CN112852668B - 一株耐酸的小白链霉菌及其在ε-聚赖氨酸发酵中的应用 - Google Patents
一株耐酸的小白链霉菌及其在ε-聚赖氨酸发酵中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株小白链霉菌(Streptomyces albulus)2019029,该菌株于2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC 20880;本发明涉及的小白链霉菌2019029具有较强的耐酸能力,与原始菌株相比,在初始pH4.0的条件下培养48h菌体干重提高了46.92%,在pH3.0的条件下胁迫48h后菌体存活率提高了1.81倍。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程领域,具体涉及一株耐酸的小白链霉菌及其在ε-聚赖氨酸发酵中的应用。
背景技术
ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种由25-35个L-赖氨酸通过α-羧基和ε-氨基形成的异形肽键连接而成的同型氨基酸聚合物。ε-PL具有抑菌谱广、水溶性好、安全性高、热稳定性好,在日本、韩国和美国等国家被广泛用做食品防腐剂;我国也在2014年正式批准其作为食品添加剂新品种。同时,作为一种阳离子生物聚合物,ε-PL被广泛用作生物可降解材料、药物载体、生物芯片外被、乳化剂、高吸收性水凝胶和抗癌增进剂等,因而,具有广阔的市场应用前景。
目前,工业化的ε-PL主要由小白链霉菌经液态好氧发酵的方式生产,然而,ε-PL的价格较为昂贵,限制了其在各个领域的应用,缺少能高效合成ε-PL的具有知识产权的菌种是最大的原因。因此,选育高产ε-PL的生产菌株成为学术界和产业界共同关注的焦点问题。
日本人岩田敏治等申请的专利(CN97182253.0)公开了一株对浓度10mg/mL或更高浓度的S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)具有抗性的高产菌株小白链霉菌B21021(FERM BP-5926)。1989年,日本Chisso公司利用小白链霉菌突变株已经实现了年产千吨级ε-PL的工业化生产线。
贾士儒等申请的专利(CN200710057098.4)公开了一株利用紫外诱变、紫外和化学诱变相结合,以及N离子注入诱变等手段选育出对10mg/mL或更高浓度的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)具有抗性的高产ε-聚赖氨酸的白色链霉菌TUST2(CGMCC 1986),在优化条件下ε-聚赖氨酸产量在10~30g/L。
宋存江等申请的专利(CN201210081685.8)中公开了一株生产ε-PL的链霉菌Streptomyces sp.NK-49(CGMCC 5932),该菌摇瓶发酵的ε-PL最高产量为2.4g/L。
徐虹等申请的专利(CN201110049986.8)公开了一株小白链霉菌Streptomycesalbulus PD-1(CCTCC M 2011043),采用该菌进行发酵生产后,ε-PL产量达到30g/L以上;在此基础上,通过在Streptomyces albulus PD-1的基因组上过表达铵转运蛋白基因amtB构建了一株小白链霉菌基因工程菌Streptomyces albulus PD-4,提高了氮源利用效率,ε-PL的产量达到35.7g/L(CN201510886138.0)。
陈旭升等申请的专利(CN201911020454.4)公开了一株可以在以琥珀酸为碳源的培养基上快速生长,且具有磺胺胍抗性的高效合成ε-聚赖氨酸的小白链霉菌Streptomycesalbulus M-Z18(CGMCC M 2019589),ε-PL的产量最高达到54.7g/L;在此菌基础上,经基因组重排,获得对3μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL或更高浓度的链霉素、庆大霉素和利福霉素具有抗性,并可以高效大量合成ε-PL的小白链霉菌Streptomyces albulus GS-114(CCTCC M2019590),发酵192h产量达到56.3g/L。
秦加阳等申请的专利(CN202010283789.1)公开了一株小白链霉菌基因工程菌Streptomyces albulus Q-PL2(CGMCC 18772),该菌株是利用基因工程方法在小白链霉菌野生菌Q-PL中过量表达ε-聚赖氨酸合成酶基因后得到的,ε-聚赖氨酸的产量最高达到42.9g/L。
ε-PL的主要产生菌为链霉菌,其最适的生长pH偏中性。然而,在ε-PL的生物合成过程中产生菌则面临着自发酸胁迫(微生物在发酵过程中自发形成的酸性物质对菌体造成的酸胁迫):随着发酵过程的进行,环境pH最终自发下降到3.0左右;而且,ε-PL合成的最适pH(pH 4.0左右)对产生菌而言也是一种酸胁迫环境。酸胁迫会引起胞内pH的下降,导致一些对酸敏感的酶失活、造成细胞膜和胞内大分子的结构损伤,最终引起细胞的死亡。此外,发明人前期的研究也表明,随着环境pH的下降,ε-PL合成的关键酶(ε-PL合成酶)的转录水平逐渐升高,pH 3.0时ε-PL合成酶的转录水平相比pH 5.0时上调了35.75倍;据此,发明人开发了一种低pH值胁迫提高ε-聚赖氨酸产量的方法(CN201510021744.6),在正常发酵过程中引入酸性pH胁迫工艺,即人为或自发使pH降为2.5-3.0,维持12-48h之后,将pH再提高到3.5-4.5,保持稳定直到发酵结束。采用此种pH调控方法,ε-聚赖氨酸的产量较普通两阶段pH调控工艺提高50%以上;然而,在酸性pH胁迫阶段,对菌体产生非常强的抑制,导致菌体生长和产物合成停滞,即使胁迫结束后pH提高到4.5,菌体也要经过相当长的时间才能够重新恢复活力。
综上所述,通过基因水平的改变提高ε-PL产生菌的耐酸能力,对于提升低pH值胁迫工艺(pH 2.5-3.0胁迫12-48h后,维持pH 3.5-4.5发酵)和其他发酵工艺(维持pH 4.0左右发酵)中酸性pH胁迫阶段的菌体活力,以及菌体自身的ε-PL合成能力都极为重要。
发明内容
针对现有技术的不足之处,本发明提供了一株耐酸的小白链霉菌及其在ε-聚赖氨酸发酵中的应用。
本发明的主要目的是提供一株具有耐酸能力且能够高效合成ε-PL的小白链霉菌。
本发明的技术方案如下:
一株小白链霉菌(Streptomyces albulus)2019029,该菌株于2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC 20880。
上述小白链霉菌2019029在生产ε-PL中的应用。
上述小白链霉菌2019029发酵合成ε-PL的方法,包括如下步骤:
将活化的小白链霉菌2019029接种到液体培养基制备种子液;将种子液接种到发酵培养基中发酵培养合成ε-PL;
或者将活化的小白链霉菌2019029接种发酵培养基中发酵合成ε-PL;
所述发酵培养基中是以葡萄糖、蔗糖、甘油、木糖、半乳糖、果糖、甘露醇、肌醇、麦芽糖、糊精、山梨醇、棉籽糖中的一种或多种组合为碳源;
所述发酵培养基中,有机氮源包括酵母提取物、牛肉膏、鱼粉、蛋白胨、玉米浆、尿素、豆粕粉、花生饼粉、棉籽蛋白、菌体蛋白或上述蛋白水解物的一种或多种组合;无机氮源包括硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等的一种或多种组合。
根据本发明优选的,所述方法中,将活化的小白链霉菌2019029接种种子培养基,种子培养基中孢子的起始浓度为1×105~1×108个/mL;进一步优选的,种子液的培养条件为28~35℃振荡培养1-2天;更优选的,种子液按质量百分数计以5-20%的接种量接种到发酵培养基。
根据本发明优选的,所述方法中,将活化的小白链霉菌2019029接种发酵培养基,发酵培养基中孢子的起始浓度为1×105~1×108个/mL。
根据本发明优选的,上述发酵培养的条件为28~35℃,通气量0.5-2vvm,发酵过程中维持pH为3.5~4.5,发酵24~192h。
进一步优选的,当发酵培养基中pH值下降到3.5~4.5时,通过添加碱溶液维持pH稳定,直到发酵结束。
进一步优选的,当发酵培养基中pH值下降到5.0~6.0时,通过添加碱溶液维持pH稳定直到菌体干重倍增,然后使pH下降到2.5-3.0,并维持6-48h,随后添加碱溶液将pH调为3.5~4.5,直到发酵结束。
根据本发明优选的,所述调节pH的碱液为NaOH溶液、液氨或氨水。
根据本发明优选的,所述种子培养基或发酵培养基为M3G液体培养基:
M3G液体培养基,每升组分含量包括如下:葡萄糖50g,酵母粉5g,(NH4)2SO4 10g,KH2PO4·2H2O 1.4g,MgSO4·7H2O 0.5g,K2HPO4·2H2O 0.8g,FeSO4·7H2O 0.03g,ZnSO4·7H2O 0.03g,余量为水。
根据本发明优选的,所述的发酵培养是分批发酵或补料-分批发酵;进一步优选的,所述的补料-分批发酵包括流加碳源、氮源中的一种或多种组合。
有益效果
1、本发明涉及的小白链霉菌2019029具有较强的耐酸能力,与原始菌株相比,在初始pH4.0的条件下培养48h菌体干重提高了46.92%,在pH3.0的条件下胁迫48h后菌体存活率提高了1.81倍;这对于提高菌株在低pH值胁迫工艺或其他发酵工艺中,酸性pH胁迫阶段的代谢活力极为重要。
2、本发明涉及的小白链霉菌2019029具有较高的ε-PL合成能力,该菌株以葡萄糖为碳源,经过192h的补料-分批发酵,ε-PL产量可以达到45.8g/L,生产效率达到5.73g/L/d。
3、本发明涉及的小白链霉菌2019029具有优良的传代稳定性:经过6次连续传代培养后,在M3G培养基中摇瓶发酵的ε-PL产量稳定在1.12±0.15g/L。
附图说明
图1为小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029在初始pH4.0胁迫下的菌体生长情况对比;
图2为小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029在pH3.0胁迫下的菌体存活率对比;
图3为小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029在5L发酵罐中以葡萄糖为碳源维持pH3.8分批发酵生产ε-PL的过程参数;
图4为小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029在5L发酵罐中以葡萄糖为碳源采用低pH值胁迫工艺补料-分批发酵生产ε-PL的过程参数。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述,但本发明所保护的范围不限于此。
实施例中未详加说明的内容均按本领域现有技术。
M3G液体培养基,每升组分含量包括如下:葡萄糖50g,酵母粉5g,(NH4)2SO4 10g,KH2PO4·2H2O 1.4g,MgSO4·7H2O 0.5g,K2HPO4·2H2O 0.8g,FeSO4·7H2O 0.03g,ZnSO4·7H2O 0.03g,余量为水;固体培养基中添加20g的琼脂。
实施例1
小白链霉菌2019029的选育方法
以在齐鲁工业大学长清校区校园土壤中筛选到的野生小白链霉菌QLU58为出发菌株,将其在pH 6.8的M3G液体培养基中30℃200rpm培养至对数生长期,按质量百分数计以10%的接种量接种于pH4.0的M3G液体培养基中,30℃200rpm发酵培养4天(发酵1天后pH即降到3.1左右,随后保持不变),随后将此发酵液按质量百分数计以10%的比例重新转接到新鲜的pH4.0 M3G液体培养基中发酵培养4天,转接10次后,将M3G液体培养基的初始pH降为3.9,如此反复操作逐渐降低M3G液体培养基的初始pH,在这一过程中,定期筛选耐酸能力提升的ε-PL高产菌。
取发酵液,经适当稀释涂布pH4.0的M3G固体平板,根据菌落大小及生成孢子的时间挑选单菌落,并于pH6.8的M3G液体培养基中30℃200rpm发酵4天,根据ε-PL产量筛选出突变菌株。得到多株耐酸且高产ε-PL的进化菌株,其中一株命名为小白链霉菌(Streptomycesalbulus)2019029,于2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC 20880。
将成熟的2019029孢子在M3G固体培养基上划线,30℃培养7-10天直至孢子成熟,然后将新成熟的孢子在新的M3G固体培养基上划线培养,如此反复传代培养6次,每次传代培养待孢子成熟后,取新鲜的孢子接种到M3G液体培养基中(接种后液体培养基中孢子的起始浓度为1×105~1×108个/mL),30℃200rpm摇床通风振荡培养96h后测定发酵上清液中ε-PL的产量;经过6次连续传代培养后,在M3G培养基中摇瓶发酵的ε-PL产量稳定在1.12±0.15g/L(如表1所示)
表1 2019029的传代稳定性
实施例2
小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029在酸胁迫条件下的生长特性,具体实验方法如下:
(1)分别取原始菌小白链霉菌QLU58和选育到的耐酸菌小白链霉菌2019029的孢子接种到M3G液体培养基中(接种后液体培养基中孢子的起始浓度为1×105~1×108个/mL),30℃200rpm摇床通风振荡培养24h作为种子液。
(2)按质量百分数计,以4%的接种量分别将小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029的种子液接种到pH4.0的M3G液体培养基中,30℃200rpm摇床通风振荡发酵2d,中间每隔12h取样,测定菌体干重和pH;随着发酵过程的进行,两株菌发酵液的pH变化趋势相同,都由4.0逐渐下降到2.88,发酵结束时,最终小白链霉菌2019029的菌体干重为3.82g/L,比小白链霉菌QLU58提高了46.92%,结果如图1所示。
实施例3
小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029的酸耐受性实验,具体实验方法如下:
(1)分别取原始菌小白链霉菌QLU58和选育到的耐酸菌小白链霉菌2019029的孢子接种到M3G液体培养基中(接种后液体培养基中孢子的起始浓度为1×105~1×108个/mL),30℃200rpm摇床通风振荡培养24h作为种子液。
(2)按质量百分数计,以4%的接种量分别将小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029的种子液接种到pH3.0的M3G液体培养基中,30℃200rpm摇床通风振荡培养48h,中间每隔12h取样,稀释菌液涂平板,测活菌数,计算存活率。随着胁迫时间的延长,小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029的存活率都存在不同程度的下降,但是,在整个过程中小白链霉菌2019029的存活率一直高于小白链霉菌QLU58,48h时小白链霉菌2019029的存活率为41.51%,小白链霉菌QLU58的存活率为14.77%,小白链霉菌2019029的存活率较小白链霉菌QLU58提高了1.81倍,结果如图2所示。
实施例4
小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029利用葡萄糖为碳源分批发酵生产ε-PL,包括如下步骤:
将3.2L的M3G液体培养基装入5L发酵罐中,121℃灭菌20min,将平板上活化的小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029分别接种到M3G液体培养基中,30℃200rpm摇瓶培养24h作为种子液。将0.3L的种子液接种到发酵培养基中(即上述发酵罐中),pH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中,温度控制在30℃,搅拌转速控制在200-800rpm,通气量控制在0.5-2vvm,溶氧控制在氧饱和溶解度的20-30%。当发酵pH自然下降至3.8时,自动流加氨水或氢氧化钠将pH维持稳定直到发酵结束。最终,小白链霉菌QLU58在48.75h时葡萄糖耗尽发酵结束,ε-PL产量为3.86g/L,产率为1.90g/L/d;小白链霉菌2019029由于在酸性pH条件下的菌体活力更高,因此,41.50h发酵结束,ε-PL产量为5.06g/L,产率为2.93g/L/d,与QLU58相比产量和产率分别提高了31.09%和54.21%,结果如图3所示。
实施例5
小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029利用葡萄糖为碳源采用低pH值胁迫工艺补料-分批发酵生产ε-PL
将3.2L的M3G液体培养基装入5L发酵罐中,121℃灭菌20min。将平板上活化的小白链霉菌QLU58和小白链霉菌2019029分别接种到M3G液体培养基中,30℃200rpm摇瓶培养24h作为种子液。将0.3L的种子液接种到发酵培养基中(即上述发酵罐中),pH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中,温度控制在30℃,搅拌转速控制在200-800rpm,通气量控制在0.5-2vvm,溶氧控制在氧饱和溶解度的20-30%。在发酵过程中,当pH自发下降到5.0时,自动流加氨水或氢氧化钠将pH维持在5.0直到菌体量倍增,后使pH自发下降到3.0,并维持9h,随后将pH上调到3.8,并自动流加氨水或氢氧化钠将pH维持在设定值,直到发酵192h时发酵结束。当发酵液中残留的葡萄糖浓度下降到10g/L的时候,自动流加经过灭菌的800g/L的葡萄糖溶液将其浓度控制在10g/L左右;当发酵液中,氨氮浓度下降到0.5g/L时,自动流加经过灭菌的600g/L的硫酸铵溶液将其浓度控制在0.5g/L左右。发酵192h后,小白链霉菌QLU58的ε-PL产量为29.16g/L,产率为3.65g/L/d,小白链霉菌2019029的ε-PL产量达到45.8g/L,产率为5.73g/L/d,产率比小白链霉菌QLU58提高了57.06%,结果如图4所示。证明小白链霉菌2019029是一株极具潜力的ε-PL工业化生产菌株。
Claims (12)
1.一株小白链霉菌(Streptomyces albulus)2019029,该菌株于2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.20880。
2.权利要求1所述小白链霉菌2019029在生产ε-聚赖氨酸中的应用。
3.权利要求1所述小白链霉菌2019029发酵合成ε-聚赖氨酸的方法,其特征在于,包括如下步骤:
将活化的小白链霉菌2019029接种到种子培养基制备种子液;将种子液接种到发酵培养基中发酵培养合成ε-聚赖氨酸;
或者将活化的小白链霉菌2019029接种发酵培养基中发酵培养合成ε-聚赖氨酸;
所述发酵培养基是以葡萄糖、蔗糖、甘油、木糖、半乳糖、果糖、甘露醇、肌醇、麦芽糖、糊精、山梨醇或棉籽糖中的一种或多种组合为碳源;
所述发酵培养基中,有机氮源包括酵母粉、牛肉膏、鱼粉、蛋白胨、玉米浆、尿素、豆粕粉、花生饼粉、棉籽蛋白或菌体蛋白的一种或多种组合;无机氮源包括硫酸铵、硝酸铵或氯化铵的一种或多种组合。
4.如权利要求3所述方法,其特征在于,所述方法中,将活化的小白链霉菌2019029接种种子培养基,种子培养基中孢子的起始浓度为1×105~1×108个/mL;
种子液的培养条件为28~35℃振荡培养1-2天;
种子液按质量百分数计以5-20%的接种量接种到发酵培养基。
5.如权利要求3所述方法,其特征在于,所述方法中,将活化的小白链霉菌2019029接种发酵培养基,发酵培养基中孢子的起始浓度为1×105~1×108个/mL。
6.如权利要求4-5任一项所述方法,其特征在于,发酵培养的条件为28~35℃,通气量0.5-2vvm,发酵过程中维持pH为3.5~4.5,发酵24~192h。
7.如权利要求6所述方法,其特征在于,所述种子培养基或发酵培养基为M3G液体培养基:M3G液体培养基,每升组分含量包括如下:葡萄糖50g,酵母粉5g,(NH4)2SO4 10g,KH2PO4·2H2O 1.4g,MgSO4·7H2O 0.5g,K2HPO4·2H2O 0.8g,FeSO4·7H2O 0.03g和ZnSO4·7H2O0.03g,余量为水。
8.如权利要求6所述方法,其特征在于,当发酵培养基中pH值下降到3.5~4.5时,通过添加碱溶液维持pH稳定,直到发酵结束。
9.如权利要求6所述方法,其特征在于,当发酵培养基中pH值下降到5.0~6.0时,通过添加碱溶液维持pH稳定直到菌体干重倍增,然后使pH下降到2.5-3.0,并维持6-48h,随后添加碱溶液将pH调为3.5~4.5,直到发酵结束。
10.如权利要求8所述方法,其特征在于,所述碱溶液为NaOH溶液、液氨或氨水。
11.如权利要求3-5任一项所述方法,其特征在于,所述的发酵培养是分批发酵或补料-分批发酵。
12.如权利要求11所述方法,其特征在于,所述的补料-分批发酵包括流加碳源或氮源中的一种或多种组合。
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