KR20100057460A

KR20100057460A - 동백꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 하는 비만억제 및 항산화 조성물

Info

Publication number: KR20100057460A
Application number: KR1020080116511A
Authority: KR
Inventors: 정경희; 양익준; 송현우; 윤수경; 김덕송; 유은혜; 정다화; 강기운; 김영민; 최미승; 박근형
Original assignee: 재단법인 전라남도생물산업진흥재단
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2008-11-21
Publication date: 2010-05-31
Also published as: KR101196426B1

Abstract

본 발명은 항비만효과를 갖는 동백추출물 및 그 이용방법에 관한 것이다. 특히 동백꽃봉오리에 함유된 동백추출물 제공과 그 효율적인 추출방법을 제공하여,동백꽃봉오리에 함유된 생리활성성분을 항비만억제 효과제 및 그 활성물질에 대한 다양한 이용방법에 관한 것이다.항비만효과를 갖는 동백추출물의 활성물질 함량은 석시닉산(succinic acid),3,4-디하이드록벤조닉산(dihydroxybenzoic acid), 4-하이드록벤조닉산(hydroxybenzoic acid),푸마르산(fumaric acid), 4-하이드록신나믹산(hydroxycinnamic acid) 순으로 동백꽃봉오리 100 g 당 각각 0.80, 0.60, 0.55, 0.15, 0.006 ㎍ 함유됨을 특징으로 하며,활성이 강한 에틸아세테이트(EtOAc) 가용 중성 획분에 함유된 항산화물질을 Sephadex LH-20 column chromatography와 ODS-HPLC 방법으로 단리시킨 5종의 활성물질을 에틸아세테이트(EtOAc) 가용 산성획분으로부터 분리함을 특징으로 하는 항비만 효과를 갖는 동백추출물에 대한 이용방법에 관 발명인 것이다.

동백,동백꽃봉오리,항비만,항산화,항노화,기능성식품,동백과립차,정제

Description

항비만효과를 갖는 동백추출물 및 그 이용방법{the Camellia japonica extracts by anti-corpulence effect and the application method}

본 발명은 항비만효과를 갖는 동백추출물 및 그 이용방법에 관한 것으로, 특히 동백꽃봉오리에 함유된 기능성물질의 추출물을 제공하고, 동백꽃봉오리에 함유된 생리활성성분의 이용방법을 제공하기 위한 것이다.

동백나무(Camellia japonica L.)는 동백나무과(Theaceae) 동백속(Camelliae)에 속하는 활엽상록수로 주로 관상수와 같은 원예자원으로, 종실은 고품질 지방이 함유되어 있어 전통적으로 식용유와 화장유의 원료로, 줄기는 고급 숯의 원료로 각각 이용되어 왔다.

높이는 약 7미터 정도이며, 잎은 어긋나고 긴 타원형이다. 4월쯤 붉은색 또는 흰색의 큰 꽃이 가지 끝마다 아름답게 피고 열매는 삭과(果)로 늦가을에 붉게 익는다. 열매는 약용하거나 기름을 짜서 머릿기름, 등잔 기름 따위로 쓰고 목재는 공예의 재료로 사용한다. 따뜻한 지방의 해안에서 자라는데 한국, 일본, 중국 등지에 분포한다.

또한, 차나무가 없는 지역에서는 예로부터 동백의 어린잎을 차의 재료로 사 용하였으며, 사찰에서는 동백꽃을 이용해 화전을 만들기도 하였다. 일본의 경우 건조시킨 동백꽃 꽃봉오리를 민간에서 토혈증에 사용한 기록이 있으며, 그밖에도 동백은 항원충작용, 진경작용, 알콜 흡수 억제 및 HIV 바이러스 억제효과 등 다양한 생리활성이 보고되고 있다.

또한, 녹차와 같이 카테킨, 탄닌산, 비타민, 플라보노이드을 함유하고 있으며 그 밖의 다른 유사한 성분도 많이 함유하고 있다.

또한 건조된 꽃잎을 토혈과 같은 증상에 처방하거나 이뇨작용에 사용하기도 하였다.

동백나무의 종자는 40% 정도가 올레인산, 팔미틴산, 리놀산, 그리고 소량의 스테롤과 토코페롤이 포함된 오일로 채워져 있으며, 그 밖에 트리테르펜(triterpene),테닌(tannin),벤조노이드(benzenoid),스테로이드(steroid),플라보노이드(flavonoid), 그리고 페닐 프로파노이드(phenyl propanoid) 등과 같은 생리활성물질이 종자는 물론 잎과 꽃등에 함유되어 있는 것으로 밝혀지고 있다.

동백기름은 맛 뿐 아니라 지방산이 78.6%나 함유 돼 있어 성인 병 예방과 노화방지 등에 탁월한 효능을 갖고 있는 기능성 식품으로 볶지 않고 그대로 짜서 얻은 동백유를 환부에 발라 상처 치유에도 사용이 가능하다.

근래 동백의 유효 기능성분을 이용한 배경기술로는 다음과 같은 문헌기술들이 있는 실정이다.

[문헌 1] KR 10-0567620 (B1) 2006.3.29

'기능성 동백엽차의 제조방법'

[문헌 2] KR 10-0556524 (B1) 2006.3.6

'항염증 및 항산화 활성을 갖는 동백 추출물 및 이를 함유한 화장료 조성물'

[문헌 3] KR 10-0516954 (B1) 2005.9.23

'동백오일을 함유한 헤어 오일 조성물 및 그 제조방법'

[문헌 4] KR 10-0495454 (B1) 2005.6.14

'피토라이트를 포함하는 미백 화장료 조성물'

[문헌 5] KR 10-0027226 (B1) 1998.10.13

'동백종실을 이용한 식용유 가공방법'

이와 같이 동백은 예로부터 다양한 용도로 사용되였고, 근래 기능성차 및 화장품원료와 오일등으로 개발된 바 있으나, 지금까지 이루어진 동백을 이용한 종전기술에서는 대부분 종실을 대상으로 이루어져서 동백나무의 부위별 성분분석이나 생리활성에 대한 연구가 거의 전무한 실정이다.

이에 본 발명에서는 동백꽃봉오리 추출물로 부터 얻어진 생리활성 물질을 검정하고 특히, 항비만효과를 갖는 동백꽃봉오리 추출물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 적정추출조건과, 그 추출된 유효성분의 손실을 최소화하는 정제방법및 그로부터 추출된 활성물징의 이용방법을 제공하고자 하는 것이다.

이에 본 발명에서는 동백꽃봉오리로부터 추출된 항비만효과를 갖는 동백추출물의 기능성을 검정하고 최적의 정제공정을 제공하도록 한다.

또, 유효성분 분리 및 기능성 검정을 통하여, 원료로부터 유효성분을 분리 정제하고 기능성을 검정하고 전처리 및 다양한 추출공정에 유효성분의 함유량을 최대화하고 안정화할 수 있는 방법을 제공한다.

이를 위하여, 본 발명에서는 동백꽃봉오리로부터 추출된 항비만효과를 갖는 동백추출물의 활성물질 함량은 석시닉산(succinic acid), 3,4-디하이드록벤조닉산(dihydroxybenzoic acid), 4-하이드록벤조닉산(hydroxybenzoic acid), 푸마르 산(fumaric acid), 4-하이드록신나믹산(hydroxycinnamic acid)순으로 동백꽃봉오리 100 g 당 각각 0.80, 0.60, 0.55, 0.15, 0.006 ㎍ 함유됨을 특징으로 하는 항비만 효과를 갖는 동백추출물을 제공하도록하며, 활성이 강한 에틸아세테이트(EtOAc) 가용 중성 획분에 함유된 항산화물질을 Sephadex LH-20 column chromatography와 ODS-HPLC 방법으로 단리시킨 5종의 활성물질을 에틸아세테이트(EtOAc) 가용 산성획분으로부터 분리함을 특징으로 하는 항비만 효과를 갖는 동백추출물 및 그 이용방법을 제공하고자 한다.

이상과 같이 본 발명에 따른 동백꽃봉오리 추출물은 활성이 강한 EtOAc 가용 중성 획분에 함유된 항산화물질을 Sephadex LH-20 column chromatography와 ODS-HPLC 방법으로 단리시킨 5종의 활성물질은 EtOAc 가용 산성획분으로부터 분리, 동정되진 활성물질의 함량은 석시닉산(succinic acid) > 3,4-디하이드록벤조닉산(dihydroxybenzoic acid) > 4-하이드록벤조닉산(hydroxybenzoic acid) > 푸마르산(fumaric acid) > 4-하이드록신나믹산(hydroxycinnamic acid)순으로 나타났으며, 동백꽃봉오리 100 g 당 각각 0.80, 0.60, 0.55, 0.15, 0.006 ㎍ 함유되어 있는 것으로 정량되였으며, 그 활성물질에 의한 3T3-L1 아지방 세포의 분화과정을 관찰결과 3T3-L1 세포에 동백꽃봉오리 추출물 (Camellia japonica buds extract)을 50, 100, 250, 500ug/ml (추출물 건조중량) 씩을 각각 처리한 후 oil red O staining을 통하여 지방 지방형성이 현저하게 억제효과를 살펴본 결과 농도 의존적으로 지방 형성이 뚜렷하게 저해되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 동백꽃봉오리으로부터 추출한 추출물은 동백잎 추출물 보다 항산화 효과 및 항비만 효과가 더 뛰어난 것으로 나타났다.

이하, 본 발명에 따른 동백꽃봉오리 열수 추출물을 이용한 항비만물질의 정제방법 및 그 이용방법에 대한 일실시예는 다음과 같다.

1-1.동백꽃봉오리 열수추출물에 함유된 항산화물질의 분리

(1) 실험재료

본 실험에 사용된 동백(Camellia japonica)은 전라남도 장흥군 천관산 천연동백림에서 자생하는 동백나무에서 2007. 3. 14. 과 2007. 4. 11. 각각 채취한 꽃봉오리를 동결건조하여 시료로 사용하였다.

(2) 용매별 추출물의 조제

동결건조된 동백꽃봉오리 36.7 g (fresh wt. 100 g eq.)을 극성이 다른 다양한 용매인 노르말헥산(n-hexane), 클로로포름(CHCl₃), 에틸아세테이트(EtOAc), 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH)로 각각 추출하였다. 즉, 동결 건조된 동백꽃봉오리에 각각의 용매 500 mL를 넣고 균질기(homogenizer;BM-2 Nissei bio-mixer, Nihonseiki Kaiseiki Ltd., Japan)로 마쇄한 다음, 상온에서 24시간 침지한 후 그라스필터(glass filter;G3)로 여과하여 여액과 잔사를 분리하였고, 이 잔사를 같은 용매로 2회 반복하여 추출여과하였다.

열수 추출은 동백꽃봉오리 36.7 g (fresh wt. 100 g eq.)을 취하여 분쇄기 (후드믹서, 동양산업, Korea)로 분쇄한 후 90℃의 물 1.5 L로 30분간 추출하였고, 추출물을 그라스필터(G3)로 여과하여 여액과 잔사를 분리하였다.

얻어진 추출 여액들은 냉각흡입기(cooling aspirator;CA-111, Eyela, Tokyo, Japan)가 장착된 진공농축기(vacuum evaporator;N-2N, Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 35℃에서 감압 농축하여 각각의 추출물을 얻었다.

(3) 활성물질 분리를 위한 열수 추출물의 조제 및 용매분획

본 발명에 따른 활성물질의 단리정제를 위한 추출물의 조제는 도 1과 같이,동결건조한 동백꽃봉오리 1.46 kg (fresh wt. 3 kg eq.)을 열수(90℃, 30분, 30 L)로 추출한 후 여과하여 얻어진 여액을 5% NaHCO₃를 이용하여 pH 8.0으로 조정한 다음, EtOAc (60 L)로 분배하여 EtOAc 가용 중성 획분 (EtOAc-soluble neutral fraction)과 수상획분 (aqueous phase)으로 분획하였다. 이 수상 획분에 2.0 N HCl를 가하여 pH 3.0으로 조절한 후, EtOAc (60 L)로 분배하여 EtOAc 가용 산성 획분 (EtOAc-soluble acidic fraction)과 수용성 획분 (aqueous phase)으로 분획하였다.

(4) 에틸 아세테이트(Ethyl acetate) 가용 중성 획분으로부터 항산화 활성물질의 분리.

1) 활성물질의 정제

① 세파덱스(Sephadex) LH-20 흡착관 크로마토그래피(adsorption column chromatography)에 의한 정제

Sephadex LH-20 column chromatography는 Lu 등[Lu, Y.R and Foo, L.Y. 1997. Identification and quantification of major polyphenols in apple pomace. Food Chemistry, 59(2): 187-194.]의 방법에 의해 Sephadex LH-20 (70~230 mesh, Pharmacia, Sweden)을 MeOH/H₂O (1:9 v/v)로 상온에서 24시간동안 팽윤시킨 다음 같은 용매로 column (5.0×51 cm)에 충진시킨 후, MeOH/H₂O 용매계를 이동상으로 MeOH 농도를 10~100%까지 10%씩 (각 단계별 560 mL) 증가시키는 단계적 용출 방법으로 용출분획하였다.

② HPLC에 의한 정제

Sephadex LH-20 column chromatography에 의해 정제한 활성획분들의 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에 의한 분석은 μBondapak ODS column (19×300 mm, 125Å, 10 μm, Waters, USA)을 이용하여, 8.0 mL/min (Model 510 solvent delivery system, Waters)의 유속으로 254 nm의 검출파장 (Model 486 tunable absorbance detector, Waters, USA)에서 행하였다. Sephadex LH-20 column chromatography의 정제로부터 얻어진 40% MeOH 획분은 25% MeOH를, 60% MeOH 획분은 30% MeOH를 이동상으로 각각 이용하여 용출분획하였다.

2) 항산화 활성 측정

① DPPH radical-scavenging 활성 측정

다양한 용매 추출물, 열수추출물의 용매분획물 및 단리된 화합물에 대한 DPPH 활성측정법(radical-scavenging)에 의한 항산화활성은 Abe등[Abe, N., Nemoto, A., Tsuchiya, Y., Hojo, H. and Hirota, A. 2000. Studies of the 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging mechanism for a 2-pyrone compound. Biosci. Biotech. Biochem., 64: 306-333. ]의 방법에 따라 측정하였다.

즉, 1,1-디페닐-2-피크릴하이드렉실(DPPH, Sigma, St. Louis, MO, USA) 에탄올용액 (100 μM) 1800 μL에 추출물이 함유된 시료용액 200 μL를 가하여 보텍스믹셔(vortex mixer)로 가볍게 혼합한 다음, 암소에서 30분간 반응시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 또한 비교구로 천연 항산화제인 알파 토코페놀(α- tocopherol)이용하였으며, DPPH radical이 50% 측정되어진 농도를 SC₅₀(50% scavenging concentration)으로 나타냈다.

② 정제 및 단리과정에서 항산화 활성 검정

Yim등[Yim, C.K., Moon, J.H. and Park, K.H. 1999. Isolation of 3,4-dihydroxybenzoic acid, which exhibits antimicrobial activity, from fruits of Gardenia jasminoides. Kor. J. Food sci. Technol., 31: 1386-1392.]의 방법에 의해 정제된 획분 혹은 단리 화합물을 박층크로마티그래피(TLC, 25 TLC aluminium sheets, silica gel 60 F₂₅₄, Merck, Darmstadt, Germany) 접시에 스폿(spot)후, DPPH의 에탄올용액(200 μM)을 접시에 분무하여 보라색이 탈색되어진 획분이나 물질을 항산화 활성의 양성으로 판정하였다. 이하, TLC를 이용한 본 항산화 활성 검정법을 “DPPH-TLC법”이라 표기하였다.

1-3. 동백꽃 열수추출물의 EtOAc-가용산성획분에 함유된 항산화물질의 GC-MS분석에 의한 동정

(1) 실험재료

(2) 추출

동결 건조된 시료 22.9 g (fresh wt. 60.7 g eq.)을 2 L 비이커에 500 mL의 증류수를 가하여 90℃에서 30분간 열수추출 한 후 와트만(Wattman) No. 2 paper가 장착된 그라스필터를 이용하여 열수 추출물을 얻었다.

(3) 열수추출물의 용매분획

동백꽃의 열수 추출물을 Park등의 방법[Kuk, J.H., Ma, S.J., Park, K.H. 1997. Isolation and characterization of benzoic acid with antimicrobial activity from needle of Pinus densiflora. Kor. J. Food Sci. Technol., 29, 204-210.]에 의하여 완충용액(5% NaHCO₃, pH 8.0)으로 조정 후, EtOAc로 분배하여 수용성획분과 EtOAc-가용 중성획분(EtOAc-soluble neutral fr.)을 얻었다.

수용성획분을 완충용액(2N HCl, pH 3.0)으로 조정한 후, EtOAc로 분배하여 EtOAc-가용 산성획분(EtOAc-soluble acidic fr.)으로 분획하였다.

(4) TLC를 이용한 DPPH radical- scavenging 활성측정

동백꽃의 열수추출물을 용매분획하여 얻어진 EtOAc-가용 산성ㆍ중성 획분(EtOAc-soluble acidic and neutral fr.)을 대상으로 항산화활성 평가를 위하여 TLC(Thin Layer Chromatography)를 이용한 DPPH-radical scavenger activity를 평가하였다[송미영. 2003. 무 착즙액에 함유된 항산화물질의 구명. 전남대학교 대학원 석사학위논문].

(5) 실리카겔 흡착관 크로마토그라피(Silicagel adsorption column chromatography)에 의한 활성물질의 정제

Lee 등[LEE SJ., JY, Cho., JI, Cho., JH, Moon., KD, Park., YJ, Lee., KH, Park. 2004. Isolation and charaterization of antimicorbial substance macrolactin A produced from Bacillus amyloliquefaciens CHO104 isolated from soil. J. Microbiol. Biotechnol. 14(3), 525-531. ] 의 방법에 따라 시료(254.45 mg)의 약 10 배량에 상당하는 실리카겔(2 g, 70~230 mesh, 컬럼 크로마토그래피용, Merck, Darmstadt, Germany)을 n-hexane/EtOAc/MeOH(8:6:1,v/v/v) 용매계로 슬러리를 만들어 관(1.6 × 23 cm)에 충진시킨 후, n-hexane/EtOAc/MeOH 용매계의 8:6:1, 6:8:1, 4:10:1, 2:12:1, 0:14:1 (v/v/v)의 순으로 극성을 증가시키면서 용출분획(각 단계별로 20 mL씩)하였다.

(6) 분리된 활성물질의 GC-MS 분석

GC-MS(gas chromatograph-mass spectrometer)분석은 MS(GCMS-QP2010, Shimadzu, Kyoto, JP)에 GC (GC 2010 gas chromatograph, Shimadzu, Kyoto, JP)가 연결된 기기로서, Rtx-1 모세관(0.32 mm × 30 m, Varian Instruments 2700, Walnut Creek, CA, USA)을 장착하고, ion source temperature 200℃, ionizing voltage 70 eV 조건에서 분석하였다.

시료의 TMS (trimethylsilyl) 유도체화는 Cho 등[Cho, J.Y., Moon, J.H., Seong, K.Y. and Park, K.H. 1998. Antimicrobial activity of 4-hydroxybenzoic acid and trans 4-hydroxycinnamic acid isolated and identified from rice hull. Biosci. Biotechnol. Biochem., 62, 2273-2276.]의 방법으로 시료 10 ㎍ 당 유도체화를 위한 시약[무수pyridin:N,O-bis(trimethylsilyl)acetamide: trimethylchlorosilane,10:5:1,v/v] 30 uL를 가하여 잘 혼합한 후, 60℃의 히팅블록(heating block)에서 30분 동안 반응시켜 GC-MS로 분석하였다(표 1).

GC-MS 분석용 표준시약으로 설퍼닉산(succinic acid; Junsei chemical, Tokyo, Japan), 푸마르산(fumaric acid;Junsei chemical, Tokyo, Japan), 4-하이드록벤조닉산(hydroxybenzoic acid), 3,4-디하이디록벤조닉산(dihydroxybenzoic acid;Sigma, St. Louis, MO, USA), 4-하이드록시시내믹산(hydroxycinnamic acid;junsei chemical, Tokyo, Japan)를 사용하였다.

Instrument	GC 2010 gas chromatograph (Shimadzu, Kyoto, JP) GCMS-QP2010 mass spectrometer (Shimadzu, Kyoto, JP)
Column (size)	Rtx-1 capillary column(φ 0.32 mm × 30 m, Varian, USA
Carrier gas	He
Injection	Split mode (20:1), inlet 220℃
Oven temperature	100℃ (3 min) → 5℃/min →240℃ (5 min
Interface temperature	240℃
Ion source temperature	200℃
Scanning mass range	m/z 50~500
Ionizing voltage	70 eV

GC-MS 동작조건(Operating conditions)

(7) 동정된 항산화물질의 정량분석

동백꽃 열수추출물로부터 항산화활성물질로 동정된 화합물들의 함량은 박 등[박선주. 2003. 무잎 착즙액에 함유된 항산화 물질의 규명. 전남대학교 대학원 석사학위논문.]의 방법에 의해 GC 분석에 의하여 측정하였다. 즉, 동백꽃 열수추출물을 용매분획하여 얻어진 각각의 EtOAc 가용 산성획분을 실리카겔 흡착관크로마토그라피(silicagel adsorption column chromatography)한후, n-henxane/EtOAc/MeOH(8:6:1, v/v/v) 획분의 일부를 취하여 TMS 유도체화 하여 GC 분석을 실시하였다. 3회 반복 분석한 후 얻어진 GC의 활성물질의 면적을 구하고, 같은 조건에서 각 표준품의 피크면적에 의한 검량곡선을 작성하여 정량하였다.

1-4. 동백꽃봉오리 열수추출물에 함유된 항산화물질의 분리

1) 용매별 추출물의 수율 및 항산화 활성

동결건조한 동백꽃봉오리 36.7 g (fresh wt. 100 g eq.)을 n-hexane, CHCl₃, EtOAc, EtOH, MeOH 및 열수로 각각 추출하여, n-hexane 추출물 (0.36 g/100 g eq.), CHCl₃ 추출물 (0.85 g/100 g eq.), EtOAc 추출물 (0.84 g/100 g eq.), EtOH 추출물 (12.93 g/100 g eq.), MeOH 추출물 (17.08 g/100 g eq.) 및 열수추출물 (21.13 g/100 g eq.)을 얻었다(표 2).

Solvent	Yield (%)
Hot water	21.1
MeOH	17.0
EtOH	12.9
EtOAC	0.8
CHCl ₃	0.8
n -Hexane	0.4

이 중 열수추출물의 수율이 가장 높게 나타났다. 또한 이들 추출물을 대상으로 DPPH 활성측정법에 대한 항산화 활성을 측정하였다. 시료의 농도에 따른 DPPH (최종농도, 100 )활성측정곡선으로부터 50%의 DPPH radical-scavenging 농도(SC₅₀)값을 구한 결과, 아래 표 3과 같이 노말헥산(n-hexane) 추출물과 클로로포름(CHCl₃)추출물은 250 μg/mL이상, 에틸아세테이트(EtOAc) 추출물이 42 μg/mL, 에탄올(EtOH) 추출물이 32 μg/mL, 메탄올(MeOH) 추출물이 30 μg/mL, 열수추출물이 28 μg/mL로 나타나, 열수 추출물 > MeOH 추출물 ≒ EtOH 추출물 > EtOAc 추출물 > CHCl₃ 추출물 > n-hexane 추출물 순으로 높은 활성을 가짐을 알 수 있었다.

DPPH (final concentration, 100 ) Radical-scavenging activity of various solvent extracts from C. japonica buds. ●-●, α-tocopherol; ■-■, hot water extract; ▲-▲, methanol extract; ◆-◆, ethanol extract; ●-●, ethyl acetate extract; □-□, chloroform extract; △-△, n-hexane extract.

2) 동백꽃봉오리 열수추출 용매분획물의 항산화 활성

동결건조된 동백꽃봉오리 1.46 kg (fresh wt. 3.0 kg eq.)을 열수로 추출한 후, 여과하여 얻어진 상등액을 EtOAc로 용매분획하여 EtOAc 가용 산성 획분(14.2 g)과 EtOAc 가용 중성 획분(20.1 g)을 얻었다. 이들 각 획분을 대상으로 DPPH radical-scavenging 활성을 검정한 결과, 아래 표 4와 같이 SC₅₀은 EtOAc 가용 산성 획분이 6 μg/mL, EtOAc 가용 중성 획분이 4 μg/mL, 그리고 α-tocopherol은 8 μg/mL로 나타났다(표 4).

이들 EtOAc 가용 획분의 항산화 활성은 강한 항산화 활성물질로 알려진 α-토코페롤(tocopherol)의 활성보다 더 높게 나타났다. 이는 동백꽃봉오리 열수추출물의 EtOAc 가용 획분에 다수 혹은 다량의 항산화 물질이 존재함이 시사되었다. 이에 열수추출물의 용매분획 획분 중 가장 강한 활성을 갖는 EtOAc 가용 중성 획분에 함유된 활성 물질의 단리를 시도하였다.

DPPH (final concentration, 100 ) Radical-scavenging activity of EtOAc-soluble neutral fraction (■-■) and EtOAc-soluble acidic fraction (▲-▲) of hot water extracts from C. japonica buds. ●-●, α-tocopherol.

3) 에틸아세테이트(Ethyl acetate)가용 중성 획분으로부터 항산화 활성물질의 분리

가. 활성물질의 정제 및 단리

①세파덱스(Sephadex)LH-20 흡착관크로마토그라피(adsorption column chromatography)에 의한 정제

동백꽃봉오리 열수추출물의 EtOAc 가용 중성 획분(20.1 g)을 MeOH/H₂O 용매계, 즉 MeOH 농도를 10~100%까지 10%씩 증가시키는 스텝와이즈(step-wise) 용출 방법으로 Sephadex LH-20 adsorption column chromatography에 의해 용출 분획하였다. 각각의 용출 획분을 대상으로 DPPH-TLC법에 의해 항산화 활성을 검정한 결과, 20% 메탄올(MeOH) 용출 획분부터 100% 메탄올(MeOH) 용출 획분까지의 모든 획분에서 항산화 활성이 나타났다.

② HPLC에 의한 단리

Sephadex LH-20 column chromatography에 의해 얻어진 각각의 활성획분을 대상으로 μBondapak ODS column에 의한 HPLC 분석을 행하여 각 용출획분의 크로마토그램(chromatogram)상의 패턴을 비교하였다. 그 결과, 40%와 60% MeOH 용출획분은 비교적 높은 분리능이 나타나 이들 용출획분을 대상으로 항산화 화합물의 단리를 행하였다.

㉮ 화합물 1, 2, 3, 4의 단리

Sephadex LH-20 column chromatography에 의해 얻어진 40% MeOH 용출획분을 25% MeOH을 이동상으로 한 C₁₈(19×300 mm, Waters, USA)에 의해 분석한 결과 이 획분의 HPLC 크로마토그램(chromatogram)상에 다수의 피크가 검출되었다(표 5).

이들 피크를 분취하여 얻어진 획분을 대상으로 DPPH-TLC법에 의해 항산화 활성을 검정한 결과, t _R 15, 31, 38, 49, 52분에서 용출된 화합물의 활성이 확인되었다. 동일조건으로 HPLC에 의해 반복분취하여 화합물 1, 2, 3 그리고 4를 각각 단리하는데 성공하였다.

HPLC chromatogram of 40% MeOH fraction after Sephadex LH-20 column chromatography of hot water extract from C. japonica buds. Column, μBondapak ODS (19×300 mm); wavelength, 254 nm; flow rate, 8.0 mL/min; mobile phase, 25% MeOH.

㉯ 화합물 5의 단리

HPLC chromatogram of 60% MeOH fraction after Sephadex LH-20 column chromatography of hot water extract from C. japonica buds. Column, μBondapak ODS (19×300 mm); wavelength, 254 nm; flow rate, 8.0 mL/min; mobile phase, 30% MeOH.

Sephadex LH-20 column chromatography에 의해 얻어진 60% 메탄올(MeOH) 용출획분에 대한 30% 메탄올(MeOH)을 이동상으로 C₁₈(19×300 mm, Waters, USA) 컬럼을 이용하여 HPLC 분석을 행하였다. 그 결과, 다수의 피크들이 검출되었으며(표 6), 이중 순도가 보다 높은 t _R 22, 57, 65분에서 검출된 3종의 피크를 분취하였으며, 이들 획분들은 모두 DPPH 라디칼(radical)를 소거하는 항산화 활성을 나타냈다.

동일조건으로 HPLC에 의해 반복분취하여 화합물 5를 단리하였다. t _R 57, 65분에서 용출된 획분을 분취하여 단리하였으나 미량이고 불순물이 혼재되어 있어 보다 정제의 필요성이 요구되었다.

동백꽃봉오리 열수추출물의 EtOAc 가용 중성획분으로부터 분리된 5종의 항산화 활성 물질에 대한 정제 및 단리 흐름도를 도 2에 나타내었다.

1-5. 동백꽃봉오리 열수추출물의 EtOAc-가용산성획분에 함유된 항산화물질의 GC-MS분석에 의한 동정

1) TLC를 이용한 동백꽃봉오리 용매분획물의 항산화활성

동백꽃보오리(22.29g)의 열수추출물 용매분획하여 EtOAc-가용 산성획분(508.9 mg)과 중성획분(99 mg)을 얻었다. 이들 획분을 대상으로 TLC 평판(plate)를 이용하여 DPPH-radical scavenging 활성을 검정한 결과, EtOAc-가용 산성획분에서 활성을 나타내었다. 그래서 EtOAc-가용 산성획분을 대상으로 활성을 나타내는 원인물질을 구명하고자 하였다.

2) 실리카겔흡착관 크로마토그라피(Silica gel adsorption column chromatography)에 의한 에틸아세테이트(ethyl acetate) 가용 산성획분의 항산화 물질 정제.

에텔아세테이트(EtOAc) 가용 산성획분(508.9 mg)을 n-hexane/EtOAc/MeOH 용매계로 silica gel adsorption column chromatography를 실시하여 얻어진 각 획분을 대상으로 DPPH-TLC법에 의해 항산화 활성을 검정하였다. 그 결과, n-hexane/EtOAc/MeOH, 8:6:1 (v/v/v)의 용출 획분(23.28 mg)에서 활성이 나타났다. 뿐만 아니라 활성물질을 TLC 평판(plate)에 점적하여 전개하여 본 결과 수종의 물질이 존재함을 확인할 수 있었다.

3) GC-MS 분석에 의한 항산화물질의 동정

실리카겔 흡착관 크로마트그라피(silica gel adsorption column chromatography)를 행하여 정제된 활성 획분중에 함유된 화합물들을 검색하고자 GC-MS 분석을 시도하였다. silica gel adsorption column chromatography에서 얻어진 n-hexane/EtOAc/MeOH (8/6/1, v/v/v) 활성획분(23.28 mg)의 일부를 TMS 유도체로 만든 후 GC-MS 분석을 실시한 결과, GC 크로마토그램(chromatogram) 상에서 여러 종의 피크가 검출되어(표 7), 이들 피크를 나타낸 물질의 구조해석을 시도하였다.

t _R 6.13 화합물의 EI-MS spectrum (표 8)으로부터 분자이온피크(molecular ion peak)로 m/z 262 [C₁₀H₂₂O₄Si₂]⁺가 관찰되었으며, 그 외의 대표적인 조각이온(fragment ion)으로 m/z 247 [M-CH₃]⁺, 173 [M-OTMS]⁺, 147([(SiCH₃)₃]⁺, base peak)이 검출되었다. 이 스펙트럼을 Wiley 및 NIST library 검색을 행한 결과, 석시닉산(succinic acid;C₁₀H₂₂O₄Si₂)의 MS 스펙트럼과 일치하여 석시닉산(succinic acid)으로 검정되었다.

EI-MS spectrum of the trimethysilylated compound 1 ( t _R 6.13 min).

t _R 6.45 화합물의 EI-MS spectrum (표 9)으로부터 분자이온피크(molecular ion peak) 로 m/z 260 [C₁₀H₂₀O₄Si₂]⁺이 관찰되었으며, 그 외의 대표적인 조각이온(fragment ion)으로 m/z 245 [M-CH₃]⁺, 베이스피크(base peak) 147 ([(SiCH₃)₃]⁺), 115 [M-(TMS)₂]⁺이 검출되었다.

EI-MS spectrum of the trimethysilylated compound 2 ( t _R 6.45 min).

Wiley 및 NIST library 검색을 행한 결과, 분자내의 두 곳에 TMS기가 도입된 푸마르산(fumaric acid;C₁₀H₂₀O₄Si₂)의 MS spectrum과 일치하여 푸마르산(fumaric acid)으로 검정되었다.

t _R 12.23 화합물의 EI-MS spectrum (표 10)으로부터 molecular ion peak로 m/z 282 [C₁₃H₂₂O₃Si₂]⁺가 관찰되었으며, 그 외의 대표적인 fragment ion으로 m/z 267 [(M-CH₃)⁺, base peak], 223 [M-(CH₃)₄]⁺, 193 [M-OTMS]⁺이 검출되었다.

EI-MS spectrum of the trimethysilylated compound 3 ( t _R 12.23 min).

이 spectrum을 Wiley 및 NIST library 검색을 행한 결과, 분자내의 두 곳에 TMS기가 도입된 4-hydroxybenzoic acid (C₁₃H₂₂O₃Si₂)의 MS spectrum과 일치하여 4-하이드록시벤조닉산(hydroxybenzoic acid)으로 검정되었다.

t _R 16.63 화합물의 EI-MS spectrum (표 11)으로부터 molecular ion peak로 m/z 370 [C₁₆H₃₀O₄Si₃]⁺이 관찰되었으며, 그 외의 대표적인 fragment ion으로 m/z 355 [(M-CH₃)⁺], 311 [M-(CH₃)₄]⁺, 193 [M-OTMS, base peak]⁺이 검출되었다.

EI-MS spectrum of the trimethysilylated compound 4 ( t _R 16.63 min).

이 spectrum을 Wiley 및 NIST library 검색을 행한 결과, 분자내의 두 곳에 TMS기가 도입된 3,4-디하이드로벤조닉산(C₁₆H₃₀O₄Si₃)의 MS 스펙트럼과 일치하여 3,4-디하이드로벤조닉산 으로 검정되였다.

t _R 18.46 화합물의 EI-MS spectrum (표 12)은 분자이온피크(molecular ion peak)로 m/z 308 [C₁₅H₂₄O₃Si₂(M⁺)]의 시그널(signal)을 보였으며, 그 외의 대표적인 조각이온(fragment ion)으로 m/z 293 [(M-CH₃)⁺,base peak], 249[M-(CH₃)₄]⁺, 219 [M-OTMS]⁺가 검출되었다.

EI-MS spectrum of the trimethysilylated compound 5 ( t _R 18.46 min).

이 스펙트럼을 Wiley 및 NIST library 검색을 행한 결과, 분자내의 두 곳에 TMS기가 도입된 4-하이드록신나믹산(C₁₅H₂₄O₃Si₂)의 MS 스펙트럼과 일치하여 4-하이드록신나믹산으로 검정되었다.

상기 5종 화합물의 보다 신뢰성 있는 동정을 위해서 Wiley 및 NIST library 검색에 의해 예상된 각 화합물의 표준품을 동일한 방법에 의해 TMS 유도체화하여 GC-MS 분석을 행한 결과, 각 물질의 GC 스펙트럼상에서의 체류시간(retention time;t _R )뿐만 아니라 그들 각각의 EI 스펙트럼 또한 일치하였다.

따라서, 동백꽃봉오리 열수추출물의 EtOAc 가용 산성획분에 함유된 5종의 화합물에는 2종의 유기산인 석시닉산(화합물 1)와 푸마르산(화합물 2)가 그리고 3종의 페놀성 화합물(phenolic compound)들인 4-하이드록시벤조닉산(화합물 3), 3,4-디하이드록시벤조닉산(화합물 4), 4-하이드록신나믹산(화합물 5)가 각각 함유되어 있음이 확인되었으며 또한 이들 물질이 동정되었다(표 13).

identified antioxidative active compounds from EtOAc-soluble acidic fraction of Camellia japonica flowers by GC-MS.

동정된 2종의 유기산 및 3종의 페놀성 화합물들은 천연에 넓게 분포되어 있는 물질로 알려져 있다. 석시닉산(succinic acid)는 홍화꽃잎,푸마르산(fumaric acid)는 무잎등에서 항산화활성물질로 알려져 있다. 또한 4-하이드록시벤조닉산(hydorcxybenzoic acid)는 왕겨 및 땅콩껍질에, 4-하이드록시나믹산(hydroxycinnamic acid)는 왕겨에, 그리고 3,4-디하이드록벤조닉산(dihydorxybenzoic acid)는 치자 등의 항미생물 활성물질로 보고 되어진 바 있다.

4) GC에 의한 동정된 항산화물질의 정량분석

동백꽃에 함유된 활성화합물의 함량을 분석하기 위하여 GC에 의한 정량분석을 실시하고자 먼저 동정된 5종의 표준품에 의하여 검량선을 작성하고 동정을 실시하였다. 그 결과, 유기산인 석시닉산(Succinic acid) 함량이 가장 높게 나타났으며 그 다음으로 3,4-디하이드록시벤조닉산(dihydroxybenzoic acid) 그리고 4-하이드록시벤조닉산(hydroxybenzoic acid)와 푸마르산(Fumaric acid)가 높게 나타났으며 마지막으로 4-하이드록시나믹산(hydroxycinnamic acid)의 순으로 함량이 나타났다(표 14).

Compounds	Hot-water extracts
Compounds	Contents(㎍/100 g)
Succinic acid	0.80
Fumaric acid	0.15
4-hydroxybenzoic acid	0.55
3,4-dihydroxybenzoic acid	0.60
4-hydroxycinnamic acid	0.006

The content of the identified antioxidative active compounds of Camellia japonica flowers

[실험결과]

동백꽃봉오리(Camellia japonica buds)에 함유된 기능성 항산화 활성물질을 분리하였다.

동백꽃봉오리를 n-hexane, CHCl₃, EtOAc, EtOH, MeOH 및 열수로 추출하여 수율과 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging 활성을 비교하였다.

그 결과, 추출물의 수율은 열수 추출물 > 메탄올(MeOH)추출물 > 에탄올(EtOH) 추출물 > 에틸아세테이트(EtOAc)추출물 ≒ 클로로포름(CHCl₃₎추출물 > 노말헥산(n-hexane)추출물 순이었으며, 항산화 활성은 열수 추출물 > 메탄올(MeOH) 추출물 ≒ 에탄올(EtOH)추출물 > 에틸아세테이트(EtOAc)추출물 > 클로로포름(CHCl₃ )추출물 > 노말헥산(n-hexane)추출물 순으로 나타났다.

이들 추출물 중 추출물의 수율과 항산화 활성이 높은 열수 추출물으로부터 항산화 활성물질의 분리를 시도하였다.

동백꽃봉오리 열수추출물을 용매분획하여 EtOAc 가용 산성 획분과 EtOAc 가용 중성 획분으로 분획하였다. 각 획분에 대한 활성을 검정한 결과, 두 획분 모두 높은 항산화 활성이 인정되었으나 보다 활성이 강한 EtOAc 가용 중성 획분에 함유된 항산화물질을 Sephadex LH-20 column chromatography와 ODS-HPLC 방법으로 5종의 활성물질의 단리시켜 냈다.

한편,동백꽃봉오리 열수추출물을 완충용액과 에틸아세테이트(EtOAc)를 가지고 용매분획하여 EtOAc 가용 산성획분과 EtOAc 가용 중성획분으로 분획하여 DPPH radical-scavenging 활성을 검정한 결과, EtOAc 가용 산성획분에서 항산화 활성이 나타났다.

이 활성획분을 실리카겔흡착관크로마토그라피(silica gel adsorption column chromatography)에 의해 활성물질을 정제하고, TLC를 이용하여 활성을 검정한 후 GC-MS를 이용한 기기분석에 의해 활성물질을 동정하였다.

그 결과, EtOAc 가용 산성획분에서는 석시닌산(succinic acid), 푸마르산(fumaric acid), 4-하이드록벤조닉산(hydroxybenzoic acid), 3,4-디하이드록벤조닉산(dihydroxybenzoic acid), 4-하이드록신나믹산(hydroxycinnamic acid)의 5종의 항산화 활성물질의 존재가 GC-MS 분석에 의해 확인되었다.

EtOAc 가용 산성획분으로부터 분리, 동정되어진 활성물질의 함량은 succinic acid > 3,4-dihydroxybenzoic acid > 4-hydroxybenzoic acid > fumaric acid > 4-hydroxycinnamic acid 순으로 나타났으며, 동백꽃봉오리 100 g 당 각각 0.80, 0.60, 0.55, 0.15, 0.006 ㎍ 함유되어 있는 것으로 정량되었다.

상기와 같은 실험결과를 통하여, 본 발명에 따른 동백꽃봉오리 열수 추출물에 의한 항비만효과를 보기 위한 오일 레드-O 스테이닝(Oil red-O staining)을 통하여 지방형성이 억제되는지 살펴보았다.

[Oil red-O Staining]

0.7g Oil red O(sigma# O-0625,FW 408.5)를 200ml의 이소프로페놀(isopropanol)에 녹여서 Oil red O stock solution을 만들고 60% Oil red O stock solution과 40% D.W.의 비율로 Oil red O working solution을 만들었다. 배지를 제거한 후 PBS로 세포를 씻고 10% 포름알데이드(formaldehyde) 1ml 넣고 실온에서 1시간 방치시켰다. 포름알데이드를 제거 하고 60% 이소프로페놀(isopropanol)로 씻고 말린 후, Oil red O working solutioin 1ml 넣고 1시간 염색한 후 D.W.로 4회 반복해서 씻어내고 관찰결과 아래 표 15과 같았다.

(3T3-L1 아지방 세포의 분화과정)

상기 3T3-L1 아지방 세포의 분화과정을 관찰결과 3T3-L1 세포에 동백꽃봉오리 추출물 (Camellia japonica buds extract)을 50, 100, 250, 500ug/ml (추출물 건조중량) 씩을 각각 처리한 후 oil red O staining을 통하여 지방 형성이 억제되는지를 알아보았다.

그 결과는 아래 표 16과 같은 사진에서 본 바와 같이 컨트롤(control)과 비교하였을 때 positive control로 사용한 캅사이신(Capsaicin)에서는 지방 형성이 약하게 저해되었고 동백꽃봉오리 추출물을 처리한 것은 농도 의존적으로 지방 형성이 뚜렷하게 저해되는 것을 확인하였다.

(동백꽃봉오리 추출물의 지방생성 저해효과)

참고로, 3T3-L1 세포에 동백잎 추출물 (Camellia japonica flower extract)을 50, 100, 250, 500ug/ml (추출물 건조중량) 씩을 각각 처리한 후 oil red O staining을 통하여 지방 형성이 억제되는지를 알아본 결과 표 17과 같이 나타났다.

결과는 컨트롤(control)에 비해 동백잎 추출물을 처리한 그룹에서 지방 형성이 저해됨을 확인하였다.

(동백잎 추출물의 지방생성 저해효과)

이상과 같이 본 발명에 따른 동백꽃봉오리로부터 추출한 동백추출물은 동백잎 추출물 보다 항산화 효과 및 항비만 효과가 더 뛰어난 것으로 나타났다.

본 발명을 통해 기능성 물질이 함유된 동백추출물 특히 동백꽃봉오리로 부터 추출된 동백추출물을 이용한 임상실험 결과는 공중보건학적으로 사용될 것이며, 수익창출을 기할 수 있을 것이며, 이러한 동백추출물로부터 얻어진 신규 생리활성 물질의 특성에 의학, 약학, 식품학, 농학, 생물학적 기능을 갖는 물질로 활용이 가능할 것으로, 기능성 물질들이 함유된 작물의 효능 입증으로 이에 따른 작물 선정 및 재배, 추출과 제품화에 관련되어 개발된 기술을 제약회사로 기술이전을 시켜서, 기존의 의료 약물의 향상된 제형의 개발에 확대 응용할 수 있을 것이다.

도 1 은 본 발명에 따른 동백꽃봉오리의 열수추출물과 용매분획 흐름도.

도 2는 동백꽃봉오리 열수추출물의 에틸아세테이트(EtOAc)가용 중성획분으로부터 분리된 5종의 항산화 활성 물질에 대한 정제 및 단리 흐름도.

Claims

동백꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 하는 비만억제용 조성물.
제 1 항에 있어서, 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 비만억제용 조성물.
동백꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 하는 항산화 조성물.
동백꽃봉오리를 열수 추출한 후, 상기 열수 추출물의 pH 8로 조정하고 에틸아세테이트로 분배하여 에틸아세테이트층을 회수하는 것을 특징으로 하는 동백꽃봉오리로부터 항산화 활성을 갖는 추출물의 제조방법.
제 4 항에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분배과정에서 얻어지는 물층을 pH 3으로 조정하고 다시 에틸아세테이트로 분배하여 에틸아세테이트층을 회수하는 것을 특징으로 하는 동백꽃봉오리로부터 항산화 활성을 갖는 추출물의 제조방법.