DE19825557A1

DE19825557A1 - Verfahren zur regioselektiven Herstellung von 4-Hydroxy-dibenzopyrrol-Verbindungen

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Publication number: DE19825557A1
Application number: DE19825557A
Authority: DE
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-06-08
Filing date: 1998-06-08
Publication date: 1999-12-09

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von regioselektiv in 4-Position hydroxylierten Dibenzopyrrol-Verbindungen aus den jeweils in 4-Position unsubstituierten Verbindungen durch Inkubation mit einem zur Gruppierung der Proteobakterien gehörenden Mikroorganismus sowie ein Verfahren zur Gewinnung eines zur Herstellung entsprechender 4-Hydroxy-Verbindungen befähigten Enzyms. Bevorzugt haben sich Mikroorganismen der Gattungen Pseudomonas und Comamonas erwiesen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von in 4-Position hydroxylierten Dibenzo pyrrol- bzw. Carbazolderivaten, deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln, sowie ein Verfahren für die regioselektive Hydroxylierung in 4-Position von Dibenzopyrrolderivaten durch geeignete Mikroorganismen bzw. durch aus entsprechenden Mikroorganismen erhältliche En zyme.

4-Hydroxy-dibenzopyrrol-Derivate, wie beispielsweise 4-Hydroxy-carbazol, stellen wichtige Ausgangsverbindungen für zahlreiche pharmakologisch wirksame Substanzen dar (z. B. DE 22 40 599, EP 0 004 920). Bekannte Verfahren zur Herstellung entsprechender Verbindungen wie 4-Hydroxy-carbazol erfolgen im wesentlichen mittels chemischer Maßnahmen über eine Reihe von Zwischenprodukten. So kann 4-Hydroxy-carbazol beispielsweise aus 1, 2, 3, 9-Tetrahydro carbazol-4-on durch Palladium-Katalyse (Cummins und Tomlinson, J. Chem. Soc. 1955, 3475) oder Oxidation, beispielsweise mit 2,3-Dichloro-5,6-dicyanobenzochinon (J. G. Rodriguez et al., J. Chem. Crystallogr. 25, 5 (1995), 249-258) gewonnen werden. Die Ausgangsverbindung Tetra hydrocarbazol kann z. B. nach Clemo und Felton, J. Chem. Soc. 1951, 700-701 oder M. J. Martin et al., J. Med. Chem. 35, 22 (1992), 4105-4117) hergestellt werden. Ferner ist die chemische Synthese von in 4-Position hydroxylierten bzw. in anderer Weise substituierten Carbazolderiva ten ausgehend von Phenylhydrazin und 1,3-Cyclohexandion beschrieben (EP 0 004 920).

Es sind jedoch bis heute keine biochemischen oder mikrobiellen Verfahren bzw. Reaktionen zur Hydroxylierung von Dibenzopyrrol-Verbindungen in 4-Position bekannt. Eine Ausnahme stellt die Oxidation von Carbazol in 4-Position durch eine Ligninperoxidase (R. Vazquez et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 675-681 (1995)) dar, die zu einem Dimeren führt. In einem weiteren Schritt könnte durch Reduktion des Dimeren theoretisch 4-Hydroxycarbazol entstehen. Durch Peroxidasen katalysierte Reaktionen gelten jedoch als wenig selektiv, so daß mit der Bildung zahlreicher Nebenprodukte gerechnet werden muß. Ein entsprechendes präparatives Verfahren ist bisher nicht beschrieben.

Insbesondere erlauben die bekannten Maßnahmen nicht die direkte Herstellung von regioselektiv in 4-Position hydroxylierten Dibenzopyrrol-Verbindungen aus der entsprechenden in 4-Position nicht hydroxylierten Verbindung. So werden beispielsweise aus N-Methylcarbazol durch mikro bielle Umsetzung mittels Cunninghamella echinulata bzw. Kaninchenleberpräparaten lediglich in 3-Position bzw. in 1-, 2- und 3-Position hydroxylierte Derivate erhalten (Yang, W. und P. J. Davis, Drug Metabolism and Disposition 20 (1992), 38-46; Koop, D. R. und P. F. Hollenberg, Mol. Pharmacol. 17 (1980), 118-127; Novak, R. F. et al., Mol. Pharmacol. 17 (1980), 118-127). Weiterhin ist bekannt, daß mit Hilfe von bakteriellen Enzymen, wie beispielsweise Dioxygena sen aus Pseudomonaden, eine Hydroxylierung von Carbazol in 3-Position erzielt wird (Resnik, S. M. et al., FEBS Microbiol. Lett. 113 (1993), 297-302; Resnik, S. M. und D. T. Gibson, Abstr. Am. Chem. Soc. (208 Meet., Pt. 2, PETR 14, 1994).

Aufgabe der Erfindung war daher, ein einstufiges Verfahren zur Herstellung von regioselektiv in 4-Position hydroxylierten Carbazol- bzw. Dibenzopyrrol-Derivaten zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von in 4-Position hydroxylierten Dibenzopyrrol-Verbindungen aus der jeweils in 4-Position nicht substituierten Dibenzopyrrol- Verbindung, wobei die übrigen Positionen durch beliebige Reste substituiert oder unsubstituiert sein können, durch Inkubation mit einem zur Gruppierung der Proteobakterien gehörenden Mi kroorganismus oder einem daraus erhältlichen Enzym, welches zur Hydroxylierung in 4-Position von Dibenzopyrrol-Verbindungen befähigt ist. Das erfindungsgemäße Verfahren hat sich insbe sondere als geeignet erwiesen zur Herstellung von in 4-Position hydroxylierten Dibenzopyrrol- Verbindungen der allgemeinen Formel (Ia) bzw. (Ib)

worin R¹ bis R⁶, gleich oder verschieden, Wasserstoff, einen geradkettigen, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest mit einem bis zwölf Kohlenstoffatomen, eine Halogen-, Hydro xyl-, Sulfonyl-, Amino- oder Silylgruppe bedeutet und X Wasserstoff, einen Vinyl- oder Hydra zonalkylrest mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, einen geradkettigen, gesättigten oder unge sättigten aliphatischen Alkyl- oder Acyl-Rest mit einem bis zwölf Kohlenstoffatomen darstellt, wobei eine in 4-Position nicht substituierte Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit dem Mikroorganismus inkubiert und die entstandene 4-Hydroxy-dibenzopyrrol-Verbindung in der Mischung konzentriert und/oder aus dieser isoliert wird.

Bevorzugt ist für das erfindungsgemäße Verfahren für die Herstellung von Verbindungen der all gemeinen Formel (Ia) bzw. (Ib), in denen die Reste R¹ bis R⁶ jeweils Wasserstoff, oder von sol chen Verbindungen, in denen mindestens einer der Reste R¹ bis R⁶ eine Carbonylgruppe mit zwei bis 12 C-Atomen darstellt, wobei R¹ oder R⁴ bevorzugt sind, und/oder X Wasserstoff, eine Me thyl-, Ethyl-, Formyl-, Acetyl-, Tosyl-, Mesyl- oder Benzoyl-Gruppe bedeuten.

Die Inkubation einer in 4-Position nicht substituierten Dibenzopyrrol-Verbindung der allge meinen Formel (Ia) bzw. (Ib) mit dem Mikroorganismus bzw. mit nach Kultivierung separierten bzw. gegebenenfalls aufkonzentrierten Zellen erfolgt in der Regel in einem pH-Wert-Bereich von etwa 5 bis 9, bevorzugt zwischen pH 6,5 und 8, in einer niedrig konzentrierten Pufferlösung und ist innerhalb weniger Stunden bis zu etwa einem Tag (24 Stunden) beendet. Die genaue Reakti onsdauer hängt insbesondere von der Qualität der geernteten Zellen bzw. der Zelldichte und/oder der Größe des Reaktionsvolumens ab. So hat sich erwiesen, daß die Reaktionsdauer in weiten Bereichen, nämlich von etwa einer bis ca. 50 Stunden, variieren kann. Bevorzugt werden die Zel len direkt anschließend an die Kultivierung eingesetzt. Ein Einfrieren der Zellen sollte nach Möglichkeit vermieden werden. Die Reaktionstemperatur kann etwa 20° bis 35°C betragen, ein Bereich von ca. 25° bis 30°C hat sich erfindungsgemäß als besonders geeignet erwiesen.

Nach Beendigung der Reaktion werden die Zellen abgetrennt und nicht-umgesetztes Edukt bzw. erhaltenes Produkt aus dem verbleibenden Überstand mit einem organischen Lösungsmittel ex trahiert. Die erhaltene organische Phase wird anschließend gemäß dem Fachmann bekannter Maßnahmen, beispielsweise mittels HPLC aufgetrennt und die jeweilige in 4-Position hydroxy lierte Dibenzopyrrol-Verbindung der allgemeinen Formel (Ia) bzw. (Ib) isoliert. Mit dem be schriebenen Verfahren konnten entsprechende Verbindungen, beispielsweise 4-Hydroxycar bazol in technisch ausreichender Menge erhalten werden.

Als Mikroorganismen bzw. Proteobakterien, die zu den gram-negativen Bakterien gehören, kom men erfindungsgemäß insbesondere solche in Betracht, die durch Chinolin bzw. diesbezügliche Analoga induzierbar sind bzw. in der Lage sind, Chinolin- bzw. entsprechende Derivate zu me tabolisieren. Bakterien der Gattung Pseudomonas oder Comamonas wie beispielsweise Pseu domonas putida (Stamm 86), Pseudomonas spec. (RNA Gruppe I, Stamm 30/18, BMTU 7352, DSM 12196), Pseudomonas putida (Stamm 30/5), Pseudomonas putida (Stamm 30/7), Comamonas testosteroni (Stamm 30/l) oder Comamonas testosteroni (Stamm 30/13, BMTU 7355, DSM 12195), haben sich erfindungsgemäß als besonders vorteilhaft erwiesen.

Der entsprechende Mikroorganismus wird vor Einsatz in die Synthese auf einem geeigneten Kul turmedium, welches Chinolin bzw. ein oder mehrere entsprechende Derivate als Kohlenstoff quelle enthält, vorteilhafterweise bis zum Ende der logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet. Der Einsatz von Chinolinderivaten als Kohlenstoffquelle für die Züchtung entsprechender Bak terienstämme ist prinzipiell von Schwarz, G. et al., in System. Appl. Microbiol. 10, 185-190 (1988) beschrieben. Neben Chinolin haben sich erfindungsgemäß darüber hinaus insbesondere Xanthin, Hypoxanthin, 1-Methylxanthin, Nikotinsäure, 1,3-Benzodiazin und/oder ein Benzo pyran-Derivat, wie Cumann oder o-Cumarsäure, bei der Anzüchtung für die anschließende Her stellung von in 4-Position hydroxylierter Dibenzopyrrol-Verbindungen als geeignet erwiesen. Die Konzentration an Chinolin bzw. diesbezüglichen Derivaten im Kulturmedium kann bis zu etwa 10 mM betragen. Bevorzugt ist erfindungsgemäß die Verwendung von Chinolin bzw. dies bezüglichen Abkömmlingen als einziger Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von etwa 2 bis 6 mM im Medium. Weiterhin hat sich zum Erreichen einer maximalen Zelldichte als vorteilhaft erwiesen, während der Anzucht bzw. Kultivierung dosiert weiteres Chinolin bzw. entsprechende Derivate dem Medium zuzusetzen. Die nachträgliche Zugabe der Kohlenstoffquelle erfolgt be vorzugt mit solchen Fraktionen, die maximal der Konzentration der Kohlenstoffquelle im Kul turmedium entsprechen, in mehreren Schritten bis zum Ende der logarithmischen Wachstums phase. Nach entsprechender Vorzucht auf, beispielsweise, Chinolin und Resuspension der ab zentrifugierten Zellen, vorteilhafterweise in einem Zehntel des ursprünglichen Kulturvolumens, werden diese direkt zur Synthese eingesetzt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung bzw. Anreicherung eines Proteins, welches über die enzymatische Aktivität zur spezifischen Hydroxylierung von in 4-Position nicht substituierten Dibenzopyrrol-Derivaten der allgemeinen Formel (Ia) bzw. (Ib) verfügt, aus einem gram-negativen Bakterium wie insbesondere einem Proteobakterium. Die ein gangs beschriebenen Bakterienstämme haben sich für die Gewinnung des Enzyms als besonders geeignet erwiesen. Im wesentlichen wird das entsprechende Proteobakterium zunächst in einer auf einem Chinolinderivat als einziger Kohlenstoffquelle basierenden Kulturlösung fermentiert. Nach Ernte der Zellen (Zentrifligation) und Ultraschallaufschluß werden unlösliche Zellbestand teile abgetrennt und die Proteinfraktion über ein geeignetes Chromatographiematerial, wie einen Ionen-, insbesondere Anionenaustauscher eluiert. Die Elution kann in einem weiten Temperatur bereich, insbesondere zwischen etwa 4° bis 25°C erfolgen. Als Anionenaustauschermaterial hat sich erfindungsgemäß insbesondere DEAE-Cellulose DE 52 (Whatman) als geeignet erwiesen.

Das Eluat mit dem gewünschten Enzym wird gegebenenfalls konzentriert und kann anschließend direkt mit dem entsprechenden Edukt zur direkten enzymatischen Herstellung von in 4-Position hydroxylierter Dibenzopyrrol-Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (Ia) bzw. (Ib) einge setzt werden. Die Reaktionsbedingungen entsprechen dabei im wesentlichen denen der für den Einsatz intakter Zellen beschriebenen Bedingungen. Vorteilhaft für das Verfahren unter Verwen dung des angereicherten bzw. isolierten Enzyms ist jedoch, daß lediglich wenige Stunden, in den meisten Fällen nur etwa eine Stunde, inkubiert werden muß, und zudem um das etwa drei- bis zehnfache der Konzentration an Edukt, z. B. an Carbazol, eingesetzt werden kann, was zu höhe ren Ausbeuten der gewünschten 4-Hydroxy-Verbindung führt.

Erläuterungen der Abbildungen

Abb. 1: DC vom Extrakt des "Ruhezellen"-Überstandes
Spur 1: 1-Hydroxycarbazol, Spur 2: 3-Hydroxycarbazol, Spur 3: Extrakt, Spur 4: 4-Hydroxycar bazol

Abb. 2: DC von Extrakten der "Ruhezellen"-Überstände
Spur 1: 1-Hydroxycarbazol, Spur 2: 2-Hydroxycarbazol, Spur 3: 3-Hydroxycarbazol, Spur 4: Extrakt-Vorzucht auf Succinat als C-Quelle, Spur 5: Extrakt-Vorzucht auf Chinolin, Spur 6: 4- Hydroxycarbazol, Spur 7: Carbazol

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:

Beispiel 1 Züchtung, Induktion und Nachweis von 4-Hydroxycarbazol

Es wurde ein Stamm 86 verwendet, der als Pseudomonas putida klassifiziert ist.

Chinolin-Minimalmedium

Folgende Medienzusammensetzung wurde gewählt:

4,3 g Na₂HPO₄
1,15 g KH₂PO₄
1,0 g NaCl
0,4 g MgSO₄ × 7H₂O
0,05 g FeSO₄ × 7H₂O
0,01 g Na₂MoO₄ × 2H₂O
ad 1000 ml mit deionisiertem H₂O

Die Lösung wird auf pH 7,3 eingestellt, anschließend werden 470 µl Chinolin nach dem Auto klavieren zugesetzt.

Züchtungsbedingungen (1 l-Maßstab) und Synthese von 4-Hydroxycarbazol

Die Bakterienzüchtung erfolgte bei 30°C in 2 × 1 l Mineralsalzmedium mit 4 mM Chinolin Aus gangskonzentration und 2-3maligen Nachfüttern von nochmals je 4 mM Chinolin bis zur maxi malen Zelldichte (optische Dichte E_{578 nm} = 2,0-2,2).

Die durch Zentrifugation geernteten, mit Salzlösung (NaCl, 5 g/l; MgSO₄, 0,12 g/l) gewaschenen Zellen wurden anschließend in 100 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,2 mit 1 mM Carbazol aufgenommen und mindestens 16 h inkubiert. Die erhaltenen Zellen ("Ruhezellen") wurden wei ter verwendet. Anstelle von Chinolin wurden zu Kontrollzwecken auch andere C-Quellen ver wendet, z. B. wurden äquivalente Mengen Succinat zudosiert.

Nachweis der Hydroxylierung

Der Kulturbrühe werden 10-50 ml Bakterienkultur entnommen. Die Zellen wurden mittels Zen trifugation bei 4400 × g abgetrennt. Der verbleibende Überstand wurde dreimal mit jeweils etwa einem Drittel an Essigsäureethylester ausgeschüttelt. Dabei gingen organische Verbindungen in die organische Phase über, so daß die wäßrige Phase verworfen werden konnte. Die Essigester fraktion wurde dann am Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingeengt und anschließend in 100 µl Ethanol aufgenommen.

Die erhaltene Probe wurde auf DC-Platten (Sil G-UV₂₅₄, Macherey und Nagel) aufgetragen, wo bei außerdem Carbazol, 1-Hydroxy-, 2-Hydroxy-, 3-Hydroxy- und 4-Hydroxy-carbazol als Re ferenzen aufgetragen wurden. Dazu wurde als Fließmittel Toluol/Dioxan 72 : 16 (v/v) verwendet.

Die Detektion der Hydroxycarbazole erfolgte mittels UV-Licht und durch ein Sprühreagenz. Unter UV-Licht wurden aufgetrennte Hydroxycarbazole durch einen in der Plattenbeschichtung enthaltenen Fluoreszenzindikator sichtbar gemacht. Als Sprühreagenz wurden Lösungen von 0,3% K₃Fe(CN)₆, gelöst in H₂O, und 0,3% FeCl₃, ebenfalls gelöst in H₂O, angesetzt und im Ver hältnis 1 : 1 (v/v) direkt vor der Anwendung gemischt. Durch das Sprühreagenz wurden Hydroxy carbazole charakteristisch wie folgt gefärbt:

1-Hydroxycarbazol dunkelblau
2-Hydroxycarbazol azurblau
3-Hydroxycarbazol grünblau
4-Hydroxycarbazol violettblau

Ergebnisse

Es wurde eindeutig 4-Hydroxycarbazol in Extrakten aus Biotransformationsansätzen, bei denen die Biomasse auf Chinolin angezüchtet worden war, identifiziert (s. Abb. 1). Züchtung auf einem anderen Medium als Chinolin, z. B. mit Succinat, führte dagegen nicht zur Bildung von 4- Hydroxycarbazol (Abb. 2).

Beispiel 2 Züchtung, Induktion und Nachweis von 4-Hydroxy-carbazol

Anstelle von Pseudomonas putida 86 wie in Beispiel 1 wurden Pseudomonas putida Stamm 30/5, Pseudomonas putida Stamm 30/7, Comamonas testosteroni Stamm 30/l, Comamonas testo steroni Stamm 30/13 und Pseudomonas spec. Stamm 30/18 untersucht.

Die genannten Stämme wurden wie in Beispiel 1 angezüchtet, induziert und die gebildeten Hy droxycarbazole mittels DC analysiert. In Proben aus den Anzuchten sämtlicher genannter Stäm me wurde 4-Hydroxycarbazol wie in Beispiel 1 nachgewiesen.

Beispiel 3 Züchtung, Induktion und Nachweis von 4-Hydroxycarbazol nach Zellaufschluß und Proteinseparation

Es wurde wie in Beispiel 1 Pseudomonas putida Stamm 86 eingesetzt.

Anzucht/Züchtung (100 l-Fermenter) und Synthese von 4-Hydroxycarbazol

Vier 100 ml Erlenmeyerkolben mit je 50 ml Chinolin-Minimalmedium wurden mit je einer Impf öse Pseudomonas putida 86 beimpft und über Nacht bei 30°C auf einem Rundschüttler bebrütet. Mit diesen Vorkulturen wurden vier 2 l Erlenmeyerkolben mit jeweils 1 l Chinolin-Minimalme dium beimpft, die dann wieder über Nacht bei 30°C geschüttelt wurden. Mit den vier Vorkul turen erfolgte die Beimpfung des 1001 Fermenters, der bei 30°C gerührt und mit 25 l/min belüf tet wurde. Zur Steigerung der Zellausbeute wurde 3-4 mal mit 4 mM Chinolin nachgefüttert, so bald Chinolin und dessen Metabolit 2-Oxo-1,2-dihydrochinolin im Überstand abgebaut waren. Gegen Ende der logarithmischen Wachstumsphase wurden die Zellen in einem Durchlaufse parator abzentrifugiert, mit Kochsalzlösung gewaschen und in 3 l Kaliumphosphatpuffer 0,1 M, pH 7,2 mit 1 mM Carbazol (in DMSO gelöst) suspendiert. Diese "ruhenden Zellen" wurden auf sechs 2 l Erlenmeyerkolben verteilt und bei 30°C weitere 16 h unter Schütteln inkubiert.

Die Carbazol-induzierten Zellen wurden mit 4400 × g abzentrifugiert, zweimal mit 50 mM Tris- HCl (pH 7,3) gewaschen und bei -20°C eingefroren.

Zellaufschluß

50 g tiefgefrorene Zellen wurden in 50 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) aufgetaut. Die Zellsuspen sion wurde mittels Ultraschall 20 Minuten bei 0°C in Intervallen von 0,5 sec. beschallt. Unlösli che Zellbestandteile wurden daraufhin in der Kühlzentrifuge bei 4°C und 48.400 × g 45 Minuten abzentrifugiert. Der resultierende Überstand diente in den folgenden Versuchen als Rohextrakt.

Anionenaustauschchromatographie

Eine mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) äquilibrierte DEAE-Cellulose-Säule (5 × 7,5 cm), Whatman DE52, wurde (z. B. bei 4°C) mit aus ca. 50 g Zellen gewonnenem Rohextrakt beladen. Anschlie ßend wurde mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) nicht bindendes Protein von der Säule gespült und ge sammelt. Nach dem Spülen wurden adsorbierte Proteine mit einem aufsteigenden Salzgradienten von 0 bis 800 mM KCl bzw. 0 bis 1000 mM NaCl in 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) desorbiert. Das Eluat wurde in 6 ml Fraktionen aufgegangen. Der Proteingehalt der Fraktionen wurde durch Extinktionsmessungen bei 280 nm bestimmt. Entsprechend des so erhaltenen Elutionsprofils wurden Fraktionen zu Pools zusammengefügt.

Synthese von 4-Hydroxy-carbazol

Mit den so erhaltenen verschiedenen Proteinfraktionen wurde in Inkubationsansätzen die enzy matische Carbazolumsetzung durchgeführt. Diese Inkubationsansätze setzen sich folgenderma ßen zusammen:

5 ml Proteinfraktion (angereichertes Enzym oder Rohextrakt)
5 ml Carbazol, 0,1 mM in Puffer
50 µl NADH, 100 mM

Die Inkubationsansätze wurden bei 30°C unter Schütteln oder Rühren (Sauerstoffeintrag) 1 h bis 2 Tage inkubiert. Anschließend wurde das Protein gefällt, abzentrifugiert und die Umsetzungs produkte aus dem Überstand mit Essigsäureethylester extrahiert. Die einrotierten Extrakte wer den schließlich mit HPLC analysiert.

Analyse

Die in Ethanol aufgenommenen Proben wurden mittels HPLC analysiert.

Zum Vergleich wurde eine Mischung aus 1-, 2-, 3- und 4-Hydroxycarbazol aufgetrennt. Zur Auswertung wurden die Chromatogramme der aufgetrennten Proben, bzw. ihre Retentionszelten und ihre entsprechenden Absorptionsspektren mit denen der Referenzen verglichen.

Herstellung von Standardlösungen

20 mg Referenzsubstanz (1-, 2-, 3-, 4-Hydroxycarbazol) wurden in 35 ml Ethanol gelöst. Die Lö sung wurde in einen 50 ml Meßkolben gefüllt und auf 50 ml aufgefüllt. (Vor Injektion wurde diese Lösung 10-fach mit HPLC-Laufmittel verdünnt.)

HPLC Bedingungen

Säule: Nucleosil 120-3-C18
Flußrate: 1 ml/min.
Eluent: 65% 0.083 M (NH₄

)H₂

PO₄

/35% Acetonitril
Bedingungen: isokratisch
Detektion: UV bei λ = 235 nm

Ergebnisse

Es konnte durch Vergleich der Retentionszeiten und der UV-Spektren der Umsetzung von Carba zol durch die Proteinfraktion, die nicht an die Ionenaustauschsäulen gebunden hatte ("DE-Durch lauffraktion"), gezeigt werden, daß diese Carbazol zu 4-Hydroxycarbazol umgesetzt, und keine in anderer Position hydroxylierte Verbindungen, insbesondere auch kein 1-Hydroxycarbazol, mit der "DE-Durchlauffraktion" entstehen.

Die an die Säulenmatrix gebundene Proteinfraktion wurde mit einer hochkonzentrierten Salzlö sung, beispielsweise 1 M NaCl, eluiert. Die anschließende Reaktion mit Carbazol führte im we sentlichen zu 1-Hydroxycarbazol als Produkt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von regioselektiv in 4-Position hydroxylierten Dibenzopyrrol- Verbindungen aus den jeweils in 4-Position unsubstituierten Verbindungen durch Inkuba tion mit einem zur Gruppierung der Proteobakterien gehörenden Mikroorganismus bzw. mit einer aus dem Mikroorganismus gewonnenen Proteinfraktion.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von in 4- Position hydroxylierten Dibenzopyrrol-Verbindungen der allgemeinen Formel (Ia) bzw. (Ib)
worin R¹ bis R⁶, gleich oder verschieden, Wasserstoff, einen geradkettigen, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest mit einem bis zwölf Kohlenstoffatomen, eine Halogen-, Hydroxyl-, Sulfonyl-, Amino- oder Silylgruppe bedeuten und X Wasserstoff, einen Vinyl- oder Hydrazonalkylrest mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, einen geradkettigen, gesät tigten oder ungesättigten aliphatischen oder Acyl-Rest mit einem bis zwölf Kohlenstoff atomen darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß eine in 4-Position nicht substituierte Verbin dung der allgemeinen Formel (Ia) bzw. (Ib) mit dem Mikroorganismus bzw. einer entspre chenden Fraktion inkubiert und die entstandene 4-Hydroxy-dibenzopyrrol-Verbindung in der Mischung konzentriert und/oder aus dieser isoliert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem pH-Wert-Bereich von etwa 5 bis 9 über einen Zeitraum von etwa einer bis 50 Stunden ver läuft.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reakti onstemperatur zwischen etwa 20° und 35°C gehalten wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Dibenzo pyrrolderivate in 4-Position hydroxylierendes Enzym, welches aus einem Mikroorganis mus der Gruppierung der Proteobakterien in angereicherter oder reiner Form erhältlich ist, verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein durch Chinolin bzw. entsprechender Derivate induzierbarer und/oder Chinolin bzw. entspre chende Derivate abbauender Mikroorganismus verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Mikroorganis mus der Gattung Pseudomonas oder Comamonas handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Pseudomonas putida-, Pseu domonas spec.- oder Comamonas testosteroni-Stamm verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Pseudomonas spec. (DSM 12196) oder Comamonas testosteroni (DSM 12195) handelt.

10. Verfahren zur Gewinnung bzw. Anreicherung eines Proteins, welches über die enzyma tische Aktivität zur spezifischen Hydroxylierung von in 4-Position nicht substituierten Di benzopyrrol-Derivaten der allgemeinen Formel (Ia) bwz. (Ib) verfügt, aus einem Proteo bakterium, dadurch gekennzeichnet, daß man das Proteobakterium in einer auf einem Chinolinderivat als Kohlenstoffquelle basierenden Kulturlösung fermentiert, unlösliche Zellbestandteile abgetrennt und das Protein über einen Anionenaustauscher eluiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Anionenaus tauscher um DEAE-Cellulose DE52 handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Proteobakterium der Gat tung Pseudomonas oder Comamonas verwendet wird.

13. Verwendung einer nach einem der Ansprüche 10 bis 12 erhältlichen Enzymfraktion zur Herstellung von regioselektiv in 4-Position hydroxylierten Dibenzopyrrol-Verbindungen der allgemeinen Formel (Ia) bwz. (Ib).

14. Verwendung einer nach einem der Ansprüche 1 bis 9 erhältlichen Verbindung zur Her stellung von Arzneimitteln.