CN112979600A - 裂环酰基间苯三酚类化合物及其在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

裂环酰基间苯三酚类化合物及其在制备抗癌药物中的应用，涉及医药技术领域。从金丝桃属植物中经硅胶柱色谱、ODS柱色谱、高效液相制备色谱等分离手段制备裂环酰基间苯三酚类化合物。提取分离方法简易，原料容易获得。所述裂环酰基间苯三酚类化合物与核受体RXRα有直接的结合作用且具有显著的抗肝癌、肺癌、宫颈癌及乳腺癌作用，可以靶向RXRα抑制人乳腺癌细胞株MCF‑7的增殖，有望开发为以核受体RXRα为靶点的抗肿瘤药物或作为抗肿瘤药物开发的先导化合物。

Description

裂环酰基间苯三酚类化合物及其在制备抗癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种裂环酰基间苯三酚类化合物及其在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

癌症严重威胁着人类的健康，是当今社会死亡率最高的疾病之一。目前，癌症的治疗主要为手术及化疗，手术治疗后会大大减弱病人的体质，为恢复带来难度，且手术后容易复发；化疗药物多具有毒副作用，对身体伤害非常大。视黄醇受体-α(Retinoid Xreceptor-α，RXRα)是抗肿瘤药物研究的一个理想的分子靶点。(Chen L,Wu L,Zhu L,etal.Overview of the structure-based non-genomic effects of the nuclearreceptor RXRα[J].Cellular&Molecular Biology Letters,2018,23-36.)以RXRα为靶点的LGD1069(Targretin)，已由FDA批准用于治疗皮肤T-细胞淋巴瘤；因此，以RXRα为靶点从天然产物中寻找高效低毒的的抗肿瘤药物具有重要意义。

多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物(Polycyclic PolyprenylatedAcylPhloroglucinols，简称PPAPs)是藤黄科金丝桃属植物的特有成分。PPAPs不仅结构新颖多样且具有广泛的生物活性，如具有抗肿瘤、抗抑郁、抗病毒、抗氧化、抗菌等(郭洁茹,朱虎成,唐芳,张锦文.天然多环多异戊烯基间苯三酚衍生物研究进展[J].中草药,2017(10):2129-2145.)。裂环酰基间苯三酚类化合物是一类间苯三酚母核开环后形成的新颖骨架结构类型。对金丝桃属植物进行了化学成分研究，以期获得更多具有新颖骨架结构的靶向RXRα的抗肿瘤先导化合物。

发明内容

本发明的第一目的在于提供裂环酰基间苯三酚类化合物。

本发明的第二目的在于提供裂环酰基间苯三酚类化合物的制备方法。

本发明的第三目的在于提供裂环酰基间苯三酚类化合物在制备抗肝癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌药物中的应用。

本发明的第四目的在于提供裂环酰基间苯三酚类化合物作为以核受体RXRα为靶点的抗癌药物的应用。

所述裂环酰基间苯三酚类化合物的结构式如下：

所述裂环酰基间苯三酚类化合物的制备方法包括以下步骤：

1)将挺茎遍地金全草切碎后用体积分数60％～99％的乙醇-水溶液冷浸提取2～4次，每次12～24h，收集滤液并减压浓缩得到浸膏，用水混悬，再用等体积石油醚萃取后减压浓缩得到石油醚萃取浸膏；

在步骤1)中，所述乙醇-水溶液体积分数可为70％～95％，所述冷浸提取可2～3次，每次18～24h。

2)将步骤1)得到的石油醚萃取浸膏通过硅胶柱层析法，用环己烷与乙酸乙酯梯度洗脱，得到8个馏分(Fr.1～Fr.8)；

在步骤2)中，所述环己烷与乙酸乙酯的体积比可分别为1︰0，50︰1，25︰1，10︰1，5︰1，2︰1，1︰1，0︰1。

3)将步骤2)中的目标馏分Fr.5再次进行硅胶柱层析，用环己烷和乙酸乙酯梯度洗脱，得到9个馏分(Fr.5A～Fr.5I)；

在步骤3)中，所述环己烷和乙酸乙酯的体积比可分别为1︰0，50︰1，25︰1，20︰1，5︰1，3︰1。

4)将步骤3)中的馏分Fr.5D通过硅胶柱层析法，用石油醚和丙酮梯度洗脱，得到7个馏分(Fr.5D1～Fr.5D7)；

在步骤4)中，所述石油醚和丙酮的体积比可分别为1︰0，100︰1，50︰1，25︰1，10︰1，5：1。

5)将步骤4)中的馏分Fr.5D4通过硅胶柱层析法，用环己烷和乙酸乙酯梯度洗脱，得到5个馏分(Fr.5D4A～Fr.5D4E)；

在步骤5)中，所述环己烷和乙酸乙酯的体积比可分别为1︰0，100︰1，50︰1，25︰1，10︰1，5︰1，0︰1。

6)将步骤5)中的馏分Fr.5D4B通过ODS柱层析法，甲醇和水作为流动相洗脱，得到6个馏分(Fr.5D4B1～Fr.5D4B6)；

在步骤6)中，所述甲醇和水的体积比可为7︰3，8︰2，9︰1，1︰0。

7)将步骤6)中的馏分Fr.5D4B2经HPLC高效液相色谱法制备分离得到化合物1，即所述裂环酰基间苯三酚类化合物。

在步骤7)中，所述HPLC高效液相色谱法可为ODS Rp-18，5μm，250×10mm，85％ACN/H₂O，5mL/min。

所述裂环酰基间苯三酚类化合物可在制备抗癌药物中的应用。所述抗癌药物包括抗肝癌、抗肺癌、抗宫颈癌、抗乳腺癌药物。

所述裂环酰基间苯三酚类化合物可作为以核受体RXRα为靶点的抗癌药物的应用。所述抗癌药物是指抗肝癌、抗肺癌、抗宫颈癌、抗乳腺癌药物等，可以通过靶向RXRα抑制多种肿瘤细胞株的增殖。

本发明从金丝桃属植物中经硅胶柱色谱、ODS柱色谱、高效液相制备色谱等分离手段制备裂环酰基间苯三酚类化合物。本发明提取分离方法简易，原料容易获得。所述裂环酰基间苯三酚类化合物与核受体RXRα有直接的结合作用且具有显著的抗肝癌、肺癌、宫颈癌及乳腺癌作用，有望开发为以核受体RXRα为靶点的抗肿瘤药物或作为抗肿瘤药物开发的先导化合物。

附图说明

图1为不同浓度(0,5,15,20μΜ)化合物1抑制细胞增殖的MTT实验结果(药物作用48h)。其中，a为HepG2，b为H460，c为HeLa，d为MCF-7。

图2为化合物1诱导MCF7细胞凋亡作用的结果图。其中，A为不同浓度化合物1诱导PARP蛋白切割的实验结果图。B为不同作用时间化合物1诱导PARP蛋白切割的实验结果图。

图3为不同浓度(0,5,15μΜ)化合物1的RXRα转录抑制活性结果图。

图4为不同浓度化合物1与RXRα-LBD结合的荧光猝灭实验结果图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

本发明所涉及一种裂环酰基间苯三酚类化合物的制备及结构鉴定

1、化合物的制备：

步骤一：将材料挺茎遍地金(12.9kg)全草切碎后用体积分数60％～99％的乙醇-水溶液冷浸提取2～4次，每次12～24h。优选体积分数70％～95％乙醇-水溶液冷浸提取2～3次，每次18～24h。回收浸泡液并减压浓缩得到乙醇粗提物949.68g，并用等体积的石油醚萃取后减压浓缩得到萃取粗提物。

步骤二：将步骤一中石油醚萃取粗提物150.7g通过硅胶柱层析法，环己烷与乙酸乙酯作为流动相(1︰0，50︰1，25︰1，10︰1，5︰1，2︰1，1︰1，0︰1)系统梯度洗脱，得到8个馏分(Fr.1～Fr.8)。

步骤三：将步骤二中馏分Fr.5(28.72g)通过硅胶柱层析法，环己烷和乙酸乙酯作为流动相(1︰0，50︰1，25︰1，20︰1，5︰1，3︰1)系统梯度洗脱，得到9个馏分(Fr.5A～Fr.5I)。

步骤四：将步骤三中馏分Fr.5D(3.46g)通过硅胶柱层析法，石油醚和丙酮作为流动相(1︰0，100︰1，50︰1，25︰1，10︰1，5：1)系统梯度洗脱，得到7个馏分(Fr.5D1～Fr.5D7)。

步骤五：将步骤四中馏分Fr.5D4(0.75g)通过硅胶柱层析法，环己烷和乙酸乙酯作为流动相(1︰0，100︰1，50︰1，25︰1，10︰1，5︰1，0︰1)系统梯度洗脱，得到5个馏分(Fr.5D4A～Fr.5D4E)。

步骤六：将步骤五中馏分Fr.5D4B(0.59g)通过ODS柱层析法，甲醇和水作为流动相(7︰3，8︰2，9︰1，1︰0)系统梯度洗脱，最后合并为6个馏分(Fr.5D4B1～Fr.5D4B6)。

步骤七：将步骤六中馏分Fr.5D4B2(76.6mg)经HPLC高效液相色谱法(ODS Rp-18,5μm,250×10mm,85％ACN/H₂O,5mL/min)得到化合物1(11.5mg)。

所述化合物1的结构式为：

2、化合物的结构鉴定：

化合物1，无色油状；

(c 0.27,CH₃OH)；UV(CH₃OH)λmax(logε)203(4.42),279(4.52)nm；ECD(CH₃OH)λmax(Δε)205(13.03),276(16.88),309(-12.74)nm；positive-ion HRESIMSm/z 453.2603[M+Na]⁺(cacld.for C₂₆H₃₈O₅Na,453.2611).¹H-NMR(CDCl₃-d,600MHz)δ(ppm):5.03(m,1H,H-19),4.89(m,1H,H-14),3.12(dd,J＝14.4,7.2Hz,1H,H-13α),2.73(t,J＝8.4Hz,1H,H-8),2.60(dd,J＝13.8Hz；7.2Hz,1H,H-7α),2.50(dd,J＝14.4Hz；7.8Hz,1H,H-13β),2.46(m,1H,H-2'),2.06(m,1H,H-18),2.02(m,1H,H-17),1.92(dd,J＝9.0Hz；5.4Hz,1H,H-7β),1.67(s,3H,H₃-21),1.65(s,3H,H₃-16),1.58(s,3H,H₃-22),1.52(s,3H,H₃-11),1.25(s,3H,H₃-12),1.48(s,3H,H₃-10),1.13(s,3H,H₃-4'),1.12(s,3H,H₃-3')；¹³C-NMR(CDCl₃-d,150MHz)δ(ppm):208.8(C-4),198.1(C-1'),193.4(C-2),171.5(C-6),140.9(C-15),132.0(C-20),123.9(C-19),117.6(C-14),95.2(C-1),84.7(C-9),66.2(C-5),58.5(C-3),46.2(C-8),40.1(C-17),36.6(C-2'),34.3(C-7),33.7(C-13),30.4(C-11),26.5(C-18),25.9(C-21),21.1(C-12),19.4(C-3'),19.4(C-4'),17.8(C-22),16.6(C-16)。

实施例2：

本发明所涉及化合物以核受体RXRα为靶点的抗肝癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌作用。

1材料与仪器

1.1实验细胞：人乳腺癌MCF-7细胞

1.2实验仪器

倒置显微镜日本Olympus Leica公司

细胞培养箱美国Thermo公司

Millipore超纯水仪美国Millipore公司

高速冷冻离心机美国beckMan Coulter有限公司

微量移液器美国Eppendorf公司

蛋白垂直电泳仪美国Bio-Rad公司

湿式转移槽美国Bio-Rad公司

一次性培养皿比利时Orange Scientific公司

48孔培养板比利时Orange Scientific公司

96孔培养板比利时Orange Scientific公司

立式自动电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂

电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司

酶标仪上海精宏实验设备有限公司

WH-3涡旋仪上海沪西分析仪器有限公司

超净工作台苏州安泰空气技术有限公司

1.3主要试剂

DMEM(High glucose)Hyclone

胎牛血清Hyclone

胰酶消化液Hyclone

Opti-MEM Hyclone

BCAKit Thermo Scientific

1.4溶液的配置

①RIPA细胞裂解液：

50mMTris-HCl(pH 7.4),150mMNaCl,1mM EDTA,1％Triton,1％脱氧胆酸钠,0.1％SDS,1mM PMSF,5μg/mL Aprotenin,5μg/mL Leupeptasin。

②PBS缓冲溶液：

137mMNaCl,2.7mMKCl,10mM Na₂HPO₄,2mM KH₂PO₄,用盐酸调pH至7.4。

③蛋白质电泳相关试剂：

1)1.0M Tris-HCl缓冲液

取Tris 12.12g，滴加盐酸将pH调至6.8，加入去离子水，定容至100mL，再次将pH调至6.8，高温灭菌后室温保存。

2)1.5M Tris-HCl缓冲液

取Tris 18.2g，滴加盐酸将pH调至8.8，加入去离子水，定容至100mL，再次将pH调至8.8，高温灭菌后室温保存。

3)电泳缓冲液

分别取Tris-HCl 3.03g，甘氨酸18.77g，SDS 1g溶于1000mL蒸馏水中。

4)2×SDS loading buffer

dd H₂O 6mL,0.5M Tris pH 6.8 5mL,20％SDS 4mL，溴酚蓝(bromophenol blue)

4mg，50％甘油4mL，β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)1mL。

5)1×TBST

10mMTris-HCl(pH 7.5),150mMNaCl,0.1％Tween-20。

6)封闭液

5％(W/V)脱脂奶粉溶于1×TBST中。

7)电转液

Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，溶于900mL蒸馏水中，最后加入100mL甲醇溶液，混匀。

8)10％SDS

10g SDS，加蒸馏水至100mL，50℃水浴下溶解，室温保存。

9)10％过硫酸铵(AP)

0.1g过硫酸铵，加超纯水1.0mL，溶解后，4℃保存。

2化合物1对HepG2,H460,HeLa,MCF-7肿瘤细胞的细胞毒作用

外源性MTT可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并在细胞中沉积，而死细胞则无此功能。利用酶联免疫检测仪在490nm波长处检测其吸光度值，可间接反映活细胞数量。

2.1实验方法

①实验细胞：HepG2(人肝肿瘤细胞株),H460(人大细胞肺癌细胞柱),MCF-7(人乳腺癌细胞)HeLa(人宫颈癌细胞)。

②实验操作：

1)收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，制成细胞浓度为10⁵个/mL的细胞悬液，按照10⁴个/孔的细胞量接种于96孔板中，每孔100μL，(边缘孔用无菌PBS填充，每孔100μL培养基)，然后放于37℃含5％CO₂培养箱中培养。

2)待确认细胞贴壁后弃去培养基，加入含药培养基，每孔100μL,设3个复孔。在37℃含5％CO₂培养箱中孵育48h。

3)倒置显微镜下观察细胞状态，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。

4)小心弃去孔内溶液。每孔加入100μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪492nm波长处测量各孔的吸光值。实验设置空白组(培养基、MTT、二甲基亚砜)和对照组(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。肿瘤细胞生长率计算公式如下：

生长率(Growth rate,RT,％)＝[(OD_sample-OD_blank)/(OD_DMSO-OD_blank)]×100％

3.2实验结果

MTT比色法的实验结果显示，化合物1对HepG2、H460、HeLa、MCF-7四种肿瘤细胞的增值均具有一定的抑制活性，且呈浓度依赖性，其IC₅₀值分别为17.49μΜ、11.68μΜ、36.40μΜ、7.34μΜ(图1)。其中，对MCF-7细胞的生长抑制作用最强，提示化合物1通过抑制HepG2、H460、HeLa、MCF-7细胞增殖表现出抗肝癌、肺癌、宫颈癌及乳腺癌活性。

3.Western-blot检测化合物1对凋亡相关蛋白PARP切割的影响

3.1实验方法

①实验细胞：MCF-7(人乳腺癌细胞)。

②实验操作：

1)细胞培养：将冻存的HeLa细胞复苏后，置于DMEM培养基中，于37℃，含5％CO₂且湿度恒定的细胞培养箱中培养，培养24h后更换培养基。继续培养至细胞密度为70％左右时进行传代，传至2-3代后得到形态和生长状态稳定良好的细胞。

2)铺板加药：将培养好的细胞按每孔1×10⁶的密度加入到含2mL培养基的6孔板中，混合均匀后置于细胞培养箱中培养。浓度梯度实验：待细胞贴壁稳定后，换上2mL新鲜的培养基，向其中加入化合物1，终浓度分别为5、10、15和20μM，同时设置空白对照组，向其中加入等量的DMSO。然后将培养基混匀后置于细胞培养箱中培养24h。时间梯度实验：待细胞贴壁稳定后，换上2mL新鲜的培养基，向其中加入化合物1，终浓度为10μM，同时设置空白对照组，向其中加入等量的DMSO。然后将培养基混匀后置于细胞培养箱中分别培养0、12、24、48h。

3)细胞裂解：将培养好的细胞吸去培养基，用预冷的1×PBS溶液清洗细胞两遍，然后将6孔板置于冰盒上，向6孔板中加入适量的含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液。轻微摇晃6孔板至裂解液均匀分布于细胞表面，裂解2min后用细胞刮刀刮取细胞，然后将其转至预冷的1.5mL EP管中，放于冰盒上继续裂解30min，每隔10min将细胞于涡旋振荡仪中振荡2s。最后将裂解好的细胞放在预冷的4℃离心机中，12000rpm离心10min，取离心上清液备用。

4)蛋白浓度的测定：取离心上清液，利用BCA法测定蛋白样品的浓度。

5)蛋白凝胶电泳：取相同质量的蛋白样品，用裂解液补齐至相同体积，加入1/4体积的5×SDS loading buffer(含5％β-巯基乙醇)，于100℃恒温金属浴中5min，置于离心机中离心去沉淀。将等量的蛋白样品加入到制备好的电泳凝胶板的梳孔中，每孔总蛋白量控制在20-60μg，体积不超过30μL。两端加入1μL蛋白maker，于80V电压下电泳。当样品进入分离胶后，可调高电压至120V继续电泳至溴酚蓝条带距离凝胶底部1～2cm处停止电泳。

6)转膜：将凝胶从胶板上取下后暂放于预冷的电转液中，然后取相同大小的PVDF膜(预先使用甲醇处理1min)及滤纸浸入电转移液中。将电转夹黑色面朝下，依次铺上海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵。除去电转夹中气泡，按照膜朝正极的顺序装到电转槽中，于冰盒中进行电转移。此时电压控制在90V，电流控制在300mA以下，电转60～90min。

7)封闭：把电转移后的PVDF膜放于含5％脱脂牛奶的TBST缓冲液中，于水平摇床上，室温封闭1h。

8)一抗反应：把PVDF膜从封闭液中取出后，裁剪所需的蛋白条带，将其用适量的TBST缓冲液清洗2次后，放于抗体孵育盒中，向其中加入对应的一抗，所有一抗均用5％BSA1︰1000进行稀释(anti-PARP，anti-GAPDH)。然后将PVDF膜于4℃摇床振荡过夜。

9)二抗反应：回收一抗后，将PVDF膜用TBTS缓冲液于水平摇床上清洗3次，每次10min，然后加入二抗(1︰5000)，室温下孵育1h。

10)ECL化学发光检测：吸掉二抗后，将PVDF膜用TBTS缓冲液于水平摇床上清洗4次，每次8min。将PVDF膜置于塑料膜中并取ECL化学发光液的A液与B液按1︰1(V/V)混合均匀后备用。在暗室中，将适量的ECL化学发光混合液均匀涂于PVD膜的表面，暗室中曝光，根据信号强弱调整曝光时间。最后依次将胶片进行显影和定影。

3.2实验结果

化合物1可诱导PARP蛋白的切割，且呈浓度及时间依赖性(图2)。因此，化合物1可以诱导MCF-7细胞的凋亡。

4.化合物1对RXRα转录活性的影响

4.1实验过程

①细胞的培养：将人胚肾细胞293T复苏并孵育在含有10％胎牛血清DMEM培养基中，37℃，含有5％CO₂培养箱中培养；传代时用PBS清洗细胞2次，并用胰酶消化2min；传代至细胞状态良好。

②转染：取对数生长期的细胞，于转染前1h更换新鲜含血清DMEM培养基4ml；配置转染溶液，A₁管：pGL3-Promoter-RXRE+RXRα+p-Relina；B₁管：脂质体+Opti-MEM；A₂管：pBind-RXRα-LBD+pG5luc+Opti-MEM；B₂管：脂质体+Opti-MEM。A管和B管分别用振荡器混匀后，室温下静置5min，然后将A管和B管对应转移至同一管中，震荡混匀，室温下静置20min-30min。将混合液分别加入到293T细胞的培养皿中，10％胎牛血清DMEM培养基中，37℃，含有5％CO₂培养箱中培养。

③铺板：转染14h后，弃去培养液，用PBS洗2次，加入2ml胰酶消化液，消解细胞2min后，用含有血清的DMEM培养基终止胰酶的消解反应，用移液枪反复吹打细胞，使其脱壁，制成均匀的单细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl，放入37℃，含有5％CO₂培养箱中培养。

④加药：铺板后6～8h后，显微镜下观察细胞是否己经贴壁。加入不同浓度的化合物，设置单独加药孔和联合9-cis-RA加药孔，药物持续作用12h。

⑤双荧光素酶报告基因检测分析：细胞裂解：除去培养细胞中的培养基；用1×PBS清洗培养细胞，去除清洗液；每孔加入1×PLB 50μL；在室温轻缓晃动培养板30min，取20μL裂解液置于避光的检测试管中待测。使用荧光免疫分析仪检测：加入20μL的LARⅡ溶液，混合均匀后，检测萤火虫荧光素酶的活性；再向检测管中加入20μL

混合均勾，检测海肾荧光素酶活性。

荧光强度值(％)＝OD萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶×100％

4.2实验结果

化合物1分别在5-15μΜ浓度下表现出显著的RXRα转录抑制活性，且呈浓度依赖性(图3)。

5.化合物1与RXRα-LBD的结合实验

视黄酸核受体α(RXRα)是核受体超家族的关键成员。作为配体依赖性转录因子，RXRα可以通过与小分子调节剂相互作用调节广泛的生物学过程，包括细胞分化，增殖和凋亡。RXRα具有核受体的经典功能域，包括DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)。

荧光猝灭实验已广泛应用于蛋白和小分子间相互作用的研究。蛋白中的络氨酸、色氨酸、苯丙氨酸残基可以使蛋白具有荧光吸收，若蛋白与其配体小分子发生相互作用，则会使荧光发生猝灭。

5.1实验过程：

①将RXRα-LBD蛋白用PBS配置成5μM的蛋白溶液，取1mL置于比色皿中，于荧光分光光度计Cary Eclipse Fluorescence spectrophotometer(Varian)中测定荧光吸收曲线。

②将化合物1用PBS配成5mM的样品溶液，逐步向蛋白溶液中滴加1μL配置好的样品溶液，使样品终浓度分别为5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM，分别测定荧光吸收曲线。应用origin软件拟合其Kd值。

5.2实验结果

化合物与RXRα-LBD有直接的结合作用，拟合其K_D值为16.59μM(图4)。

Claims (10)

1.裂环酰基间苯三酚类化合物，其特征在于其结构式如下：

2.如权利要求1所述裂环酰基间苯三酚类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将金丝桃属植物切碎后用体积分数60％～99％的乙醇-水溶液冷浸提取2～4次，每次12～24h，收集滤液并减压浓缩得到浸膏，用水混悬，再用等体积石油醚萃取后减压浓缩得到石油醚萃取浸膏；

2)将步骤1)得到的石油醚萃取浸膏通过硅胶柱层析法，用环己烷与乙酸乙酯梯度洗脱，得到8个馏分Fr.1～Fr.8；

3)将步骤2)中的馏分Fr.5再次进行硅胶柱层析，用环己烷和乙酸乙酯梯度洗脱，得到9个馏分Fr.5A～Fr.5I；

4)将步骤3)中的馏分Fr.5D通过硅胶柱层析法，用石油醚和丙酮梯度洗脱，得到7个馏分Fr.5D1～Fr.5D7；

5)将步骤4)中的馏分Fr.5D4通过硅胶柱层析法，用环己烷和乙酸乙酯梯度洗脱，得到5个馏分Fr.5D4A～Fr.5D4E；

6)将步骤5)中的馏分Fr.5D4B通过ODS柱层析法，甲醇和水作为流动相洗脱，得到6个馏分Fr.5D4B1～Fr.5D4B6；

7)将步骤6)中的馏分Fr.5D4B2经HPLC高效液相色谱法制备分离得到裂环酰基间苯三酚类化合物。

3.如权利要求2所述裂环酰基间苯三酚类化合物的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述乙醇-水溶液体积分数为70％～95％，所述冷浸提取2～3次，每次18～24h。

4.如权利要求2所述裂环酰基间苯三酚类化合物的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述环己烷与乙酸乙酯的体积比可分别为1︰0，50︰1，25︰1，10︰1，5︰1，2︰1，1︰1，0︰1。

5.如权利要求2所述裂环酰基间苯三酚类化合物的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述环己烷和乙酸乙酯的体积比分别为1︰0，50︰1，25︰1，20︰1，5︰1，3︰1；

在步骤4)中，所述石油醚和丙酮的体积比可分别为1︰0，100︰1，50︰1，25︰1，10︰1，5：1。

6.如权利要求2所述裂环酰基间苯三酚类化合物的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述环己烷和乙酸乙酯的体积比分别为1︰0，100︰1，50︰1，25︰1，10︰1，5︰1，0︰1；

在步骤6)中，所述甲醇和水的体积比为7︰3，8︰2，9︰1，1︰0。

7.如权利要求2所述裂环酰基间苯三酚类化合物的制备方法，其特征在于在步骤7)中，所述HPLC高效液相色谱法为ODS Rp-18，5μm，250×10mm，85％ACN/H₂O，5mL/min。

8.如权利要求1所述裂环酰基间苯三酚类化合物在制备抗癌药物中的应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于所述抗癌药物包括抗肝癌、抗肺癌、抗宫颈癌、抗乳腺癌药物。

10.如权利要求1所述裂环酰基间苯三酚类化合物作为以核受体RXRα为靶点的抗癌药物的应用；所述抗癌药物可包括抗肝癌、抗肺癌、抗宫颈癌、抗乳腺癌药物，可以通过靶向RXRα抑制多种肿瘤细胞株的增殖。

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