KR20030036159A

KR20030036159A - 안사미토신의 제조 방법

Info

Publication number: KR20030036159A
Application number: KR1020027013580A
Authority: KR
Inventors: 마크 풀스톤; 안나 스테판스카; 잔 써케틀
Original assignee: 스미스클라인비이참피이엘시이
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2003-05-09
Also published as: AU2001293335B2; DE60121150D1; PL365577A1; DE60121150T2; HUP0300473A3; IL152241A0; AU9333501A; ZA200208159B; NZ521868A; WO2001077360A3; ES2266243T3; WO2001077360A2; CA2406188A1; CN1432068A; CZ20023356A3; JP2003530114A; ATE331804T1; US20020015984A1; AR028002A1; EP1272653A2

Abstract

본 발명에는 안사미토신에 대한 개선된 정제 방법이 개시되어 있다.

Description

안사미토신의 제조 방법 {Methods for Ansamitocin Production}

세포독성이 매우 높은 마이탄시노이드 (maytansinoid) 약물 및 그의 치료 용도가 미국 특허 제5,208,020호에 개시되어 있다. 이들 약물은 악티노신네마 (Actinosynnema)와 같은 미생물의 발효에 의해 생산된 안사미토신 전구체로부터 제조될 수 있다.

규정된 배양 조건하에서, 악티노신네마 프레티오숨 (Actinosynnema pretiosum)과 같은 악티노신네마 종 (Actinosynnema spp.)은 다수의 관련 안사미토신을 생산한다. 주요 생성물은 C-3 위치에 이소부티릴 잔기가 있는 안사미토신 P-3이다. C-3 아실 측쇄만 상이한 다른 안사미토신이 미량 성분으로서 생산되며, 그 예로는 P-1 (에티오닐 잔기), P-2 (프로피오닐 잔기), P-3' (부티릴 잔기), P-4 (이소발레릴 잔기) 및 P-4' (발레릴 잔기)이 있다. 모든 이들 화합물은 환원성 절단에 의해 공통의 생성물인 마이탄시놀 (maytansinol)(P-0 형성)을 생성한다. 또한, 다수의 다른 안사미토신이 소량으로 생성되는데, 이들은 분자 내의 다른 부위가 개질된(히드록실화 또는 n-탈메틸화됨) 것이다. 이들은 탈아실화 후에도 원하는 P-0을 생성하지 않는다.

악티노신네마 종으로부터 안사미토신 P-3을 제조하는 방법은 미국 특허 제4,162,940호, 제4,228,239호, 제4,356,265호 및 제4,450,234호에 기재되어 있다. 일반적으로, 이들 방법은 필터 보조물 및 수혼화성 용매를 전체 발효 브로쓰 (broth)에 첨가하는 단계, 고형물을 제거하고 수성 분획을 수불혼화성 용매로 추출하는 단계, 석유 에테르로 농축 및 침전시키는 단계, 실리카 크로마토그래피를 이용하여 침전물을 정제하는 단계, 및 결정화 후에 추가로 크로마토그래피 또는 재결정화를 수행하는 단계를 필요로 한다. 다른 방법은 실리카 크로마토그래피 대신 디아이온 (Diaion) HP-10 흡착을 이용하고, 그 후에 추가로 용매 추출 및 결정화를 수행한다.

이들 방법으로 허용가능한 수율의 안사미토신 P-3을 얻을 수는 있지만, 이들 방법이 다수의 단계를 포함하기 때문에 대규모 생산 조작에 있어서의 제한점이 되고, 특히 안사미토신 화합물 고유의 맹독성으로 인해 이 고정을 조작하는 사람의 안전을 보장해 주여야만 한다. 따라서, 단계수가 더 적고 보다 제한된 단계를 이용하는, 보다 안전한 다른 방법에 대한 요구가 존재하는 실정이다.

<발명의 개요>

본 발명의 한 측면은

a. 안사미토신 생산 미생물을 액체 배양 배지에서 배양하는 단계,

b. 안사미토신의 용매 추출을 촉진시키기 위해 배양 배지를 처리하는 단계,

c. 방향족 탄화수소 용매를 사용하여 배양 배지로부터 안사미토신을 추출하는 단계,

d. 추출된 안사미토신을 농축시키는 단계, 및

e. 결정화에 의해 안사미토신을 정제하는 단계

를 포함하는, 정제된 안사미토신의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은

b. 방향족 탄화수소 용매를 사용하여 배양 배지로부터 안사미토신을 추출하는 단계,

c. 추출된 안사미토신을 농축시키는 단계, 및

d. 결정화에 의해 안사미토신을 정제하는 단계

본 발명은 안사미토신 (ansamitocin)의 제조 방법, 구체적으로는 마이탄시놀 (maytansinol)로 전환될 수 있는 안사미토신의 제조 방법에 관한 것이다.

특허 및 특허 출원 등을 비롯하여 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된 것으로 간주한다.

여과 단계를 거치지 않고 정제된 안사미토신을 제조하는 방법이 제공된다. 이 방법은 안사미토신 생산 미생물을 액체 배양 배지에서 배양하는 단계, 안사미토신이 미생물로부터 방출되도록 배양 배지를 처리함으로써 용매 추출을 촉진시키는 단계, 방향족 탄화수소 용매를 사용하여 안사미토신을 처리된 배양 배지로부터 추출하는 단계, 추출된 안사미토신을 농축시키는 단계, 및 결정화에 의해 안사미토신을 정제하는 단계를 포함한다. 별법으로, 처리 단계를 생략할 수도 있다.

정제된 안사미토신은 마이탄시놀로 환원될 수 있고, 그 예로는 안사미토신 P-3, P-1, P-2, P-3', P-4 및 P-4'이 있다. 정제된 안사미토신은 분자 내의 다른 부위가 개질된, 원치않는 안사미토신을 매우 소량으로만 함유한다. 바람직하게는, 안사미토신 생산 미생물이 악티노신네마 종이다. 특히 바람직하게는 ATCC 31565의 악티노신네마 프레티오숨이다. 또한, 특히 바람직하게는 ATCC 31281의 악티노신네마 프레티오숨이다. 이들 미생물은 미국 특허 제4,450,234호에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 알려진 발효 배양 기술에 의해 배양할 수 있다.

본 발명 방법의 한 실시양태는 세포내 안사미토신의 방출을 보조하고 세포 결합 안사미토신이 용매 추출에 보다 적합해지도록 하는 미생물 처리법을 이용한다. 처리 방법의 예로는 초음파 처리, 가압 또는 승온이 포함된다. 바람직하게는, 이 처리가 열처리이다. 열처리는 약 60℃ 내지 약 80℃에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 열처리 단계가 미생물을 사멸시켜 안사미토신의 용매 추출을 촉진시키는 온도인 약 75℃에서 수행된다. 다른 실시양태에서는, 총 안사미토신 중 대략 60％가 배양 배지에서 발견될 수 있기 때문에, 추출 전에 처리 단계를 거치지 않는다.

안사미토신은 방향족 탄화수소 용매를 사용하여 배양 배지로부터 추출될 수 있다. 방향족 탄화수소는 다른 브로쓰 성분보다 안사미토신에 특별한 선택성을 지니고 있어서, 순수한 생성물을 단리하기 위해 이후의 공정에 단지 간단한 과정만이 필요하게끔 해준다. 바람직하게는 방향족 탄화수소 용매가 톨루엔 또는 크실렌이다. 특히 바람직한 것은 톨루엔인데, 이는 톨루엔이 저온 증발에 보다 적합하기때문이다. 톨루엔 및 크실렌의 성질은 용매 및 수성층이 기계적 분리없이 중력하에서 용이하게 분리되도록 하기 때문에, 보다 큰 공정 억제성 (containment) 및 증가된 조작자 안전성을 달성할 수 있다. 추출은 약 20℃ 내지 약 60℃에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 추출이 약 45℃에서 수행된다. 추출전 수용액의 pH는 3 내지 9의 범위여야 한다. 바람직하게는, pH가 거의 중성, 즉 pH 6 내지 8이다.

일반적으로, 전체 브로쓰에 대해 1 당량 부피의 용매 (1:1)가 추출에 바람직하다. 또한, 다른 비율 범위인 2:1 내지 1:4가 이용될 수도 있다. 용액은 일반적으로 교반하면서 서서히 혼합하고, 혼합물은 약 80％를 초과하는 안사미토신이 유기층 내로 추출될 때까지 교반한다. 바람직하게는, 15℃ 내지 50℃ 사이의 온도에서 중력하에 가라앉도록 혼합물을 방치한다. 혼합물을 가라앉히기에 바람직한 온도는 약 45℃이다.

유기층을 분리하여, 용매의 부피 감소에 의한 추출물의 농축을 진공하에서 또는 당업계에 잘 알려진 다른 방법에 의해 수행할 수 있다. 부피 감소 이후에, 농축된 추출물을 메탄올과 같은 극성 용매 중에 임의로 용해시키고, PTFE와 같은 막 필터, 또는 실리카 또는 알루미나와 같은 적층형 필터를 사용하여 정화시킬 수 있다.

결정화는 원치않는 안사미토신의 양을 감소시킴으로써 원하는 안사미토신, 구체적으로는 P-3을 정제하는 데 이용된다. 결정화를 위해 바람직한 용매 혼합물은 에틸 아세테이트와 헵탄이다. 그러한 결정화는 통상적인 방법으로 수행된다. 결정화를 위한 고형물의 용해를 보조하기 위해, 에틸 아세테이트의 첨가 전에 소량의 메탄올 또는 유사한 극성 용매를 첨가한 다음, 다량의 헵탄으로 처리하고, 임의로 교반 및 냉각을 통해 결정화된 생성물을 수득할 수 있다. 이 생성물은 동일한 절차를 따라 재결정화될 수 있다.

별법으로, 결정화 이전에, 발효 브로쓰로부터 추출된 순수하지 않은 안사미토신은 실리카겔을 이용하여, 예를 들어 용매 추출물의 용액을 실리카 베드 (bed)에 통과시켜 정제될 수 있다. 크로마토그래피에 사용하는 용매는 톨루엔 및 톨루엔-메탄올 혼합물일 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 다른 용매가 사용될 수도 있다. 안사미토신 P-3을 함유하는 분획을 합하여 감압하에서 농축시킨다.

또한, HPLC에 의한 안사미토신의 분석 방법이 제공된다. 안사미토신 P-3의 정량 및 안사미토신 비율의 분석은 이 방법에 의해 달성된다. 이들 방법은 하기 실시예에서 이용되었다.

브로쓰 및 추출 샘플 중의 안사미토신 P-3에 대한 정량분석은 10 mm 가드 (guard) 컬럼이 구비된 4.6×250 mm의 C18 워터스 (Waters) Q 스페리소르브 (Spherisorb) S5 ODS2 컬럼 상에서 측정할 수 있다. UV 검출은 252 nm 및 205 nm에서 수행한다. 물 (0.05％ TFA) 중 60％ MeCN (0.05％ TFA)으로 된 1 ㎖/분 유속의 등용매 이동상, 및 20 ㎕의 주입 부피가 사용된다.

이후의 공정 샘플에서 안사미토신 비율의 분석은 가드 컬럼이 없는 3.9×150 mm의 C8 워터스 시메트리 쉴드 (Waters Symmetry Shield) 컬럼 상에서 측정할 수 있다. UV 검출은 252 nm 및 205 nm에서 수행한다. 물 (0.05％ TFA) 중 35 내지 45％ MeCN (0.05％ TFA)으로 된 1 ㎖/분 유속의 30분 (40℃에서 10분 재평형화 처리함)에 걸친 구배 이동상, 및 10 ㎕의 주입 부피가 사용된다.

크로마토그래피 분획 및 최종 생성물에서 안사미토신 비율의 분석은, 가드 컬럼이 없는 3.9×150 mm의 C8 워터스 시메트리 쉴드 컬럼상에서 LC-MS 검출 시스템 (대기압 전기분무 이온화, +ve 이온 모드)으로 측정할 수 있다. 피크를 명확하게 나타내는 30V 콘 (cone) 전압 질량 검출을 전범위 스캔 MS (quad 1로 600에서 700 amu까지 스캔)에 의해 수행한다. 안사미토신의 클래스를 결정하기 위한 MS-MS 분열 (fragmentation)은 동일한 구배 시스템을 이용하여 수행된다. 물 (0.05％ TFA) 중 35 내지 45％ MeCN (0.05％ TFA)으로 된 1 ㎖/분 유속의 30분 (40℃에서 10분 재평형화 처리함)에 걸친 구배 이동상, 및 10 ㎕의 주입 부피가 사용된다.

폐기물 스트림 및 고감도를 요하는 소량의 다른 샘플에서 안사미토신 P-3의 정량은, 10 mm의 가드 컬럼 및 LC-MS-MS 대기압 전기분무 이온화 검출 시스템 (+ve 이온 모드, 30V 콘 전압)이 구비된 4.6×250 mm의 C8 워터스 스페리소르브 S5 ODS2 컬럼 상에서 측정할 수 있다. 구조형을 결정하기 위해, 주요 종의 분자 이온을 선택하였고, 관찰된 분열 패턴은 547 이온 (N-메틸화를 의미함) 및 553 (N-탈메틸화를 의미함)에서 우세하게 나타났다. 물 (0.05％ TFA) 중 60％ MeCN (0.05％ TFA)으로 된 1 ㎖/분 유속의 등용매 이동상, 및 20 ㎕의 주입 부피가 사용된다.

본 발명이 방법은 종양 활성화 전구약물로서 유용한 세포 결합제/마이탄시노이드 복합체의 제조에 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 안사미토신은 환원성 절단을 통해 마이탄시놀을 생성할 수 있으며, 이는 미국 특허 제5,208,020호에 기재된 바와 같이 사용되어 N-메틸-L-알라닌 함유 마이탄시노이드유도체를 생성할 수 있다. 이들 유도체는 그 후에 디술피드 결합과 같은 다양한 링커에 의해 세포 결합제, 바람직하게는 항체와 접합된다.

전형적인 세포 결합제/마이탄시노이드 복합체는

(1) 본 발명의 방법에 의해 제조된 안사미토신을 마이탄시놀로 환원시키는 단계,

(2) 마이탄시놀을 N-메틸-L-알라닌 유도체로 에스테르화시켜 디술피드 함유 마이탄시노이드 에스테르를 형성하는 단계,

(3) 단계 (2)에서 제조된 디술피드 함유 마이탄시노이드 에스테르를 티올 함유 마이탄시노이드로 환원시키는 단계,

(4) 디티오피리딜기를 세포 결합제에 도입시키는 단계, 및

(5) 단계 (3)에서 제조된 티올 함유 마이탄시노이드를 디술피드 결합에 의해 단계 (4)의 디티오피리딜 세포 결합제에 결합시키는 단계

를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

이제, 본 발명은 하기의 구체적이며 비제한적인 실시예를 참조하여 설명될 것이다.

<실시예 1>

악티노신네마 프레티오숨 배양 브로쓰의 추출 및 안사미토신 정제

생산 균주인 ATCC 31565의 악티노신네마 프레티오숨 (안사미토신 P-3 역가 86.3 ㎎/ℓ)을 함유하는 전체 브로쓰 37 ℓ를 75℃에서 60분 동안 계내에서 열처리하여, 미생물을 사멸시키고 안사미토신의 용매 추출을 촉진시켰다. 톨루엔 40 ℓ를 첨가하고, 혼합물을 45℃로 가온시켰다. 볼텍싱 (vortexing)을 통해 상부 톨루엔 상을 하부 브로쓰 상으로 끌어내리되, 유화되거나 상이 완전히 균질화되지 않도록 상을 교반하였다. 추출은 16시간 내에 완결되었으며, 중력하의 분리는 2시간 내에 완결되었다.

80 ㎎/ℓ의 P-3을 함유하는 톨루엔 39 ℓ를 사이펀 (siphon)에 의해 회수하고, 20 ℓ 회전 증발기 (용기 온도 = 40 내지 45℃, 속도 = 약 9 ℓ/시간)를 이용하여 증발시켰다. 증발 후, 3.1 g의 P-3 (27.6 중량/중량％)을 함유하는 이동성 오일 11.2 g이 생성되었다. 결과의 추출물을 톨루엔 중에 용해시켜 플라스크로 옮기고 다시 증발시켰다 (추출 단계 수율 = 97％).

추출물을 톨루엔 120 ㎖에 용해시키고, 톨루엔 375 ㎖ (3 bv) 중의 실리카 컬럼 (키젤겔 (Kieselgel) 60, 톨루엔 중의 충전층 부피 (bed volume) 125 ㎖, 4 cm의 직경×10 cm)에 로딩하였다. 컬럼을 2 bv의 톨루엔으로 세척한 후, 톨루엔 중 2％ MeOH 2 bv의 양으로 4회 용출한 다음, 톨루엔 중 4％ MeOH 1 bv의 양으로 12회 용출하였다. 컬럼을 40 ㎖/분의 속도로 용출하여 유색의 조밀한 밴드를 생성하였다. 안사미토신 P-3을 함유하는 분획 7 내지 10을 합한 후에 이를 증발시켜, 2.5 g의 P-3을 함유하는 오일성 고형물 3.2 g을 생성하였다. 이 물질을 LC-MS 및 MS-MS에 의해 분석하였다.

이 단계에서의 생성물은 85.1％의 안사미토신 P-3을 함유하였고, 총 93.9％의 원하는 안사미토신을 함유하였다 (컬럼 단계 수율 = 80.6％).

실리카 컬럼으로부터의 생성물을 40℃로 가온된 EtOAc 200 ㎖에 용해시켰다. 헵탄 (200 ㎖)을 첨가하고, 용액을 냉각시켰다. 용액에 1 ㎎의 순수한 P-3 결정을 시딩 (seeding)하였다 (또한, 결정화가 플라스크 내 다른 부위에서 자발적으로 발생함). 상온에서 4시간 후, 상층액을 HPLC에 의해 분석한 결과, 0.8 g의 P-3 (30％)이 여전히 용액에 존재하는 것으로 측정되었다. 추가로 헵탄을 첨가 (150 ㎖)하고, 플라스크를 추가로 3시간 동안 방치한 후에 다시 분석하였다. 그 결과, 0.4 g의 P-3 (16％)이 용액 중에 남아있는 것으로 나타났다. 플라스크를 밤새 4℃에 방치하였다. 이후의 분석 결과, 단지 70 ㎎의 P-3 (3％)만이 용액 중에 남아있는 것으로 나타났다. 소결된 필터 라인 어셈블리 (sintered filter line assembly)를 이용하여 모액을 흡인 제거하였다. 백색 침상형 결정을 1:3의 EtOAc:헵탄 15 ㎖로 2회 세척하였다. 이 결정을 회전 증발기 상의 진공하에서 30℃로 10시간 동안 계내에서 건조시켰다. 2.5 g의 결정을 수득하였다 (결정화 수율 = 86％).

최종 생성물은 86％의 안사미토신 P-3을 함유하였고, 총 98.4％의 원하는 아실화 안사미토신 (P-1, P-2, P-3, P-3', P-4, P-4')을 함유하였다.

<실시예 2>

생산 균주인 ATCC 31565의 악티노신네마 프레티오숨 (안사미토신 P-3 역가 75.1 ㎎/ℓ, 82.6 g P-3)을 함유하는 전체 브로쓰 1,100 ℓ를 75℃에서 60분 동안 계내에서 열처리하여, 미생물을 사멸시키고 안사미토신의 용매 추출을 촉진시켰다. 77.6 g의 P-3이 가열 사멸 과정 이후에 남아있었다. 45℃로 미리 가온된 동일 부피의 톨루엔을 첨가하고, 혼합물을 45℃로 유지시켰다. 볼텍싱 (vortexing)을 통해 상부 톨루엔 상을 하부 브로쓰 상으로 끌어내리되, 유화되거나 상이 완전히 균질화되지 않도록 상을 교반하였다. 45시간 동안 추출을 수행한 후, 30분 이내에 중력하의 분리를 수행하였다 (추출 단계 수율 = 90.3％).

낙하 필름 증발기 (falling film evaporator: FFE)를 이용하여, 안사미토신을 함유하는 톨루엔 추출물 1,127 ℓ를 22 ℓ로 농축시켰다. 농축물을 50 ℓ 회전 증발기로 옮기고, 적은 부피로 증발시켰다 (증발율 = 14.6 ℓ/시간). FFE를 톨루엔 20 ℓ로 2회 세정하고, 세정물을 증발기에 통과시켜 생성물이 완전히 전달되도록 하였다. 농축물을 건조될 때까지 증발시켰다.

건조 추출물을 톨루엔 중 4％ 메탄올 7.2 ℓ에 용해시키고, 실리카 컬럼 (키젤겔 60, 톨루엔 중 4％ 메탄올 중의 충전층 부피 4.8 ℓ, 15.0 cm의 직경×27.0 cm, 로딩율 120 ㎖/분)에 로딩하였다. 컬럼을 227 내지 384 ㎖/분 유속의 톨루엔 중 4％ 메탄올을 사용하여 등용매 용출하였고 유색의 조밀한 밴드를 생성하였다. 최초 분획은 충전층의 부피였고, 분획 3 내지 6은 충전층 부피의 절반으로 수거되었다. 분획을 TLC (키젤겔 60 F₂₅₄플레이트, 디클로로메탄 중 5％ 메탄올 중에서 러닝, 254 nm의 UV에 의해 가시화)에 의해 모니터링하였고, 안사미토신을 함유하는 분획들은 HPLC 및 LC-MS에 의해 모니터링하였다. 결정화를 위한 분획은 분획의 HPLC 및 LC-MS 분석을 토대로 선택하여, 안사미토신 P-3 회수를 최적화하고 원치않는 안사미토신을 최소화하였다. 안사미토신 P-3을 함유하는 분획 5 내지 10을 합한 후에 이를 증발시켜, 54.6 g의 P-3을 함유하는 오일성 고형물을 생성하였다. 이 단계에서의 생성물은 77.1％의 안사미토신 P-3을 함유하였고, 총 96.1％의 원하는 안사미토신을 함유하였다 (컬럼 단계 수율 = 92.5％).

실리카 컬럼으로부터의 생성물을 미리 46℃로 가온된 메탄올 91 ㎖에 용해시킨 후, 동일한 온도로 가온된 에틸 아세테이트 546 ㎖에 용해시켰다. 추가의 메탄올 분취액을 첨가하여 고형물의 용해를 보조하였다. 총 166 ㎖의 메탄올을 혼합물에 첨가하였다. 처음으로 흐린 상태 (cloudiness)의 징후가 나타날 때 50℃로 가온된 헵탄 (100 ㎖)을 첨가한 후, 용액의 온도가 상온이 되게 함으로써 결정화를 개시하였다. 4시간 후, (상온에서) 추가의 헵탄 1,324 ㎖을 첨가하였다. 상층액을 HPLC에 의해 분석한 결과, 6.6 g의 P-3이 여전히 용액에 존재하는 것으로 측정되었다. 혼합물을 얼음 상에서 냉각시키고, 모액에 3.9 g의 P-3 (6.8％)이 남아있을 때까지 추가의 헵탄 분취액 (200 및 400 ㎖)을 첨가하였다.

소결된 필터 라인 어셈블리를 이용하여 모액을 흡인 제거하였다. 결정을 1:3의 에틸 아세테이트:헵탄 150 ㎖로 2회 세척하였다. 이 결정을 회전 증발기 상에서, 처음에는 낮은 진공하에, 그 후에는 높은 진공 (1.0 내지 1.3 mbar)하에 30℃로 88.5시간 동안 계내에서 건조시켰다. 76.4 g의 결정을 수득하였다.

최종 생성물은 74.5％의 안사미토신 P-3 (56.9 g)을 함유하였고, 총 97.8％의 원하는 아실화 안사미토신을 함유하였다 (전체 수율 = 69％).

<실시예 3>

실리카 크로마토그래피 및 안사미토신의 결정화

본질적으로는 실시예 1에 기재된 바와 같이, 64.8 ㎎/ℓ의 안사미토신 P-3 역가를 갖는 악티노신네마 프레티오숨 전체 브로쓰 1,088 ℓ를 열처리하고, 톨루엔으로 추출하여 증발시켰다.

34.5 g의 안사미토신 P-3을 함유하는 농축물을 톨루엔 3 ℓ에 용해시키고, 실리카 컬럼 (키젤겔 60, 톨루엔 중의 충전층 부피 3.0 ℓ, 13.8 cm의 직경×16.6 cm)에 로딩하였다. 컬럼의 상부에 4 cm의 모래층을 설비하였다. 컬럼을 톨루엔 5 ℓ로 세척한 후, 톨루엔 중 2％ MeOH 20 ℓ로 세척하여, 이를 5 ℓ의 분획으로서 수거하였다. 그 후, 컬럼을 톨루엔 중 4％ MeOH 20 ℓ로 용출하여, 이를 2.5 ℓ의 분획으로서 수거하였다. 안사미토신은 분획 9 내지 15에서 용출되었다. 결정화를 위한 분획은 분획의 HPLC 및 LC-MS 분석을 토대로 선택하여, 안사미토신 P-3 회수를 최적화하고 원치않는 안사미토신을 최소화하였다. 분획 10 내지 12를 합한 후에 이를 건조될 때까지 증발시켜, 32.5 g의 안사미토신 P-3을 함유하는 오일을 수득하였다.

이 단계에서의 생성물은 91.8％의 안사미토신 P-3을 함유하였고, 총 95.3％의 원하는 아실화 안사미토신을 함유하였다 (컬럼 단계 수율 = 94.2％).

합해진 실리카 분획으로부터의 농축물을 수조에서 50℃로 가온시키고, 최소량의 가온된 메탄올/에틸 아세테이트 (50℃) 중에 용해시켰다. 메탄올 60 ㎖을 최초에 첨가한 후, 에틸 아세테이트 300 ㎖을 서서히 첨가하였다. 가온된 메탄올 20 ㎖을 추가로 첨가하였고, 이 시점에서 농축물이 완전히 용해되었다. 가온된 헵탄 (50℃) 200 ㎖을 첨가하고, 수조로부터 결정화 용액을 제거하였다. 결정화를 개시하고, 총 800 ㎖의 양이 첨가될 때까지 추가의 헵탄을 200 ㎖ 분취액으로 첨가하였다. 이 혼합물을 빙욕에서 18시간 동안 냉각시켰다. 결정화는 모액의 HPLC 분석에 의해 모니터링하였다. 18시간 째에, 6.3％의 안사미토신 P-3이 모액에 남아있었다. 추가로 헵탄 200 ㎖을 첨가하고, 혼합물을 추가로 5시간 동안 냉각시켰다. HPLC 분석 결과, 4.0％의 안사미토신이 모액에 남아있는 것으로 나타났다.

암갈색 모액의 흡인에 의해 결정을 회수하였다. 이 결정을 3:1의 헵탄:에틸 아세테이트 50 ㎖로 3회 세척하고, 진공 (0.8 mbar)하에서 밤새 건조시켰다. 이 결정은 28.2 g의 안사미토신 P-3을 함유하는, 균일하고 미세한 회백색의 침상형이었다 (결정화 단계 회수율 = 86.9％).

최종 생성물은 93.1％의 안사미토신 P-3을 함유하였고, 총 98.4％의 원하는 아실화 안사미토신을 함유하였다.

<실시예 4>

톨루엔 추출물로부터의 안사미토신 정제 및 결정화

본질적으로는 실시예 1에 기재된 바와 같이, 74.5 ㎎/ℓ의 안사미토신 P-3 역가를 갖는 악티노신네마 프레티오숨 전체 브로쓰 1,001 ℓ를 열처리하고, 톨루엔으로 추출하고 증발시켜, 54.7 g의 안사미토신 P-3을 함유하는 농축 추출물 9.5 L를 수득하였다.

농축물을 45℃로 가열하고 헵탄 14.5 ℓ를 33분에 걸쳐 첨가하여 안사미토신을 침전시켰다. 이 혼합물을 얼음 상에서 냉각시켰다. 추가의 헵탄 5 ℓ를 첨가하고, 혼합물을 밤새 가라앉도록 방치하였다. 모액을 흡인 제거하고, 침전물을1:1의 톨루엔:헵탄 10 ℓ로 세척하였다. HPLC 분석 결과, 모액은 6.5％의 안사미토신 P-3을 함유하고 세척액은 1.8％의 P-3을 함유하는 것으로 나타났다. 침전물을 메탄올 2 ℓ 중에 용해시키고, 이를 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하였다.

메탄올 용액을 건조될 때까지 증발시키고, 50℃에서 메탄올 85 ㎖ 중에 다시 용해시켰다. 에틸 아세테이트 510 ㎖을 용액에 첨가한 후, 헵탄 200 ㎖을 첨가하였다. 이 혼합물을 상온으로 냉각시키고, 추가의 헵탄 990 ㎖을 서서히 첨가하여 결정화를 개시하였다. 4.14 g의 안사미토신 P-3이 모액에 남아있었다. 추가의 헵탄 400 ㎖을 첨가하고, 혼합물을 얼음 상에서 냉각시켰다. 2.7 g의 안사미토신 P-3이 모액에 남아있었다.

모액을 흡인 제거하고, 결정을 50℃에서 메탄올 110 ㎖ 및 에틸 아세테이트 520 ㎖ 중에 용해시켰다. 헵탄을 75 ㎖ 분취액으로 2회 첨가하고, 혼합물을 상온으로 냉각시킨 후, 헵탄 900 ㎖을 더 첨가하였다. 추가의 헵탄 400 ㎖을 첨가하고, 혼합물을 얼음 상에서 냉각시킨 후, 밤새 방치하여 결정화시켰다. HPLC 분석 결과, 2.3 g의 안사미토신 P-3이 모액에 남아있는 것으로 나타났다. 모액을 흡인 제거하고, 결정을 3:1의 헵탄:에틸 아세테이트로 세척한 후, 이를 진공 (0.6 mbar)하에서 밤새 건조시켰다. 47.8 g의 결정은 84.3％의 안사미토신 P-3을 함유하였고, 총 97.0％의 원하는 아실화 안사미토신을 함유하였다.

<실시예 5>

크실렌을 사용한 악티노신네마 프레티오숨 배양 브로쓰의 추출 및 안사미토신 정제

44 ㎍/ℓ의 안사미토신 P-3 역가를 갖는 가열된 악티노신네마 프레티오숨220 ㎖을 45℃의 수조에 넣고, 동일 부피의 크실렌을 첨가하였다. 볼텍싱을 통해 크실렌을 하부 브로쓰 상으로 끌어내리되, 유상액이 생성되지 않도록 상을 혼합하였다. 20시간 후, 64％의 안사미토신 P-3이 크실렌 상으로 추출되었다.

이 혼합물을 중력하에서 분리하고, 170 ㎖의 크실렌을 분리하였다. 크실렌 추출물을 건조될 때까지 증발시켰다. 실리카 크로마토그래피를 이용하여 크실렌 추출물을 정제하였다. 이 추출물을 톨루엔 중 4％ 메탄올 2 ㎖에 용해시키고, 동일한 용매 혼합물을 사용하여 로딩 및 용출하였다. 분획 (0.5 ㎖)을 수거하여, TLC (20:1의 디클로로메탄:메탄올 중에서 러닝된 키젤겔 60 F₂₅₄플레이트)에 의해 분석하였다. 안사미토신 P-3을 함유하는 분획을 상기 실시예에 기재된 절차를 이용하여 결정화시켰다. 결정질 생성물의 품질은 색상 및 순도의 면에서 발효 브로쓰의 톨루엔 추출에 의해 생성된 것과 필적할만 하였다.

본 발명은 본 발명의 범위 및 본질적인 속성을 벗어나지 않고 다른 특정한 형태로 실시될 수 있으며, 따라서 본 발명의 범위를 나타내는 것으로서 상기 명세서보다는 첨부된 청구항을 참조해야 한다.

Claims

a. 안사미토신 (ansamitocin) 생산 미생물을 액체 배양 배지에서 배양하는 단계,

b. 안사미토신의 용매 추출을 촉진시키기 위해 배양 배지를 처리하는 단계,

c. 방향족 탄화수소 용매를 사용하여 배양 배지로부터 안사미토신을 추출하는 단계,

d. 추출된 안사미토신을 농축시키는 단계, 및

e. 결정화에 의해 안사미토신을 정제하는 단계

를 포함하는, 정제된 안사미토신의 제조 방법.
a. 안사미토신 생산 미생물을 액체 배양 배지에서 배양하는 단계,

b. 방향족 탄화수소 용매를 사용하여 배양 배지로부터 안사미토신을 추출하는 단계,

c. 추출된 안사미토신을 농축시키는 단계, 및

d. 결정화에 의해 안사미토신을 정제하는 단계

를 포함하는, 정제된 안사미토신의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 안사미토신 생산 미생물이 악티노신네마 종 (Actinosynnema spp.)인 방법.
제3항에 있어서, 악티노신네마 종이 ATCC 31565의 악티노신네마 프레티오숨 (Actinosynnema pretiosum)인 방법.
제3항에 있어서, 악티노신네마 종이 ATCC 31281의 악티노신네마 프레티오숨 (Actinosynnema pretiosum)인 방법.
제1항에 있어서, 처리가 약 75℃에서의 가열인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 용매가 톨루엔인 방법.
제7항에 있어서, 톨루엔 대 열처리된 배양 배지의 비율이 약 1:1인 방법.
제8항에 있어서, 추출이 약 45℃에서 수행되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 용매가 크실렌인 방법.
제10항에 있어서, 크실렌 대 열처리된 배양 배지의 비율이 약 1:1인 방법.
제11항에 있어서, 추출이 약 45℃에서 수행되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 안사미토신이 환원성 절단에 의해 마이탄시놀 (maytansinol)을 형성할 수 있는 아실화된 안사미토신을 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조된 안사미토신.
제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조된 안사미토신을 세포 결합제와 마이탄시노이드 (maytansinoid)의 복합체로 전환시킴으로써 제조된, 세포 결합제와 마이탄시노이드의 복합체.
제15항에 있어서, 세포 결합제가 항체인 세포 결합제와 마이탄시노이드의 복합체.