KR20070030923A - 바이오매터로부터 마크롤라이드를 추출하는 방법 - Google Patents

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KR20070030923A
KR20070030923A KR1020077001842A KR20077001842A KR20070030923A KR 20070030923 A KR20070030923 A KR 20070030923A KR 1020077001842 A KR1020077001842 A KR 1020077001842A KR 20077001842 A KR20077001842 A KR 20077001842A KR 20070030923 A KR20070030923 A KR 20070030923A
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빌모스 케리
라조스 디아크
크샤바 스자보
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테바 기오기스제르갸르 자르트쾨렌 뮈쾨되 레스즈베니타르사사그
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
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Abstract

본 발명은 바이오매터로부터 마크롤라이드, 특히 타크롤리머스를 얻는 방법을 제공한다.
마크롤라이드, 타크롤리머스

Description

바이오매터로부터 마크롤라이드를 추출하는 방법{METHOD FOR EXTRACTING A MACROLIDE FROM BIOMATTER}
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2002년 2월 13일자로 출원된 가명세 출원 Serial No. 60/356,959호의 이익을 35 U.S.C. §1.119(e) 하에 특허청구하고 있는 것이며, 이것은 본 명세서에 참고 인용되어 있다.
발명의 기술분야
본 발명은 바이오매터(biomatter), 특히 발효 브로쓰(fermentation broth)로부터 마크롤라이드(macrolide), 예를 들면 타크롤리머스(tacrolimus)를 추출하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경기술
마크롤라이드는 치환체로서 하나 이상의 데옥시 당을 갖는 복수 구성원으로 이루어진 락톤 고리이다. 에리트로마이신, 아지트로마이신 및 클라리트로마이신은 정균 및/또는 살균 활성을 갖고 있는 마크롤라이드이다.
또한, 타크롤리머스(FK 506)는 면역억제제이기도 한 항균성 마크롤라이드이 다. 시클로스포린보다 더 유효한 타크롤리머스는 T-림프구에 대하여 선택적인 억제 작용을 갖는다.
마크롤라이드는, 합성 경로가 어느 정도 공지되어 있긴 하지만, 전형적으로 발효에 의해 얻어진다. 본 발명의 추출 방법은 종래의 기술보다 몇가지 이점을 제공한다. 예를 들어, 전체 발효 브로쓰(whole fermentation broth)는 본 발명의 방법("전체 브로쓰 방법(whole broth method)")의 경우 출발물질로서 사용할 수 있고, 소수성 추출 용매의 사용은 결과적으로 1 단계로 균사체(mycelium)를 제거함으로써 대부분의 수용성 불순물을 잔류하게 하면서 효율적인 추출 수율을 형성하게 된다. 25℃ 이상의 온도에서 감압 하에 실시하는 감압 농축 처리는 결과적으로 타크롤리머스의 침전 또는 분해 없이 높은 증발 속도를 형성하게 된다. 본 발명의 추가 이점은 당업자에게 명백히 이해될 수 있을 것이다.
발명의 개요
한 실시양태에서, 본 발명은 마크롤라이드 함유 바이오매터를 소수성 추출 용매로 추출하여 소수성 추출 용매 중의 마크롤라이드의 용액을 얻는 단계를 포함하여 마크롤라이드, 특히 타크롤리머스를 얻는 방법에 관한 것으로, 특히 여기서 소수성 추출 용매는 n-부탄올, iso-부탄올, 아세트산 또는 포름산의 (C2-C6) 선형 또는 분지형 에스테르, (C3-C6) 선형 또는 분지형 지방족 케톤, 할로겐화 메탄, 할로겐화 에탄, 및 25℃에서 액체이고 대기압에서 약 150℃ 미만의 비등점을 갖고 있 는 방향족 탄화수소로 이루어진 군 중에서 선택되고, 추출되는 바이오매터의 pH는 약 5.5 내지 약 13이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 마크롤라이드 함유 바이오매터를 소수성 추출 용매로 추출하여 소수성 추출 용매 중의 마크롤라이드의 용액을 얻는 단계를 포함하여 마크롤라이드, 특히 타크롤리머스를 얻는 방법에 관한 것으로, 특히 여기서 소수성 추출 용매는 n-부탄올, iso-부탄올, 아세트산 또는 포름산의 (C2-C6) 선형 또는 분지형 에스테르, (C3-C6) 선형 또는 분지형 지방족 케톤, 할로겐화 메탄, 할로겐화 에탄, 및 25℃에서 액체이고 대기압에서 약 150℃ 미만의 비등점을 갖고 있는 있는 방향족 탄화수소로 이루어진 군 중에서 선택되고, 추출은 약 2℃ 내지 약 70℃의 온도, 특히 약 15℃ 내지 약 35℃의 온도에서 실시한다.
추가 양태에서, 본 발명은 마크롤라이드 함유 바이오매터를 소수성 추출 용매로 추출하여 소수성 추출 용매 중의 마크롤라이드의 용액을 얻는 단계를 포함하여 마크롤라이드, 특히 타크롤리머스를 얻는 방법에 관한 것으로, 특히 여기서 소수성 추출 용매는 n-부탄올, iso-부탄올, 아세트산 또는 포름산의 (C2-C6) 선형 또는 분지형 에스테르, (C3-C6) 선형 또는 분지형 지방족 케톤, 할로겐화 메탄, 할로겐화 에탄, 및 25℃에서 액체이고 대기압에서 약 150℃ 미만의 비등점을 갖고 있는 있는 방향족 탄화수소로 이루어진 군 중에서 선택되고, 추출은 약 2℃ 내지 약 70℃의 온도, 특히 약 15℃ 내지 약 35℃의 온도에서, 그리고 약 5.5 내지 약 13, 특히 약 7.5 내지 약 13의 pH에서 실시한다.
추가 양태에서, 본 발명은 마크롤라이드 함유 바이오매터를 소수성 추출 용매로 추출하여 소수성 추출 용매 중의 마크롤라이드의 용액을 얻는 단계, 마크롤라이드 함유 용액을 농축하는 단계, 그 농축된 용액을 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 마크롤라이드 함유 용액인 하나 이상의 마크롤라이드 함유 분류물을 얻는 단계, 및 그 용액으로부터 마크롤라이드를 결정화시키는 단계를 포함하여 마크롤라이드, 특히 타크롤리머스를 얻는 방법에 관한 것으로, 특히 여기서 소수성 추출 용매는 n-부탄올, iso-부탄올, 아세트산 또는 포름산의 (C2-C6) 선형 또는 분지형 에스테르, (C3-C6) 선형 또는 분지형 지방족 케톤, 할로겐화 메탄, 할로겐화 에탄, 및 25℃에서 액체이고 대기압에서 약 150℃ 미만의 비등점을 갖고 있는 있는 방향족 탄화수소로 이루어진 군 중에서 선택되고, 추출은 약 2℃ 내지 약 70℃의 온도, 특히 약 15℃ 내지 약 35℃의 온도에서, 그리고 약 5.5 내지 약 13, 특히 약 7.5 내지 약 13의 pH에서 실시한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 마크롤라이드 함유 바이오매터를 소수성 추출 용매로 추출하여 소수성 추출 용매 중의 마크롤라이드의 용액을 얻는 단계, 그 추출된 마크롤라이드 함유 바이오매터로부터 마크롤라이드를 함유하는 용액을 분리하는 단계, 그 분리된 마크롤라이드 함유 용액을 농축하는 단계, 그 농축된 용액을 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 마크롤라이드 함유 용액인 하나 이상의 마크롤라이드 함유 분류물을 얻는 단계, 임의로 그 용액을 농축하는 단계, 그 임의로 농축된 분리 용액으로부터, 특히 약 20℃ 이하의 온도로 냉각하여 마크롤라이드를 결정 화시키는 단계, 및 그 결정화된 마크롤라이드를 단리하는 단계를 포함하여 마크롤라이드, 특히 타크롤리머스를 얻는 방법에 관한 것으로, 특히 여기서 소수성 추출 용매는 n-부탄올, iso-부탄올, 아세트산 또는 포름산의 (C2-C6) 선형 또는 분지형 에스테르, (C3-C6) 선형 또는 분지형 지방족 케톤, 할로겐화 메탄, 할로겐화 에탄, 및 25℃에서 액체이고 대기압에서 약 150℃ 미만의 비등점을 갖고 있는 있는 방향족 탄화수소로 이루어진 군 중에서 선택된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 마크롤라이드 함유 바이오매터를 소수성 추출 용매로 추출하여 소수성 추출 용매 중의 마크롤라이드의 용액을 얻는 단계, 그 추출된 마크롤라이드 함유 바이오매터로부터 마크롤라이드를 함유하는 용액을 분리하는 단계, 그 분리된 마크롤라이드 함유 용액을 농축하는 단계, 그 농축된 용액을 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 마크롤라이드 함유 용액인 하나 이상의 마크롤라이드 함유 분류물을 얻는 단계, 임의로 그 용액을 농축하는 단계, 그 임의로 농축된 분리 용액을 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 헥산, 헵탄, 및 물로 이루어진 군 중에서 선택된 결정화 용매와 배합하여 그 농축된 분리 용액으로부터 마크롤라이드를 결정화시키는 단계, 및 그 결정화된 마크롤라이드를 단리하는 단계를 포함하여 마크롤라이드, 특히 타크롤리머스를 얻는 방법에 관한 것으로, 특히 여기서 소수성 추출 용매는 n-부탄올, iso-부탄올, 아세트산 또는 포름산의 (C2-C6) 선형 또는 분지형 에스테르, (C3-C6) 선형 또는 분지형 지방족 케톤, 할로겐화 메탄, 할로겐화 에탄, 및 25℃에서 액체이고 대기압에 서 약 150℃ 미만의 비등점을 갖고 있는 있는 방향족 탄화수소로 이루어진 군 중에서 선택된다.
추가 양태에서, 본 발명은 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis), 스트렙토마이세스 히그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 중에서 선택된 미생물로부터 얻어지는 마크롤라이드 함유 바이오매터를 소수성 추출 용매로 추출하여 소수성 추출 용매 중의 마크롤라이드의 용액을 얻는 단계를 포함하여 마크롤라이드, 특히 타크롤리머스를 얻는 방법에 관한 것으로, 특히 여기서 소수성 추출 용매는 n-부탄올, iso-부탄올, 아세트산 또는 포름산의 (C2-C6) 선형 또는 분지형 에스테르, (C3-C6) 선형 또는 분지형 지방족 케톤, 할로겐화 메탄, 할로겐화 에탄, 및 25℃에서 액체이고 대기압에서 약 150℃ 미만의 비등점을 갖고 있는 방향족 탄화수소로 이루어진 군 중에서 선택되고, 추출되는 바이오매터의 pH는 약 5.5 내지 약 13이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis), 스트렙토마이세스 히그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 중에서 선택된 미생물의 발효에 의해 얻어지는 전체 발효 브로쓰인 타크롤리머스 함유 바이오매터를, n-부틸 아세테이트, iso-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 아세테이트, 부틸 메틸 케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라클로로메탄, 및 톨루엔으로 이루어진 군 중에서 선택된 소수성 추출 용매로 약 2℃ 내지 약 70℃의 온도, 특히 약 15℃ 내지 약 35℃의 온도에서, 그리고 약 5.5 내지 약 13, 특히 약 7.5 내지 약 13의 pH에서 추출하여 소수성 추출 용매 중의 타크롤리머스의 용액을 얻는 단계; 그 추출된 타크롤리머스 함유 바이오매터로부터 타크롤리머스 함유 용액을 분리하는 단계; 타크롤리머스 함유 용액을 농축하는 단계; 그 농축된 용액을 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 타크롤리머스 함유 용액인 하나 이상의 타크롤리머스 함유 분류물을 얻는 단계; 임의로 그 용액을 농축하는 단계; 및 그 임의로 농축된 분리 용액으로부터 그 용액을 냉각시키거나, 또는 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 헥산, 헵탄, 및 물로 이루어진 군 중에서 선택된 결정화 용매와 배함으로써 타크롤리머스를 결정화시켜서 결정화된 타크롤리머스의 침전물을 형성시키는 단계; 및 타크롤리머스를 단리하는 단계 포함하여 타크롤리머스 함유 바이오매터로부터 타크롤리머스를 얻는 방법에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis), 스트렙토마이세스 히그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 중에서 선택된 미생물의 발효에 의해 얻어지는 전체 발효 브로쓰인 타크롤리머스 함유 바이오매터를, iso-부틸 아세테이트로 약 2℃ 내지 약 70℃의 온도, 특히 약 15℃ 내지 약 35℃의 온도에서 추출하여 iso-부틸 아세테이트 용매 중의 타크롤리머스의 용액을 얻는 단계; 그 추출된 타크롤리머스 함유 바이오매터로부터 타크롤리머스 함유 iso-부틸 아세테이트 용액을 분리하는 단계; 타크롤리머스 함유 iso-부틸 아세테이 트 용액을 농축하는 단계; 그 농축된 용액을 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 타크롤리머스 함유 용액인 하나 이상의 타크롤리머스 함유 분류물을 얻는 단계; 임의로 그 용액을 농축하는 단계; 및 그 임의로 농축된 분리 용액으로부터 그 용액을 약 20℃ 이하의 온도로 냉각시키거나, 또는 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 헥산, 헵탄, 및 물로 이루어진 군 중에서 선택된 결정화 용매와 배함으로써 타크롤리머스를 결정화시켜서 결정화된 타크롤리머스의 침전물을 형성시키는 단계; 및 타크롤리머스를 분리하는 단계 포함하여 타크롤리머스 함유 바이오매터로부터 타크롤리머스를 얻는 방법에 관한 것이다.
발명에 관한 상세한 설명
한 실시양태에서, 본 발명은 마크롤라이드 함유 바이오매터로부터 마크롤라이드를 소수성 추출 용매로 추출하여 소수성 추출 용매 중의 마크롤라이드의 용액(이 용액으로부터 마크롤라이드가 얻어질 수 있음)을 얻는 단계를 포함하여 마크롤라이드 함유 바이오매터로부터 마크롤라이드, 바람직하게는 타크롤리머스(또한 FK 506이라고 공지되어 있기도 함)를 얻는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 바이오매터를 소수성 추출 용매로 추출하여 마크롤라이드의 용액을 얻고, 이어서 그 용액을 농축하여 농축물(이 농축물로부터 마크롤라이드가 단리됨)을 얻음으로써 마크롤라이드 함유 바이오매터로부터 마크롤라이드, 바람직하게는 타크롤리머스를 얻는 방법을 제공한다.
마크롤라이드 함유 바이오매터는 발효 또는 배양 또는 기타 수단에 의해 마 크롤라이드를 생성시키는 마크롤라이드 생성 미생물, 예를 들면 박테리아 또는 곰팡이로부터 또는 그러한 미생물의 사용을 통해 얻어지는 물질이다. 미생물의 발효는 해당 기술 분야의 당업자에 잘 알려진 방법에 의해 실시할 수 있으며, 예를 들어 문헌(Surjit S. Sengha, Fermentation, in 10 Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 361(Jacquiline I. Kroschwitz, ed. 4th ed. 1993)에 기술되어 있다.
바람직한 마크롤라이드 함유 바이오매터는, 미국 특허 출원 제4,894,366호, 제5,116,756호, 제5,624,842호, 제5,496,727호 및 제5,622,866호에 설명되어 있는 바와 같이, 타크롤리머스 생성 미생물, 예를 들면 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis), 이것의 신규한 돌연변이형 균주, 스트렙토마이세스 히그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)를 사용하는 발효에 의해 얻을 수 있는 타크롤리머스 함유 바이오매터, 특히 발효 브로쓰이다.
마크롤라이드 생성 미생물의 발효로부터 발효 브로쓰를 여과함으로써 얻어지는 균사체 및 여과물은 또한 본 발명의 실시에서 유용한 바이오매터이다. 균사체를 분리하기 위해서 미여과되거나 정제된, 마크롤라이드 생성 미생물의 발효로부터 유래한 전체 발효 브로쓰, 즉 "전체 브로쓰"는 본 발명의 실시에 바람직한 마크롤라이드 함유 바이오매터이다. 전체 브로쓰를 사용하는 경우, 본 발명의 방법은 "전체 브로쓰 방법"이라고 칭할 수도 있다.
마크롤라이드 함유 바이오매터는 마크롤라이드, 특히 타크롤리머스에 적합하 긴 하지만, 25℃에서 단지 수중에만 난용성인 소수성 추출 용매로 추출한다. 바람직한 소수성 추출 용매로는 아세트산 또는 포름산의 (C2-C6) 선형 및 분지형 에스테르, 예를 들면 iso-부틸 아세테이트, (C3-C6) 선형 또는 분지형 지방족 케톤, 할로겐화 에탄, 예를 들면 디클로로에탄, 및 25℃에서 액체이고 대기압에서 약 150℃ 미만인 비등점을 갖는 방향족 탄화수소가 있다. 또한, n-부틸 알콜 및 iso-부틸 알콜도 소수성 추출 용매로서 사용할 수 있다.
소수성 추출 용매로는 iso-부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 포르메이트, 부틸 메틸 케톤(2-헥산온), 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라클로로메탄 및 톨루엔이 바람직하다.
에틸 아세테이트 및 iso-부틸 아세테이트가 특히 바람직한 소수성 추출 용매이다.
마크롤라이드의 용액을 형성시키는 추출은 해당 기술 분야의 당업자 및 루티너 등에 공지되어 있는 바와 같이 그러한 방법 및 장비를 사용하여 수행할 수 있다. 선택된 방법 및 장비는 단지 적절한 교반만을 제공하며, 추출된 마크롤라이드 함유 바이오매터로부터 용액 분리를 허용하거나, 또는 추출 혼합물의 분리 장치로의 이동을 허용한다. 추출은 약 2℃ 내지 약 70℃의 임의 용이한 온도에서 수행할 수 있다. 추출은 약 15℃ 내지 약 35℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 해당 기술 분야의 당업자는 사용되는 마크롤라이드 함유 바이오매터, 소수성 추출 용 매, 장비 및 온도에 따라 추출 시간을 최적화하는 방법을 이해할 수 있을 것이다. 추출 말기에서, 추출 혼합물은 소수성 추출 용매 중의 마크롤라이드의 용액 뿐만 아니라 잔류하는 추출된 마크롤라이드 함유 바이오매터를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 추출은 균사체를 제거하는 임의의 정제 처리, 예를 들면 여과를 실시하지 않은 최초 상태의 바이오매터, 예를 들면 발효 브로쓰 상에서 수행한다. 이러한 경우, 추출은 전체 브로쓰 추출이라고 칭한다.
추출은 약 1 내지 약 13의 임의 pH에서 수행할 수 있다. 추출은 약 5.5 내지 약 13의 pH에서 수행하는 것이 바람직하고, 약 7.5 내지 약 13의 pH에서 수행하는 것이 가장 바람직하다. 바이오매터, 특히 발효 브로쓰의 pH는 적당한 무기 염기, 단지 몇가지만을 언급한다면, 예를 들면 NH4OH, NaOH, KOH, LiOH 또는 Ca(OH)2를 사용하여 조정할 수 있다. 본 발명자들은, 약 5.5 내지 약 13의 pH를 갖는 바이오매터 상에서 추출을 실시할 경우, 구체적인 이점, 특히 마크롤라이드의 순도에 관한 이점을 관찰하게 되었다. pH는 알칼리성 pH, 특히 약 7.5 내지 약 13의 pH인 것이 바람직하다.
추출을 수행한 후, 소수성 추출 용매 중의 마크롤라이드의 용액은 추출 혼합물로부터 분리하고, 바람직한 실시양태에서, 농축하여 농축물을 얻는다. 분리는 해당 기술 분야의 당업자 및 루티너 등에 잘 알려진 방법 및 장비, 예를 들어 경사분리, 분별 깔대기에서의 분리, 및 액체-액체 원심분리기를 사용하는 원심분리를 이용하여 달성할 수 있다.
추출된 마크롤라이드 함유 바이오매터로부터 분리된 마크롤라이드 함유 용액은 농축하여 농축물을 얻는다. 농축은 일반적인 대기압(해당 기술 분야의 당업자가 인식하는 대기압은 평균 760 mmg에서 약간 근소하게 변함)에서 실시하거나, 또는 예를 들어 진공 펌프 또는 수분 흡인기의 수단에 의해 이루어지는 감압에서 실시할 수 있다. 농축은 약 25℃ 이상의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 농축은 마크롤라이드 함유 용액의 부피가 초기 부피의 약 0.2% 내지 약 2.0% 또는 그 미만으로 감소될 때까지 실시하여 농축된 마크롤라이드 함유 용액("농축물")을 제공할 수 있다. 미정제 타크롤리머스는 그 농축물로부터 단리할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 농축물은 실리카 겔 컬럼 상에서 컬럼 크로마토그래피로 처리한다. 적용된 크로마토그래피 방법은 본 명세서에서 그 전체 내용이 참고 인용되어 있는 미국 특허 제4,894,366호에 기술되어 있는 것일 수 있다.
처리에 있어서, 농축물(농축된 마크롤라이드 함유 용액)은 실리카 겔 컬럼 상에 로딩한다. 로딩 작업에 있어서, 농축물은 마크롤라이드에 사용되는 용매, 예를 들어 에틸 아세테이트인 용매와 배합하고, 실리카 겔과 슬러리화할 수 있다. 용매는 슬러리로부터 제거하여 농축물로부터 유래한 마크롤라이드 및 다른 물질로 로딩된 실리카 겔을 산출한다. 이 로딩된 실리카 겔은 컬럼 상부에 충전하고, 필요한 경우, 로딩 용출제는 그 컬럼에 통과시킨다. 이어서, 컬럼은 용출제로 용출시킨다.
용출제는 용출제의 조성이 일정하거나, 또는 용출제의 조성이 용출 동안 변할 수 있는 이소크래틱성(isochratic)을 지닐 수 있다. 바람직한 용출제는 에틸 아세테이트와 헥산의 혼합물을 포함한다.
분류물은 수집하여 용출제 중의 마크롤라이드의 용액인 하나 이상의 마크롤라이드 함유 분류물을 얻는다. 복수개의 마크롤라이드 함유 분류물은 합하여 단일의 마크롤라이드 함유 분류물을 얻는다. 마크롤라이드 함유 분류물(들)은 농축하여 마크롤라이드의 농축된 용액(농축된 분류물)을 얻을 수 있으며, 이로부터 마크롤라이드가 결정화될 수 있다.
마크롤라이드는 바람직하게는 농축된 마크롤라이드 함유 용액으로부터 결정화(침전)시킨다. 이와 같이 결정화(침전)된 마크롤라이드는 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 단리할 수 있다. 결정화는 마크롤라이드 함유 용액을, 바람직하게는 약 20℃ 이하의 온도로 냉각시킴으로써 수행할 수 있다. 또한, 결정화는 바람직하게는 농축된 마크롤라이드 함유 용액과 배합되는 결정화 용매에 의해 수행할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이후 그 배합물은 약 25℃ 이하의 온도에서 약 19 시간 내지 약 60 시간의 유지 기간 동안 유지한다. 전형적 유지 시간은 48 시간이다. 유용한 결정화 용매에는 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 헥산, 헵탄 및 물이 포함된다.
특히 바람직한 실시양태에서는 마크롤라이드 함유 용액을 농축 건조시켜서 마크롤라이드를 얻는데, 이 경우에는 추가 냉각 없이 그리고 결정화 용매의 사용 없이 마크롤라이드가 얻어진다.
본 발명의 실시는 하기 실시예들에 의해 추가 예시되지만, 이들 실시예에 의해 국한되는 것이 아니다.
실시예 1
발효 브로쓰(50 ml)를 iso-부틸 아세테이트 50 ml와 혼합하였다. 이 혼합물의 pH는 희석된 황산 용액을 사용하여 pH 2로 조정하였다. 30분 동안 교반한 후, 상을 분리하였다. 이 분리된 iso-부틸 아세테이트 상(39 ml)을 60℃에서 감압 하에 농축 건조시켰다. 달성된 수율은 83%이었다.
실시예 2
발효 브로쓰(50 ml)를 iso-부틸 아세테이트 50 ml와 혼합하였다. 이 혼합물에 황산마그네슘 250 mg과 희석된 도데실 트리메틸 염화암모늄 용액 몇 방울을 첨가하였다. 혼합물의 pH는 희석된 황산 용액을 사용하여 pH 4로 조정하였다. 30 분 동안 교반한 후, 상을 분리하였다. 분리된 상 iso-부틸 아세테이트 상(44 ml)을 70℃에서 감압 하에 농축 건조시켰다. 달성된 수율은 88%이었다.
실시예 3
발효 브로쓰(50 ml)를 iso-부틸 아세테이트 50 ml와 혼합하였다. 이 혼합물에 황산마그네슘 250 mg 및 희석된 도데실 트리메틸 수산화암모늄 용액 몇 방울을 첨가하였다. 혼합물의 pH는 희석된 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH 8로 조정하였다. 이 배합물을 35-40℃로 가열하였다. 30 분 동안 교반한 후, 상을 분리하였다. iso-부틸 아세테이트 상(44 ml)을 82℃에서 감압 하에 농축 건조시켰다. 달성된 수율은 94%이었다.
실시예 4
발효 브로쓰(50 ml)를 iso-부틸 아세테이트 50 ml와 혼합하였다. 이 혼합물에 황산마그네슘 250 mg 및 희석된 도데실 트리메틸 수산화암모늄 용액 몇 방울을 첨가하였다. 혼합물의 pH는 희석된 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH 10으로 조정하였다. 그 배합물을 15℃로 냉각하였다. 30 분 동안 교반한 후, 상을 분리하였다. iso-부틸 아세테이트 상(43 ml)을 55℃에서 감압 하에 농축 건조시켰다. 달성된 수율은 92%이었다.
실시예 5
발효 브로쓰(50 ml)를 에틸 아세테이트 50 ml와 혼합하였다. 이 혼합물에 황산마그네슘 250 mg 및 희석된 도데실 트리메틸 수산화암모늄 용액 몇 방울을 첨가하였다. 혼합물의 pH는 희석된 황산 용액을 사용하여 pH 4로 조정하였다. 30 분 동안 교반한 후, 상을 분리하였다. 분리된 에틸 아세테이트 상을 29℃에서 감압 하에 농축 건조시켰다. 달성된 수율은 92%이었다.
본 발명의 마크롤라이드 수득 방법은 전체 발효 브로쓰를 출발물질로서 사용할 수 있고, 소수성 추출 용매의 사용으로 1 단계로 균사체를 제거함으로써 대부분의 수용성 불순물을 잔류하게 하면서 효율적인 추출 수율을 형성할 수 있다.

Claims (34)

  1. 타크롤리머스 함유 바이오매터를 소수성 추출 용매로 추출하여 소수성 추출 용매 중의 타크롤리머스의 용액을 수득하는 단계를 포함하고, 추출된 타크롤리머스 함유 바이오매터의 pH가 8 초과 13 이하인 타크롤리머스의 수득 방법.
  2. 제1항에 있어서, 소수성 추출 용매가 n-부탄올, iso-부탄올, 아세트산 또는 포름산의 (C2-C6) 선형 및 분지형 에스테르, (C3-C6) 선형 또는 분지형 지방족 케톤, 할로겐화 메탄, 할로겐화 에탄, 및 25℃에서 액체이고 대기압에서 150℃ 미만의 비등점을 갖는 방향족 탄화수소로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 소수성 추출 용매가 n-부탄올, iso-부탄올, n-부틸 아세테이트, iso-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 포르메이트, 아세톤, 부틸 메틸 케톤, 메틸 iso-부틸 케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라클로로메탄, 디클로로에탄 및 톨루엔으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 소수성 추출 용매가 에틸 아세테이트, iso-부틸 아세테이트 또는 이들의 혼합물인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 소수성 추출 용매가 iso-부틸 아세테이트인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 추출 온도가 2℃ 내지 70℃인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 추출 온도가 15℃ 내지 35℃인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 추출된 바이오매터의 pH가 8 초과 10 이하인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 타크롤리머스 함유 바이오매터가 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis), 스트렙토마이세스 히그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 중에서 선택된 미생물로부터 수득되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 타크롤리머스 함유 바이오매터가 전체 발효 브로쓰(whole fermentation broth)인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 바이오매터의 pH가 8 초과 10 이하인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 소수성 추출 용매가 iso-부틸 아세테이트인 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 추출 후
    추출된 타크롤리머스 함유 바이오매터로부터 타크롤리머스를 함유하는 용액을 분리하여, 분리된 타크롤리머스 함유 용액을 수득하는 단계,
    분리된 타크롤리머스 함유 용액을 농축하는 단계,
    농축된 타크롤리머스 함유 용액을 실리카 겔 컬럼 상에 로딩하고 용출제로 용출하여 타크롤리머스 함유 용액인 하나 이상의 타크롤리머스 함유 분류물을 수득하는 단계,
    타크롤리머스 함유 용액으로부터 타크롤리머스를 결정화시키는 단계, 및
    결정화된 타크롤리머스를 단리하는 단계
    를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 결정화가 타크롤리머스 함유 용액인 하나 이상의 타크롤리머스 함유 분류물을 농축하고 농축된 용액을 25℃ 이하의 온도로 냉각시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 결정화가 분리된 용액을 결정화 용매와 배합함으로써 수행되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 결정화 용매가 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, i-프로판 올, 아세톤, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 헥산, 헵탄 및 물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 결정화 용매가 메탄올, 에탄올, i-프로판올 및 물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 분리된 용액과 결정화 용매의 배합물이 10 시간 내지 60 시간의 유지 기간 동안 25℃ 이하의 온도에서 유지되는 것인 방법.
  19. (a) 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스, 스트렙토마이세스 히그로스코피커스 및 스트렙토마이세스 리비단스로 이루어진 군 중에서 선택된 미생물의 발효에 의해 수득되는 전체 발효 브로쓰인 타크롤리머스 함유 바이오매터를, n-부탄올, iso-부탄올, n-부틸 아세테이트, iso-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 포르메이트, 부틸 메틸 케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라클로로메탄, 디클로로에탄, 및 톨루엔으로 이루어진 군 중에서 선택된 소수성 추출 용매로 2℃ 내지 70℃의 온도 및 8 초과 13 이하의 pH에서 추출하여 소수성 추출 용매 중의 타크롤리머스의 용액을 수득하는 단계;
    (b) 추출된 타크롤리머스 함유 바이오매터로부터 타크롤리머스 함유 용액을 분리하는 단계;
    (c) 타크롤리머스 함유 용액을 농축하는 단계;
    (d) 농축된 타크롤리머스 함유 용액을 실리카 겔 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩하고, 컬럼을 용출제로 용출시켜서 타크롤리머스 함유 용액인 하나 이상의 타크롤리머스 함유 분류물을 수득하는 단계;
    (e) 하나 이상의 타크롤리머스 함유 분류물로부터 타크롤리머스를 결정화시켜서 결정화된 타크롤리머스의 침전물을 형성시키는 단계; 및
    (f) 결정화된 타크롤리머스를 분리하는 단계
    를 포함하는, 타크롤리머스 함유 바이오매터로부터 타크롤리머스의 수득 방법.
  20. 제19항에 있어서, 전체 발효 브로쓰의 pH가 8 초과 10 이하인 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 소수성 추출 용매가 iso-부틸 아세테이트인 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 추출 온도가 15℃ 내지 30℃인 것인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 결정화가 하나 이상의 타크롤리머스 함유 분류물을 농축하고 농축된 분류물을 25℃ 이하의 온도로 냉각시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  24. 제19항에 있어서, 결정화가 하나 이상의 타크롤리머스 함유 분류물을 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 헥산, 헵탄 및 물로 이루어진 군 중에서 선택된 결정화 용매와 배합함으로써 수행되는 것인 방법.
  25. 전체 발효 브로쓰인 타크롤리머스 함유 바이오매터를 n-부틸 아세테이트, iso-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 포르메이트, 부틸 메틸 케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라클로로메탄, 및 톨루엔으로 이루어진 군 중에서 선택된 소수성 추출 용매로 추출하는 단계를 포함하고, 타크롤리머스 함유 바이오매터의 pH가 8 초과 13 이하인, 타크롤리머스 함유 바이오매터로부터 타크롤리머스의 수득 방법.
  26. (a) 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스, 스트렙토마이세스 히그로스코피커스 및 스트렙토마이세스 리비단스로 이루어진 군 중에서 선택된 미생물의 발효에 의해 얻어지는 전체 발효 브로쓰인 타크롤리머스 함유 바이오매터를, iso-부틸 아세테이트로 2℃ 내지 70℃의 온도에서 추출하여 iso-부틸 아세테이트 중의 타크롤리머스의 용액을 수득하는 단계로서, 타크롤리머스 함유 바이오매터의 pH가 8 초과 13 이하인 것인 단계;
    (b) 추출된 타크롤리머스 함유 바이오매터로부터 타크롤리머스 함유 용액을 분리하는 단계;
    (c) 타크롤리머스 함유 용액을 농축하는 단계;
    (d) 농축된 타크롤리머스 함유 용액을 실리카 겔 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩하고, 용출제로 용출시켜서 타크롤리머스 함유 용액인 하나 이상의 타크롤리머 스 함유 분류물을 수득하는 단계;
    (e) 하나 이상의 타크롤리머스 함유 분류물을 농축하는 단계;
    (f) 농축된 분류물로부터 타크롤리머스를 결정화시켜서 결정화된 타크롤리머스의 침전물을 형성시키는 단계; 및
    (g) 결정화된 타크롤리머스를 분리하는 단계
    를 포함하는, 타크롤리머스 함유 바이오매터로부터 타크롤리머스의 수득 방법.
  27. 제26항에 있어서, 타크롤리머스 함유 바이오매터의 pH가 8 초과 10 이하인 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 타크롤리머스 함유 바이오매터의 pH가 10 내지 13인 것인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 추출 온도가 15℃ 내지 35℃인 것인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 바이오매터의 pH가 10 내지 13인 것인 방법.
  31. 제1항에 있어서, 타크롤리머스 함유 바이오매터로부터 타크롤리머스가 80% 내지 95%의 수율로 수득되는 것인 방법.
  32. 제19항에 있어서, 바이오매터의 pH가 10 내지 13인 것인 방법.
  33. 제25항에 있어서, 바이오매터의 pH가 8 초과 10 이하인 것인 방법.
  34. 제25항에 있어서, 바이오매터의 pH가 10 내지 13인 것인 방법.
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