CZ299567B6

CZ299567B6 - Kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 a zpusob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy z neho

Info

Publication number: CZ299567B6
Application number: CZ20080247A
Authority: CZ
Inventors: Cejka@Jan; Kopecký@Jirí; Lukešová@Alena; Štys@Dalibor; Zelík@Petr
Original assignee: Mikrobiologický ústav AV CR, v.v.i.; Biologické centrum AV CR, v.v.i.; Jihoceská univerzita v Ceských Budejovicích; Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
Priority date: 2008-04-22
Filing date: 2008-04-22
Publication date: 2008-09-03
Also published as: CZ2008247A3

Abstract

Predmetem rešení je produkcní kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97, proces izolace nové biologickyaktivní látky z tohoto kmene a vlastní bioaktivnílátka vykazující inhibicní aktivitu vuci enzymu acetylcholinesterasa. Proces izolace spocívá v extrakci biomasy produkcního kmene methanolem, odparení surového methanolického extraktu do sucha, rozpuštení odparku v acetonu a vysrážení aktivní látky prídavkem nadbytku alifatického uhlovodíku. Aktivní látka se dále chromatograficky cistí postupne nasloupci polyamidu, silikagelu a pomocí semipreparativní HPLC na reverzní fázi C.sub.18.n.. Tím se získá inhibitor acetylcholinesterasy o strukturním vzorci 2,2´-bis[4,5-bis(4-hydroxybenzyl)-2-(4-hydroxyfenyl)cyclopent-4-en-1,3-dion] o cistote vyšší než 98 %.

Description

Kmen sinice Nostoc sp, Lukešová 27/97 a způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy z něho

Oblast techniky

Vynález se týká struktury bioaktivní látky s inhibiční aktivitou vůči acetylcholinesterase a metody izolace této látky z biomasy sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97.

Dosavadní stav techniky

Alzeimerova choroba je progresivní neurodegenerativní porucha centrální nervové soustavy, v současné době 10-15 % starší populace trpí různými formami demence z čehož okolo 70 % zahrnuje právě Alzeimerovu chorobu. Jelikož přesná příčina vzniku Alzeimerovy choroby není dosud zcela objasněna, uplatňují se při její paliativní léčbě především reverzibilní inhibitory acetylcholinesterasy.

Rada přírodních látek, které snižují aktivitu acetylcholinesterasy, byla izolována především z vyšších rostlin. Mezi typické příklady takovýchto látek patří různé alkaloidy, terpenoidy, glykosidy a kumariny izolované např. z Sarcococca saligna, Halonyxon recurvum nebo Buxus papillosa. Oproti tomu u mikroorganismů bylo nalezeno doposud jen několik producentů látek s inhibičním účinkem vůči acetylcholinesterase. Na základě výsledků testování více než 7000 mikroorganismů, především bakterií a hub, byly např. z kultivačního média Penicillium sp.

FO-4259 izolovány dva meroterpenoidy s vysoce selektivním inhibičním účinkem vůči acetylcholinesterase. Jako další příklady inhibitorů acetylcholinesterasy izolované z mikroorganismů mohou sloužit Streptomyces antibioticus a Streptomyces levandulae produkují cyklické organofosfáty. Z farmakologického hlediska jsou však tyto látky nevyužitelné, neboť v případě meroterpenoidů se jedná o látky s vedlejšími toxickými účinky a cyklické organofosfáty se na enzym vážou ireverzibilně.

Sekundární metabolity sinic se oproti vyšším rostlinám, houbám i baktériím liší nejen chemickou strukturou (např. alkaloidy, peptidy, fenoly, terpenoidy, polyethery), ale i spektrem biologických aktivit, jako je např. antibakteriální, aleopatická, antivirová, fungicidní nebo inhibiční účinky vůči řadě enzymů. Navzdory tomu nebyl dosud proveden prakticky žádný průzkum sinic na produkci inhibitorů acetylcholinesterasy. V současné době jsou známy pouze dva kmeny sinic, které produkují inhibitory cholinesteráz. Anabaena flos aquae)e producentem ireverzibilního inhibitoru acetylcholinesterasy anatoxinu-a(s). Druhým producentem je Nostoc 78-12A, který syntetizuje nostocarbolin, kvartémí β-karbolinový alkaloid, jehož inhibiční aktivita byla publikována pouze pro butyrylcholinesterázu, ale nikoliv pro acetylcholinesterasu.

Příkladem přírodních látek užívaných v současnosti v klinické praxi jsou donepezil, galanthamin, huperzin A nebo rivastigmin. Hlavní nevýhodou nejen všech dosud nově objevených látek vykazujících inhibiční aktivitu vůči acetylcholinesteráze, ale i výše zmíněných látek již schválených pro léčbu Alzeimerovy choroby, však zůstávají jejich různé nežádoucí vedlejší efekty. Mezi typické vedlejší účinky těchto látek patří svalová dystrofie, nespavost, toxicita kjaterním buňkám, průjmy, nevolnost a bolesti hlavy. Proto trvá neustálý zájem o vyhledávání nových sloučenin vykazujících inhibiční aktivitu vůči acetylcholinesteráze s minimem nežádoucích účinků.

Podstata vynálezu:

Výše uvedené nedostatky jsou odstraněny inhibitorem acetylcholinesterasy podle tohoto vynálezu, jehož strukturní vzorec je následující:

-1 CZ 299567 B6

OH

Tento inhibitor acetylcholinesterasy byl zjištěn v novém kmeni sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97, který je uložený ve Sbírce kultur řas a sinic na Botanickém ústavu AVCR v Třeboni.

Inhibitor acetylcholinesterasy svýše uvedeným strukturním vzorcem je chemicky 2,2'-bis[4,5bis(4-hydroxybenzyl)-2-(4-hydroxyfenyl)cyklopent-4-en-l,3-dion]. Jedná se o neselektivní reverzibilní inihibitor s rozdílným typem inhibice acetylcholinesterasy a butyrylcholinesterasy. Jedná se o ^-parabolický /-parabolický nekompetitivní inhibitor acetylcholinesterasy ío s IC₅₀=5,3 μΜ a S-parabolický /-parabolický smíšený inhibitor butyrylcholinesterasy s IC₅o=6,8 μΜ. Porovnání inhibičních účinků inhibitoru butyrylcholinesterasy s výše uvedeným strukturním vzorcem s galanthaminem a takrinem je uvedeno v Tabulce 1.

Tabulka 1: Inhibiční účinek inhibitoru acetylcholinesterasy s výše uvedeným strukturním vzor15 cem a porovnávacích standardů na acetylcholinesterasu (AChE) z elektrického úhoře a butyrylcholinesterasu (BChE) z koňského séra in vitro.

Látka	ICso ΙμΜ)	Selektivita (BChE/AChE)
AChE aktivita	BChE aktivita
inhibitor acetylcholinesterasy	5,5		1,4^C
Galanthamin	0,30-0,54“	8,6 - 37.9^h	70,2^c
Takrin	0,057	0,0062 - 0,0122”	0,2^c

^a pro rozsah koncentrací ATCI 0,062-1,25 mM,^b pro rozsah koncentrací BTCI 0,159-2,27 mM, ^c pro 1,25 mM ATCI a 2,27 mM BTCI

Proces izolace inhibitoru acetylcholinesterasy spočívá ve zpracování surového methanolického extraktu připraveného z biomasy sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97. Surový methanolický extrakt se zahustí do sucha a odparek se rozpustí rozpouštědlem a surový inhibitor acetylcholinesterasy se po té vysráží přídavkem nadbytku alifatického uhlovodíku s výhodou hexanu, čímž se odstraní nepolární balastní látky. Jako rozpouštědlo může být použit aceton nebo methanol. Sraženina se rozpustí v roztoku vodného alkoholu a chromatografuje na sloupci polyamidu směsí voda-alkohol. Jako alkohol je možno použít methanol. V takovém případě je výhodné použít směs methanokvoda v poměru 7:3 objemových jednotek. Aktivní frakce se zahustí na odparek, který se nás30 ledně rozpustí ve směsi acetonu a hexanu a chromatografuje na silikagelové koloně směsí ketonalifatický uhlovodík (například aceton-hexan). Výhodný poměr acetonu a hexanu je 5:4 objemovým jednotkám. Vzniklá aktivní frakce se zahustí na odparek, který se rozpustí ve vodném organickém rozpouštědle a chromatografuje se pomocí semipreparativní HPLC (high performance liquid chromatography) na reverzní fázi (například Ci₈) směsí voda-organické roz35 pouštědlo jako mobilní fáze. Jako organické rozpouštědlo pro HPLC chromatografii je možno použít acetonitril. Tím se získá inhibitor acetylcholinesterasy s výše uvedeným strukturním vzor-2CZ 299567 B6 cem o čistotě vyšší než 98 %. Jedná se o pevnou látku žluté barvy, která rozpustná v alkoholech, acetonu, ethylcetátu a nerozpustná v uhlovodících, halogenovaných uhlovodících nebo vodě.

Postup izolace a stanovení biologických aktivit blíže vysvětlí následující příklad:

Příklad provedení izolace inhibitoru acetylcholinesterasy

66,7 g lyofilizované biomasy sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 se homogenizuje mořským pískem a extrahuje 800,0 ml methanolu. Směs se centrifuguje (5 000 RPM, 10 min) a supematant se ío oddělí. Extrakce sedimentu se opakuje ještě třikrát, ale objem methanolu pro extrakci se sníží na

530 ml. Spojené surové extrakty se zahustí na odparek, který se rozpustí ve 30 ml acetonu. Ke vzniklému roztoku se přidá 600 ml hexanu, vyloučená sraženina obsahující inhibitor acetylcholinesterasy s výše uvedeným strukturním vzorcem se separuje centrifugací (5 000 RPM, 10 min) a supematant se vyřadí z procesu. Sraženina se po rozpuštění ve 20 ml acetonu přesráží přídavkem

500 ml hexanu ještě dvakrát. Takto získaná sraženina (4,50 g) se rozpustí v 10 ml 70 % vodného methanolu (V/V) a roztok se nanese na kolonku 15 g polyamidu. Přední frakce eluovaná 280 ml 70 % vodného methanolu (V/V) se zahustí na odparek (2,5 g), ke kterému se přidá 15 ml acetonu a 12 ml hexanu. Vzniklý roztok se chromatografuje na sloupci 80 g silikagelu směsí acetonhexan (5:4, V/V) a frakce se jímají po 150 ml. Třetí frakce se zahustí na odparek (1,5 g), který se rozpustí v 50 % vodném acetonitrilu (V/V) na koncentraci 21 mg/ml a chromatografuje za následujících podmínek:

Kolona·. Reprosil 100 C₎₈, 250x8 mm, 5 μΜ Teplota'. 30 °C

Detekce'. 280 nm

Objem nástřiku·. 500 μΐ Průtok: 3 ml/min Gradienť.

Čas [min]	0	11	12	15	16	20
Acetonitril [%\|	47	47	90	90	47	47
Voda [%[	53	53	10	10	53	53

Frakce obsahující inhibitor acetylcholinesterasy se jímají jako pík s retenčním časem 8,510,4 min. Jednotlivé frakce se spojí a zahustí na odparek (1,15 g), čímž se získá inhibitor acetylcholinesterasy o čistotě 99,4 %.

Biologické studie In Vitro

Inhibiční aktivita vůči acetylcholinesterase byla stanovena na enzymu izolovaném z elektrického úhoře. Inhibiční aktivita vůči butyrylcholinesterase byla stanovena na enzymu izolovaném z koňského séra. Pro stanovení byla použita Ellmanova metoda (G. L. Ellman et al., Biochem. Pharmacol., 7, 88 (1961)) optimalizovaná pro 96-ti jamkové mikrodestičky. Výsledky in vitro testů jsou uvedeny v Tabulce 1 a na obrázcích 1-3.

Průmyslová využitelnost

Inhibitor acetylcholinesterasy s nahoře uvedeným strukturním vzorcem je vhodný pro využití jako potencionální léčivo Alzheimerovy choroby nebo Myasthenia gravis.

Claims

1. Kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 uložený ve Sbírce kultur řas a sinic na Botanickém ústavu AVČR v Třeboni.

2. Kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že ío obsahuje inhibitor acetylcholinesterasy o strukturním vzorci

3. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 2, vyznačující se

15 t í m , že se extrahuje z biomasy sinice kmene Nostoc sp. Lukešová 27/97 organickým rozpouštědlem a po převedení do jiného vhodného rozpouštědla se vysráží přídavkem nadbytku alifatického uhlovodíku.

4. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 3, vyznačující se

20 tím, že jako extrakční rozpouštědlo se použije methanol.

5. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 3, vyznačující se tím, že jako rozpouštědlo, ze kterého se provádí srážení se použije aceton.

25

6. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 3, vyznačující se t í m , že alifatický uhlovodík je hexan.

7. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároků 3, 4, 5, 6, vyznačující se tí m , že vysrážený surový inhibitor acetylcholinesterasy se chromatograficky čistí na poly30 amidovém sorbentu směsí voda-alkohol, potom na silikagelu směsí keton-alifatický uhlovodík a nakonec HPLC chromatografií na reverzní fázi směsí voda-organické rozpouštědlo jako mobilní fáze.

8. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 7, vyznačující se

35 t í m , že alkohol jako složka mobilní fáze pro chromatografii na polyamidu je methanol.

9. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 8, vyznačující se t í m , že pro chromatografii na polyamidu je poměr methanokvoda 7:3 (obj.).

40

10. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 7, vyznačující se t í m , že v mobilní fázi pro chromatografii na silikagelu je alifatickým uhlovodíkem hexan a jako keton je použit aceton.

-4CZ 299567 B6

11. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 10, vyznačující se t í m , že pro chromatografií na silikagelu je směs acetonu a hexanu v poměru 5:4 (obj.).

12. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 7, vyznačující se 5 t í m , že reverzní fáze je silikagel s navázanými oktadecylovými řetězci (C_]8).

13. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 7, vyznačující se t í m , že organické rozpouštědlo pro HPLC chromatografii je acetonitril.