DE2438100A1

DE2438100A1 - Verfahren zur herstellung einer bicyclischen verbindung

Info

Publication number: DE2438100A1
Application number: DE2438100A
Authority: DE
Inventors: Manfred Dr Liersch; Jakob Dr Nueesch; Hansjoerg Dr Treichler; Walter Dr Voser
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1973-08-17
Filing date: 1974-08-08
Publication date: 1975-02-27
Also published as: FR2257682B1; DK385974A; FR2257682A1; IE40928L; GB1480379A; CA1048430A; FR2252406A1; JPS5048191A; SE7409375L; FR2252406B1; IE40928B1; NL7410058A; SE7808905L

Description

CIBA-GEIGY AG, Cll-4002 BASEL

Case 4-8929/1+2 Deutschland

Verfahren zur Herstellung einer bicyclischen Verb5.nciung.

Gegenstand der Erfindung ist.ein neues Verfahren zur Herstellung von Desacetoxycephalosporin C (3-MethyI~7-(£- aminoadipoyl)-ceph~3-em-carbonsä"ure) der Formel I

H₂N _v

HOOC

CH - (CH₂ )₃ - CO - KH

COOH

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und seiner Salze. Diese Verbindung ist bekannt, vgl. Stedman et al. J. Med. Chem., 7. (1964), 117-119 und US-Patent 3,124,576. Sie wurde durch katalytische Hydrierung von Cephalosporin C erhalten· und, ohne charakterisiert zu werden, direkt in Derivate übergeführt. Auch Derivate von Verbindung I, z.B. 3-Mcthyl-7-(phenoxyacetyl)-ceph-3-em-4-carbonsäure, wurden durch katalytische Hochdruckhydrierung der entsprechenden 3-Acetoxymethylverbindung hergestellt, vgl. .Morin et al., J. Am. Chern. Soc. 85_(1963), 1896-97. Ein anderer Weg zur Herstellung solcher Derivate besteht in der Sulfoxidumlagerung entsprechender Penicilline, vgl. Morin et al., 1. c.

Die Verbindung der Formel I ist von erheblichem praktischem Interesse, und zwar weniger wegen ihrer relativ schwachen antibiotischen Wirkung, als wegen ihrer Verwendbarkeit als Ausgangsmaterial zur Herstellung wertvoller Derivate der Formel II .

R - NH

! I

II,

·. - · - COOH

worin R ein anderer Acylrest als der Aininoadipoylrest ist, insbesondere ein Acylrest, wie er in therapeutisch verwendbaren Acylderivaten der 6-Aminopenicillansäure und 7-Aminocephalosporansäure vorkommt, vgl. z.B. Sassiver et al., Adv. Appl. Microbiol. 1_3 (1970), 163-235. Um solche Acylderivate herzustellen, wird aus Vor bindung I zunächst der &-Aminoadipoylrest abgespalten, z.B.

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nach dem Verfahren des französischen Patentes Nr. 1 394 820 oder des belgischen· Patentes Nr. 720 185, wobei die Verbindung der obigen Formel II, worin R für Viasserstoff steht, erhalten wird. Diese Verbindung kann dann in erwünschter Weise acyliert werden.

Die vorliegende Erfindung macht Verbindung I durch Fermentation zugänglich. Es wurde gefunden, dass man einen Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus so mutieren kann, dass er Desacetoxycephalosporin C produziert. "

Die Biosynthese von Cephalosporin C im Mikroorganismus ist bisher nicht aufgeklärt. Als Nebenprodukte in der Cephalosporin C-Produktion war Desacetylcephalosporin C bekannt, nicht aber Desacetoxycephalosporin C. Es war daher sehr überraschend, dass es gelang, Mutanten herzustellen, die Desacetoxycephalosporin C produzieren. Die Auffindung der Mutanten lässt den Schluss zu, dass Desacetoxycephalosporin C ein Zwischenprodukt in der Biosynthese von Cephalosporin C durch Cephalosporin C-bildende Mikroorganismen ist und dass bei der Mutante die Reaktionsschritte, welche Desacetoxycephalosporin C in Cephalosporin C bzw. Desacetylcephalosporin C überführen, blockiert sind. Da biosynthetische Reaktionen unter Mitwirkung von Enzymen zustande kommen, kann man vermuten,

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dass bei der neuen Mutante ein oder mehrere Enzyme, die an der Biosynthese von Cephalosporin C aus Desacetoxycephalosporin C beteiligt sind, nicht mehr vorhanden oder ganz

oder teilv7eise blockiert sind. Das bedeutet, dass ein oder mehrere Enzyme 5-hre Funktj.on der Katalyse der Umwandlung von Desacetoxycephalosporin C in Cephalosporin C (als Endprodukt) nicht oder nicht vollständig erfüllen können. Im ersten Fall wird gar kein Cephalosporin C produziert, im zweiten Fall könnte neben Desacetoxycephalosporin C eine kleinere oder grössere Menge von Cephalosporin C oder Desacetylcephalosporin C gebildet werden. Für die Auffassung, dass die neuen Mutanten einen Defekt aufweisen hinsichtlich eines oder mehrere Enzyme, die an der Ueberführung von Desacetoxycephalosporin C in Cephalosporin C im Mikroorganismus beteiligt sind, spricht die Tatsache, dass aus Cephalosporin C - produzierenden Mikroorganismen bzw. in deren zellfreien Extrakten ein Enzym nachgewiesen werden konnte, das in Gegenwart von Sauerstoff und einem Cofaktor (H-Donator:NAPH, NADPH) Desacetoxycephalosporin C in Desacetylcephalosporin C überführt. Das Enzym (Desacetoxycephalosporin C-Hydroxyläse), das sehr wahrscheinlich in die Gruppe der Oxido-Reduktasen gehört, ist ein lösliches Protein, das ein pH-Optimum von 6,5 aufweist und das durch Hitze (5-Min. bei 100° C) denaturiert wird. In den neuen Mutanten bzw. deren zellfreien Extrakten konnte diese Hydroxy1-ase nicht nachgewiesen werden. Man kann daraus schliessen,

¹ ' , ■ ■ ^: ■<; - ■

' 7 500809/1193

dass durch den Mangel an Hydroxyläse in den neuen Mutanten die Biosynthese des Cephalosporin C auf der Stufe des Desacetoxycephalosporin C abgebrochen wird. Die neuen Mutanten, die man als Desacetoxycephalosporin C-Hydroxylase-Ausfallmutanten (hydroxylase-defective or leaky mutants) bezeichnen kann, wurden in der Natur bisher nicht gefunden.

Gegenstand der Erfindung sind daher Mutanten von Cephalosporin C-produzierenden Mikroorganismen, bei denen die Ueberführung von Desacetoxycephalosporin C in Cephalosporin C bzw. Desacetylcephalos.porin C ganz oder teilweise unterbunden ist. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der genannten Desacetoxycephalosporin C-Hydroxylase-Ausfallmutanten zur Gewinnung von Desacetoxycephalosporin- C durch Fermentation der genannten Mutanten. Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der neuen Mutanten nach an sich bekannten Methoden, nämlich durch Behandlung mit mutagenen Mitteln. Weiter ist ein Erfindungsgegenstand das Verfahren zur Herstellung von Desacetoxycephalosporin C, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Mutante eines Cephalosporin C-produzierenden Mikroorganismus, bei der die Ueberführung von Desacetoxycephalosporin C in Cephalosporin C ganz oder teilweise unterbunden ist, in an sich bekannter Weise züchtet und Desacetoxycephalosporin C isoliert.

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Als der Mutagenese zu unterwerfende Cephalosporin .C produzierende Microorganismen verwendet man die bekannten Pilze der Gattung Emericellopsis oder Cephalosporium, wie Cephalosporium acremonium, z.B. den Brotzu-Stamm I.M.I. • 49 137 (ATCC 11550) oder Mutanten hiervon, z.B. die Clevedon Mutante 8650 (ATCC 14533), vgl. die U.S. Patente 2 831 797 und 3 396 083, ferner deren Mutanten, die mehr Cephalosporin C produzieren, z.B. die in der deutschen Offenlegungsschrift 2 101 345 beschriebenen Methionin-auxotrophen Mutanten oder die Mutanten gemäss der deutschen Offenlegungsschrift 2 239 321.

Die Herstellung der neuen Mutanten erfolgt nach den fUr die Gewinnung von Mutanten bekannten Methoden durch Einwirkung von mutationsauslösenden Strahlen oder chemischen Agenzien auf Wuchsformen des Pilzstammes, wie vor allem Konidien, ferner Arthrosporen, vegetative Mycelien oder eventuell Ascosporen.

So können zur Mutationsauslösung radioaktive Strahlen» wie α-, β- oder γ-Strahlen, oder Neutronen, ferner ultraviolette Strahlen verwendet werden. Bekannte chemische Mutagene sind z.B. alkylierende, besonders niederalkylierende Agenzien, wie Diäthylsulfati Aethylmethansulfonat, Aethylä'thansulfonat, oder Analoge von Nucleotidbasen wie 5-Bromuracil oder 2-Aminopurin, oder Verbindungen, welche die Nucleotidbasen chemisch verändern, wie Hydroxylamin, salpetrige Säure oder l-Methyl-3-nitro-nitrosoguanidin oder Verbindungen, die

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einen Ausfall oder einen zusätzlichen Einschub einer oder mehrerer Nucleotidbasen bewirken, z.B. Acridine wie Proflavin. Die mutationsausl'dsenden Strahlen oder chemischen Agenzien werden zur Einwirkung -z.B. auf Konidien des Pilzetammes gebracht. Die Einwirkungszeit wird so bemessen, dass die Zahl der Mutanten möglichst gross ist; bei einer solchen Einwirkungsdauer werden die meisten Konidien (ca. 90 - 99%) abgetötet, vgl. z.B. die deutsche Offenlegungsschrift 2 101 345 (Case 4-6940/E), Fig. 1. Vorzugsweise wird die mutagene Behandlung so. durchgeführt, dass die Ueberlebensrate ca. 1% beträgt.

Es wurde experimentell gefunden, dass das Verhältnis der Anzahl der die mutagene' Behandlung überlebenden Konidien zur Anzahl der erhaltenen Desacetoxycephalosporin C-produzierenden Mutanten unabhängig von der Behandlungsmethode innerhalb statistischer Grenzen konstant und reproduzierbar ist. Im Durchschnitt findet man eine Desacetoxycephalosporin C-produzierende Mutante unter 5000 bis 10 000 die mutagene Behandlung überlebenden Konidien. " ·

Die mutagene Behandlung kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:

Die in M/15 Phosphatpuffer vom pH 7 suspendierten Konidien (2,5 ·1ο /ml) werden gleichmässig auf der Oberfläche eines festen Agamährmediums, das alle benötigten Nährstoffe

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enthält, z.B. auf dem "komplexen Vollmedium 1 H" (10 g (Glucose, 4 g Difco-Bacto-Hefeextrakt, 4 g D,L-Methionin, 25 g Difco-Agar, Leitungswasser ad 1000 ml, Sterilisation 20 Minuten bei 120° C und 1,2 atü, pH nach der Sterilisation 7,0) verteilt; pro Agarplatte werden 0,1 ml aüsge-·

strichen. Auf diese Weise gelangen 2,5 * 10 lebende Konidien auf die Agaroberfläche. Diese wird während 14 Sekunden dem UV-Licht einer Philips TUV-Sterilisationslampe mit einer maximalen Strahlenintensität bei der Wellenlänge von 2537 A ausgesetzt. Dabei gelangen 10 000 erg/sec/cm auf die Oberfläche. Die Strahlenmenge kann mittels eines Präzisions -UV -Messgerät es gemessen und so dosiert werden, dass die gewünschte Zahl von überlebenden Kondien, z.B. 1% (30 + .5) erhalten wird. :.:...;:. ; .

Die Isolierung der gewünschten Mutanten aus den tnutagen behandelten Konidien erfolgt in der Weise, dass man die Agarplatten inkubiert, z.B. 7 Tage bei 25°, und die separaten Kolonien, im obigen Fall 25 - 35 Kolonien (Durchmesser ca. 8 mm), testet, ob sie Desacetoxycephalosporin C bilden, bzw. ob sie das Hydroxylase-Enzym enthalten, welches für die UeberfUhrung von Desacetoxycephalosporin C in Desacetylcephalosporin C verantwortlich ist.

Diese Prüfungen werden wie üblich nicht an den einzelnen Kolonien selbst, sondern an der Tochtergeneration, die man

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durch Züchtung der einzelnen Kolonien in einem flüssigen Nährmedium, z.B. in Schiittelkolben während 3 bis 7 Tagen bei 23°C erhält, vorgenommen. Man kann entweder das Kulturfiltrat untersuchen, um festzustellen, ob darin Desacetoxycephalosporin C bzw. kein oder nur wenig Cephalosporin C vorhanden ist oder man kann das Mycel untersuchen, um festzustellen, ob die erwähnte Hydroxylase darin vorhanden ist. ' .

Da man, wie bereits erwähnt, im Durchschnitt unter 5000 bis 10 000 Kolonien, die aus den.die mutagene Behandlung Überlebenden Konidien hervorgegangen.sind, nur eine Desacetoxycephalosporin C-produzierende Kolonie findet, ist es arbeitstechnisch wichtig, ein Vorausleseverfahren zur Verfugung zu haben, mit dem man die Cephalosporin C-bildenden Kolonien ausscheiden kann. Hierfür geeignet ist vor allem der mikrobiologische Plattendiffusionstest mit auf Cephalosporin C, nicht aber gleich empfindlich auf Desacetoxycephalosporin C ansprechenden Mikroorganismen, z.B. mit Alcaligenes faecalis, Sarcina lutea oder Neisseria catarrhalis. Diesen Stämmen gegenüber zeigt Desacetoxycephalosporin C nur eine sehr schwache Aktivität, also einen kleinen Hemmhof, während Cephalosporin C stark aktiv ist Und dementsprechend einen

.x

grossen Hemmhof bildet. Von der weiteren Prüfung auf Desacetoxycephalosporin C-enthalt*ende Kulturfiltrate können

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daher diejenigen, die einen grossen Hemmhof gegenüber den genannten Mikroorganismen erzeugen, ausgeschieden werden. Im Durchschnitt können auf diese Weise 95% der Kulturen von der weiteren Prüfung ausgeschlossen V7erden. In den gegenüber den genannten Microorganismen weniger aktiven Fermentationsbriihen kann z.B. biologisch, biochemisch und dlinnschichtchromatographisch auf Anwesenheit von Desacetoxycephalosporin C geprüft werden.

Die biologische Prüfung kann z.B. vorgenommen werden, indem man von mehreren, beispielsweise 5 - 10, Kultur-, filtraten und einer Standardmenge von authentischem Desacetoxycephalosporin C ein Bioautograinm mit den genannten Mikroorganismen, z.B. Alcaligenes faecalis, herstellt. Zu diesem Zweck, chromatographiert man die Kulturfiltrate und das Standard-Desacetoxycephalosporin C auf Papier (z.B. Whatman Nr. 1) in einem der in Tabelle 1 genannten Lösungsmittelsysteme (Laufzeit ca. 8-10 Stunden) und legt das Papier dann, auf eine Agarplatte mit dem betreffenden Mikroorganismus. Nach 30 Minuten bei 4°C. ..wird das Papier wieder entfernt und die Agarplatte inkubiert (ca. 12 - 20 Stunden bei 37°C ). Desacetoxyc.ephalosporin C weist an der Stelle des Rf-Wertes (s. Tabelle 1) einen Hemmhof auf. Man kann daher ablesen, welche Kulturfiltrate Desacetoxy· cephalosporin C enthalten und aus der Grosse des Hemmhofs auf die Menge an Desacetoxycephalosporin C schliessen. Auf

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diese Weise kann man auch erkennen, ob die geprüfte Mutante ausschliesslich Desacetoxycephalo'sporin C produziert oder ob sie "daneben auch noch Cephalosporin C,. Desacety!cephalosporin C oder eine andere mikrobiöl. aktive Substanz produziert.

Die biochemische Prüfung auf Anwesenheit von Desacetoxycephalosporin C-Hydroxyläse kann beispielsweise so durchgeführt werden, dass man im Mycel des mutierten Stammes bzw. in daraus erhaltenen zellf-reien Extrakten auf Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein der erwähnten Hydroxyläse prüft. Das Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den zu untersuchenden Stamm (aus einer Kolonie der oben erwähnten Agarplatten) in einer synthetischen Nährlösung ("synthetisches Grundmedium C3", s. unten), der A g D,L-Methionin zugesetzt sind, z.B. während 96 Stunden bei 23°C inkubiert und abtrennt, z.B. durch Zentrifugieren. (Man verwendet in diesem Fall vorzugsweise ein synthetisches Nährmedium, um zu vermeiden, dass andere unbekannte oder ähnliche Enzyme aus den Nährlösungsbestandteilen, z.B. aus Erdnussmehl, zugegen sind.) Zwecks Herstellung des zellfreien Extraktes wird das Mycel mit M/15 Phosphatpuffer vom pH 7,0 zweimal gewaschen, dann werden die Zellen mit einer X-Presse (der Fa. AB Biox, NACKA 2, Schweden) in analoger Weise wie z.B. für D-Aminosäureoxidase von Benz et al., Eur. J. Biochem. 20 (1971) 82, beschrieben aufgeschlossen.' Der so gewonnene zellfreie Rohextrakt in M/15 Phosphatpuffer pH 7 wird auf seine Fähigkeit geprüft, Desacetoxycephalo-

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Ο¹

t. *■»

sporin C in Gegenwart von Sauerstoff in Desacetylcephalosporin C umzuwandeln, z.B. indem man ihn während 4 Stunden bei 23°C unter Schütteln mit Desacetoxycephalosporxn C reagieren lässt. Falls die Hydroxylase vorhanden ist, wird Desacetylcephalosporin C gebildet. Dieses wird mittels eines weiteren Enzyms (Desacetylcephalosporin C-0-Acetyl-Transferase) und Acetyl-1-C " -Coenzyra. A in Cephalosporin C übergeführt. Wenn keine Hydroxylase vorhanden ist, bildet sich kein Desacetylcephalosporin C und somit auch kein (radioaktives) Cephalosporin C. Das Desacetoxycephalosporin C häuft sich während der-Züchtung des Pilzstammes "an und ist dann im KuItürfiltrat nachweisbar.

Synthetisches Grundmedium C 3

(NH, )_o SO.,	2,5 ε
KNO₃	5,0 ε
MS SO₄.7H₂O	• o,2 ε-
KH₂PO₂,	ο,2 ε -
Ca CO, . - l) Spurenelementlosung ' s.o."	5,ο ε · 10 ml *
Maltose . "' . ^;	^0,0 g
Methyloieat * " * -	7,0 g
Meso-Inosit	2,0 g .
HpO. dest.	aa 1000 ml
pH vor der Sterilisation	7,3 .
pH nach der Sterilisation	7,0 -ί- 0,2

Sterilisation :'im Autoklaven,. 20 Min., 120°C, 1,2 atü.

5 0 9809/1193 . original inspected

Ill ■

- 13 «-■ ■

Die dUnnschichtchromatographische Prüfung auf Anwesenheit von Desacetoxycephalosporin C kann in der vorgereinigten Ferinentationslösung des zu untersuchenden Stammes (aus einer Kolonie der oben erwähnten Agarplatten) vorgenommen werden. Die Fermentation des Stammes und die Vorreinigung der Fermentationsbrühe erfolgen vorzugsweise in der für die Gewinnung von Cephalosporin C bekannten Weise. So wird der Stamm beispielsweise in einem komplexen Vollmedium 144 Stunden fermentiert und die Ferinentationsbrlihe wie im. belgischen Patent 750 292 (Case 4-6770) beschrieben vorgereinigt, z.B. durch Ansäuern, Filtration, Extraktion, Adsorption an nicht-ionischen Harzen mit grosser Oberfläche, wie Amberlite^ XAD-2, ge~ gegebenenfalls Absorption an schwach basischen Ionenaustauschern wie Amberlite^ IR-68, Elution und Lyophilisation. Das so erhaltene Lyophilisat wird dUnnschichtchromatographisch untersucht. In der Tabelle 1 sind die Rf-Werte an Cellulose

iin 9 verschiedenen Lösungsmittelsystemen angegeben_ViAuss_erdem ent·

hält die Tabelle die entsprechenden Rf-Werte für Cephalosporin C, Desacetylcephalosporin C und Desacetylcephalosporin C-Lacton.

Die L'dsungsmittel sind: . . - . . . ·

Ä: Isopropanol-Ameisensäure-Wasser (77:4:19) B: n-Butanol-Aceton-Diäthylamin-Wasser (37:37:8:18) C: n-Butanol-Essigsäure-Pyridin-Wasser (37,5: 7,5:25:30)

■ . ORIGINAL INSPECTED 509809/1193

D: n-Butanol-Aethanol-Wasser-Eisessig (50:15:20:15)

E: 66%iges wässeriges Acetonitril

F:■ 80%iges wässeriges Phenol

G': n-Butanol-Ameisensäure-Wasser (4:1:4)

H: n-Butanol-Eisessig-Wasser (obere Phase) [11:3:7]

I: 70%iges wässeriges n-Propanol-,

Tabelle 1

Verbindung Pvf-Werte im Lösungsmittel sy st em

A B CDE FG H I

Desacetoxy-

cephal.C °>²¹ °>¹⁸ 0,20 0,33 0,27 0,62 0,33 0,49 0,22 Desacetyl-

cephal. C 0,16 0,00 0,17 0,14 0,25 0,52 0,25 0,36 0,16

Desacetyl-

ceph.C-Lacton0,20 0,00 0,37 0,17 0,45 0,9 -- 0,47

Cephalosporin C 0,25 0,00 0,27 0,22 0,38 0,72 0,29 0,44 0,33

Das durch Fermentation gewonnene Desacetoxycephalosporin C weist die gleichen Rf-Werte wie die synthetisch erhaltene Verbindung auf. Wie Tabelle 1 zeigt, kann Desacetoxy· cephalosporin C, wenn erwünscht, dUnnschichtchromatographisch von den Übrigen Verbindungen abgetrennt werden.

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Zur Abtrennung eignet sich auch der Amino säur eanaly sator [AJv] (Technicon TSMl der Fa. Technicon Corp., Tarryton, -N.Y., USA). In der Tabelle 2 sind die R.etentionszeiten der oben genannten Verbindungen (20 jLbl-Proben einer 5 millimolaren Lösung der Verbindung in 0,2 M Natriumcitrat'puffer vom pH 2) angegeben. Weiter kann Desacetoxycephalosporin C nachgewiesen und von den genannten übrigen Verbindungen getrennt werden durch HochdruckflUssigkeitsehromatographie [ HPLC ].(s. J. Konecny et al., J. Antibiotics 26, [1973]). In Tabelle 2, äusserste rechte Spalte sind die entsprechenden Retentionszeiten in Minuten angegeben.

Tabelle 2

Verbindung Retentionszeit in Minuten

AA "' HPLC

Desacetoxycephalosporin C 59 ' 11,0

Desacetylcephalosporin C 93 10,0

Desacetylcephalosporin C-Lacton 93 5,5

Cephalosporin C 54 12,4

Die Fermentation der erfindungsgemässen Mutanten und die Isolierung von Desacetoxycephalosporin C aus der Fermentationsbruhe erfolgt nach den fUr die Gewinnung von Antibiotika bekannten Methoden. Da Desacetoxycephalosporin C

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ein dem Cephalosporin C sehr ähnliches chemisch-physikalisches Verhalten zeigt, sind alle bekannten Verfahren zur Gewinnung von Cephalosporin C aus Fermentationsflüssigkeiten anwendbar.

Die Gewinnung von Desacetoxycephalosporin C aus der Fermentationsbrühe kann daher z.B. nach den Verfahren der englischen Patente 810,196; 938,758; 968,324; 1,036,125; 1,109,362, 1,205,226 (Case 4-6067), der französischen Patente 1,429,873 oder 2,011,520 (Case 4-6485), des belgischen Patentes 750,292 (Case 4-6770) oder der deutschen Offenlegungsschriften 2,101,345 (Case 4-6940), 1,933,187, 2,031,754 oder 1,939,341 erfolgen.

Der Pilz wird aerob gezüchtet, vorzugsweise submers, unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schottelflaschen oder den bekannten Fermentern. Die Fermentationslösung enthält eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe sowie anorganische Salze. Als Kohlenstoffquelle kommen z.B. assimilierbare Kohlenhydrate wie Glucose, Saccharose, Laktose, Maltose, Stärke, ferner Mannit, Inosit, Glyzerin, in Betracht. Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt: Aminosäuren, insbesondere Methionin,

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Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, z.B. Erdnussmehl, Sojabohnenmehl, Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern oder Destillationsrückstände der Alkoholherstellung , z.B. Cornsteep dry, Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate,'Sulfate von Alkali- oder Erdalkalimetallen, Eisen, Kupfer, Zink und Mangan enthalten.

Die Züchtung erfolgt bei einer Temperatur zwischen 18 und 37°C, vorzugsweise bei ca. 23°C während .4-7 Tagen.

Zur Isolierung des Desacetoxycephalosporin C kann man sich verschiedener Methoden bedienen. Vorzugsweise wird Desacetoxycephalosporin C aus der Fermentationsbrllhe nach den für die Isolierung von Cephalosporin C bekannten Methoden isoliert.

Die Isolierung kann entweder nach dem Whole-Broth-Verfahren direkt aus der Fermentationsbrühe oder Vorzugsv?eise nach Abtrennung des Mycels, z.B. durch Filtrieren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Filterhilfsmitteln wie Diatomeenerde, aus dem Kulturfiltrat erfolgen. Vor oder nach dem Filtrieren kann eine Behandlung mit Säuren, z.B. Mineralsäuren wie Schwefelsäure oder organischen Säuren wie Oxalsäure, zur Ausfällung schwerlöslieber Salze,

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z.B. Calciumsalze, aus der Nährlösung und zur Zerstörung gegebenenfalls vorhandenen Penicillins N vorgenommen werden. Auch können zur weiteren Vorreinigung des Kulturfiltrates lipophile Verunreinigungen daraus entfernt werden. Hierzu eignen sich beispielsweise Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch und/oder Adsorption an Ionenaustauschern. · . '

Als mit VJasser nicht mischbare Lösungsmittel kommen beispielsweise in Betracht aliphatische, cycloaliphatische, araliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe' mit höchstens 12 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls durch Halogenatome, wie Brom, Fluor, besonders Chlor, substituiert sind, z.B. Hexan, Heptan, Cyelohexan, Benzin, Petroläther (Kp. 110- 140⁰C), Kerosen (Kp. 210-240°C), Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Methylenchlorid,· Methylchloroform, Aethylenchlorid, Perchloräthylen, Perfluor-Hthylen, Isopropylbromid, Benzol, Toluol, Xylole, ferner Ester, besonders Niederalkylester von niederen Fettsäuren wie Essigester, Butylacetat, Amylacetat, Ketone wie Methylisobutylketon, Methylisoamylketon, Aether wie Diisopropyläther, mit Wasser nicht oder wenig mischbare Alkohole wie Butanol, 2-Aethylbutanol. Aethylhexanol, Cyclopentanol, Cyclohexanol.

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Die Extraktion mit einem mit Wässer nicht mischbaren Lösungsmittel wird vorzugsweise in Gegenwart eines flüssigen Ionenaustauschers, z.B. "Amberlite" LA-2 (der Fa. Rohm und Haas) durchgeführt. Zweckmässig arbeitet man im sauren pH-Bereich, z.B. pH 1-6. '.' .:-:■ ---·■-: ·----=--· c—

Statt das Kulturfiltrat durch Säurebehandlung und/ oder Lösungsmittelextraktion vorzureinigen, kann man es auch einer aufeinanderfolgenden Behandlung mit einem starken Kationenaustauscherharz, z.B. "Amberlite¹¹ IR-120 oder "Dowex" 50-8 (der Fa. Dow Chemical Co., ) und einem starken Anionen-_Λ austauscherharz, z.B. "Amberlite" IRA-AOO oder 'Dowex" 1 unterwerfen, v?ie im englischen Patent 968,324 beschrieben. Um Desacetoxy cephalosporin C demgegebenen-. falls wie erwähnt vorgereinigten Kultur-1 —r^r-r^-z— filtrat zu entziehen, sind verschiedene Methoden geeignet, die ein- oder mehrmals, einzeln oder in beliebiger Kombination angewandt werden können. Zu nennen sind insbesondere Absorption oder Adsorption, Lösungsmittelverteilung und Präzipitation. "·- . · ·- : ·

Als Absorptionsr oder Adsorptionsmittel kann man beispielsweise Aktivkohle, Alumiiiiumoxid, Cellulose, Ionenaustauschharze und nichtionische Äd^orptionsharze,

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zur Elution vor allem wässerige Lösungen verwenden. Die Verwendung von Aktivkohle und Aluminiumoxid sind beispielsweise im englischen Patent 810 196 beschrieben. Als Ionenaustauscher sind z.B. zu nennen schwach basische Anionenaustauscher wie "Amberlite" IR- .4l3, oder "Deacidite" E, aus denen das gewünschte Produkt z.B. mit wässerigem Pyridinacetat bei einem pH von ca. 6 eluiert werden kann. Es können auch stark basische Anionenaustauscherharze wie "Amberlite" IRA-400, "Dowex" 1, "Dowex" 2 oder "Deacidite" FF verwendet werden, aus denen die Produkte mit ca. 1-n. Essigsäure eluiert V7erden können, vgl. englische Patente 810 196 und 968 324. Als -nichtionisehe Adsorptionsharze hervorzuheben sind mit Divinylbenzol vernetzte Styrolpolymerisate mit grosser Oberfläche wie "Amberlite" XAD-2, aus denen das Desacetoxycephalosporin C beispielsweise mittels wässerigen Alkoholen, z.B. Niederalkanolen wie Methanol, Aethanol, besonders Isopropanol, eluiert werden kann, vgl. belgisches Patent 750,292.

Die Methode der Lösungsmittelverteilung kann beispielsweise in Form der Gegenstromverteilung angewandt werden. Als Lösungsmittelsystem eignen sich Gemische von Wasser und Phenol oder Niederalkyl-substituierten Phenolen, vgl. das englische Patent 810 196.

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Zur Präzipitation von Desacetoxycephalosporxn C aus V7ä*sserigen Lösungen eignen sich z.B.. mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel wie Ketone, z.B. Aceton, oder Niederalkanole, z.B. Isopropanol. Aus konzentrierten, wässerigen Lösungen kann ~die Verbindung auch in Form ihrer Metall- wie Alkalimetall-, z.B. Natrium-, oder Erdalkalimetall-, z.B. Calcium- oder Bariumsalze gefällt werden. Besonders hervorzuheben ist die Fällung als schwerlösliche Schwermetallkomplexe, z.B. als Komplex: mit Kupfer, Quecksilber, Cadmium, Blei, Mangan, Eisen, Kobalt, Nickel, oder insbesondere mit Zink, vgl. franz. Patent 2 011 520. . ...

Zur Trennung von Desacetoxycephalosporin C und gegebenenfalls durch Fermentation ebenfalls gebildeten Cephalosporin C eignet sich besonders Chromatographie an Cellulose. Bei hohem Gehalt an Cephalosporin C.kann es erforderlich sein, die- Chromatographie · in mehr als einer Stufe durchzuführen. Es kann auch vorteilhaft sein, das Cephalosporin C vor einer der Chromatographie-Stufen in Desacetylcephalosporin C überzuführen, da dieses besser von Desacetoxycephalosporin C abgetrennt werden kann. Die Ueberführung von Cephalosporin C in Desacetylcephalosporin C erfolgt in bekannter Weise durch Desäcetyliterung, z.B. mittels Desacetylasen wie Citrus-Desacetylase oder

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Desacetylase aus Mikroorganismen wie sie im englischen Patent 1 080 904 für die Desacetylierung von 7-Amino~ cephalosporansä'ure beschrieben sind, insbesondere mit der Desacetylase aus Bac. subtilis ATCC 6633. Man kann mit dem Zell-Lyophilisat des Mikroorganismus oder mit aus dem Mikrooorganismus gewonnenem Enzym desacetylieren.

Die Eluüion wird z.B. mit vjässerig-alkoholischen oder w'ässerig-phenolischen Lösungen wie wässerigen Niederalkanolen, sj.B. Propanol oder Butanol oder wässerigem Phenol durchgeführt.

Desacetoxycephalosporin C der Formel I hat die folgenden Eigenschaften:

Im UV-Spektrum in Wasser ist 2 = 260 mn. Im NMR-Spektrum

'/ max

(in D^O) ist ein scharfes Signal bei 1,92 S vorhanden, das den 3 Proteinen der CH^-Gruppe in 3-Stellung zugeordnet werden kann. Im IR-Spektrum (in Kaliumbromid) fehlen die für Cephalosporin "C typischen Banden bei 8,15^«- und 9,7 Ii₁ statt dessen ist bei 3,36 Lh eine Bande vorhanden.

20 Die "optische Drehung von Desacetoxycephalosporin C beträgt I«]jj

+.125° + 1° (c — 1 in Wasser). Bei der Hydrolyse von Desacetoxycephalosporin C mit 6 N HCl im Bombenrohr ( 24 h, HO⁰ C) wird neben anderen Zersetzungsprodukten a-Aminoadipinsäure erhalten. Weitere chemisch-physikalische Charakteristika sind oben in den Tabellen 1 und 2 angegeben.

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In allen genannten Charakteristica stimmt das fermenta· tiv hergestellte Desacetoxycephalosporin C mit chemisch hergestelltem Desacetoxycephalosporin C völlig Überein.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. " '

Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

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Beispiel 1

Der Inhalt einer Ampulle mit.lyophilisierter Mycel-Sporen-Suspension der Desacetoxycephalosporin C-Hydrolyase-Ausfallmutante I27a/2, die man durch Bestrahlung von Cephalosporium acretnonium ATCG 14533 mit UV-Licht, wie im allgemeinen Teil der Beschreibung angegeben, erhalten hat, wird in 5 ml M/15 Phosphatpuffer pH 7 aufgelöst. Ein 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 4 Strömungsbrechern und 100 ml der Nährlösung a) wird mit den 5 ml der Cephalosporiumsuspension beimpft und 72 Stunden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 250 Umdrehungen pro Minute (upm), Amplitude 50 mm, bei 25°C inkubiert. Mit je 5 ml der so gewonnenen Vorkultur beimpft man die Hauptkulturlösung b), die'sich ebenfalls in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 1 Strömungsbrecher und 100 ml Nährlösung befindet. Die Kolben werden 168 Stunden auf einer rotierenden Sehtittelmaschine mit 250 upm bei 25°C inkubiert. Vom 4. Tag an werden täglich Proben zur biologischen (Plattendiffusionstest) und chemischen (DUnnschichtchromatogramm) Aktivitätsbestimmung entnommen. Nach 168 Stunden hat sich die maximale Menge Desacetoxycephalosporin C gebildet. Die Kulturlösung hat dann ein pH von 7,5 und eine Konzentration von ca. 750 mg/1 Desacetoxycephalosporin C.

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Nährlösung a) Nähr!Ssuns b)

Cornsteep powder 12,0 g/l Erdnussmehl 30.0 g/l Ammoniumacetat 4.5 g/l RUbenmelasse 20.0 g/l Saccherose 20.0 g/l Maismehl 20.0 g/l

pH vor Sterilisation 7.5 Methyloleat 6.7 g/l pH nach Sterilisation 7.0 ' DL-Methionin 10.0 g/l

Borax < 0.5 g/l CaCO₃ 5.0. g/l

pH vor Sterilisation mit KOH auf 7.0 einstellen.

3 Liter KuItürlösung, die 0,75 g Desacetoxycephalosporin C pro Liter enthält, wird mit 50%iger wässeriger Schwefelsäure (V:V) auf pH 3.0 angesäuert und zentrifugiert. Das Kulturfiltrat mit einem Gehalt von 680 mg Desacetoxycephalosporin C pro Liter wird mit 1,5 Liter einer Lösung von 10% Amberlite LA-2 (Acetatform) in 2-Aethylhexanol in 3 Portionen a 0,5 Liter extrahiert, wobei das Desacetoxycephalosporin C in der wässerigen Phase bleibt . Das extrahierte Kulturfiltrat wird mit 50%iger Schwefelsäure auf pH 2.6 angesäuert und durch 15 Liter Amberlite XAD-2 perklorierto Das Harz wird mit 750 ml deionisiertem Wasser gewaschen und anschliessend mit 3 Liter 12%igem wässerigem Isopropanol eluiert. Das Eluat wird in 4 Fraktionen a 600 ml aufgefangen. Die Fraktion mit der höchsten Konzentration an Desacetoxycephalosporin C wird lyophilisiert. Das Rohlyophilisat enthält 24% Desacetoxycephalosporin C. Es kann wie im Beispiel 2 beschrieben in den Zinkkomplex und sodann in das freie Desacetoxycephalosporin C übergeführt werden.

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Beispiel 2:

27 Liter KulturbrUhe, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, werden mit 50%iger Schwefelsäure auf pH 2,8 gestellt und nach Zusatz'von 810 g Filterhilfsmittel auf einer Filterpresse filtriert. Das saure Filtrat wird an 18 Liter "Amberlite" XAD-2 (Polystyrol-divinylbenzol·- harz) adsorbiert. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt 18 l/Stunden. Die beladene XAD-2 Säule wird mit 20% V/V wässerigem Isopropanol eluiert. Die Eluiergeschwindigkeit beträgt 36 1/Std. Das Eluat wird in Fraktionen zu 2 Liter aufgefangen. Ueber 70% der adsorbierten Aktivität sind in den Fraktionen 7 - 18, d.h. in 24 Liter Eluat. Diese werden an 500 ml Amberlite IRA-68 (Acetat-Form) adsorbiert. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt 5 1/Std. Die Säule wird alsdann mit Pyridinacetatpuffer vom pH 5,5, der 0,44 molar an Pyridin und 0,2 molar an Essigsäure ist, eluiert. Die Eluiergeschwindigkeit beträgt 1 1/Std. Es werden Eluate zu 200 ml aufgefangen. Die Fraktionen 2-13, d.h. 2,4 Liter, enthalten die gesamte Aktivität. Sie werden im Vakuum bei 30 - 35° C auf 100 ml eingeengt. Das Konzentrat wird unter Rühren in 1200 ml Isopropanol eingetragen. Die dabei entstandene Fällung wird abgenutscht, mit Isopropanol gewaschen und saugtrocken in 200 ml Wasser gelöst. Zur klaren Lösung gibt man 20 g Zinkacetat, versetzt dann die homogene Lösung innert 15 Minuten mit 250 ml Isopropanol. Dabei fällt Desacetoxy-

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Cephalosporin C als Zinkkomplex aus. Nach 4-stündigem Kühlen auf 0⁰C wird abgenutscht. Man wäscht den Filterrückstand mit Wasser.und Isopropanol und trocknet bei 50⁰C im Vakuum. Man erhält das Produkt in Form hellbeiger Kristalle, welche gemäss HPLC und DUnnschichtchromatogramm mit Desacetoxy-Cephalösporin C identisch sind (da der Zinkkomplex sich bei diesen beiden analytischen Nachweismethoden gleich wie das freie Desacetoxy-Cephalosporin C verhält).

Aus dem Zinkkomplex kann das freie Desacetoxy-Cephalosporin C in gleicher Weise freigesetzt werden wie Cephalosporin C aus dem Zinkkomplex, vgl. U.S.Patent 3,661,901. Beispielsweise wird eine ca. 10%ige wässerige Suspension des Zinkkomplexes langsam unter Rühren mit einem stark sauren Kationenaustauscher in der Η-Form wie Dowex 50-WX 12*— (sulfoniertesy mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrol) versetzt, bis ein pH von 2,5 erreicht ist. Dann wird die Lösung filtriert und eingedampft. Man kann auch das Natriumsalz herstellen, indem man bis zu einem pH-Wert von 6,5 Natronlauge zugibt, dann einengt und das Nätriumsalz auskristallisieren lässt.

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Claims

Patentansprüche:

,Ii Verfahren zur Herstellung von Desacetoxycephalosporin C, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mutante eines Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus, bei der die Ueberflihrung von Desacetoxycephalosporin C in Cephalosporin C ganz oder teilweise unterbunden ist, in an sich bekannter Weise züchtet und Desacetoxycephalosporin C isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mutante die Desacetoxycephalosporin C-Hydroxylase-Ausfallmutante I27a/2 verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Desacetoxycephalosporin C, gegebenenfalls zusammen mit Cephalosporin C, aus der Fermentationsbrühe nach den für die Gewinnung von Cephalosporin C bekannten Methoden isoliert.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man Desacetoxycephalosporin C, gegebenenfalls zusammen mit Cephalosporin C, durch Absorption oder Adsorption, Lösungsmittelverteilung und/oder Präzipitation aus der Fermentationsbrühe isoliert.

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5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentätionsbrühe durch
Säurebehandlung, Filtration und/oder Lösungsmittelextraktion vorreinigt. . .

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Säurebehandlung mittels Schwefelsäure oder
Oxalsäure durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösungsmittelextraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel in Gegenwart eines flüssigen Ioenenaustauschers durchführt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man das Kulturfiltrat durch Behandlung mit Ionenaustauschern vorreinigt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Desacetoxycephalosporin C, gegebenenfalls zusammen mit Cephalosporin C, an schwach basischen Anionenaustauschern absorbiert und mit wässerigen Lösungen eluiert.

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10; · Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch {»/.'.kennzeichnet, dass man Desacetoxycephalosporin C, gegebenenfalls zusammen mit Cephalosporin C, an nichtionischen Aclßorptionsharzen mit grosser Oberfläche adsorbiert und mit Lösungen eluiert. . . ·

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man Desacetoxycephalosporin C, gegebenenfalls zusammen mit Cephalosporin C, an mit Diviny!benzol vernetzten Polystyrolen adsorbiert und mit vi'asserigen Niederalkanolen eluiert.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11, dadurch gekennzeichnet, dass man Desacetoxycephalosporin C, gegebenenfalls zusammen mit Cephalosporin C, in Form eines Salzes ausfallt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - \X_j dadurch gekennzeichnet, dass man Desacetoxycephalosporin C, gegebenenfalls zusammen mit Cephalosporin C, in Form eines Schwermetallkcmplexes ausfällt.

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1£V · Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man Desacetoxycephalosporin C, gegebenenfalls zusammen mit Cephalosporin C, in Form des Zink-· komplexes ausfällt. ·' . - ■

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, dass man Desacetoxycephalosporin C, von Cephalosporin C trennt, z.B..durch Chromatographie.

16. Verfahren zur Gevjinnung von Desacetoxycephalosporin C vie im Beispiel beschrieben. ""

17. Das nach dem Verfahren der vorhergehenden Ansprlichc erhältliche Desacetoxycephalosporin C.

18. Mutanten von Cephalosporin C-produzierenden Mikroorganismen, bei denen die Ueberführung von Desacetoxycephalo-* sporin C in Cephalosporin C ganz oder teilweise unterbunden ist.

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19. Die Desacetoxycephalosporin C-Hydroxylase-Ausfallmutante I 27a/2.

20. Verwendung von Mutanten von Cephalosporin C-produzierenden Mikroorganismen, bei denen die Ueberfuhrung von Desacetoxycephalosporin C in Cephalosporin C ganz oder teilweise unterbunden ist, zur Gewinnung von Desacetoxycephalosporin Cj dadurch gekennzeichnet, dass man die genannten Mutanten fermentiert und Desacetoxycephalosporin C isoliert.

21. Verwendung der Desacetoxycephalosporin C-Hydroxylase-Ausfallmutante I27a/2, dadurch gekennzeichnet, dass man die . genannte Mutante fermentiert.

22. Verfahren zur Herstellung von Desacetoxycephalosporin C-Hydroxylase-Ausfallmutanten, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus in an sich bekannter Weise mutiert.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus mit mutagenen Mitteln behandelt.

24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet_s dass man einen Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus mit UV-Strahlen mutiert.

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25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 -.24, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mutagenese so durchführt, dass von den behandelten Konidien ca. VU überleben. ■ . .

26. . Verfahren nach einem der Ansprüche 22 - 25, dadurch gekennzeichnet, dass man' eine Vorauslese aus den mutagen behandelten Konidien bzw. den daraus erhaltenen Kulturen durchführt, indem man die Kulturen einem Plattendiffusionstest mit Mikroorganismen, die verschieden empfindlich auf Cephalosporin C und Desacetoxycephalosporin C reagieren, unterwirft. -

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass man als Testorganismen Alcaligenes faecalis, .Neisseria catarrhalis und/oder Sarcina lutea verwendet.·

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 - 27, dadurch gekennzeichnet, dass man die aus den mutagen behandelten Konidien erhaltenen Kulturen bioautographisch mit Mikroorganismen, die verschieden empfindlich, auf Cephalosporin C und Desacetoxycephalosporin C reagieren auf Produktion von Desacetoxycephalosporin C prüft.

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29. Verfahren nach einem der Ansprüche 22-28, dadurch gekennzeichnet, dass man als rautagen zu behandelnden Mikroorganismus Cephalosporium acremonium oder Cephalosporin C produzierende Mutanten dieses Stammes verwende t .

- CIBA-GEIGY AG

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