KR940004838B1

KR940004838B1 - 녹차 플라보노이드의 추출방법

Info

Publication number: KR940004838B1
Application number: KR1019910011858A
Authority: KR
Inventors: 박수남; 부용출; 전체옥; 하병조; 김진우
Original assignee: 주식회사 태평양; 한동근
Priority date: 1991-07-12
Filing date: 1991-07-12
Publication date: 1994-06-02
Also published as: KR930001920A

Abstract

내용 없음.

Description

녹차 플라보노이드의 추출방법

제1도는 실시예 1에서 얻은 플라보노이드를 함유하는 TLC 분획의 건조물질의 HPLC 크로마토그램.

제2도는 실시예 2에서 얻은 (-)에피갈로카테친 갈레이트의 적외선 스펙트럼이다.

본 발명은 녹차 플라보노이드의 추출방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 녹차의 수용성 추출액 또는 수용성 알콜 추출액을 농축하여 얻는 수용액으로부터 초산에칠로 분배 추출하여 얻는 분획을 클로로포름과 메탄올의 혼액을 전개용매 또는 용출 용매로 사용하여 세파댁스컬럼을 통과시켜 간단하고 선택적으로 플라보노이드를 추출하는 방법에 관한 것이다.

녹차 플라보노이드는 주로 (-)-epigallocatechin gallate, (-)-epicatechin gallate, (-)-epigallocatechin, (-)-epicatechin 등으로 구성되어 있으며 그 중에서도 하기 구조식의 (-)-epigallocatechin gallatete의 함량의 가장 높다.

녹차 플라보노이드는 천연 항산화제(Hara et al., USP-4,673,530). 고혈압 치료제(Hara et al., USP- 4,840,966), 그리고 모발용 화장료(Iwabuchi et al., USP-4,517,175)등으로 제시된 바 있으며, 최근에도 계속해서 여러 약물학적 작용에 대한 연구가 진행되고 있는 유용한 식물성분이다. 따라서 보다 간단하고 선택적으로 이 녹차 플라보노이드를 제조하려는 노력이 끊임없이 계속되어 왔으며, 최근에는 Okada등(USP 4,248,789)과 Hara등(USP 4,613,672)에 의해 녹차 플라보노이드를 제조하는 방법이 제시된 바 있다.

Okada등이 제시한 녹차 플라보노이드(또는 catechins)의 제조방법은 녹차의 수용성 추출액에 카페인을 추가하여 페놀성화합물을 침전시킨 후 그 침전물을 물과 크로로포름에서 분배하여 카페인이 제거된 페놀성 물질 분획을 얻은 제1단계, 그리고 그 페놀성 물질 분획을 세파덱스 컬럼을 통과시켜 각각의 플라보노이드 성분을 단리하는 제2단계로 구성되어 있다. 이들의 컬럼 충진제로 사용한 세파덱스는 Pharmacia사의 상품명 Sephadex LH-20였으며 그때 전개 용매로는 부탄올-아세톤-물의 혼액을 쓰고 있다. 이들의 방법은 각각의 플라보노이드 성분을 분리하기에는 매우 적합한 방법이라 판단된다.

그러나 실제로 산업적으로 녹차의 플라보노이드를 이용하고자 할때 각각의 플라보노이드 성분을 단리할 이유는 거의 없으며 그렇다면 이 방법은 너무 복잡하여 산업적으로 그 가치가 높지 못하다. 그리고 제1공정만으로 녹차 플라보노이드를 충분히 정제할 수 있다고 생각할 수 있을지 모르나 그것은 실제가 아니다. 녹차 플라보노이드를 제조하고자 할때 가장 큰 문제가 되는 불순물은 카페인이다. 그러한 카페인을 첨가하는 것은 좋은 제조방법이 못된다. 카페인을 첨가함으로써 플라보노이드 성분만을 선택적으로 침전시킬 수 있다고 주장할지 모르나 실제로는 그렇지 않다. 카페인은 플라보노이드 성분에 선택적이지 않으며 각종 산성물질, 일반적으로 거의 모든 페놀성 물질을 침전시킨다. 이 침전법은 그 선택성에도 문제가 있지만 그 수율에도 문제가 있다. 즉, 침전되지 않고 남은 분획도 무시할 수 없으며, 그만큼 손실이다. 또 카페인이 플라보노이드 성분만을 선택적으로 거의 완벽하게 침전시켰다 하더라도 그 침전물을 단순히 물과 클로로포름의 분배를 통하여 카페인을 완벽하게 제거하는 것은 사실상 불가능하다. 이 조작은 여러번 수행하면 카페인을 완벽히 제거할 수 있지만 이 경우 플라보노이드 성분의 손실을 초래한다. 따라서 이 방법은 제1단계와 제2단계로 구성시킨 공정의 경우 각각의 플라보노이드를 단리할 경우가 아니면 유용하지 않고 따라서 산업적으로는 그 가치가 낮으며, 제1단계만으로 구성된 공정의 경우는 플라보노이드만을 선택적으로, 효율적으로 제조하는 것의 거의 불가능하므로 또한 유용하지가 않다.

Hara등이 제시한 녹차 플라보노이드(또는 catechins)의 제조방법은 녹차의 수용성 알콜 추출액을 농축하여 수용액으로 한 후 클로로포름으로 분해 추출하여 색소, 카페인등을 제거하고, 수층은 다시 초산에칠로 분배 추출하여 초산에칠 분획을 얻는 제1단계, 그리고 그 초산에칠 분획을 고속액체크로마토그래피(HPLC)하여 각각의 플라보노이드 성분을 단리하는 제2단계로 구성되어 있다. 이들의 HPLC는 역상컬럼 충진제를 이용하였고 전개 용매로는 테트라하이드로푸란(THF)-아세톤-물의 혼액을 쓰고 있다. 이 방법도 각각의 플라보노이드 성분을 단리하기에는 매우 적합한 방법이다. 그러나 실제로 산업적으로 녹차의 플라보노이드를 이용하고자 할때 각각의 플라보노이드 성분을 단리할 이유는 거의 없으며 그렇다면 이 방법은 너무 복잡하며, 또한 산업적인 대량 분리에는 적합지 않다. 그리고 제1공정만으로 녹차 플라보노이드를 충분히 정제할 수있다고 생각할 수 있을지 모르나 그것은 실제가 아니다. 농축된 수용액으로부터 클로로포롬으로 분배 추출하여 카페인을 제거하고자 하고 있으나 단 한번의 조작으로 카페인을 완벽하게 제거하는 것은 사실상 불가능하다. 이 조작을 여러번 수행하면 카페인을 완벽히 제거할 수 있지만 이 경우 플라보노이드 성분의 소실을 초래한다.

따라서 이 방법은 제1단계와 제2단계로 구성시킨 공정의 경우 각각의 플라보노이드를 단리할 경우가 아니면 유용하지가 않고 따라서 산업적으로는 그 가치가 낮으며, 제1단계만으로 구성된 공정의 경우는 플라보노이드만을 선택적으로, 효울적으로 제조하는 것이 거의 불가능하므로 또한 유용하지가 않다.

본 발명자 등은 Okada등과 Hara등에 의해 제시된 이들 방법들이 각각의 플라보노이드 성분을 단리할 경우가 아니면 지나치게 그 공정이 복잡하고, 또는 그 공정을 단축시킬 경우는 카페인등 불순물을 선택적이고 완벽하게 제거하는 것이 불가능하다는 문제점이 있음을 파악하고 예의 연구를 진행하여 마침내 1) 공정의 단순화 2) 카페인등 불순물의 선택적이고 완벽한 제거를 실현하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명을 상세히 설명하면 녹차의 수용성 추출액, 또는 수용성 알콜추출액을 농축하여 얻는 수용액을 초산에칠로 추출하여 얻은 분획(이 분획은 플라보노이드외에도 카페인, 엽록소, 기타 유용성 불순물들이 공존하고 있다.)을 클로로포롬-메탄올의 혼액을 전개용매 또는 용출용매로 사용하여 세파덱스 컬럼을 통과시켜 정제하고 농축시켜 플라보노이드를 선택적으로 추출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법을 통하면 얻어진 녹차 플라보노이드를 HPLC 분석한 결과 4가지 주성분 플라보노이드가 98%이상을 차지하고 있었다. 이렇게 간단한 공정으로 이렇게 선택적이고 효율적으로 녹차 플라보노이드를 제조하는 방법은 이전에 없었다.

본 발명은 1) 공정의 단순화 2) 카페인등 불순물의 선택적이고 완벽한 제거를 실현하기 위하여 클로로포롬-메탄올의 혼액을 컬럼분리용 용매로 사용하는 것이 중요한 특징이다. 즉 기존의 발명들에서는 수용액으로부터 클로로포롬으로 추출하여 카페인등의 불순물을 제거하는 전처리를 한 이후에 비로서 컬럼을 통한 정제가 가능하였지만 이 발명에서는 클로로포롬-메탄올의 혼액을 컬러 분리용 전개용매 또는 용출용매로 사용함으로써 그러한 전처리가 필요없게 되었다.

[실시예1]

건조된 녹차 2㎏에 30% 수용성 에탄올 20㎏을 가하고 실온에서 8시간 교반 후 여과한다. 그 여과액 전량을 감압 농축하여 약 5㎏의 수용액을 얻는다. 그 수용액에 초산 에칠 5㎏을 가하고 진탕 후 정치하여 층분리를 행한다. 초산에칠층을 감압 농축하여 초산에칠 분획 약 300㎏을 얻은 후 이를 클로로포롬-메탄올 1:1(v/v)혼액 300㎖에 녹여 미리 충진시킨 세파댁스 컬럼(d=10㎝, h=75㎝)에 가한다. 클로로포롬-메탄올의 1:1(v/v)혼액을 컬럼분리용 전개용매로 사용하여 크로마토그래피한다. 유속은 시간당 3리터를 유지한다. 그 용출액은 유리그릇에 1리터씩 20개 분획을 수집한다. 각 분회중 소량씩을 메탄올에 100배 희석하여 280㎚에서의 흡광도를 측정한다. 분획 4-7에서, 그리고 분획 10-16에서 흡광도가 높게 나타났다. 분획 4-7에는 카페인, 엽록소등의 불순물이 있음이 박충 크로마토그래피(TLC)로 확인된다. TLC할때는 실리카박층에서 클로로포름-메탄올의 7:1(V/V)혼액을 전개용매로 한다. 카페인은 Rf치가 약 0.75이고, 엽록소는 Rf치가 0.8이상이다. 분획 10-16에는 플라보로이드가 있음이 TLC로 확인된다. TLC할때에는 실리카박층에서 클로로포름-메탄올-물의 50:10:1의 (v/v)혼액을 전개용매로 한다. 플로보노이드는 Rf치 약 0.2-0.6에 분포한다. 플라보노이드에 매우 선택전인 발색 시약으로는 바닐린-염산 시약이 있으며 플라보노이드가 있는 부위에서 적색의 반점을 보인다. 이상의 방법으로 플라보노이드의 존재가 확인된 분획 10-16을 합하고 증발 건조시켜 건조 물질 약 200g을 제조한다.

이 건조물질은 메탄올에 1% 농도로 녹이고 HPLC분석한다. 분석컬럼으로는 Lichrosorb RP-18(d=4.6×25㎝)을 이용하였고 전개 용매로는 20% THF를 이용하였다. 유속은 분당 2㎖로 하였고 280㎚의 흡광도로 검출하였다. 그 흡광도로 그려진 크로마토그램은 제1도와 같고 그 분석된 결과는 표1과 같다.

[표 1]

이 분석결과에 따르면 그 피크 면적을 기준으로 할 경우 4종류의 플라보노이드 성분, 즉(-)-에피갈로카테친 갈레이트, (-)-에피카테친 갈레이트, (-)-에피카테친의 피크 면적의 합계는 약 98% 이상에 달한다. 이하에서 이와 동일한 조건에서 분석할 때 그 HPLC 크로마토그램의 피크면적을 기준으로 할 경우 4종류의 플라보노이드 성분, 즉 (-)-에피갈로카테친 갈레이트, (-)-에피카테친 갈레이트, (-)-에피갈로카텐친, (-)-에피카테친의 피그 면적의 합계가 전체 피크면적의 98% 이상인 녹차의 추출물질을 녹차 플라보노이드라 부른다.

[실시예2]

건조된 녹차 2㎏에 30% 수용성 에탄올 20㎏을 가하고 실온에서 8시간 교반후 여과한다. 그 여과액 전량을 가압 농축하여 약 5㎏의 수용액을 얻는다. 그 수용액에 초산 에칠 5㎏을 가하고 진탕 후 정치하여 층분리를 행한다. 초산에칠층을 감압 농축하여 초산에칠 분획 약 300㎏을 얻은 후 이를 클로로포롬-메탄올 1:1(v/v)혼액 300㎖에 녹여 미리 충진시킨 세파덱스 컬럼(d=10㎝, h=75㎝)에 가한다. 클로로포롬-메탄올의 3:1(v/v)혼액을 컬럼 분리용 전개 용매로 사용하여 크로마토그래피한다. 유속은 시간당 3리터를 유지한다. 그 용출액은 유리그릇에 1리터씩 30개 분획을 수집한다. 분획 15-22에는 플라보노이드가 있음이 실시예 1과 동일한 조건에서 TLC로 확인된다. 이 방법으로 플라보노이드의 존재가 확인된 분획 15-22 각각으로부터 소량씩을 농축 건조한 후 각각의 건조물질들을 메탄올에 1% 농도로 녹이고 실시예 1과 동일한 조건에서 HPLC분석하였다. 그 결과 분획 18-19는 (-)-에피갈로카테친 갈레이트의 단일 피크를 보였다. 이들 분획을 농축, 건조하여 건조물질 약 300g을 제조하였다. 이 건조물지의 적외선 스펙트럼은 제2도와 같고 이는 hara등과 Okada등이 보인 (-)-에피갈로카테친 갈레이트의 스펙트럼과 잘 일치하였다.

[실시예3]

건조된 녹차 20㎏에 50% 수용성 에탄올 200㎏을 가하고 실온에서 8시간 교반 후 여과한다. 그 여과액 전량을 감압 농축하여 약 50㎏의 수용액을 얻는다. 그 수용액에 초산 에칠 50㎏을 가하고 진탕 후 정치하여 층분리시킨다. 초산에칠층을 감압 농축하여 초산 에칠 분획 약 4㎏을 얻은 후 이를 클로로포롬-메탄올 1:1(v/v)혼액 4리터에 녹인다. 이 용액을 정제할 용액이라 부르고 그중 400㎖를 미리 충진시킨 세파댁스 컬럼(d=10㎝, h=75㎝)에 가하고 클로로포름-메탄올의 1:1(v/v)혼액을 컬럼 분리용 전개용매로 사용하여 크로마토그래피한다. 유속은 시간당 3리터를 유지한다. 그 용출액은 280㎚에서의 흡광도를 측정할 수 있는 디텍터를 통과시킨 후 처음의 용출액 9리터를 버리고 다음으로 용출되는 액 6리터를 모아 증발건조시켜 건조물질 약 300g을 얻는다. 그리고 나머지 정제할 용액에 대해서도 이 크로마토그래피를 반복하여 전체적으로 건조물질 약 3㎏을 제조한다. 이 건조물질을 실시예 1에서와 동일 조건에서 분석할 때 4종류의 플라보노이드 성분, 즉 (-)-에피갈로카테친 갈레이트, (-)-에피카테친 갈레이트, (-)-에피갈로카테친, (-)-에피카테친의 피크면적의 합계가 전체 피크면적의 98%이상이었다.

[실시예4]

건조된 녹차 20㎏에 50% 수용성 에탄올 200㎏을 가하고 실온에서 8시간 교반 후 여과한다. 그 여과액 전량을 전압 농축하여 약 50㎏의 수용액을 얻는다. 그 수용액에 초산 에칠 50㎏을 가하고 진탕 후 정치하여 충분을 행한다. 초산에칠층을 감압 농축하여 초산 에칠 분획 약 4㎏을 얻은 후 이를 클로로포름-메탄올 1:1(v/v)혼액 4리터에 녹인다. 이 용액을 정제할 용액이라 부르고, 그중 400㎖를 미리 충진시킨 세파덱스 컬럼(d=10㎝, h=75㎝)에 가하고 클로로포롬-메탄올의 5:1(v/v)혼액 10리터로 용출한 후 계속해서 클로로포롬-메탄올의 1:1(v/v)혼액 10리터를 용출한다. 유속은 시간당 3리터를 유지한다. 클로로포롬-메탄올의 5:1(v/v)혼액에 의한 용출액을 버리고 클로로포롬-메탄올의 1:1(v/v)혼액에 의한 용출액만을 모아 증발건조시켜 건조 물질 약 100g을 얻는다. 그리고 나머지 정제할 용액에 대해서도 이 크로마토그래피를 반복하여 전체적으로 건조물질, 즉 녹차 플라보노이드 약 3㎏을 제조한다. 이 물질은 실시예 1에서와 동일 조건에서 분석할 때 4종류의 플라보노이드 성분, 즉 (-)-에피갈로카테친 갈레이트, (-)-에피카테친 갈레이트, (-)-에피갈로카테친, (-)-에피카테친의 피크면적의 합계가 전체 피크면적의 98% 이상이었다.

[실시예5]

건조된 녹차 20㎏에 정제수 200㎏을 가하고 70-80℃에서 8시간 교반 후 여과하다. 그 여과액 전량을 전압 농축하여 약 50㎏의 수용액을 얻는다. 그 수용액에 초산 에칠 50㎏을 가하고 진탕 후 정치하여 층분리 시킨다. 초산에칠층을 감압 농축하여 초산 에칠 분획 약 3㎏을 얻은 후 이를 클로로포름-메탄올 1:1(v/v)혼액 3리터에 녹인다. 이 용액을 정제할 용액이라 부르고, 그중 500㎖를 미리 충진시킨 세파덱스 컬럼(d=10㎝, h=75㎝)에 가하고 클로로포롬-메탄올의 4:1(v/v)혼액 10리터로 용출한 후 계속해서 클로로포롬-메탄올의 1:1(v/v)혼액 10리터를 용출한다. 유속은 시간당 3리터를 유지한다. 클로로포롬-메탄올의 4:1(v/v)혼액에 의한 용출액을 버리고 클로로포롬-메탄올의 1:2(v/v)혼액에 의한 용출액만을 모아 증발 건조시켜 건조 물질 약 400g을 얻는다. 그리고 나머지 정제할 용액에 대해서도 이 크로마토그래피를 반복하여 전체적으로 건조물질, 즉 녹차 플라보노이드 약 2.4㎏을 제조한다. 이 물질은 실시예 1에서와 동일 조건에서 분석할 때 4종류의 플라보노이드 성분, 즉 (-)-에피갈로카테친 갈레이트, (-)-에피카테친 갈레이트, (-)-에피갈로카테친, (-)-에피카테친의 피크면적의 합계가 전체 피크면적의 98% 이상이었다.

Claims

녹차의 수용성 추출액, 또는 수용성 알콜 추출액을 농축하여 얻은 수용액으로부터 초산에칠로 분배 추출하고 그 분배 추출물을 클로로포름과 메탄올의 혼액을 용출액으로 하여 세파덱스(Sephades LH-20, Pharmacia 제품)컬럼을 통과시켜 불순물을 제거하고 플라보노이드 함유 분획을 증발 건조함을 특징으로 하는 녹차 플로보노이드의 추출방법.
제1항에 있어서, 용출액으로 사용되고 클로로포롬과 메탄올의 혼액의 클로로포롬과 메탄올의 3:1 내지 1:1(v/v)혼액임을 특징으로 하는 녹차 플라보노이드의 추출방법.
제1항 또는 2항에 있어서, 수용성 알콜 추출액은 30∼50%(v/v)의 수용성 알콜 추출액임을 특징으로 하는 녹차 플라보노이드의 추출방법.
제1항에 있어서, 세파덱스 컬럼을 클로로포름과 메탄올의 5:1 내지 4:1(v/v)혼액으로 먼저 용출시킨 후 이어서 클로로포름과 메탄올의 1:1 내지 1:2(v/v)혼액으로 용출시킴을 특징으로 하는 녹차 플라보노이드의 추출방법.
제1항 또는 4항에 있어서, 수용성 알콜 추출액은 30∼50%(v/v)의 수용성 알콜 추출액임을 특징으로 하는 녹차 플라보노이드의 추출방법.