生成物を４０℃に加温した２００ｍＬのＥｔＯＡｃに溶か
した。ヘプタン（２００ｍＬ）を加え、該溶液を冷却した。該溶液に１ｍｇの純
粋なＰ−３結晶を接種した（結晶化はまたフラスコの他の部位でも同時に起った
）。外界温度で４時間経過後、上澄をＨＰＬＣにより分析し、０．８ｇのＰ−３
（３０％）がまだ溶液中にあると測定された。さらにヘプタン（１５０ｍｌ）を
加え、該フラスコをさらに３時間放置して、再び分析した。この分析は０．４ｇ
のＰ−３（１６％）が溶液中に残っていることを示した。該フラスコを4℃で一
夜放置した。その後の分析で、わずかに７０ｍｇのＰ−３（３％）だけが溶液中
に残っていることがかわった。焼結フィルターラインアセンブリーを用いて吸引
して、母液を除去した。白色針状晶をＥｔＯＡｃ：ヘプタン（１：３）（２ｘ１
５ｍｌ）で洗浄した。結晶を、ロータリーエバポレーター中、３０℃で１０時間
、真空下で系内乾燥に付した。２．５ｇの結晶を得た（結晶化収率＝８６％）。 最終生成物は８６％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９８．４％の所望
のアシル化アンサミトシン（Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３、Ｐ−３’、Ｐ−４、Ｐ−
４’）を含有した。
【００１５】
アクチノシンネマ・プレチオサム培養ブロスの抽出およびアンサミトシン精製
産生菌アクチノシンネマ・プレチオサムＡＴＣＣ３１５６５を含有する１１０
０Ｌの全ブロス（アンサミトシンＰ−３の力価、７５．１ｍｇ／Ｌ、８２．６ｇ
のＰ−３）を７５℃で６０分間系内で加熱処理して微生物を死滅させ、アンサミ
トシンの溶媒抽出を容易にした。加熱死滅工程の後に、７７．６ｇのＰ−３が残
った。予め４５℃に加温した等容量のトルエンを加え、その混合物を４５℃に維
持した。上相のトルエンの渦巻きが下相のブロスに引き込まれるが、乳化または
相が完全に均一とならないように、相を攪拌した。抽出を４５時間行い、つづい
て重力下で３０分以内に分離が生じた。（抽出段階の収率＝９０．３％）。 アンサミトシン含有の１１２７Ｌのトルエン抽出物を流下フィルムエバポレー
ター（ＦＦＥ）を用いて２２Ｌに濃縮した。その濃縮物を５０Ｌのロータリーエ
バポレーターに移し、低容量にまで蒸発させた（蒸留速度１４．６Ｌ／時間）。
ＦＦＥを２ｘ２Ｌのトルエンですすぎ、そのリンス液を該エバポレーターに通し
、生成物を完全に移した。その濃縮物を蒸発乾固させた。
０Ｌの全ブロス（アンサミトシンＰ−３の力価、７５．１ｍｇ／Ｌ、８２．６ｇ
のＰ−３）を７５℃で６０分間系内で加熱処理して微生物を死滅させ、アンサミ
トシンの溶媒抽出を容易にした。加熱死滅工程の後に、７７．６ｇのＰ−３が残
った。予め４５℃に加温した等容量のトルエンを加え、その混合物を４５℃に維
持した。上相のトルエンの渦巻きが下相のブロスに引き込まれるが、乳化または
相が完全に均一とならないように、相を攪拌した。抽出を４５時間行い、つづい
て重力下で３０分以内に分離が生じた。（抽出段階の収率＝９０．３％）。 アンサミトシン含有の１１２７Ｌのトルエン抽出物を流下フィルムエバポレー
ター（ＦＦＥ）を用いて２２Ｌに濃縮した。その濃縮物を５０Ｌのロータリーエ
バポレーターに移し、低容量にまで蒸発させた（蒸留速度１４．６Ｌ／時間）。
ＦＦＥを２ｘ２Ｌのトルエンですすぎ、そのリンス液を該エバポレーターに通し
、生成物を完全に移した。その濃縮物を蒸発乾固させた。
【００１６】
その乾燥抽出物を７．２Ｌのトルエン中４％メタノールに溶かし、シリカカラ
ム（キーゼルゲル６０、トルエン中４％メタノールをパックした４．８Ｌの床容
量、１５．０ｃｍ径ｘ２７．０ｃｍ、ローディング速度１２０ｍＬ／分）にロー
ディングした。該カラムを、トルエン中４％メタノールを用い、２２７−３８４
ｍＬ／分の流速でイソクラティックに溶出させ、有色のタイトなバンドを得た。
最初のフラクションは１床容量であった；フラクション３ないし６は１／２床容
量で集めた。フラクションをＴＬＣ（キーゼルゲル６０ Ｆ２５４プレート、ジ
クロロメタン中５％メタノールで操作、２５４ｎｍでＵＶにより可視化）により
モニターし、アンサミトシンを含有するフラクションをＨＰＬＣおよびＬＣ−Ｍ
Ｓでモニターした。結晶化のためのフラクションの選択はフラクションのＨＰＬ
ＣおよびＬＣ−ＭＳ分析に基づいており、アンサミトシンＰ−３回収を最適化し
、望ましくないアンサミトシンを最小とした。アンサミトシンＰ−３を含有する
フラクション５ないし１０をまとめ、蒸発させて、Ｐ−３を５４．６ｇ含有する
固体を得た。この段階で、該生成物は７７．１％のアンサミトシンＰ−３を含有
し、合計９６．１％の所望のアンサミトシンを含有した（カラム段階の収率＝９
２．５％）。
ム（キーゼルゲル６０、トルエン中４％メタノールをパックした４．８Ｌの床容
量、１５．０ｃｍ径ｘ２７．０ｃｍ、ローディング速度１２０ｍＬ／分）にロー
ディングした。該カラムを、トルエン中４％メタノールを用い、２２７−３８４
ｍＬ／分の流速でイソクラティックに溶出させ、有色のタイトなバンドを得た。
最初のフラクションは１床容量であった；フラクション３ないし６は１／２床容
量で集めた。フラクションをＴＬＣ（キーゼルゲル６０ Ｆ２５４プレート、ジ
クロロメタン中５％メタノールで操作、２５４ｎｍでＵＶにより可視化）により
モニターし、アンサミトシンを含有するフラクションをＨＰＬＣおよびＬＣ−Ｍ
Ｓでモニターした。結晶化のためのフラクションの選択はフラクションのＨＰＬ
ＣおよびＬＣ−ＭＳ分析に基づいており、アンサミトシンＰ−３回収を最適化し
、望ましくないアンサミトシンを最小とした。アンサミトシンＰ−３を含有する
フラクション５ないし１０をまとめ、蒸発させて、Ｐ−３を５４．６ｇ含有する
固体を得た。この段階で、該生成物は７７．１％のアンサミトシンＰ−３を含有
し、合計９６．１％の所望のアンサミトシンを含有した（カラム段階の収率＝９
２．５％）。
【００１７】
シリカカラムからの生成物を予め４６℃に加温した９１ｍＬのメタノールに溶
かし、つづいて同じ温度に加温した５４６ｍｌの酢酸エチルに溶かした。さらに
メタノールのアリコートを加え、固体の溶解を助成した。合計１６６ｍＬのメタ
ノールを該混合物に加えた。５０℃に加温したヘプタン（１００ｍＬ）を最初の
混濁の徴候のあるまで加え、ついで結晶化が生じるように、溶液を外界温度に冷
却した。４時間後、さらに１３２４ｍＬのヘプタン（外界温度）を加えた。上澄
をＨＰＬＣで分析し、６．６ｇのＰ−３がまだ溶液中にあると測定された。混合
物を氷冷し、さらなるアリコートのヘプタン（２００および４００ｍＬ）を３．
９ｇのＰ−３（６．８％）が母液中に残るまで加えた。焼結フィルターラインア
センブリーを用いて吸引して、母液を除去した。結晶をＥｔＯＡｃ：ヘプタン（
１：３）（２ｘ１５０ｍｌ）で洗浄した。結晶を、ロータリーエバポレーター中
、３０℃で８８．５時間、最初は低真空下、つづいて高真空下（１．０−１．３
ミリバール）で系内乾燥に付した。７６．４ｇの結晶を得た。 最終生成物は７４．５％のアンサミトシンＰ−３（５６．９ｇ）を含有し、合
計９７．８％の所望のアシル化アンサミトシンを含有した（全収率＝６９％）。
かし、つづいて同じ温度に加温した５４６ｍｌの酢酸エチルに溶かした。さらに
メタノールのアリコートを加え、固体の溶解を助成した。合計１６６ｍＬのメタ
ノールを該混合物に加えた。５０℃に加温したヘプタン（１００ｍＬ）を最初の
混濁の徴候のあるまで加え、ついで結晶化が生じるように、溶液を外界温度に冷
却した。４時間後、さらに１３２４ｍＬのヘプタン（外界温度）を加えた。上澄
をＨＰＬＣで分析し、６．６ｇのＰ−３がまだ溶液中にあると測定された。混合
物を氷冷し、さらなるアリコートのヘプタン（２００および４００ｍＬ）を３．
９ｇのＰ−３（６．８％）が母液中に残るまで加えた。焼結フィルターラインア
センブリーを用いて吸引して、母液を除去した。結晶をＥｔＯＡｃ：ヘプタン（
１：３）（２ｘ１５０ｍｌ）で洗浄した。結晶を、ロータリーエバポレーター中
、３０℃で８８．５時間、最初は低真空下、つづいて高真空下（１．０−１．３
ミリバール）で系内乾燥に付した。７６．４ｇの結晶を得た。 最終生成物は７４．５％のアンサミトシンＰ−３（５６．９ｇ）を含有し、合
計９７．８％の所望のアシル化アンサミトシンを含有した（全収率＝６９％）。
【００１８】
実施例３
シリカクロマトグラフィーおよびアンサミトシンの結晶化
６４．８ｍｇ／Lの力価のアンサミトシンＰ−３を含む１００８Lのアクチノシ
ンネマ・プレチオサム全ブロスを、本質的に実施例１に記載されるように、熱処
理し、トルエンで抽出して蒸発させた。 ３４．５ｇのアンサミトシンＰ−３を含有する濃縮物を３Ｌのトルエンに溶か
し、シリカカラム（キーゼルゲル６０、トルエンをパックした３．０Ｌの床容量
、１３．８ｃｍ径ｘ１６．６ｃｍ）にローディングした。該カラムを４ｃｍの砂
床で頂部を覆った。該カラムを５Ｌのトルエンで洗浄し、つづいて２０Ｌのトル
エン中２％ＭｅＯＨで洗浄し、それを５Ｌのフラクションで集めた。ついで、該
カラムをトルエン中４％ＭｅＯＨで溶出し、２．５Ｌのフラクションで集めた。
アンサミトシンはフラクション９ないし１５で溶出した。結晶化のためにフラク
ションの選択はフラクションのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ分析を基礎とし、アン
サミトシンＰ−３回収を最適とし、望ましくないアンサミトシンを最小とした。
フラクション１０ないし１２をまとめ、蒸発乾固させて、３２．５ｇのアンサミ
トシンＰ−３を含有する油を得た。 この段階の生成物は９１．８％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９５．
３％の望ましいアシル化アンサミトシンを含有した（カラム段階の収率＝９４．
２％）。
ンネマ・プレチオサム全ブロスを、本質的に実施例１に記載されるように、熱処
理し、トルエンで抽出して蒸発させた。 ３４．５ｇのアンサミトシンＰ−３を含有する濃縮物を３Ｌのトルエンに溶か
し、シリカカラム（キーゼルゲル６０、トルエンをパックした３．０Ｌの床容量
、１３．８ｃｍ径ｘ１６．６ｃｍ）にローディングした。該カラムを４ｃｍの砂
床で頂部を覆った。該カラムを５Ｌのトルエンで洗浄し、つづいて２０Ｌのトル
エン中２％ＭｅＯＨで洗浄し、それを５Ｌのフラクションで集めた。ついで、該
カラムをトルエン中４％ＭｅＯＨで溶出し、２．５Ｌのフラクションで集めた。
アンサミトシンはフラクション９ないし１５で溶出した。結晶化のためにフラク
ションの選択はフラクションのＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ分析を基礎とし、アン
サミトシンＰ−３回収を最適とし、望ましくないアンサミトシンを最小とした。
フラクション１０ないし１２をまとめ、蒸発乾固させて、３２．５ｇのアンサミ
トシンＰ−３を含有する油を得た。 この段階の生成物は９１．８％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９５．
３％の望ましいアシル化アンサミトシンを含有した（カラム段階の収率＝９４．
２％）。
【００１９】
まとめたシリカフラクションからの濃縮物を５０℃の水浴中で加温し、最小容
量の加温メタノール／酢酸エチル（５０℃）に溶かした。まず、６０ｍＬのメタ
ノールを加え、つづいて３００ｍＬの酢酸エチルをゆっくりと添加した。さらに
２００ｍＬの温メタノールを添加し、その時点で濃縮物は完全に溶解した。２０
０ｍＬの温ヘプタン（５０℃）を加え、水浴を結晶化溶液から取り外した。結晶
化が始まり、総容量８００ｍＬのヘプタンが添加されるまで、さらにヘプタンを
２００ｍＬのアリコートで添加した。その混合物を氷浴中で１８時間冷却した。
母液をＨＰＬＣ分析に付すことで結晶化をモニターした。１８時間の時点で、６
．３％のアンサミトシンＰ−３が母液中に残っていた。さらに２００ｍＬのヘプ
タンを添加し、混合物をさらに５時間冷却した。ＨＰＬＣ分析は４．０％のアン
サミトシンが母液中に残っていることを示した。 暗褐色母液を吸引することで結晶を回収した。該結晶を５０ｍｌのヘプタン：
酢酸エチル（３：１）で３回洗浄し、真空下（０．８ミリバール）で一夜乾燥さ
せた。該結晶は２８．２ｇのアンサミトシンＰ−３を含有する均一な細かい灰白
色針状晶であった。（結晶化段階の回収率＝８６．９％） 最終生成物は９３．１％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９８．４％の
望ましいアシル化アンサミトシンを含有した。
量の加温メタノール／酢酸エチル（５０℃）に溶かした。まず、６０ｍＬのメタ
ノールを加え、つづいて３００ｍＬの酢酸エチルをゆっくりと添加した。さらに
２００ｍＬの温メタノールを添加し、その時点で濃縮物は完全に溶解した。２０
０ｍＬの温ヘプタン（５０℃）を加え、水浴を結晶化溶液から取り外した。結晶
化が始まり、総容量８００ｍＬのヘプタンが添加されるまで、さらにヘプタンを
２００ｍＬのアリコートで添加した。その混合物を氷浴中で１８時間冷却した。
母液をＨＰＬＣ分析に付すことで結晶化をモニターした。１８時間の時点で、６
．３％のアンサミトシンＰ−３が母液中に残っていた。さらに２００ｍＬのヘプ
タンを添加し、混合物をさらに５時間冷却した。ＨＰＬＣ分析は４．０％のアン
サミトシンが母液中に残っていることを示した。 暗褐色母液を吸引することで結晶を回収した。該結晶を５０ｍｌのヘプタン：
酢酸エチル（３：１）で３回洗浄し、真空下（０．８ミリバール）で一夜乾燥さ
せた。該結晶は２８．２ｇのアンサミトシンＰ−３を含有する均一な細かい灰白
色針状晶であった。（結晶化段階の回収率＝８６．９％） 最終生成物は９３．１％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９８．４％の
望ましいアシル化アンサミトシンを含有した。
【００２０】
実施例４
アンサミトシンのトルエン抽出液からの精製および結晶化
７４．５ｍｇ／Lの力価のアンサミトシンＰ−３を含む１００１Lのアクチノシ
ンネマ・プレチオサム全ブロスを、本質的に実施例１に記載されるように、熱処
理し、トルエンで抽出して蒸発させ、５４．７ｇのアンサミトシンＰ−３を含有
する９．５Ｌの濃縮抽出物を得た。 その濃縮物を４５℃に加熱し、１４．５Ｌのヘプタンを３３分間にわたって添
加し、アンサミトシンを沈殿させた。その混合物を氷冷した。さらに５Ｌのヘプ
タンを加え、混合物を一夜放置した。吸引により母液を取りだし、沈殿物をトル
エン：ヘプタン（１：１）で洗浄した。ＨＰＬＣ分析は母液が６．５％のアンサ
ミトシンＰ−３を含有することを、そして洗液が１．８％のＰ−３を含有するこ
とを示した。沈殿物を２Ｌのメタノールに溶かし、０．２ミクロンフィルターを
介して濾過した。
ンネマ・プレチオサム全ブロスを、本質的に実施例１に記載されるように、熱処
理し、トルエンで抽出して蒸発させ、５４．７ｇのアンサミトシンＰ−３を含有
する９．５Ｌの濃縮抽出物を得た。 その濃縮物を４５℃に加熱し、１４．５Ｌのヘプタンを３３分間にわたって添
加し、アンサミトシンを沈殿させた。その混合物を氷冷した。さらに５Ｌのヘプ
タンを加え、混合物を一夜放置した。吸引により母液を取りだし、沈殿物をトル
エン：ヘプタン（１：１）で洗浄した。ＨＰＬＣ分析は母液が６．５％のアンサ
ミトシンＰ−３を含有することを、そして洗液が１．８％のＰ−３を含有するこ
とを示した。沈殿物を２Ｌのメタノールに溶かし、０．２ミクロンフィルターを
介して濾過した。
【００２１】
そのメタノール溶液を蒸発乾固させ、５０℃の８５ｍＬのメタノールに再び溶
かした。５１０ｍＬの酢酸エチルを該溶液に溶かし、つづいて２００ｍＬのヘプ
タンを添加した。該混合物を外界温度にまで冷却し、結晶化が始まるように、さ
らに９００ｍＬのヘプタンをゆっくりと添加した。４．１４ｇのアンサミトシン
Ｐ−３が母液中に残った。さらに４００ｍＬのヘプタンを添加し、混合物を氷冷
した。２．７ｇのアンサミトシンＰ−３が母液中に残った。 吸引により母液を取りだし、結晶を５０℃の１１０ｍＬのメタノールおよび５
２０ｍＬの酢酸エチルに溶かした。ヘプタンを２回の７５ｍＬのアリコートにて
添加し、その混合物を外界温度にまで冷却し、別の９００ｍＬを加えた。さらに
４００ｍＬのヘプタンを加え、混合物を氷冷し、結晶化させるのに一夜放置した
。ＨＰＬＣ分析は２．３ｇのアンサミトシンＰ−３が母液中に残っていることを
示した。その母液を吸引により取りだし、結晶をヘプタン：酢酸エチル（３：１
）で洗浄し、真空下（０．６ミリバール）で一夜乾燥させた。４７．８ｇの結晶
は８４．３％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９７．０％の望ましいアシ
ル化アンサミトシンを含有した。
かした。５１０ｍＬの酢酸エチルを該溶液に溶かし、つづいて２００ｍＬのヘプ
タンを添加した。該混合物を外界温度にまで冷却し、結晶化が始まるように、さ
らに９００ｍＬのヘプタンをゆっくりと添加した。４．１４ｇのアンサミトシン
Ｐ−３が母液中に残った。さらに４００ｍＬのヘプタンを添加し、混合物を氷冷
した。２．７ｇのアンサミトシンＰ−３が母液中に残った。 吸引により母液を取りだし、結晶を５０℃の１１０ｍＬのメタノールおよび５
２０ｍＬの酢酸エチルに溶かした。ヘプタンを２回の７５ｍＬのアリコートにて
添加し、その混合物を外界温度にまで冷却し、別の９００ｍＬを加えた。さらに
４００ｍＬのヘプタンを加え、混合物を氷冷し、結晶化させるのに一夜放置した
。ＨＰＬＣ分析は２．３ｇのアンサミトシンＰ−３が母液中に残っていることを
示した。その母液を吸引により取りだし、結晶をヘプタン：酢酸エチル（３：１
）で洗浄し、真空下（０．６ミリバール）で一夜乾燥させた。４７．８ｇの結晶
は８４．３％のアンサミトシンＰ−３を含有し、合計９７．０％の望ましいアシ
ル化アンサミトシンを含有した。
【００２２】
実施例５
キシレンを用いるアクチノシンネマ・プレチオサム培養ブロスの抽出およびアン
サミトシン精製 ４４μｇ／ｍｌの力価のアンサミトシンＰ−３を含む、熱処理した２２０ｍＬ
のアクチノシンネマ・プレチオサムを４５℃の水浴中に置き、等容量のキシレン
を加えた。キシレンの渦巻きが下相ブロスに引き込まれるが、エマルジョンを形
成しないように、相を混合した。２０時間後には、６４％のアンサミトシンＰ−
３がキシレン相に抽出された。 重力で混合物を分離し、１７０ｍＬのキシレンを取り出した。キシレン抽出液
を蒸発乾固させた。キシレン抽出物をシリカクロマトグラフィーを用いて精製し
た。抽出物を２ｍＬのトルエン中４％メタノールに溶かしてローディングし、同
じ溶媒混合液を用いて溶出させた。フラクション（０．５ｍＬ）を集め、ＴＬＣ
（キーゼルゲル６０Ｆ２５４プレートをジクロロメタン：メタノール（２０：１
）中で取り扱う）でアッセイした。アンサミトシンＰ−３を含有するフラクショ
ンを上記した実施例に記載の操作を用いて結晶化させた。その結晶性生成物は、
色相および純度の点で、発酵ブロスをトルエン抽出することで得られたものに匹
敵する特性であった。
サミトシン精製 ４４μｇ／ｍｌの力価のアンサミトシンＰ−３を含む、熱処理した２２０ｍＬ
のアクチノシンネマ・プレチオサムを４５℃の水浴中に置き、等容量のキシレン
を加えた。キシレンの渦巻きが下相ブロスに引き込まれるが、エマルジョンを形
成しないように、相を混合した。２０時間後には、６４％のアンサミトシンＰ−
３がキシレン相に抽出された。 重力で混合物を分離し、１７０ｍＬのキシレンを取り出した。キシレン抽出液
を蒸発乾固させた。キシレン抽出物をシリカクロマトグラフィーを用いて精製し
た。抽出物を２ｍＬのトルエン中４％メタノールに溶かしてローディングし、同
じ溶媒混合液を用いて溶出させた。フラクション（０．５ｍＬ）を集め、ＴＬＣ
（キーゼルゲル６０Ｆ２５４プレートをジクロロメタン：メタノール（２０：１
）中で取り扱う）でアッセイした。アンサミトシンＰ−３を含有するフラクショ
ンを上記した実施例に記載の操作を用いて結晶化させた。その結晶性生成物は、
色相および純度の点で、発酵ブロスをトルエン抽出することで得られたものに匹
敵する特性であった。
【００２３】
本発明はその精神または本質的な属性から逸脱することなく他の特定の形態に
て具現化することができ、したがって、本発明の範囲を示すものとして、明細書
の記載よりもむしろ特許請求の範囲を参考とすべきである。
て具現化することができ、したがって、本発明の範囲を示すものとして、明細書
の記載よりもむしろ特許請求の範囲を参考とすべきである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ
，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，
ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ
Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ
，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，
ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ
Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ
，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，
ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 アナ・ステファンスカ
イギリス、シーエム19・５エイダブリュ
ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ
ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ
エンス・パーク・サウス、グラクソスミス
クライン
(72)発明者 ジャン・サーケトル
イギリス、ビーエヌ14・８キューエイチ、
ウエスト・サセックス、ワーシング、クラ
レンドン・ロード、グラクソスミスクライ
ン
Ｆターム(参考） 4B064 AE58 CA03 CE08 DA02
4C076 AA95 CC27 CC42 EE41 EE59
FF02
4C086 AA03 CB22 MA01 MA05 NA13
NA15 ZB26
Claims (16)
- 【請求項１】 精製されたアンサミトシンの製法であって、 ａ．アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し； ｂ．その培地を処理してアンサミトシンの溶媒抽出を容易にし； ｃ．芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその培地から抽出し； ｄ．その抽出されたアンサミトシンを濃縮し； ｅ．結晶化によりアンサミトシンを精製する 工程を含む、方法。
- 【請求項２】 精製されたアンサミトシンの製法であって、 ａ．アンサミトシン産生微生物を液体培地で培養し； ｂ．芳香族炭化水素溶媒を用いてアンサミトシンをその培地から抽出し； ｃ．その抽出されたアンサミトシンを濃縮し； ｄ．結晶化によりアンサミトシンを精製する 工程を含む、方法。
- 【請求項３】 アンサミトシン産生微生物がアクチノシンネマ種である、請
求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 アクチノシンネマ種がアクチノシンネマ・プレチオサムＡＴ
ＣＣ３１５６５である、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 アクチノシンネマ種がアクチノシンネマ・プレチオサムＡＴ
ＣＣ３１２８１である、請求項３記載の方法。 - 【請求項６】 上記した処理が約７５℃で加熱することである、請求項１記
載の方法。 - 【請求項７】 溶媒がトルエンである、請求項１または２記載の方法。
- 【請求項８】 トルエンの熱処理した培地に対する割合が約１：１である、
請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 抽出温度が約４５℃である、請求項８記載の方法。
- 【請求項１０】 溶媒がキシレンである、請求項１または２記載の方法。
- 【請求項１１】 キシレンの熱処理した培地に対する割合が約１：１である
、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 抽出温度が約４５℃である、請求項１１記載の方法。
- 【請求項１３】 アンサミトシンが還元的切断を受けてマイタンシノールを
形成することができるアシル化アンサミトシンを含む、請求項１または２記載の
方法。 - 【請求項１４】 請求項１または２に記載の方法により調製されたアンサミ
トシン。 - 【請求項１５】 請求項１または２に記載の方法により調製されたアンサミ
トシンを細胞結合剤−マイタンシノイド複合体に変えることにより調製される細
胞結合剤−マイタンシノイド複合体。 - 【請求項１６】 細胞結合剤が抗体である、請求項１５記載の細胞結合剤−
マイタンシノイド複合体。
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