CN114075580B - 一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，属于生物技术领域。本发明公开的一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，以酵母菌为发酵菌种，葡萄糖为原料，根据在线参数CER的变化调控补料阶段的补料速率提高发酵液中赤藓糖醇的含量，从而提高赤藓糖醇的转化率。本发明方法操作简单，成本低，转化率显著提高。

Description

一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法。
背景技术
赤藓糖醇，又名丁四醇，分子式为C4H10O4，普遍存在于自然界环境中，如甜瓜、海藻、蘑菇、葡萄等水果和蔬菜中。赤藓糖醇成品性状为白色结晶颗粒或粉末，具有熔点低、热量低、吸湿性低、甜味协调性好、溶解时吸热多，而且对酸、热的稳定性高等良好性质。赤藓糖醇是一种具有良好的理化特性和生物学活性的功能性糖醇，被广泛应用在食品饮料、乳制品、日化以及医药等行业中。
赤藓糖醇最早是从藻类、苔藓及某些草类中提取获得的，但其成本高，产量很低，目前赤藓糖醇的生产方法主要有化学合成法、微生物发酵法。化学合成法主要有两种方式，一是利用高碘酸法将淀粉转化成双醛淀粉，然后再经过氧化过程得到赤藓糖醇和其他衍生物；二是丁烯二醇与过氧化氢反应氢化还原合成。这两种化学合成法均存在能耗大、污染大等问题，而微生物发酵法相比化学合成法，表现出明显优势而被广泛采用，如生产条件温和、能耗低、产品质量稳定、食品安全性高、环境友好等。微生物发酵使用的菌种是以耐高渗酵母等微生物为主，该方法是采用酵母发酵将葡萄糖转化成赤藓糖醇及少量的核糖醇、丙三醇等副产物，再经分离、提取、精制获得赤藓糖醇成品。
微生物发酵法在发酵罐中发酵合成目的产物受很多因素的影响，除了菌体自身的生产性能以外，还有培养基成分、培养基的配比、种子的质量和发酵条件控制等因素都会一定程度上影响目的产物的生产。菌种一般选用酵母菌包括解脂假丝酵母、丛梗孢酵母或球拟酵母。以解脂假丝酵母为菌种发酵时，还存在发酵周期长，赤藓糖醇底物溶度低和转化率不稳定等问题。
因此，提供一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，具体步骤如下：
(1)将处于对数生长中后期的酵母菌按8～10％的接种量接种于发酵培养基中培养发酵；所述培养发酵工艺为罐压0.02～0.08Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.5vvm，搅拌速率200～600r/min，循环水控制发酵罐温度30±0.5℃，发酵初始pH为5.5～6.0，其中通过调控转速和通气比调节溶解氧DO 15％-30％；
(2)发酵到细胞密度为OD600nm＝18～30，pH为3.0～4.0进入发酵转化产赤藓糖醇阶段；培养发酵工艺为罐压0.02～0.05Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.0vvm，搅拌速率200～500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0.5℃，维持发酵pH为3.0～3.5，其中通过调控转速和通气比调节溶解氧DO 20～30％；
(3)当发酵液中葡萄糖含量低于150g/L时通过流加补料培养基进行补料，补料速率为0.10～1.2L/h，根据发酵过程中CER数据变化进行调控，以获得较高产物浓度的发酵液，具体为：CER在5～10逐渐递增时其补糖速率在0.10～1.0L/h不断加快；CER高于10时采取低补料速率，为0.10L/h；CER低于5时采取高补料速率，为1.2L/h。
进一步，步骤(1)所述酵母菌包括解脂假丝酵母、丛梗孢酵母或球拟酵母；优选解脂假丝酵母。
进一步，步骤(1)所述对数生长中后期是指酵母菌细胞密度OD600nm＝1.2～2.0。
进一步，步骤(1)所述发酵培养基包括葡萄糖250-300g/L、磷酸二氢钾5g/L、酵母粉15g/L、玉米浆(波美度19.5)10g/L、硫酸镁0.25g/L、柠檬酸8g/L。
进一步，步骤(3)所述补料培养基包括葡萄糖500g/L、硫酸镁10g/L、植酸5g/L以及微量元素溶液5mL/L；其中微量元素溶液包括氯化钴2.5g/L、氯化锰15g/L、氯化铜1.5g/L、氯化锌8g/L和维生素B14.5g/L，具体为先将微量元素溶于水，制备成微量元素溶液，再用于制备培养基。
进一步，步骤(3)所述CER为二氧化碳释放率，采用质谱仪对发酵过程中的进气和尾气实时在线采集后通过发酵之星软件在线计算获得。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，在以酵母菌发酵制备赤藓糖醇的过程中，根据CER值变化调控补料速率对赤藓糖醇的转化率有明显提高，转化率可提高至62％；该方法操作简单，成本低，转化率显著提高。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用酵母均为购买获得。
实施例1
一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，具体步骤如下：
(1)将解脂假丝酵母在摇床中进行培养，得到OD600nm为1.2的解脂假丝酵母菌种。
(2)将发酵培养基在105℃灭菌15min，冷却后将解脂假丝酵母菌种接种于发酵培养基中进行培养，接种量10％，控制参数初始温度为30±0.5℃，初始pH值为6.0，调控搅拌或通气比维持溶解氧DO 15～30％，罐压0.02～0.08Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.5vvm，搅拌速率200～600r/min；发酵培养基的配方为：葡萄糖300g/L、磷酸二氢钾5g/L、酵母粉15g/L、玉米浆(波美度19.5)10g/L、硫酸镁0.25g/L、柠檬酸8g/L。
(3)发酵到酵母菌细胞密度OD600nm为20，调节pH值为3.5，进入发酵转化产赤藓糖醇阶段，此时调控发酵工艺参数为罐压0.02～0.05Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.0vvm，搅拌速率200～500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0.5℃，流加柠檬酸与氨水所得的柠檬酸铵维持发酵pH为3.0～3.5，其中通过调控转速和通气比调节溶解氧DO 20～30％。
(4)葡萄糖浓度低于150g/L时开始补料，补料速率为0.10-1.2L/h，根据CER的数值反馈适当调控，发酵工艺参数为罐压0.05Mpa，反应罐内通气比为0.8vvm，搅拌速率500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0.5℃；补料培养基为葡萄糖500g/L、硫酸镁10g/L、植酸5g/L以及微量元素溶液5mL/L，其中微量元素溶液包括氯化钴2.5g/L、氯化锰15g/L、氯化铜1.5g/L、氯化锌8g/L和维生素B14.5g/L；
(5)补料25h后停止补料继续发酵直至葡萄糖含量低于5.0g/L，发酵结束，得发酵液中赤藓糖醇含量190g/L，赤藓糖醇的转化率为62.4％。
实施例2
一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，具体步骤如下：
(1)将丛梗孢酵母菌在摇床中进行培养，得到OD600nm为1.4的丛梗孢酵母菌种。
(2)将发酵培养基在105℃灭菌15min，冷却后将丛梗孢酵母菌种接种于发酵培养基中进行培养，接种量8％，控制参数初始温度为30±0.5℃，初始pH值为5.5，调控搅拌或通气比维持溶解氧DO 15～30％，其中罐压0.02～0.08Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.5vvm，搅拌速率200～600r/min；所述发酵培养基的配方为：葡萄糖280g/L、磷酸二氢钾5g/L、酵母粉15g/L、玉米浆(波美度19.5)10g/L、硫酸镁0.25g/L、柠檬酸8g/L。
(3)发酵到酵母菌细胞密度OD600nm为20，调节pH值为3.0，进入发酵转化产赤藓糖醇阶段，此时调控发酵工艺参数为罐压0.02～0.05Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.0vvm，搅拌速率200～500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0.5℃，流加柠檬酸与氨水所得的柠檬酸铵维持发酵pH为3.0～3.5，其中通过调控转速和通气比调节溶解氧DO 20～30％。
(4)葡萄糖浓度低于150g/L时开始补料，补料速率为0.10-1.2L/h，根据CER的数值反馈适当调控，发酵工艺参数为pH 3.5，罐压0.05Mpa，反应罐内通气比为0.8vvm，搅拌速率500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0.5℃；补料培养基为葡萄糖500g/L、硫酸镁10g/L、植酸5g/L以及微量元素溶液5mL/L，其中微量元素溶液包括氯化钴2.5g/L、氯化锰15g/L、氯化铜1.5g/L、氯化锌8g/L和维生素B14.5g/L；
(5)补料25h后停止补料继续发酵直至葡萄糖含量低于5.0g/L，发酵结束，得发酵液中赤藓糖醇含量187.8g/L，赤藓糖醇的转化率为61.7％。
实施例3
一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，具体步骤如下：
(1)将球拟酵母菌在摇床中进行培养，得到OD600nm为1.6的球拟酵母菌种。
(2)将发酵培养基在105℃灭菌15min，冷却后将球拟酵母菌种接种于发酵培养基中进行培养，接种量8％，控制参数初始温度为30±0.5℃，初始pH值为6.0，调控搅拌或通气比维持溶解氧DO 15～30％，罐压0.02～0.08Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.5vvm，搅拌速率200～600r/min；所述发酵培养基的配方为：葡萄糖300g/L、磷酸二氢钾5g/L、酵母粉15g/L、玉米浆(波美度19.5)10g/L、硫酸镁0.25g/L、柠檬酸8g/L。
(3)发酵到酵母菌细胞密度OD600nm为24，调节pH值为4.0，进入发酵转化产赤藓糖醇阶段，此时调控发酵工艺参数为罐压0.02～0.05Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.0vvm，搅拌速率200～500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0.5℃，流加柠檬酸与氨水所得的柠檬酸铵维持发酵pH为3.0～3.5，其中通过调控转速和通气比调节溶解氧DO 20～30％。
(4)葡萄糖浓度低于150g/L时开始补料，补料速率为0.10-1.2L/h，根据CER的数值反馈适当调控，发酵工艺参数为pH 3.0，罐压0.05Mpa，反应罐内通气比为0.8vvm，搅拌速率500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0.5℃；补料培养基为葡萄糖500g/L、硫酸镁10g/L、植酸5g/L以及微量元素溶液5mL/L，其中微量元素溶液包括氯化钴2.5g/L、氯化锰15g/L、氯化铜1.5g/L、氯化锌8g/L和维生素B14.5g/L；
(5)补料25h后停止补料，继续发酵直至葡萄糖含量低于5.0g/L，发酵结束，得发酵液中赤藓糖醇含量186.4g/L，赤藓糖醇的转化率为61.4％。
实施例4
一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，具体步骤如下：
(1)将解脂假丝酵母菌种在摇床中进行培养，得到OD600nm为1.6的解脂假丝酵母菌种。
(2)将发酵培养基在105℃灭菌15min，冷却后将解脂假丝酵母菌种接种于发酵培养基中进行培养，接种量8％，控制参数初始温度为30±0.5℃，初始pH值为6.0，调控搅拌或通气比维持溶解氧DO 15～30％，罐压0.02～0.08Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.5vvm，搅拌速率200～600r/min；所述发酵培养基的配方为：葡萄糖260g/L、磷酸二氢钾5g/L、酵母粉15g/L、玉米浆(波美度19.5)10g/L、硫酸镁0.25g/L、柠檬酸8g/L。
(3)发酵到酵母菌细胞密度OD600nm为30，调节pH值为3.5，进入发酵转化产赤藓糖醇阶段，此时调控发酵工艺参数为罐压0.02～0.05Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.0vvm，搅拌速率200～500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0.5℃，流加柠檬酸与氨水所得的柠檬酸铵维持发酵pH为3.0～3.5，其中通过调控转速和通气比调节溶解氧DO 20～30％。
(4)葡萄糖浓度低于150g/L时开始补料，补料速率为0.10-1.2L/h，根据CER的数值反馈适当调控，发酵工艺参数为pH 3.2，罐压0.05Mpa，反应罐内通气比为0.8vvm，搅拌速率500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0.5℃；补料培养基为葡萄糖500g/L、硫酸镁10g/L、植酸5g/L以及微量元素溶液5mL/L，其中微量元素溶液包括氯化钴2.5g/L、氯化锰15g/L、氯化铜1.5g/L、氯化锌8g/L和维生素B14.5g/L；
(5)补料25h后停止补料，继续发酵直至葡萄糖含量低于5.0g/L，发酵结束，得发酵液中赤藓糖醇含量187.6g/L，赤藓糖醇的转化率为62.1％。
实施例5
一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，具体步骤如下：
(1)将解脂假丝酵母菌种在摇床中进行培养，得到OD600nm为2.0的解脂假丝酵母菌种。
(2)将发酵培养基在105℃灭菌15min，冷却后将解脂假丝酵母菌种接种于发酵培养基中进行培养，接种量8％，控制参数初始温度为30±0.5℃，初始pH值为6.0，调控搅拌或通气比维持溶解氧DO 15～30％，罐压0.02～0.08Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.5vvm，搅拌速率200～600r/min；所述发酵培养基的配方为：葡萄糖260g/L、磷酸二氢钾5g/L、酵母粉15g/L、玉米浆(波美度19.5)10g/L、硫酸镁0.25g/L、柠檬酸8g/L。
(3)发酵到酵母菌细胞密度OD600nm为30，调节pH值为3.5，进入发酵转化产赤藓糖醇阶段，此时调控发酵工艺参数为罐压0.02～0.05Mpa，反应罐内通气比为0.5-1.0vvm，搅拌速率200～500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0.5℃，流加柠檬酸与氨水所得的柠檬酸铵维持发酵pH为3.0～3.5，其中通过调控转速和通气比调节溶解氧DO 20～30％。
(4)葡萄糖浓度低于150g/L时开始补料，补料速率为0.10-1.2L/h，根据CER的数值反馈适当调控，发酵工艺参数为pH3.0，罐压0.05Mpa，反应罐内通气比为0.8vvm，搅拌速率500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0.5℃；补料培养基为葡萄糖500g/L、硫酸镁10g/L、植酸5g/L以及微量元素溶液5mL/L，其中微量元素溶液包括氯化钴2.5g/L、氯化锰15g/L、氯化铜1.5g/L、氯化锌8g/L和维生素B14.5g/L；
(5)补料25h后停止补料，继续发酵直至葡萄糖含量低于5.0g/L，发酵结束，得发酵液中赤藓糖醇含量188.1g/L，赤藓糖醇的转化率为62.3％。
对比例
该对比例提供一种提高赤藓糖醇生产转化效率的方法，所述方法与实施例1的区别仅在于步骤(4)中补料过程补料速率恒定为0.5L/h，其他条件保持不变，发酵液中赤藓糖醇含量132g/L，赤藓糖醇的转化率为54.8％。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将处于对数生长中后期的酵母菌按8～10％的接种量接种于发酵培养基中培养发酵；所述培养发酵工艺为罐压0 .02～0 .08Mpa，反应罐内通气比为0 .5-1 .5vvm，搅拌速率200～600r/min，循环水控制发酵罐温度30±0 .5℃，发酵初始pH为5 .5～6 .0，其中通过调控转速和通气比调节溶解氧DO 15％-30％；
(2)发酵到细胞密度为OD600nm＝18～30，pH为3 .0～4 .0进入发酵转化产赤藓糖醇阶段；培养发酵工艺为罐压0 .02～0 .05Mpa，反应罐内通气比为0 .5-1 .0vvm，搅拌速率200～500r/min，循环水控制发酵罐温度32±0 .5℃，维持发酵pH为3 .0～3 .5，其中通过调控转速和通气比调节溶解氧DO 20～30％；
(3)当发酵液中葡萄糖含量低于150g/L时通过流加补料培养基进行补料，补料速率为0.10～1 .2L/h，根据发酵过程中CER数据变化进行调控，具体为：CER在5～10逐渐递增时其补糖速率在0 .10～1 .0L/h不断加快；CER高于10时采取低补料速率，为0 .10L/h；CER低于5时采取高补料速率，为1 .2L/h；
步骤(3)所述补料培养基包括葡萄糖500g/L、硫酸镁10g/L、植酸5g/L以及微量元素溶液5mL/L，其中微量元素溶液包括氯化钴2 .5g/L、氯化锰15g/L、氯化铜1 .5g/L、氯化锌8g/L和维生素B14 .5g/L；
步骤(3)所述CER为二氧化碳释放率，采用质谱仪对发酵过程中的进气和尾气实时在线采集后通过发酵之星软件在线计算获得。
2.根据权利要求1所述的一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，其特征在于，步骤(1)所述酵母菌包括解脂假丝酵母、丛梗孢酵母或球拟酵母。
3.根据权利要求1所述的一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，其特征在于，步骤(1)所述对数生长中后期是指酵母菌细胞密度OD600nm＝1 .2～2 .0。
4.根据权利要求1所述的一种提高赤藓糖醇产物浓度和生产转化率的方法，其特征在于，步骤(1)所述发酵培养基包括葡萄糖250-300g/L、磷酸二氢钾5g/L、酵母粉15g/L、玉米浆10g/L、硫酸镁0 .25g/L、柠檬酸8g/L。
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