MXPA02010109A - Metodos para produccion de ansamitocina. - Google Patents

Abstract

Se describen metodos de purificacion mejorados para ansamitocinas.

Description

MÉTODOS PARA PRODUCCIÓN DE ANSAMITOC1NA CAMPO DE LA INVENCIÓN ' Esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de ansamitocinas, en particular ansamitocinas que pueden transformarse en maitansinol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los fármacos maitansinoides altamente citotóxicos y su uso terapéutico se han descrito en la patente de E.U.A. No. 5,208,020. Estos fármacos pueden prepararse a partir de precursores de ansamitocina producidos mediante la fermentación de microorganismos tales como Actinosynnema. Bajo las condiciones de cultivo definidas, Actinosynnema spp. tal como Actinosynnema pretiosum produce un número de ansamitocinas relacionadas. El producto principal es ansamitocina P-3 con una porción ísobutirilo en ía posición C-3. Otras ansamitocinas que difieren únicamente en la cadena lateral de acilo C-3 se producen como componentes menores, P-1 (porción etionilo), P-2 (porción propionilo), P-3' (porción butirilo), P-4 (porción isovalerilo) y P-4' (porción valerilo). Todos estos compuestos pueden sufrir división reductiva para producir un producto común, maitansinol (forma P-0).

Además, un número de otras ansámitocinas se producen a bajos niveles, que se modifican en otros sitios en la molécula (hidroxiladas o n-demetiladas). Estas no producen la P-O deseada en desacilación. Los procedimientos para la producción de ansamitocina P-3 a partir de Actinosynnema spp se han descrito en la patente de E.U.A. Nos. 4,162,940; 4,228,239; 4,356,265; y 4,450,234. En general, estos métodos requieren añadir un auxiliar de filtro y un solvente miscible en agua a todo el caldo de fermentación, removiendo sólidos y extrayendo la fracción acuosa con un solvente inmiscible en agua, concentrando y precipitando con éter de petróleo, purificando el precipitado utilizando cromatografía de sílice, y cristalizando seguido por cromatografía adicional o re-cristalización. Procedimientos alternativos utilizan adsorción de Diaion HP-10 en lugar de cromatografía de sílice seguido por extracción de solvente adicional y cristalización. Estos procedimientos pueden utilizarse para ganar producciones aceptables de ansamitocina P-3, pero los métodos implican un gran número de etapas que introducen limitaciones en las operaciones de producción a gran escala, particularmente debido a la naturaleza extremadamente tóxica de los compuestos de ansamitocina y la necesidad de asegurar la seguridad de los operadores humanos de los procedimientos. De este modo, existe una necesidad de tener un procedimiento alternativo seguro disponible, utilizando menos etapas pero más confinadas contenidas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención es un método para preparar ansamitocinas purificadas que comprenden los pasos de: a. cultivar un microorganismo que produce ansamitocina en un medio de cultivo líquido; b. tratar el medio de cultivo para facilitar la extracción de solvente de las ansamitocinas; c. extraer las ansamitocinas del medio de cultivo con un solvente de hidrocarburo aromático; e. concentrar las ansamitocinas extraídas; y f. purificar las ansamitocinas mediante cristalización. „ Otro aspecto de la presente invención es un método para preparar ansamitocinas purificadas que comprende los pasos de: a. cultivar un microorganismo que produce ansamitocina en un medio de cultivo líquido; b. extraer ansamitocinas del medio de cultivo con un solvente de hidrocarburo aromático; c. concentrar las ansamitocinas extraídas; y d. purificar las ansamitocinas mediante cristalización.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones, incluyendo más no limitándose a patentes y solicitudes de patente, citadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. Se proveen métodos para preparar ansamitocinas purificadas sin un paso de filtración. Los métodos comprenden los pasos de cultivar un microorganismo que produce ansamitocina en un medio de cultivo líquido, tratar el medio de cultivo para liberar ansamitocinas del microorganismo en el medio de cultivo facilitando con ello la extracción de solvente, extrayendo las ansamitocinas del medio de cultivo tratado, con un solvente de hidrocarburo aromático, concentrando las ansamitocinas extraídas, y purificando las ansamitocinas mediante cristalización. Alternativamente, el paso de tratamiento puede omitirse. Las ansamitocinas purificadas pueden reducirse a maitansinol e incluir ansamitocina P-3, P-1, P-2, P-3', P-4 y P-4'. Las ansamitocinas purificadas contienen únicamente muy bajos niveles de ansamitocinas no deseadas con modificaciones en otros sitios en la molécula. Preferiblemente, el microorganismo que produce ansamítocina es Actinosynnema spp. Se prefiere en particular la Actinosynnema pretiosum ATCC 31565. También se prefiere en particular Actinosynnema pretiosum ATCC 31281. Los microorganismos pueden crecer mediante técnicas de cultivo de fermentación bien conocidas por los expertos en la técnica como las que se describen en la patente de E.U.A. No. 4,450,234. Una modalidad del método de la invención utiliza tratamiento del microorganismo para ayudar a liberar las ansamitocinas intracelulares y haciendo a las ansamitocinas asociadas a células más dóciles a la extracción de solvente. Métodos de tratamiento ejemplares incluyen tratamiento con sonido, presión incrementada o temperatura incrementada. Preferiblemente, el tratamiento es un tratamiento con calor. El tratamiento con calor puede realizarse de alrededor de 60°C a aproximadamente 80°C. Preferiblemente, el paso de tratamiento con calor se realiza a alrededor de 75°C lo cual elimina al microorganismo y facilita la extracción de solvente de ansamitocinas. En una modalidad alternativa, ningún paso de tratamiento se utiliza antes de la extracción ya que aproximadamente 60% de las ansamitocinas totales pueden encontrarse en el medio de cultivo. Las ansamitocinas pueden extraerse del medio de cultivo con el uso de solventes de hidrocarburos aromáticos. Los hidrocarburos aromáticos tienen una selectividad particular para las ansamitocinas sobre otros constituyentes de caldo, que asegura que se requieran únicamente procedimientos simples corriente abajo para aislar el producto puro. Preferiblemente, el solvente de hidrocarburo aromático es tolueno o xileno. Se prefiere en particular el tolueno ya que es más dócil a la evaporación a baja temperatura. Las propiedades del tolueno y xileno son tales que el solvente y las capas acuosas se separan fácilmente bajo gravedad sin la necesidad de separación mecánica y de este modo se logran una contención superior del procedimiento y seguridad del operador incrementada. La extracción puede realizarse de alrededor de 20°C a aproximadamente 60°C. Preferiblemente, la extracción se realiza a alrededor de 45°C. El pH de la solución acuosa antes de la extracción debe encontrarse en la escala de 3 a 9. Preferiblemente el pH es casi neutral, es decir PH 6 a 8. En general, un volumen equivalente de solvente a caldo entero (1:1) se prefiere para la extracción. La relación alternativa que oscila de 2:1 a 1:4 también puede utilizarse. Las soluciones generalmente se mezclan lentamente con agitación y la mezcla se agita hasta que alrededor de >80 de las ansamitocinas se hayan extraído en la capa orgánica. Preferiblemente la mezcla se deja precipitar bajo gravedad a una temperatura entre 15°C y 50°C. La temperatura preferida de precipitación es de alrededor de 45°C. La capa orgánica se remueve, y la concentración del extracto mediante reducción de volumen del solvente puede llevarse a cabo in vacuo o mediante otros métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Después de la reducción de volumen, el extracto concentrado puede disolverse opcionalmente en un solvente polar tal como metanol, y clarificarse utilizando un filtro de membrana tal como PTFE, o un filtro de profundidad tal como sílice o alúmina. La cristalización se utiliza para purificar las ansamitocinas deseadas, particularmente P-3, al reducir los niveles de ansamitocinas no deseadas. Una mezcla de solvente preferida para cristalización es acetato de etilo y heptano. Dicha cristalización se realiza en una manera convencional. Para ayudar a la disolución del sólido para cristalización, un pequeño volumen de metanol o solvente polar similar puede añadirse antes de la adición de acetato de etilo y posteriormente el tratamiento con grandes volúmenes de heptano, opcionalmente con agitación y enfriamiento para proporcionar el producto cristalizado. El producto puede recristalizarse después del mismo procedimiento. Alternativamente, antes de la cristalización, las ansamitocinas impuras extraídas del caldo de fermentación pueden purificarse utilizando gel de sílice, por ejemplo, al pasar una solución del extracto de solvente a través de un lecho de sílice. Los solventes utilizados para la cromatografía pueden ser tolueno y mezclas de tolueno-metanol. Otros solventes conocidos por los expertos en la técnica también pueden utilizarse. Las fracciones que contienen ansamitocina P-3 se agrupan y concentran bajo presión reducida. También se proveen métodos para análisis de las ansamitocinas mediante CLAR. La cuantificación de la ansamitocina P-3 y análisis de relaciones de ansamitocina se logran mediante los métodos. Estos métodos se emplean en los ejemplos que se establecen a continuación. La cuantificación de ansamitocina P-3 en caldo y muestras de i extracción puede determinarse en una columna C18 Waters Q Spherisorb S5 ODS2, 4.6 x 250 mm, con una columna de seguridad de 10 mm. La detección ? ultravioleta es a 252 nm y 205 nm. Una fase móvil ¡socrática de 1 ml/min 60% MeCN (0.5% TFA) en agua (0.5% TFA) y un volumen de inyección de 20 µl se utilizaron. El análisis de las relaciones de ansamitocina en muestras del procedimiento corriente abajo puede determinarse en una columna C8 Waters Symmetry Shield, 3.9 x 150 mm, sin columna de seguridad. La detección ultravioleta es a 252 nm y 205 nm. Una fase móvil de gradiente de 1 ml/min 35-45% MeCN (0.05% TFA) en agua (0.05% TFA) durante 30 minutos con reequilibrio de 10 minutos a 40°C y un volumen de inyección de 10 µl se utilizaron. El análisis de las relaciones de ansamitocina en fracciones de cromatografía y producto final pueden determinarse en una columna C18 Waters Symmetry Shield, 3.9 x 150 mm, sin columna de seguridad con un sistema de detección LC-MS, ionización de eiectroaspersión de presión atmosférica, modo del ion +vo. La detección de masa de voltaje con cono de 30V para identificar positivamente los picos se logra mediante EM de exploración total (exploración desde 600-700amu con quad 1). La fragmentación MS-MS para determinar la clase de ansamitocinas se lleva a cabo utilizando el mismo sistema de gradiente. Una fase móvil de gradiente de 1 ml/min 35-45% MeCN (0.05% TFA) en agua (0.05% TFA) durante 30 minutos con un re-equilibrio de 10 minutos a 40°C y un volumen de inyección de 10 µl se utilizan. La cuantificación de ansamitocina P-3 en corrientes de desperdicio y otras muestras de bajo nivel que requieren gran sensibilidad pueden determinarse en una columna C18 Waters Spherisorb S5 ODS2, 4.6 x 250 mm, con una columna de seguridad de 10 µl y el sistema de detección de ionización de electroaspersión de presión atmosférica LC-MS-MS, modo de ion +vo, voltaje con cono de 30V. Para la determinación del tipo estructural, los iones moleculares de las especies mayores se seleccionaron y los patrones de fragmentación observados fueron un ion 547 predominante que indica la N-metilado y un 533 que indica N-desmetilado. Una fase móvil ¡socrática de 1 ml/min 60% MeCN (0.05% TFA) en agua (0.05% TFA) y un volumen de inyección de 20 µl se utilizaron. El procedimiento de la invención puede utilizarse para elaborar agentes de unión a células/complejos de maitansinoides que son útiles como profármacos activados por tumores. Las ansamitocinas preparadas mediante el procedimiento de ¡a invención pueden sufrir división reductiva a maitansinol que puede utilizarse como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,208,020 para producir N-metil-L-alanina que contiene derivados de maitansinoide. Estos derivados entonces se conjugan a agentes de enlace celular, preferiblemente anticuerpos, por medio de varios enlazadores tales como un enlazador de disulfuro. Un agente de enlace celular ejemplar/complejo de maitansinoide puede prepararse mediante un procedimiento que comprende los siguientes pasos: (1) reducir las ansamitocinas preparadas mediante el procedimiento de la invención a maitansinol; (2) esterificar el maitansinol con derivados de N-metil-L-alanina para formar un éster maitansinoide que contiene disulfuro; (3) reducir el éster maitansinoide que contiene disulfuro preparado por medio del paso (2) a un maitansinoide que contiene tiol; (4) introducir grupos ditiopiridilo en un agente de enlace celular; y (5) unir el maitansinoide que contiene tiol producido por medio del paso (3) al agente de enlace celular de ditiopiridilo del paso (4) mediante un enlace de disulfuro. La presente invención se describirá ahora con relación a 10 ejemplos no limitantes específicos.

EJEMPLO 1 Extracción del caldo de cultivo de Actinosynnema pretiosum y purificación de ansamitocina -15 37 I de caldo entero que contiene la cepa de producción Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 (86.3 mg/l de título de ansamitocina P-3) se trataron con calor a 75°C durante 60 minutos para eliminar el microorganismo y facilitar la extracción de solvente de las ansamitocinas. 40 I 20 de tolueno se añadieron y la mezcla se calentó a 45°C. Las fases se agitaron de tal manera que un remolino de fase de toiueno superior fue llevado a la fase de caldo inferior pero sin emulsificación u homogeneización completa de las fases. La extracción se completó en 16 horas y la separación bajo gravedad en 2 horas. 39 I del tolueno que contiene 80 mg/L P-3 fueron recuperados mediante sifón, y se evaporaron utilizando un evaporador giratorio de 20 I (temperatura de baño 40-45°C, velocidad ~9L/hr). 11.2 g de aceite móvil, que contiene 3.1 gramos de P-3; 27.6% p/p) se generaron después de la evaporación. El extracto resultante se transfirió a un matraz mediante disolución en tolueno y re-evaporación (producción de etapa de extracción = 97%). El extracto se absorbió en 120 ml de tolueno y se cargó en una columna de sílice (Kieselgel 60, volumen del lecho 125 ml empacado en tolueno, 4 cm díam. X 10 cm) en 375 ml de tolueno (3 bv). La columna se lavó con 2bv de tolueno y posteriormente se eluyó con 4 x 2bv de MeOH al 2% en tolueno, seguido por 12 x 1bv de MeOH al 4% en tolueno. La columna se eluyó a 40 ml/min y se produjeron bandas apretadas de color. Las fracciones 7-10 que contienen la ansamitocina P-3 se expandieron y evaporaron para producir 3.2 gramos de sólido oleoso que contiene 2.5 gramos de P-3. Este material se analizó mediante LC-MS y MS-MS. En esta etapa el producto contenía 85.1% de ansamitocina P-3, y un total de 93.9% de las ansamitocinas deseadas. (Producción de la etapa de columna = 80.6%). El producto de la columna de sílice se absorbió en 200 ml de EtOAc calentado a 40°C. Heptano (200 ml) se añadió y la solución se enfrió.

La solución se sembró con 1 mg de cristales de P-3 puros (la cristalización también ocurrió espontáneamente en otros sitios en el matraz). Después de 4 horas a temperatura ambiente el sobrenadante se analizó mediante CLAR y 0.8 g de P-3 (30%) se determinaron para estar aún en solución. Heptano adicional se agregó (150 ml) y el matraz que se dejó durante 3 horas adicionales y se volvió a analizar. Esto indicó que 0.4 gramos de P-3 (16%) permanecieron en solución. El matraz se dejó durante la noche a 4°C. Un análisis subsecuente indicó que únicamente 70 mg de P-3 (3%) permanecieron en solución. Las soluciones madre se removieron mediante aspiración, utilizando un ensamble de línea de filtro sinterizado. Los cristales de aguja blancos se lavaron con 2 x 15 ml 1 :3 EtOAc:heptano. Los cristales se secaron in situ bajo vacío en un evaporador giratorio a 30°C durante 10 horas. 2.5 g de cristales se obtuvieron. (Producción de cristalización = 86%). El producto final contenía 86% de ansamitocina P-3, y un total de 98.4% de las ansamitocinas adiadas deseadas (P-1 , P-2, P-3, P-3', P-4, P-4').

EJEMPLO 2 Extracción del caldo de cultivo de Actinosynnema pretiosum y purificación de ansamitocina 1100 litros de todo el caldo que contiene la cepa de producción de Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 (75.1 mg/l de título de ansamitocina P-3, 82.6g P-3) se trataron mediante calor in situ a 75°C durante 60 minutos para eliminar el microorganismo y facilitar la extracción de solvente de las ansamitocinas. 77.6 g de P-3 permanecieron después del procedimiento de eliminación por calor. Un volumen igual de tolueno precalentado a 45°C se añadió y la mezcla se mantuvo a 45°C. Las fases se agitaron de tal manera que un remolino de fase de tolueno superior fue llevado a la fase de caldo inferior pero sin emulsificación u homogeneización completa de las fases. La extracción se llevó a cabo durante 45 horas, seguido por la separación bajo gravedad que ocurrió en 30 minutos. (Producción de etapa de extracción 90.3%). 1.127 I del extracto de tolueno, que contiene las ansamitocinas, se concentraron a 22 litros utilizando un evaporodor de película descendente (FFE). El concentrado se transfirió a un evaporador giratorio de 50 litros y se evaporó a un bajo volumen (velocidad de operación 14.6L/hr). El FFE se enjuagó con 2 x 20 I de tolueno y los enjuagues pasaron al evaporador para asegurar una trasferencia completa del producto. El concentrado se evaporó hasta sequedad.

El extracto seco se absorbió en 7.2 litros de metanol al 4% en tolueno y se cargó en una columna de sílice (Kieselgel 60, 4.8 I del volumen de lecho se empacó en metanol al 4% en tolueno 15.0 cm diam. x 27.0 cm, velocidad de carga 120 mL/min.). La columna se eluyó ¡socráticamente utilizando metanol al 4% en tolueno a una velocidad de flujo de 227-384 mL/min y se produjeron bandas apretadas de color. Las fracciones iniciales fueron un volumen del lecho; fracciones 3 a 6 se recolectaron como medios de volúmenes de lecho. Las fracciones se monitorearon mediante TLC (placas Kieselgel 60 F254, que se activaron en metanol al 5% en diclorometano, se visualizaron mediante rayos UV a 254 nm), y aquellas que contenían ansamitocinas se monitorearon mediante CLAR y LC-MS. La selección de fracción para cristalización se basó en el análisis de CLAR y LC-MS de las fracciones para optimizar la recuperación de la ansamitocina P-3 y reducir al mínimo las ansamitocinas no deseadas. Las fracciones 5 a 10 que contenían ansamitocina P-3 se expandieron y se evaporaron para producir un sólido que contenía 54.6 g de P-3. En esta etapa, el producto contenía 77.1 % de ansamitocina P-3, y un total de 96.1% de las ansamitocinas deseadas. (Producción de la etapa de columna = 92.5%). El producto de la columna de sílice se absorbió en 91 ml de metanol previamente calentado a 46°C, seguido por 546 ml de acetato etílico calentado a la misma temperatura. Las alícuotas adicionales de metanol se añadieron para ayudar a la disolución del sólido. Un total de 166 ml de metanol se agregaron a la mezcla. Heptano (100 ml) calentado a 50°C se añadió a la primera señal de nubosidad y posteriormente la solución se enfrió a temperatura ambiente a medida que comenzó la cristalización. Después de 4 horas, 1.324 ml de heptano adicionales (a temperatura ambiente) se añadieron. El sobrenadante se analizó mediante CLAR y 6.6 g de P-3 se determinaron para estar aún en solución. La mezcla se enfrió en hielo y alícuotas adicionales (de heptano (200 y 400 ml) se añadieron hasta que 3.9 g de P-3 (6.8%) permanecieron en la solución madre. La soluciones madre se removieron mediante aspiración, utilizando un ensamble de línea de filtro sinterizada. Los cristales se lavaron con 2 x 150 mi 1 :3 de acetato de etilo:heptano. Los cristales se secaron in situ en un evaporador giratorio, inicialmente a bajo vacío, seguido por alto vacío (1.0-1.3 mbar) a 30°C durante 88.5 horas. 76.4 g de cristales se obtuvieron. El producto final contenía 74.5% de ansamitocina P-3 (56. 9g) y un total de 97.8% de las ansamitocinas adiadas deseadas (producción total = 69%).

EJEMPLO 3 Cromatografía de sílice y cristalización de las ansamitocinas 1.008 I de caldo entero de Actinosynnema pretiosum con un título de 64.8 mg/l de ansamitocina P-3 se trataron mediante calor, se extrajo con tolueno y se evaporó esencialmente como se describió en el ejemplo 1.

El concentrado que contenía 34.5 g de ansamitocina P-3 se absorbió en 3 l de tolueno y se cargaron en una columna de sílice (Kieselgel 60, volumen de lecho 3.0 I, empacado en tolueno, 13.8 cm diam, x 16.6 cm). A ia columna se le colocó encima un lecho de 4 cm de arena. La columna se lavó con 5 I de tolueno, seguido por 20 I de MeOH al 2% en tolueno, que se recolectó como fracciones de 51. La columna posteriormente se eluyó con 20 I de MeOH al 4% en tolueno, que se recolectó como fracciones de 2.5 I. Las ansamítocinas se eluyeron en fracciones 9 a 15. La selección de fracción para cristalización se basó en análisis de CLAR y LC-MS de las fracciones para optimizar la recuperación de ansamitocina P-3 y reducir al mínimo las ansamitocinas no deseadas. Las fracciones 10 a 12 se expandieron y evaporaron hasta sequedad para producir un aceite que contiene 32.5 g de ansamitocina P-3. En esta etapa, el producto contenía 91.8% de ansamitocina P-3, y un total de 95.3% de la ansamitocinas aciladas deseadas. (Producción de etapa de columna = 94.2%). El concentrado a partir de las fracciones de sílice aumentadas, se calentó en un baño con agua a 50°C y se disolvió en un volumen mínimo de metanol caliente/acetato de etilo (50°C). 60 ml de metanol se añadieron inicialmente, seguido por adición lenta de 300 mi de acetato de etilo. 20 ml adicionales de metanol caliente se añadieron en cuyo punto el concentrado se disolvió por completo. 200 ml de heptano caliente (50°C) se añadieron y la solución de cristalización se removió del baño de agua. La cristalización comenzó, y se agregó heptano adicional en 200 ml de alícuotas hasta que un volumen total de 800 mL se añadieron. La mezcla se enfrío en un baño con hielo durante 18 horas. La cristalización se monitoreó mediante análisis de CLAR de las soluciones madre. A las 18 horas 6.3% de ansamitocina P-3 permanecieron en las soluciones madre. 200 ml adicionales de heptano se añadieron y la mezcla se enfrió durante 5 horas adicionales. El análisis de CLAR indicó que 4.0% de ansamitocinas permanecieron en las soluciones madre. Los cristales se recuperaron mediante aspiración de las soluciones madre color café obscuro. Los cristales se lavaron 3 veces con 50 ml de heptano:acetato de etilo, 3:1 y se secaron bajo vacío (0.8 mBar) durante la noche. Los cristales fueron agujas uniformes, finas, color hueso que contenían 28.2 g de ansamitocina P-3. (Recuperación de etapa de cristalización = 86.9%). El producto final contenía 93.1% de ansamitocina P-3 y un total de 98.4% de ansamitocinas aciladas deseadas.

EJEMPLO 4 Purificación y cristalización de ansamitocinas a partir de extracto de tolueno 1.001 I de caldo entero de Actinosynnema pretiosum con un título de 74.5 mg/l de ansamitocina P-3 se trataron mediante calor, se extrajeron con tolueno y se evaporaron esencialmente como se describe en el ejemplo 1 para dar 9.5 I de extracto concentrado que contiene 54.7 g de ansamitocina P-3. El concentrado se calentó a 45°C y 14.5 I de heptano se añadieron durante 33 minutos para precipitar las ansamitocinas. La mezcla se enfrió en hielo. 5 I adicionales de heptano se añadieron y la mezcla se dejó precipitar durante la noche. La solución madre se removió mediante aspiración y el precipitado se lavó con 10 I de tolueno:heptano, 1 :1. El análisis de CLAR indicó que la solución madre contenía 6.5% de ansamitocina P-3, y el lavado contenía 1.8% de P-3. El precipitado se disolvió en 2 I de metanol y se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras. La solución de metanol se evaporó hasta sequedad y se volvió a disolver en 85 ml de metanol a 50°C. 510 ml de acetato de etilo se añadieron a la solución seguido por 200 ml de heptano. La mezcla se enfrió a ambiente y 900 ml adicionales de heptano se añadieron lentamente a mediada que comenzaba la cristalización. 4.14 g de ansamitocina P-3 permanecieron en la solución madre. 400 ml de heptano adicionales se añadieron y la mezcla se enfrió en hielo. 2.7 g de ansamitocina P-3 permanecieron en la solución madre. La solución madre se removió mediante aspiración y los cristales se disolvieron en 110 ml de metanol y 520 ml de acetato de etilo a 50°C. Heptano se añadió en dos soluciones de 75 ml, la mezcla se enfrió a ambiente y se agregaron 900 ml adicionales. 400 ml adicionales de heptano se añadieron y la mezcla se enfrió en hielo y se dejó durante la noche para cristalización. El análisis de CLAR indicó que 2.3 g de ansamitocina P-3 permanecieron en la solución madre. La solución madre se removió mediante aspiración y los cristales de lavaron con heptano:acetato de etilo, 3:1 y se secaron al vacío (0.6 mBar) durante ia noche. 47.8 g de cristales contenían 84.3% de ansamitocina P-3, y un total de 97.0% de ansamitocinas aciladas deseadas.

EJEMPLO 5 Extracción del caldo de cultivo de Actinosynnema pretosium con x?leno y purificación de ansamitocina 220 ml de Actinosynnema pretiosum tratado por calor, con un título de 44 ug/ml de ansamitocina P-3, se colaron en un baño con agua a 45°C y un volumen igual de xileno se añadió. Las fases se mezclaron de manera que un remolino de xileno fue llevado a la fase de caldo inferior pero sin la formación de una emulsión. Después de 20 horas, 64% de ansamitocina P-3 se extrajo en la fase de xileno. La mezcla se separó bajo gravedad y 170 ml de xileno se removieron. El extracto de xileno se evaporó hasta sequedad. El extracto de xileno se purificó utilizando cromatografía de sílice. El extracto se disolvió en 2 mi de metanol al 4% en tolueno y se cargó y se eluyó utilizando la misma mezcla de solvente. Las fracciones (0.5 ml) se recolectaron y analizaron mediante TLC (placas Kieselgel 60 F254 que se corrieron en diclorometano: metanol 20:1). Las fracciones que contienen ansamitocina P-3 se cristalizaron utilizando el procedimiento descrito en ejemplos anteriores. El producto cristalino fue de calidad comparable en términos de color y pureza con el producido mediante extracción de tolueno de caldo de fermentación. La presente invención puede modalizarse en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o atributos esenciales de la misma, y, por lo tanto, debe hacerse referencia a las reivindicaciones anexas, antes que a la especificación anterior, como lo indica el alcance de la invención.

Claims (16)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para preparar ansamitocinas purificadas que comprende ios pasos de: a) cultivar un microorganismo que produce ansamitocinas en un medio de cultivo líquido; b) tratar el medio de cultivo para facilitar la extracción de solvente de ansamitocinas; c) extraer las ansamitocinas del medio de cultivo con un solvente de hidrocarburo aromático; d) concentrar las ansamitocinas extraídas; y e) purificar las ansamitocinas mediante cristalización.

2.- Un método para preparar ansamitocinas purificadas que comprende los pasos de: a) cultivar un microorganismo que produce ansamitocinas en un medio de cultivo líquido; b) extraer ansamitocinas del medio de cultivo con un solvente de hidrocarburo aromático; c) concentrar las ansamitocinas extraídas; y d) purificar las ansamitocinas mediante cristalización

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el microorganismo que produce ansamitocina es Actinosynnema spp.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque Actinosynnema spp. es Actinosynnema pretiosum ATCC 31565.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque Actinosynnema spp. es Actinosynnema pretiosum ATCC 31281.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el tratamiento es calentar a alrededor de 75°C.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el solvente es tolueno.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la relación de tolueno a medio de cultivo tratado con calor es de alrededor de 1 :1.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la extracción es a alrededor de 45°C.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el solvente es xileno.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la relación de xileno a medio de cultivo tratado con calor es de alrededor de 1 :1.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la extracción es a alrededor de 45°C.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque las ansamitocinas comprenden ansamitocinas aciladas que pueden sufrir división reductiva para formar maitansinol.

14.- Ansamitocinas preparadas mediante el procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 ó 2.

15.- Un complejo de maitansinoide de agente de unión a células preparado al convertir las ansamitocinas preparadas mediante el procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 en el complejo de maitansinoide de agente de unión a células.

16.- El complejo de maitansinoide de agente de unión a células de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el agente de enlace celular es un anticuerpo.