ES2266243T3 - Procedimientos de produccion de ansamitocina. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para preparar ansamitocinas purificadas que comprende las etapas de: a. cultivar un microorganismo que produce ansamitocina en un medio de cultivo líquido; b. tratar el medio de cultivo para facilitar la extracción con solvente de las ansamitocinas; c. extraer ansamitocinas del medio de cultivo con tolueno o xileno; d. concentrar las ansamitocinas extraídas; y e. purificar las ansamitocinas mediante cristalización, en el que dicho procedimiento no incluye una etapa de filtración.
Description
Procedimientos de producción de
ansamitocina.
Esta invención se refiere a los procedimientos
para la preparación de ansamitocinas, en particular ansamitocinas
que pueden convertirse en maytansinol.
Los fármacos maytansinoides altamente
citotóxicos y su uso terapéutico se describieron en la Patente de
EEUU Nº 5.208.020. Estos fármacos pueden prepararse a partir de los
precursores de ansamitocina producidos por fermentación de
microorganismos como la Actinosynnema.
Bajo condiciones definidas de cultivo,
Actinosynnema spp. tal como Actinosynnema pretiosum
produce una cantidad de ansamitocinas relacionadas. El producto
principal es ansamitocina P-3 con un fragmento
isobutirilo en la posición C-3. Otras ansamitocinas
que difieren sólo en la cadena acilo C-3 lateral se
producen como componentes menores, P-1 (fragmento
etionilo), P-2 (fragmento propionilo),
P-3' (fragmento butirilo), P-4
(fragmento isovalerilo) y P-4' (fragmento valerilo).
Todos estos compuestos pueden sufrir un clivaje reductivo para
producir un producto común, maytansinol (forma P-0).
Además, se producen en niveles bajos una cantidad de otras
ansamitocinas, que se modifican en otros sitios de la molécula
(hidroxilada o n-desmetilada). Esto no produce el
P-0 deseado en la desacilación.
Los procedimientos de producción de ansamitocina
P-3 a partir de Actinosynnema spp. se
describieron en las Patentes de EEUU Nº 4.162.940; 4.228.239;
4.356.265 y 4.450.234. En general, estos procedimientos requieren
agregar de un filtro de ayuda y un solvente miscible en agua para
todo el caldo de fermentación, eliminar los sólidos y extraer la
fracción acuosa con un solvente inmiscible en agua, concentrar y
precipitar con éter de petróleo, purificar el precipitado usando
cromatografía en sílice y cristalizar seguido por otra cromatografía
o recristalización. Procedimientos alternativos usan adsorción en
Diaion HP-10 en vez de cromatografía en sílice
seguida de extracción y cristalización.
Estos procedimientos puede usarse para lograr
rendimientos aceptables de ansamitocina P-3, pero
los procedimientos involucran un gran número de etapas que
introducen limitaciones en las operaciones de producción a gran
escala, particularmente debido a la naturaleza extremadamente tóxica
de los compuestos de ansamitocina y la necesidad de asegurar la
seguridad de los operadores humanos del procedimiento. Por ello,
existe la necesidad de disponer de un procedimiento alternativo más
seguro, usando menos cantidad de etapas y más controladas.
Un aspecto de la presente invención es un
procedimiento para la preparación de ansamitocinas purificadas que
comprende las etapas de:
a. cultivar un microorganismo que produce
ansamitocina en un medio de cultivo líquido;
b. tratar el medio de cultivo para facilitar la
extracción con solvente de las ansamitocinas;
c. extraer ansamitocinas del medio de cultivo
con un solvente hidrocarbonado aromático;
d. concentrar las ansamitocinas extraídas; y
e. purificar las ansamitocinas mediante
cristalización.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para preparar ansamitocinas purificadas que comprende
las etapas de:
a. cultivar un microorganismo que produce
ansamitocina en un medio de cultivo líquido;
b. extraer ansamitocinas del medio de cultivo
con un solvente hidrocarbonado aromático;
c. concentrar las ansamitocinas extraídas; y
d. purificar las ansamitocinas mediante
cristalización.
Se proveen procedimientos para preparar
ansamitocinas purificadas sin una etapa de filtración. Los
procedimientos comprenden las etapas de cultivar un microorganismo
que produce ansamitocinas en un medio de cultivo líquido, tratar el
medio de cultivo para liberar las ansamitocinas del microorganismo
hacia el medio de cultivo, facilitando así la extracción con
solvente, extraer las ansamitocinas del medio de cultivo tratado con
un solvente hidrocarbonato aromático, concentrar las ansamitocinas
extraídas y purificar las ansamitocinas mediante cristalización.
Alternativamente, puede omitirse la etapa de tratamiento.
Las ansamitocinas purificadas pueden reducirse a
maytansinol e incluyen ansamitocina P-3,
P-1, P-2, P-3',
P-4 y P-4'. Las ansamitocinas
purificadas solo contienen muy bajos niveles de ansamitocinas no
deseables con modificaciones en otros sitios de la molécula. De
preferencia, el microorganismo que produce ansamitocina es
Actinosynnema spp.. De particular preferencia
Actinosynnema pretiosum ATCC 31565. Actinosynnema
pretiosum ATCC 31281 resulta también particularmente de
preferencia. Los microorganismos pueden cultivarse mediante técnicas
de cultivo por fermentación bien conocidas por los expertos en la
técnica como aquellas descritas en la Patente de EEUU Nº
4.450.234.
Una forma de realización del procedimiento de la
presente invención usa el tratamiento de los microorganismos para
ayudar a liberar las ansamitocinas intracelulares y dejar las
ansamitocinas asociadas a las células más fácilmente disponibles
para la extracción con solvente. Procedimientos de tratamiento
ejemplares incluyen sonicación, presión elevada o temperaturas
elevadas. De preferencia, el tratamiento es un tratamiento por
calor. El tratamiento por calor puede llevarse a cabo a desde
aproximadamente 60ºC hasta aproximadamente 80ºC. De preferencia, la
etapa de tratamiento con calor se lleva a cabo a aproximadamente
75ºC, lo que mata al microorganismo y facilita la extracción con
solvente de las ansamitocinas. En una forma de realización
alternativa, no se usa ninguna etapa de tratamiento previo a la
extracción ya que aproximadamente el 60% de las ansamitocinas
totales pueden encontrarse en el medio de cultivo.
Las ansamitocinas pueden extraerse del medio de
cultivo mediante el uso de solventes hidrocarbonados aromáticos. Los
carbohidratos aromáticos tienen una selectividad particular por las
ansamitocinas sobre otros constituyentes del caldo, lo que asegura
que son necesarios sólo procedimientos simples para aislar el
producto puro. De preferencia el solvente hidrocarbonado aromático
es tolueno o xileno. Resulta particularmente de preferencia el
tolueno ya que se evapora a temperatura baja. Las propiedades del
tolueno y el xileno son tales que las capas acuosas y de solvente se
separan rápidamente por gravedad sin la necesidad de separación
mecánica y de este modo se consigue una contención mayor del
procedimiento y aumento en la seguridad del operador. La extracción
puede llevarse a cabo a temperaturas desde aproximadamente 20ºC
hasta aproximadamente 60ºC. De preferencia, la extracción se lleva a
cabo aproximadamente a 45ºC. El pH de la solución acuosa previo a la
extracción debería estar en el intervalo de 3 a 9. De preferencia,
el pH es cercano a la neutralidad, es decir, pH 6 a 8.
En general, para la extracción resulta de
preferencia un volumen equivalente de solvente con respecto al caldo
completo (1:1). Pueden usarse también intervalos de proporciones
alternativos de 2:1 a 1:4. Generalmente las soluciones se mezclan
lentamente por agitación y la mezcla se agita hasta que
aproximadamente >80% de las ansamitocinas hayan sido extraídas en
la capa orgánica. De preferencia la mezcla se deja decantar por
gravedad a una temperatura de entre 15ºC y 50ºC. La temperatura de
preferencia para la decantación es aproximadamente 45ºC.
Se elimina la capa orgánica y la concentración
del extracto por reducción de volumen del solvente puede llevarse a
cabo en vacío o mediante otros procedimientos bien conocidos por los
expertos en la técnica. Tras la reducción del volumen, el extracto
concentrado puede disolverse opcionalmente en un solvente polar tal
como metanol y clarificarse usando un filtro de membrana tal como
PTFE, o un filtro de profundidad tal como sílice o alúmina.
Para purificar las ansamitocinas deseadas, en
particular P-3, se usa la cristalización reduciendo
los niveles de ansamitocinas no deseadas. Una mezcla de solventes de
preferencia para la cristalización es acetato de etilo y heptano.
Tal cristalización se lleva a cabo de manera convencional. Para
ayudar a la disolución del sólido para la cristalización, puede
agregarse un pequeño volumen de metanol o solvente polar similar
previo al agregado del acetato de etilo y posteriormente tratar con
volúmenes mayores de heptano, opcionalmente con agitación y
enfriamiento para alcanzar el producto cristalizado. El producto
puede recristalizarse siguiendo el mismo procedimiento.
Alternativamente, previo a la cristalización,
las ansamitocinas impuras extraídas del caldo de fermentación pueden
purificarse usando gel de sílice, por ejemplo pasando una solución
del extracto de solvente a través de un lecho de sílice. Los
solventes usados para cromatografía pueden ser tolueno o mezclas de
tolueno y metanol. También pueden usarse otros solventes conocidos
por los expertos en la técnica. Se combinan y concentran las
fracciones que contienen ansamitocinas P-3 bajo
presión reducida.
Se proveen también procedimientos para el
análisis de ansamitocinas mediante HPLC. Por medio de los
procedimientos se obtiene la cuantificación de ansamitocina
P-3 y análisis de proporciones de ansamitocina.
Estos procedimientos se emplearon en los Ejemplos que se exponen a
continuación.
La cuantificación de ansamitocina
P-3 en caldo y muestras de extracción puede
realizarse en una columna C18 de Waters Q Spherisorb S5 ODS2, de 4,6
x 250 mm, con una columna de seguridad de 10 mm. La detección UV es
a 252 nm y 205 nm. Se usa una fase móvil isocrática de 1 ml/min, 60%
MeCN (0,05% TFA) en agua (0,05% TFA) y un volumen de inyección de 20
\mul.
Puede determinarse las proporciones de
ansamitocina a lo largo del procedimiento en una columna C8 de
Waters Symmetry Shield, de 3,9 x 150 mm, sin columna de seguridad.
La detección de rayos UV es a 252 nm y 205 nm. Se usa una fase móvil
de gradiente de 1 ml/min, 35-45% MeCN (0,05% TFA) en
agua (0,05% TFA) durante 30 minutos con un reequilibrado de 10
minutos a 40ºC y un volumen de inyección de 10 \mul.
Puede determinarse análisis de proporciones de
ansamitocinas en fracciones de cromatografía y producto final en
una columna C8 de Waters Symmetry Shield, de 3,9 x 150 mm, sin
columna de seguridad con un sistema de detección
LC-MS, ionización por electrovaporización a presión
atmosférica, modo ión +ve. La detección de Masa con voltaje de 30 V
para identificar positivamente los picos se logra mediante
exploración MS completo (exploración desde 600-700
uma con quad 1). La fragmentación MS-MS para
determinar la clase de ansamitocina se lleva a cabo usando el mismo
sistema de gradiente. Se usa una fase móvil de gradiente de 1
ml/min, 35-45% MeCN (0,05% TFA) en agua (0,05% TFA)
durante 30 minutos con un reequilibrado de 10 minutos a 40ºC y un
volumen de inyección de 10 \mul.
La cuantificación de ansamitocina
P-3 en flujos de deshecho y otras muestras de bajo
nivel que requieren alta sensibilidad puede determinarse en una
columna C18 de Waters Spherisorb S5 ODS2, 4,6 x 250 mm, con una
columna de seguridad de 10 mm y sistema de detección de ionización
por electrovaporización a presión atmosférica
LC-MS-MS, modo ión +ve, con voltaje
de 30 V. Se seleccionaron los iones moleculares para la
determinación del tipo estructural de las especies principales, y
los patrones de fragmentación observados fueron un ión predominante
547 que indica N-metilado y uno 533 que indica
N-demetilado. Se usan una fase móvil isocrática de 1
ml/min, 60% MeCN (0,05% TFA) en agua (0,05% TFA) y un volumen de
inyección de 20 \mul.
El procedimiento de la invención puede usarse
para formar complejos agente/maytansinoid de unión a células, que
son útiles como profármacos para tumores activados. Las
ansamitocinas preparadas mediante el procedimiento de la invención
pueden sufrir clivaje reductivo a maytansinol, que puede usarse como
se describió en la Patente de EEUU Nº 5.208.020 para producir
N-metil-L-alanina
conteniendo derivados de maytansinoid. Estos derivados conjugan
posteriormente con agentes de unión a células, de preferencia
anticuerpos, mediante varios conectores tal como un enlace
disulfuro.
Puede prepararse un complejo agente/maytansinoid
de unión a células mediante un procedimiento que comprende las
siguientes etapas:
(1) reducción de ansamitocinas preparadas
mediante el procedimiento de la invención a maytansinol;
(2) esterificación del maytansinol con derivados
de N-metil-L-alanina
para formar un éster de maytansinoid que contiene disulfuro;
(3) reducción del éster de maytansinoid que
contiene disulfuro preparado mediante la etapa (2) a un maytansinoid
que contiene tiol;
(4) introducción de grupos ditiopiridilo en un
agente de unión a células; y
(5) unión del maytansinoid que contiene tiol
producido en la etapa (3) al agente de unión a células con
ditiopiridilo de la etapa (4) mediante una unión disulfuro.
La presente invención se describirá ahora con
referencia a los siguientes ejemplos específicos, no
limitativos.
Se trataron 37 l del caldo completo conteniendo
la cepa productora Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 (título
de ansamitocina P-3 86,3 mg/l) con calor in
situ a 75ºC durante 60 minutos para matar los microorganismos y
facilitar la extracción con solvente de las ansamitocinas. Se
agregaron 40 l de tolueno y se llevó la mezcla a 45ºC. Se agitaron
las fases de tal manera que un vórtex de la fase superior del
tolueno la llevó hacia la fase inferior de caldo pero sin emulsionar
u homogeneizar por completo las fases. La extracción se completó
dentro de las 16 horas y la separación bajo gravedad dentro de las 2
horas.
Se recuperaron mediante sifón 39 l de tolueno
conteniendo 80 mg/l de P-3 y se evaporaron usando un
evaporador rotativo de 20 l (temperatura del baño
40-45ºC, velocidad de aproximadamente 9 l/h). Tras
la evaporación se generaron 11,2 g de aceite móvil, conteniendo 3,1
g de P-3; 27,6% p/p). El extracto resultante se
transfirió a un matraz por disolución en tolueno y reevaporación.
(Rendimiento de la etapa de extracción = 97%).
Se retomó el extracto en 120 ml de tolueno y se
cargó en una columna de sílice (Kieselgel 60, 125 ml de volumen del
lecho empaquetado en tolueno, 4 cm de diámetro x 10 cm) en 375 ml de
tolueno (3bv). Se lavo la columna con 2 bv de tolueno y
posteriormente se eluyó 4 veces con 2 bv de 2% MeOH en tolueno,
seguido por 12 veces 1 bv de 4% en tolueno. Se eluyó la columna a 40
ml/min y produjo bandas de color concretas apretadas. Se juntaron
las fracciones 7-10 conteniendo ansamitocina
P-3 y se evaporaron para producir 3,2 g de sólido
oleoso conteniendo 2,5 g de P-3. Este material se
analizó mediante LC-MS y MS-MS.
En esta etapa el producto contenía 85,1% de
ansamitocina P-3 y un total de 93,9% de las
ansamitocinas deseadas. (Rendimiento de la etapa de columna =
80,6%).
\newpage
Se retomó el producto proveniente de la columna
de sílice en 200 ml de EtOAc y se llevó a 40ºC. Se agregó heptano
(200 ml) y se dejó enfriar la solución. Se agregó a la solución 1 mg
de cristales de P-3 puros (también se produjo
cristalización espontánea en otros sitios del matraz). Tras 4 horas
a temperatura ambiente el se analizó sobrenadante mediante HPLC y se
determinó la presencia de 0,8 g de P-3 (30%)
todavía en la solución. Se agregó más heptano (150 ml) y se dejó el
matraz otras 3 horas y se volvió a analizar. Esto indicó que 0,4 g
de P-3 (16%) permanecían en la solución. Se dejó el
matraz toda la noche a 4ºC. El análisis subsiguiente indicó que
quedaban sólo 70 mg de P-3 (3%) en la solución. Se
extrajeron los licores madre por medio de aspiración, usando una
serie de filtros ensamblados. Se lavaron los cristales blancos en
forma de aguja dos veces con 15 ml de 1:3 EtOAc:heptano. Se secaron
los cristales in situ bajo vacío en un evaporador rotativo a
30ºC durante 10 horas. Se obtuvieron 2,5 g de cristales.
(Rendimiento de la cristalización = 86%).
El producto final presentó 86% de ansamitocina
P-3 y un total de 98,4% de las ansamitocinas
aciladas deseadas (P-1, P-2,
P-3, P-3', P-4,
P-4').
Se trataron 1.100 l del caldo completo
conteniendo la cepa productora Actinosynnema pretiosum ATCC
31565 (título de ansamitocina P-3 75,1 mg/l, 82,6 g
P-3) con calor in situ a 75ºC durante 60
minutos para matar los microorganismos y facilitar la extracción con
solvente de las ansamitocinas. Tras la muerte de los microorganismos
por calentamiento quedaron 77,6 g de P-3. Se agregó
a la mezcla un volumen igual de tolueno precalentado a 45ºC y se
mantuvo la mezcla a 45ºC. Se agitaron las fases de tal manera que un
vórtex de la fase superior de tolueno la llevó hacia la fase
inferior de caldo pero sin emulsionar u homogeneizar por completo
las fases. La extracción se llevó a cabo durante 45 horas seguida
por la separación bajo gravedad durante 30 minutos. (Rendimiento de
la etapa de extracción = 90,3%).
Se concentraron 1.127 l del extracto de tolueno
a 22 l usando un evaporador en película descendente (FFE). Se
transfirió el concentrado a un evaporador rotativo de 50 l y se
evaporó hasta volumen bajo (velocidad de evaporación de 14,6 l/h).
Se aclaró el FFE 2 veces con 20 l de tolueno y se pasaron los
aclarados por el evaporador para asegurar la transferencia completa
del producto. Se evaporó el concentrado a sequedad.
Se retomó el extracto seco en 7,2 l de 4%
metanol en tolueno y se cargó en una columna de sílice (Kieselgel
60, 4,8 l de volumen del lecho empaquetado en 4% metanol en tolueno,
15,0 cm de diámetro x 27,0 cm, velocidad de carga 120 ml/min). Se
eluyó la columna de manera isocrática usando 4% metanol en tolueno a
una velocidad de flujo de 227-384 ml/min y produjo
bandas de color concretas apretadas. El volumen de las fracciones
iniciales fue el volumen del lecho; las fracciones 3 a 6 se
recogieron en la mitad del volumen del lecho. Se controlaron las
fracciones por TLC (placas Kieselgel F_{254}, corriendo en 5%
metanol el diclorometano, se visualizaron por UV a 254 nm) y se
controlaron aquellas conteniendo ansamitocinas con HPLC y
LC-MS. La selección de fracciones para
cristalización se basó en el análisis HPLC y LC-MS
de las fracciones para optimizar la recuperación de ansamitocina
P-3 y minimizar las ansamitocinas no deseadas. Se
juntaron las fracciones 5 a 10 conteniendo ansamitocina
P-3 y se evaporaron para producir un sólido
conteniendo 54,6 g de P-3. En esta etapa el producto
contenía 77,1% de ansamitocina P-3 y un total de
96,1% de las ansamitocinas deseadas. Rendimiento en la etapa de
columna = 92,5%).
Se retomó el producto de la columna de sílice en
91 ml de metanol previamente calentado a 46ºC, seguido por 546 ml de
acetato de etilo calentado a la misma temperatura. Se agregaron
otras alícuotas de metanol para ayudar a la disolución del sólido.
Se agregó un total de 166 ml de metanol a la mezcla. Se agregó
heptano (100 ml) calentado a 50ºC hasta la primera señal de turbidez
y posteriormente se dejó enfriar la solución hasta temperatura
ambiente al comenzar la cristalización. Tras 4 horas, se agregaron
otros 1.324 ml de heptano (a temperatura ambiente). Se analizó el
sobrenadante por HPLC y se determinó que 6,6 g de
P-3 estaban aún en la solución. Se enfrió la
solución en hielo y se agregaron otras alícuotas de heptano (200 y
400 ml) hasta que quedaron 3,9 g de P-3 (6,8%) en el
licor madre.
Se extrajeron los licores madre por medio de
aspiración, usando una serie de filtros ensamblados. Se lavaron los
cristales dos veces con 150 ml de 1:3 acetato de etilo:heptano. Se
secaron los cristales in situ en un evaporador rotativo,
inicialmente bajo leve vacío, seguido por alto vacío
(1,0-1,3 mbar) a 30ºC durante 88,5 horas. Se
obtuvieron 76,4 g de cristales.
El producto final presentó 74,5% de ansamitocina
P-3 (56,9 g) y un total de 97,8% de las
ansamitocinas aciladas deseadas. (Rendimiento total = 69%).
Se trataron 1,018 l de caldo de cultivo completo
de Actinosynnema pretiosum con un título de 64,8 mg/ml de
ansamitocina P-3 con calor, se extrajo con tolueno y
evaporó esencialmente como se describió en el Ejemplo 1.
\newpage
Se retomó el concentrado conteniendo 34,5 g de
ansamitocina P-3 en 3 l de tolueno y se cargó en una
columna de sílice (Kieselgel 60, volumen del lecho 3,0 l,
empaquetado en tolueno, 13,8 cm diámetro x 16,6 cm). Se colocaron 4
cm de lecho de arena en la columna. Se lavó la columna con 5 l de
tolueno, seguido de 20 l de 2% MeOH en tolueno, que se recogió en
fracciones de 5 l. Posteriormente se eluyó la columna con 20 l de
4% MeOH en tolueno, recogido como fracciones de 2,5 l. Se eluyeron
las ansamitocinas en las fracciones 9 a 15. La selección de
fracciones para cristalización se basó en análisis HPLC y
LC-MS de las fracciones para optimizar la
recuperación de ansamitocina P-3 y minimizar las
ansamitocinas no deseadas. Se juntaron las fracciones 10 a 12 y se
evaporó a sequedad para dar un aceite conteniendo 32,5 g de
ansamitocina P-3
En esta etapa el producto presentó 91,8% de
ansamitocina P-3, y un total de 95,3% de las
ansamitocinas aciladas deseadas. (Rendimiento en etapa de columna =
94,2%).
Se calentó el concentrado obtenido de las
fracciones cargadas en sílice en baño de agua a 50ºC y se disolvió
en un volumen mínimo de metanol/acetato de etilo a 50ºC. Se
agregaron inicialmente 60 ml de metanol, seguidos por agregado de
300 ml de acetato de etilo lentamente. Se agregaron otros 20 ml de
metanol caliente y en este punto el concentrado estaba completamente
disuelto. Se agregaron 200 ml de heptano a 50ºC y se extrajo la
solución de cristalización del baño de agua. Comenzó la
cristalización y se agregó más heptano en alícuotas de 200 ml hasta
que se agregó un volumen total de 800 ml. Se enfrió la mezcla en
baño de hielo durante 18 horas. Se controló la cristalización con
análisis HPLC de los licores madre. A las 18 horas quedaba en el
licor madre 6,3% de ansamitocina P-3. Se agregaron
otros 200 ml de heptano y se enfrió la mezcla durante otras cinco
horas. El análisis HPLC indicó 4,0% de ansamitocinas aún presentes
en los licores madre.
Se recuperaron los cristales por aspiración de
los licores madre de color marrón oscuro. Se lavaron los cristales
tres veces con 50 ml de heptano:acetato de etilo, 3:1 y se secaron
bajo vacío (0,8 mbar) durante la noche. Los cristales fueron agujas
finas, uniformes de color blanco perlado conteniendo 28,2 g de
ansamitocina P-3. (Recuperación en etapa de
cristalización = 86,9%).
El producto final presentó 93,1% de ansamitocina
P-3 y un total de 98,4% de ansamitocinas
deseadas.
Se trataron 1,001 l de caldo de cultivo completo
de Actinosynnema pretiosum con un título de 74,5 mg/ml de
ansamitocina P-3 con calor, se extrajo con tolueno y
evaporó esencialmente como se describió en el Ejemplo 1 para dar 9,5
l de extracto concentrado conteniendo 54,7 g de ansamitocina
P-3.
Se calentó el concentrado a 45ºC y se agregaron
14,5 l heptano durante 33 minutos para precipitar las ansamitocinas.
Se enfrió la mezcla sobre hielo. Se agregaron otros 5 l de heptano y
se dejó reposar la mezcla durante la noche. Se recogió el licor
madre por aspiración y se lavó el precipitado con 10 ml de
tolueno:heptano, 1:1. El análisis HPLC indicó que el licor madre
contenía 6,5% de ansamitocina P-3, y el lavado
contenía 1,8% de P-3. Se disolvió el precipitado en
2 l de metanol y se filtró a través de un filtro de 0,2
micrómetros.
Se evaporó la solución de metanol hasta sequedad
y se redisolvió en 85 ml de metanol a 50ºC. Se agregaron 510 ml de
acetato de etilo a la solución seguidos por 200 ml de heptano. Se
enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente y se agregaron otros 990
ml de heptano lentamente al comenzar la cristalización. Quedaron en
el licor madre 4,14 g de ansamitocina P-3. Se
agregaron otros 400 ml de heptano y se enfrió la mezcla sobre hielo.
En el licor madre quedaron 2,7 g de ansamitocina
P-3.
Se retiró el licor madre por aspiración y se
disolvieron los cristales en 110 ml de metanol y 520 ml de acetato
de etilo a 50ºC. Se agregó heptano en dos alícuotas de 75 ml, se
enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente y se agregaron otros 900
ml. Se agregaron otros 400 ml de heptano y se enfrió la mezcla sobre
hielo y se dejó cristalizar durante la noche. El análisis HPLC
indicó que quedaron 2,3 g de ansamitocina P-3 en el
licor madre. Se recogió el licor madre por aspiración y se lavaron
los cristales con heptano:acetato de etilo, 3:1 y se secaron bajo
vacío (0,6 mbar) durante la noche. Los 47,8 g de cristales contenían
84,3% de ansamitocina P-3, y un total de 97,0% de
ansamitocinas aciladas.
Se colocaron 220 ml de Actinosynnema
pretiosum tratados con calor, con un título de 44 \mug/ml de
ansamitocina P-3 en un baño de agua a 45ºC y se
agregó un volumen igual de xileno. Se mezclaron las fases de tal
manera que un vórtex de xileno llevó la fase hacia la fase de caldo
inferior pero sin formar emulsión. Tras 20 horas, se extrajo el 64%
de la ansamitocina P-3 en la fase de xileno.
Se separó la mezcla por gravedad y se retiraron
170 ml de xileno. Se evaporó el extracto de xileno hasta sequedad.
Se purificó el extracto de xileno usando cromatografía en sílice. Se
disolvió el extracto en 2 ml de 4% metanol en tolueno y se cargó y
eluyó usando la misma mezcla de solvente. Se recogieron fracciones
(0,5 ml) y el ensayo por TLC (placas Kieselgel F_{254}, corriendo
en diclorometano:metanol 20:1). Se cristalizaron las fracciones
conteniendo ansamitocina P-3 usando el procedimiento
descrito en los ejemplos anteriores. El producto cristalino fue de
calidad comparable en términos de color y pureza con el producido
por extracción con tolueno del caldo de fermentación.
La presente invención puede realizarse en otras
formas específicas sin apartarse del espíritu o de los atributos
esenciales de la misma, y, de acuerdo con esto, debería hacerse
referencia a lo añadido.
Claims (11)
1. Un procedimiento para preparar ansamitocinas
purificadas que comprende las etapas de:
- a.
- cultivar un microorganismo que produce ansamitocina en un medio de cultivo líquido;
- b.
- tratar el medio de cultivo para facilitar la extracción con solvente de las ansamitocinas;
- c.
- extraer ansamitocinas del medio de cultivo con tolueno o xileno;
- d.
- concentrar las ansamitocinas extraídas; y
- e.
- purificar las ansamitocinas mediante cristalización, en el que dicho procedimiento no incluye una etapa de filtración.
2. Un procedimiento para preparar ansamitocinas
purificadas que comprende las etapas de:
- a.
- cultivar un microorganismo que produce ansamitocina en un medio de cultivo líquido;
- b.
- extraer ansamitocinas del medio de cultivo con tolueno o xileno;
- c.
- concentrar las ansamitocinas extraídas; y
- d.
- purificar las ansamitocinas mediante cristalización, en el que dicho procedimiento no incluye una etapa de filtración.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2
en el que el microorganismo que produce ansamitocina es
Actinosynnema spp.
4. El procedimiento de la reivindicación 3 en el
que el microorganismo que produce ansamitocina es Actinosynnema
pretiosum ATCC 31565.
5. El procedimiento de la reivindicación 3 en el
que el microorganismo que produce ansamitocina es Actinosynnema
pretiosum ATCC 31281.
6. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que el tratamiento es calentar a aproximadamente 75ºC.
7. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2
en el que el solvente es tolueno.
8. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2
en el que el solvente es xileno.
9. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8
en el que el la relación de tolueno o xileno a medio de cultivo
tratado con calor es aproximadamente 1:1.
10. El procedimiento de le reivindicación 9 en
el que la extracción es aproximadamente a 45ºC.
11. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2
en el que las ansamitocinas comprenden ansamitocinas aciladas que
pueden sufrir clivaje reductivo para formar maytansinol.
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