CZ20023356A3

CZ20023356A3 - Způsob přípravy ansamitocinu

Info

Publication number: CZ20023356A3
Application number: CZ20023356A
Authority: CZ
Inventors: Mark Fulston; Anna Stefanska; Jan Thirkettle
Original assignee: Smithkline Beecham Plc
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2003-04-16
Also published as: US20020015984A1; CN1432068A; JP4832697B2; JP2003530114A; NO20024893L; CA2406188A1; DE60121150T2; US6573074B2; NZ521868A; AU2001293335B2; HUP0300473A2; ATE331804T1; EP1272653B1; MXPA02010109A; AR028002A1; NO20024893D0; ES2266243T3; EP1272653A2; PL365577A1; WO2001077360A3

Description

Tento vynález se týká způsobů přípravy ansamitocinů, obzvlášrě ansamitocinů, které mohou týt převedeny na maytansinol.

Dosavadní stav techniky

Vysoce cytotoxická maytansinoidní léčiva a jejich terapeutické použití je popsáno v US patentu č. 5 208 C20. Tato léčiva mohou být připravena z ansamirocinových prekurzorů vyrobených fermentací mikroorganismů jako jsou Actinosynnema.

Za definovaných kultivačních podmínek Actinosynnema spp., jako je Actinosynnema pretiosum, produkují řadu příbuzných ansamitocinů. Hlavním produktem je ansamitocin P-3 s isobutyrylovou částí v poloze C-3. Další ansamitociny, které se liší pouze v acylovém bočním řetězci na C-3, jsou produkovány jako menšinové složky, P-l (ethionylová část), P-2 (propionylová část), P-3' (butyrylová část), P-4 (isovalerylová část) a P-4' (valerylc-vá část). Všechny tyto sloučeniny mohou podstoupit redukční štěpení k vytvoření společného produktu, maytansinolu (forma P-0). Navíc jsou v nízkých hladinách vytvářeny četné další ansamitociny, které jsou modifikovány na jiných místech molekuly (hydroxylované nebo n-demethylované). Tyto ansamitociny neposkytují požadovaný P-0 při deacylaci.

Způsoby pro přípravu ansamitocinu P-3 z Actinosynnema spp. jsou popsány v US patentech čísel 4 162 940, 4 228 239,

356 265 a 4 450 234. Obecně tyto způsoby vyžaduji přidání filtrační pomocné látky a s vodou mísitelného rozpouštědla k celému fermentačnímu bujónu, odstraňování tuhých látek a extrakci vodné frakce rozpouštědlem nemísitelným s vodou, odpaření a vysrážení petroletherem, vyčištění sraženiny za použití chromatografie na oxidu křemičitém a krystalizaci následovanou další chromatografii nebo rekrystalizaci. Alrernarivní způsoby využívají adsorpci na Diaion HP-1C místo chromatografie na oxidu křemičitém následovanou další extrakcí rozpouštědlem a krystalizaci.

Tyto způsoby mohou být použity k získání přijatelných výtěžku ansamitocínu P-3, ale tyto způsoby zahrnuji velký počet stupňů, které zavádějí omezení pro operace ve velkém měřítku, obzvláště kvůli extrémně toxické povaze ansamitocinových sloučenin a nezbytnosti zajištění bezpečnosti lidské obsluhy provádějící způsob. Existuje tedy potřeba mít dostupnou bezpečnější alternativní proceduru využívající méně stupňů, které jsou snáze zvládnutelné.

Podstata vynálezu

Jedním aspektem předloženého vynálezu je způsob přípravy vyčištěných ansamitocinů zahrnující kroky:

a) kultivace mikroorganismu produkujícího ansamitocin v kapalném kultivačním médiu,

b) ošetření kultivačního média k usnadnění extrakce ansamitocinů rozpouštědlem,

c) extrakce ansamitocinů z kultivačního média aromatickým uhlovodíkovým rozpouštědlem,

d) odpaření extrahovaných ansamitocinů a

e) vyčištění ansamitocinů krystalizaci.

Dalším aspektem předloženého vynálezu je způsob přípravy vyčištěných ansamitocinů zahrnující kroky:

b) extrakce ansamitocinů z kultivačního média aromatickým uhlovodíkovým rozpouštědlem,

c) odpaření extrahovaných ansamitocinů a

d) vyčištění ansamitocinů krystalizací.

Detailní popis vynálezu

Všechny publikace včetně patentů a patentových přihlášek, výčet tím však není omezen, citované v tomto popise jsou zde zahrnuty formou odkazu, jako kdyby zde byly plně uvedeny.

Jsou poskytnuty způsoby přípravy čištěných ansamitocinů bez filtračního kroku. Tyto způsoby zahrnují kroky kultivace mikroorganismů produkujících ansamitocin v kapalném kultivačním médiu, ošetření kultivačního média k uvolnění ansamitocinů z mikroorganismů do kultivačního média, čímž se usnadní extrakce rozpouštědlem, extrakce ansamitocinů z ošetřeného kultivačního média aromatickým, uhlovodíkovým rozpouštědlem, odpaření extrahovaných ansamitocinů a vyčištění ansamitocinů krystalizací. Alternativně se může vynechat krok ošetření.

Vyčištěné ansamitociny mohou být redukovány na maytansincl a obsahovat ansamitocin P-3, P-l, P-2, P-3', P-4 a P-4'. Vyčištěné ansamitociny obsahují pouze velmi nízké hladiny nežádoucích ansamitocinů s modifikacemi na jiných • · · · · ·

místech molekuly. Výhodně je mikroorganismem produkujícím ansamitccin Actinosynnema spp. Obzvláště výhodný je Actinosynnema pretiosum ATCC 31565. Také obzvláště výhodný je Actinosynnema pretiosum ATCC 31281. Tyto mikroorganismy mohou být pěstovány technikami fermentační kultury odborníkovi v oboru dooře známé, jako jsou techniky popsané v US patentu č. 4 450 234.

Jedno ztělesnění způsobu podle tohoto vynálezu využívá ošeoření mikroorganismu k nápomoci uvolnění intracelulárních ansamítocínů a uzpůsobení ansamitocinů spojených s buňkou k snazší extrakci rozpouštědlem.. Příkladné způsoby ošeoření zahrnují vystavení působení ultrazvuku, zvýšení olaku nebo zvýšení teploty. Výhodně je ošetřením tepelné ošeoření. Tepelné ošetření se může provádět při teplotě cd asi 60 do asi 80 °C. Výhodně se krok ošetření teplem provádí při teplotě okolo 75 °C, která mikroorganismus zabíjí a usnadňuje extrakci ansamitocinů rozpouštědlem.

V alternativním ztělesnění se před extrakcí nepoužije žádný ošetřovací krok, protože přibližně 60 % celkového množství ansamitocinů může být nalezeno v kultivační médiu.

Ansamitociny mohou být extrahovány z kultivačního média za použití aromatických uhlovodíkových rozpouštědel. Aromatické uhlovodíky mají obzvláštní selektivitu vůči ansamítocinům ve srovnání s dalšími složkami bujónu, což zajišťuje, že jsou v následných krocích způsobu vyžadovány pouze jednoduché způsoby k isolaci čistého produktu. Výhodně je aromatickým uhlovodíkovým rozpouštědlem toluen nebo xylen. Obzvláště výhodný je toluen, protože je vhodnější pro odpařování při nízké teplotě. Vlastnosti toluenu a xylenu jsou takové, že vrstva rozpouštědla a vodná vrstva se snadno oddělí působením gravitace bez potřeby mechanického oddělení a tedy • · se dosáhne vyšší uzavřenosti způsobu a zvýšené bezpečnosti obsluhy. Extrakce se může provádět při teplotě od asi 20 do asi 60 ⁵C. Výhodně se extrakce provádí při teplotě okolo 45 °C. Hodnota pH vodného roztoku před extrakcí by měla být v rozmezí od 3 do 9. Výhodně je hodnota pE v oblasti blízké neutralitě, tj. od 6 do 8.

Obecně je pro extrakcí výhodný jeden ekvivalent rozpouštědla k celému bujónu (1 : 1). Mohou být také použity alternativní poměry v rozmezí od 2 : 1 do 1 : 4. Roztoky se obecně pomalu mísí za míchání a směs se míchá až je extrahováno okolo více než 80 % ansamitocinů do organické vrstvy. Výhodně se směs nechá usadit pod vlivem gravitace při teplotě od 15 do 50 °C. Výhodná teplota pro usazeni je okolo 45 °C.

Organická vrstva se odstraní a koncentrace extraktu sníženého objemu rozpouštědla se může provádět ve vakuu nebo jinými způsoby odborníkovi v oboru dobře známými. Po snížení objemu se koncentrovaný extrakt může případně rozpustit v polárním rozpouštědle, jako je methanol, a vyčeřit za použití membránového filtru, jako je PTFE, nebo hloubkového filtru, jako je oxid křemičitý nebo cxid hlinitý.

K vyčištění požadovaných ansamitocinů, obzvláště P-3 se použije krystalizace, kterou se sníží nežádoucí ansamitociny. Výhodnou směsí rozpouštědel pro krystalizaci je ethylacetár a heptan. Taková krystalizace se provádí obvyklým způsobem. K nápomoci rozpouštění tuhé látky pro krystalizaci může být přidáno malé množství methanolu nebo podobného polárního rozpouštědla před přidáním ethyl-acetátu a následným zpracováním většími objemy heptanu, případně za míchání a • · ·· ···· • » · • · • « • · « • · · » » · »· · · · · chlazení k získání krystalického produktu. Produkt se může rekrystalovat stejným způsobem.

Alternativně, před krystalizací, nečisté ansamitocin extrahované z fermentačního bujónu mohou být vyčištěny za použizí silikagelu, např. průchodem roztoku extraktu v rozpouštědle přes lože oxidu křemičitého. Rozpouštědly použitými pro chromatografií mohou být toluen a směsi toluen-methanol. Mohou býz také použita další rozpouštědla známá odborníkovi v oboru. Frakce obsahující ansamitocin P-3 se shromáždí a odpaří za sníženého tlaku.

Jsou také poskytnuty způsoby analýzy ansamitocir.ů pomocí HPLC. Těmito způsoby se dosáhne kvantifikace ansamitocinu P-3 a analýza poměrů ansamitocinů. Tyto způsoby jsou použity v příkladech uvedených dále.

Kvantifikace ansamitocinů P-3 v bujónu a extrakčních vzorcích může být stanovena na sloupci C18 Waters Q Spherisorb S5 ODS2, 4, 6 x 250 mm, s lOmm vodícími sloupcem. JV detekce se provede pří 252 a 205 nm. Použije se isokratická mobilní fáze 1 ml/min 60% MeCN (0,05% kyselina trifluoroctové) ve vodě (0,05% kyselina trifluoroctové) a 20μ1 injekčním objemem.

Analýza poměrů ansamitocinů v následných vzorcích způsobu může být stanovena na sloupci C8 Waters Symmetry Shield, 3,9 x 150 mm, bez vodícího sloupce. UV detekce se provede při 252 a 205 nm. Použije se gradient mobilní fáze 1 ml/min 35 až 45% MeCN (0,05% kyselina trifluoroctové) ve vodě (0,05% kyselina trifluoroctové) během 30 minut s 10-minurovým znovuvyvážením při teplotě 40 °C a 10μ1 injekčním objemem.

Analýza poměrů ansamitocinů v chromatografických • g • · o · ♦ • 9 · · • * · · · « » * · ··· » · · · · · frakcích a konečném produktu může být stanovena na sloupci C8 Waters Symmetry Shield, 3,9 x 150 mm, bez vodícího sloupce s detekčním systémem LC-MS, elektrosprayové ionisaci při atmosférickém tlaku a iontovém modu +ve. Plným skaném MS (skaň od 600 do 700 amu s quad 1) se dosáhne hmotnostní detekce s konickým napětím 30 V k positivní identifikaci píků. Za použití stejného gradientového systému se provede MS-MS fragmentace ke stanovení třídy ansamitocinu. Použije se gradient mobilní fáze 1 ml/min 35 až 45% MeCN (0,05% kyselina trifluoroctová) ve vodě (0,05% kyselina trifluoroctová) během 30 minut s 10-minutovým znovuvyvážením při teplotě 40 °C a lOul injekčním objemem.

Kvantifikace ansamitocinu P-3 v odpadních proudech a dalších nízkohladinových vzorcích vyžadující vysokou citlivost mohou být stanoveny na sloupci C18 Waters Q Spherisorb S5 ODS2, 4,6 x 250 mm, s lOmm vodícím sloupcem a ionizačním detekčním systémem elektrospraje při atmosférickém tlaku LC-MS-MS, iontový modus +ve, konické napění 30 V. Pro stanovení strukturního typu se vyberou molekulární ionty hlavních druhů a pozorované fragmentační vzory jsou převážně 547 ion, což ukazuje na M-methylovaný typ a 533, což ukazuje na N-demethy-lovaný typ. Použije se isokratická mobilní fáze 1 ml/min 6C% MeCN (0,05% kyselina trifluoroctová) ve vodě (0,05% kyselina trifluoroctová) a 20μ1 injekčním objemem.

Způsob podle tohoto vynálezu může být použit k přípravě komplexů na buňky se vážící činidlo/maytansinoíd, které jsou užitečné jako tumorem aktivované prekurzory léčiv. Ansamitociny připravené způsobem podle tohoto vynálezu mohou podstoupit redukční štěpení na maytansinol, který může být použit podle popisu v US patentu č. 5 208 020 k vytvoření maytansinoidních derivátů obsahujících N-methyl—L-alanin. Tyto • · • 4 4 · • 9

4

4 ·

deriváty se poté konjugují s činidly vážícími se na buňku, výhodně protilátkami, prostřednictvím různých linkerů, jako je disulfidový můstek.

Příkladný komplex na buňky se vážící činidlo/maytansincid může být připraven způsobem zahrnujícím následující kroky:

1) redukce ansamitocinů připravených způsobem podle tohoto vynálezu na maytansinol,

2/ esterifikace maytansinolu deriváty N-methyl-L-alaninu k vytvoření maytansinoidního esteru obsahujícího disulfidovou vazbu,

3) redukce maytansinoidního esteru obsahujícího disulfidovou vazbu připraveného v kroku 2) na maytansinoid obsahující thiol,

4) zavedení dithiopyridylových skupin do činidla vážícího se na buňku a

5} spojení maytansínoidu obsahujícího thiol připraveného v kroku 3 na dithíopyridylové činidlo vážící se na buňku z kroku 4 disulfidovým můstkem.

Předložený vynález bude nyní popsán s odkazem na následující specifické, neomezující příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Extrakce kultivačního bujónu Actinosynnema pretiosum a čištění ansamitocinů • · 9 9 9 9 9

9 β · · · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

Ο 9 9 9 9 9 · 9 9

999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·9 9 9 9 9 litrů celého bujónu obsahujícího produkční kmen Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 (ansamitocin P-3 titr 86,3 mg/litr) se tepelně ošetřuje in sítu pří teplotě 75 °C 60 minut k usmrcení mikroorganismů a k usnadnění extrakce ansamitocinů rozpouštědlem. Přidá se 40 litrů toluenu a směs se ohřeje na teplotu 45 °C. Fáze se promíchají tak, že vír horní toluenové fáze se stáhne do spodní fáze bujónu, ale bez emulgace nebo úplné homogenizace fází. Extrakce se dokonči během 16 hodin a rozdělení gravitací během 2 hodin.

litrů toluenu obsahujícího 80 mg/litr P-3 se získá násoskou a odpaří se za použití rotačního odpařovače o objemu 20 litrů (teplota lázně je od 40 do 45 °C, rychlost přibližně 9 litrů za hodinu). Po odpaření se získá 11,2 g mobilního oleje, který obsahuje 3,1 g P-3, 27,6 % hmotnostního. Výsledný extrakt se přenese do nádoby rozpuštěním v toluenu a zncvuodpařením. (Výtěžek extrakčního stupně =97 %) .

Extrakt se vyjme 120 ml toluenu a vnese se na sloupec oxidu křemičitého (Kieselgel 60, 125 ml objemu lóže vyplněného toluenem, 4cm průměr x 10 cm) ve 375 ml toluenu (3 objem lóže) . Sloupec se promyje 2 objemy lóže toluenu a poté se eluuje 4x2 objemy lóže 2% methanolu v toluenu, náslecuje 12. x 1 objem lóže 4% methanolu v toluenu. Sloupec se eluuje rychlostí 40 ml/min a vytvoří se pevné svazky barev. Frakce 7 až 10 obsahující ansamitocin P-3 se spojí a odpaří k získání 3,2 g olejové tuhé látky obsahující 2,5 g P-3. Tento materiál se analyzuje LC-MS a MS-MS.

V tomto stupni obsahuje produkt 85,1 % ansamitocinů P-3 a celkem 93,9 % požadovaných ansamitocinů (Výtěžek stupně na sloupci = 80,6 %).

9 9 99 9 • 9 99 9 9

Produkt ze sloupce oxidu křemičitého se vyjme 2C0 ml ethyl-acetázu ohřátého na 40 °C. Přidá se heptan (200 ml) a roztok se nechá vychladnout. Roztok se očkuje 1 mg čistých krystalu P-3 (krystalizace se také spontánně objeví v jiných místech nádoby). Po 4 hodinách při teplotě místnosti se supernatant analyzuje pomocí HPLC a stanoví se, že v roztoku je stále 0,3 g P-3 (30 %). Přidá se další heptan (150 ml) a nádoba se nechá další 3 hodiny a znovu se analyzuje. Analýza ukáže, že v roztoku zůstává 0,4 g P-3 (16 %) . Nádoba se nechá stát přes noc při teplotě 4 °C. Následná analýza ukáže, že v roztoku zůstává pouze 70 mg P-3 (3 %). Matečné kapaliny se odsají za použití linkové sestavy slinutého filtru.. Bílé jehličkovité krystaly se promyj1 2 x 15 ml směsi ethylacetát:heptan 1:3. Krystaly se 10 hodin vysoušejí in sítu ve vakuu na rotační odparce při teplotě 30 °C. Získá se 2,5 g krystalů. (Výtěžek krystalizace = 86 %).

Konečný produkt obsahuje 86 % ansamitocinu P-3 a. celkem 98,4 % požadovaných acylovaných ansamitocinu (P-l, P-2, P-3, P-3 ', P-4, P-4 ') .

Příklad 2

Extrakce kultivačního bujónu Actinosynnema pretiosum a čištění ansamitocinu

1100 litrů celého bujónu obsahujícího produkční kmen Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 (ansamitocin P-3 titr 75,1 mg/litr, 82,6 g P-3) se tepelně ošetřuje ín šitu při teplotě 75 °C 60 minut k usmrcení mikroorganismů a k usnadnění extrakce ansamitocinu rozpouštědlem. Po procesu tepelného usmrcení zůstane 77,6 g P-3. Přidá se stejný objem toluenu předem ohřátého na teplotu 45 °C a směs se udržuje při teplotě ·· ···· °C. Fáze se promíchají tak, že vír horní toluenové fáze se sráhne do spodní fáze bujónu, ale bez emulgace nebo úplné homogenizace fází. Extrakce se provádí 45 hodin, následuje rozdělení gravitací, které nastane během 30 minut. (Výtěžek extrakčního stupně = 90,3 %.)

1127 litrů toluenového extraktu obsahujícího ansamitociny se odpaří za použití odparky padajícího filmu (FFE) . Koncentrát se přenese do rotační odparky o objemu 50 litrů a odpaří se na malý objem (rychlost odpařování 14,6 litrů za hodinu). FFE se propláchne 2 x 20 litry toluenu a výplachv se přenesou do odparky k zajištění úplného přenosu produktu. Koncentrát se odpaří do sucha.

Suchý extrakt se vyjme 7,2 litry 4% merhanolu v toluenu a vnese se na sloupec oxidu křemičitého (Kieselgel 60, 4,8 litru objemu lóže vyplněného 4% methanolem v toluenu, 15,0 cm průměr x 27,0 cm, rychlost vnášení 120 ml/min). Sloupec se eluuje isokraticky za použití 4% methanolu v toluenu při rychlosti průtoku 227 až 384 ml/min a vytvoří se pevné svazky barev. Počáteční frakce jsou objemem jednoho lóže, frakce 3 až 6 se zachytí jako objemy poloviny lóže. Frakce se monitorují pomocí TLC (desky Kieselgel 60 F254, běh v 5% methanolu v dichlor-methanu, vizualizováno pomocí (JV při 254 nm) a frakce obsahující ansamitociny se monitorují pomoci HPLC a LCMS. Volba frakcí pro krystalizaci je založena na analýze frakcí pomocí HPLC a LC-MS k optimalizaci výtěžku P-3 a k. mini-malizaci nežádoucích ansamitocinů. Frakce 5 až 10 obsahující ansamitocin P-3 se spojí a odpaří k získání tuhé látky obsahující 54,6 g P-3. V tomto stupni obsahuje produkt 77,1 % ansamitocinů P-3 a celkem 96,1 % požadovaných ansamirocinů. (Výtěžek stupně na sloupci = 92,5 %) ..

·· ·· *» • · · * · · • · · ·

9 9 9 9

9 9 9

9 999 99 9999

Produkt ze sloupce oxidu křemičitého se vyjme 91 ml methanolu předem ohřátého na teplotu 46 °C, následuje 546 ml ethyl-acetátu ohřátého na stejnou teplotu. Přidají se další alikvoty merhanolu k usnadnění rozpouštění tuhé látky. Celkem se ke směsi přidá 166 ml methanolu. Přidá se heptan (100 ml) ohřátý na teplotu 50 °C při prvních známkách zakalení a poté se roztok nechá vychladnout na teplotu místnosti jak krystalizace započne. Po 4 hodinách se přidá dalších 1324 ml heptanu (při teplotě místnosti) . Supernatant se analyzuje pomocí HPLC a stanoví se, že v roztoku je stále 6,6 g P-3.

Směs se ochladí na ledu a přidávají se další alikvoty heptanu (200 a 4C0 ml) až v matečném roztoku zůstane 3,9 g P-3 (6,8

p. \

Ό j .

Matečné kapaliny se odsají za použití linkové sestav slinutého filtru. Krystaly se promyjí 2 x 150 ml směsi ethylacetát:heptan 1 : 3. Krystaly se 88,5 hodiny vysoušejí in šitu ve vakuu na rotační odparce při teplotě 30 °C za nízkého vakua následovaného vysokým vakuem (100 až 130 Pa). Získá se 76,4 q krystalů.

Konečný produkt obsahuje 74,5 % ansamitocinu P-3 (56,9 g) a celkem 97,8 % požadovaných acylovaných ansamitocinů. (Celkový výtěžek - 69 %).

Příklad 3

Chromatografie na oxidu křemičitém a krystalizace ansamitocinu

1008 litrů celého bujónu obsahujícího Actinosynnema pretiosum s titrem 64,8 mg/litr ansamitocinu P-3 se tepelně ošetřuje, extrahuje toluenem a odpaří v podstatě podle popisu v příkladu i.

·« ·99 9

9

999 · • 99 99 99 • 9 9 · · f · · • · 9 9 · • 9 9 9 9 9

9 9 9 9

99 999 9 ·· 99 9·

Koncentrát obsahující 34,5 g ansamitocinu P-3 se vyjme 3 litry toluenu a vloží se na sloupec oxidu křemičitého (Kieselgel 60, lóže o objemu 3,0 litru, vyplněné toluenem, 13,8cm průměr x 16,6 cm). Sloupec se vyloží 4cm ložem písku. Sloupec se promyje 5 litry toluenu, následuje' 20 litrů 2% methanolu v toluenu, které se zachytí jako 5-litrové frakce. Sloupec se poté eluuje 20 litry 4% methanolu v toluenu, zachycenými jako 2,5-litrové frakce. Ansamitociny se eluují ve frakcích 9 až 15. Volba frakcí pro krystalizaci je založena na analýze frakcí pomocí HPLC a LC-MS k optimalizaci výtěžku P-3 a k minimalizaci nežádoucích ansamitocinů. Frakce 10 až 12 se spojí a odpaří do sucha k získání oleje obsahujícího 32,5 g ansamitocinu P-3.

V tomto stupni obsahuje produkt 91,3 % ansamitocinu P-3 a celkem 95,3 % požadovaných ansamitocinů. (Výtěžek stupně na sloupci = 92,4 %).

Odparek ze spojených frakcí prošlých přes oxid křemičitý se ohřeje na vodné lázni na teplotu 50 °C a rozpustí se v minimálním objemu teplé směsi methanol/ethyl-acetát i 50 °C) . Na začátku se přidá 60 ml methanolu, následuje pomalé přidávání 300 ml ethyl-acetátu. Přidá se dalších 20 ml teplého methanolu, v kterémžto bodě se odparek úplně rozpustí. Přidá se 20C ml teplého heptanu (50 °C) a krystalizační roztok se odejme z vodné lázně. Započne krystalizace a přidává se další heptan ve 200ml alikvotech až se přidá celkový objem 800 ml. Směs se 18 hodin chladí na ledové lázni. Krystalizace se monitoruje pomocí HPLC analýzy matečných roztoků. Po 18 hodinách v matečném roztoku zůstává 6,3 % ansamitocinu P-3. Přidá se dalších 200 ml heptanu a směs se chladí dalších 5

• ···· • · · • · • · ·

hodin. Analýza HPLC ukáže, že v matečném roztoku zůstávají 4,0 % ansamitocínů.

Krystaly se získají odsátím tmavě hnědých matečných rcztckú. Krystaly se promyjí 3-krát 50 ml směsi heptan: ethy.1-acetát 3:1a vysouší se ve vakuu (80 Pa) přes noc. Krystaly jsou rovnoměrné, jemné bělavé jehličky obsahující 28,2 q ansamitocinu P-3. (Výtěžek krystalizačního kroku = 86,9 %).

Konečný produkt obsahuje 93,1 % ansamitocinu P-2 a celkem 98,4 % požadovaných acylovaných ansamitocínů.

Příklad 4

Čištění a krystalizace ansamitocínů z toluenového extraktu

1001 litrů celého bujónu obsahujícího Actinosynnema pretiosum s titrem 74,5 mg/litr ansamitocinu P-3 se tepelně ošetřuje, extrahuje toluenem a odpaří v podstatě podle popisu v příkladu 1 k získání 9,5 litrů extraktu obsahujícího 54,7 g ansamitocinu P-3.

Koncentrát se zahřívá na teplotu 45 °C a přidá se

14,5 litrů heptanu během 33 minut k vysrážení ansamitocinu. Směs se ochladí na ledu. Přidá se dalších 5 litrů heptanu a směs se nechá přes noc usadit. Matečný roztok se odstraní odsátím a sraženina se promyje 10 litry směsi toluen/heptan 1 : 1. Analýza HPLC ukáže, že matečný roztok obsahuje 6,5 % ansamitocinu P-3 a výplach obsahuje 1,8 % P-3. Sraženina se rozpustí ve 2 litrech methanolu a zfiltruje se přes filtr o velikosti pórů 0,2 mikrometru.

···«·· 4 ·· 44 44 • 4 4 4444 444

4 4 4 4 4

44 · 44444

444 44 444

Methanolový roztok se odpaří do sucha a znovu se rozpustí v 85 ml methanolu o teplotě 50 °C. K roztoku se přidá 510 ml ethyl-acetátu následovaných 200 ml heptanu. Směs se ochladí na teplotu místnosti a pomalu se přidá dalších 900 ml heptanu jak krystalízace započne. V matečném roztoku zůstane 4,14 g ansamitocinu P-3. Přidá se dalších 400 ml heptanu a směs se ochladí na ledu. V matečném roztoku zůstane 2,7 g ansamitocinu P-3.

Matečný roztok se odstraní odsátím a krystaly se rozpustí ve 110 ml methanolu a 520 ml ethyl-acetátu při teplotě 50 °C. Ve dvou 75ml alikvotech se přidá heptan, směs se ochladí na teplotu místnosti a přidá se dalších 900 ml. Přidá se dalších 400 ml heptanu a směs se chladí na ledu a nechá se přes noc krystalovat. Analýza HPLC ukáže, že v matečném roztoku zůstává 2,3 ansamitocinu P-3. Matečný roztok se odstraní odsátím a krystaly se prcmyjí směsí heptan:ethyl-acetát 3:1a vysouší se ve vakuu (60 Pa) přes noc. 47,8 g krystalů obsahuje 83,4 % ansamitocinu P-3 a celkem 97,0 % požadovaných acylovaných ansamitocinů.

Příklad 5

Extrakce kultivačního bujónu Actinosynnema pretiosum xylenem a čištění ansamitocinu

220 ml tepelně ošetřených Actinosynnema pretiosum s titrem 44 pg/ml ansamitocinu P-3 se umístí na vodnou lázeň o teplotě 45 °C a přidá se stejný objem xylenu. Fáze se mísí tak, že vír xylenu je vtažen do spodní fáze, ale bez tvorby emulze. Po 20 hodinách se do xylenové fáze extrahuje 64 % ansamitocinu P-3.

·· ····

Snes se rozdělí působením gravitace a oddělí se 170 ml xylenu. Xylenový extrakt se odpaří do sucha. Xylenový extrakt se vyčistí za použití chromatografie na oxidu křemičitém. Extrakt se rozpustí ve 2 ml 4% methanolu v toluenu a vloží a eluuje se za použití stejné směsi rozpuštědel.

Frakce (0, 5 ml) se zachytí a stanoví pomocí TLC (desky Kieselgel 60 F254, běh ve směsí dichlormethan/methanol 20 : 1) . Frakce obsahující ansamitocin P-3 se krystalují za použití postupu popsaného v předchozích příkladech. Krystalický produkt je srovnatelné kvality, pokud jde o barvu a čistotu, s produktem získaným toluenovou extrakcí fermentačnínc bujónu.

Předložený vynález může být ztělesněn v dalších soecifických formách aniž by se opustil jeho duch nebo podstatné atributy a tudíž by se mělo přihlížet k připojeným patentovým nárokům, spíše než k předchozímu popisu, jak vymezují rozsah tohoto vynálezu.

··*· • · · • · • * ·

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy vyčištěných ansamitocinú, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

a) kultivace mikroorganismu produkujícího ansamitocin v kapalném kultivačním médiu,

b) ošetření kultivačního média k usnadnění extrakce ansamitocinú rozpouštědlem,

c) extrakce ansamitocinú z kultivačního média aromatickým uhlovodíkovým rozpouštědlem,

d) odpaření extrahovaných ansamitocinú a

e) vyčištění ansamitocinú krystalizací.
2. Způsob přípravy vyčištěných ansamitocinú, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

a) kultivace mikroorganismu produkujícího ansamitocin v kapalném kultivačním médiu,

b) extrakce ansamitocinú z kultivačního média aromatickým' uhlovodíkovým rozpouštědlem,

c) odpaření extrahovaných ansamitocinú a

d) vyčištění ansamitocinú krystalizací.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že mikroorganismem produkujícím ansamitocin je Actinosynnema spp.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že Actinosynnema spp. je Actinosynnema pretiosum ATCC 31565.
5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že Actinosynnema spp. je Actinosynnema pretiosum ATCC 31218.

·· ·*··
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že ošetřením je zahřátí na teplotu okolo 75 °C.
7. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že rozpouštědlem je toluen.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že poměr toluenu ke kultivačnímu médiu ošetřenému teplem je okolo 1 : 1.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že extrakce se provádí při teplotě okolo 45 °C.
10. Způsoo podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že rozpouštědlem je xylen.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že poměr xylenu ke kultivačnímu médiu ošetřenému teplem je okolo 1 : 1.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že extrakce se provádí při teplotě okolo 45 °C.
13. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že ansamitociny zahrnují acylované ansamitociny, které mohou podstoupit redukční štěpení k vytvoření maytansinolu.
14 . Ansamitociny připravené způsobem podle nároku 1 nebo 2.
15.Komplex činidlo vážící se na buňku/maytansinoid připravený

00 ···· «

···· • ·· ·· · · • ·

0 0 «00 ···· ·· ·« • · · · • · ·

0 · · 0 • · · «0 ···· konverzí ansamitocinů připravených způsobem podle nároku 1 nebo 2 na komplex činidlo vážící se na buňku maytansinoid.
16.Komplex činidlo vážící se na buňku/maytansinoid podle nároku 15, kde činidlem vážícím buňku je protilátka.