CN105026547A - 脂类的产生和胞外分泌方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及通过使用缺乏氮和铁的改良生长培养基从含油微生物产生和胞外分泌脂类的方法。
Description
技术领域
本公开内容涉及由微生物产生和胞外分泌脂类的方法。
背景技术
从替代可再生资源获得的生物柴油(biodiesel)由于应对世界能源供应恶化状况而受到相当大的关注。已很好的建立了通过例如细菌、酵母和藻类等微生物的脂类的生物合成。在食品工业、药物和化妆品领域中脂类有众多商业应用。脂类例如甘油三酯用作生物柴油的前体。一旦提取，甘油三酯可通过酯交换反应转化为生物柴油。已报道含油微生物(oleaginous microorganism)的很多物种积累相当大量的脂类(Meng等人,Renewable Energy,2009,34,1–5)。
微藻(microalgae)是一组高度特化的适应各种生态生境的含油微生物。在应激(stress)和不利的环境条件下，微藻的许多物种改变其脂类生物合成通路，从而利于甘油三酯的形成和积累(干细胞重的20–50％)。合成之后，甘油三酯沉积至致密堆积的胞质脂质体中(Hu等人，The Plant Journal,2008,54,621–639)。甘油三酯通常充当微藻中的能量储存分子。
已进行了大量研究，从而通过调节例如营养可获得性、渗透压、辐射暴露、pH、温度、暴露于重金属和其它化学物质等各种环境因素来鉴别和开发有效的脂类诱导技术(Sharma等人，Energies,2012,5,1532-1553)。
WO1989000606描述了限定培养基中氮和磷的量在微藻细胞中产生ω-3(n-3)脂类。
WO2001054510描述了在非醇碳源和有限营养源中生长的真核微生物中增强微生物脂类的产生。
US8475543描述了从藻类生产生物燃料的方法，包括通过促进连续的光能自养和异养生长来培养产油藻类。异养生长阶段是用应激诱导机制来起始的，该机制包括光剥夺、营养剥夺、活性氧源的注入、脂类引发和化学添加剂的至少一种。此外，该方法描述了通过裂解细胞来从产油藻类中提取油。
从微藻生产生物柴油是新兴的领域，且看来是潜在的替代生物资源。然而，现有技术涉及微藻中甘油三酯或脂类的胞内产生，由此产生下游处理的障碍，即，为了提取脂类，不得不收集、干燥并通过机械或生物化学方法破裂微藻细胞，因而增加时间和成本因素。
鉴于现有技术和科学进展，存在对于开发无需为了提取胞内的脂类而收集和破裂微生物细胞的成本有效且高效的方法的需求。
发明内容
发明要解决的问题
本公开的一方面涉及脂类的产生和胞外分泌方法。
本公开的一方面涉及增强脂类产生和胞外分泌的方法，其包括：(a)获得含油微生物的生物质(biomass)；和(b)在缺乏氮和铁的改良生长培养基中培养含油微生物的生物质，导致脂类产生和胞外分泌的增强。
本概述用来介绍与通过使用缺乏氮和铁的改良生长培养基的脂类合成和胞外分泌方法相关的概念。本概述既不意图等同请求保护的主题的必要技术特征，也不意图用于确定或限制请求保护的主题的范围。
附图说明
下列附图构成本说明书的一部分，将其包括进来从而进一步说明本公开的各方面。可通过参照附图并与本文提供的具体实施方式的详细描述相结合而更好地了解公开内容。
图1示出根据本公开的实施方案，在不同培养基中按克/升(g/L)测定的生物质生长的图示。
图2示出根据本公开的实施方案，在不同的生长培养基中培养的微生物质的图示。
图3示出根据本公开的实施方案，在不同的营养条件中生长的微生物培养物中胞内和胞外TAGs浓度和总量的定量图示。
具体实施方式
本领域技术人员将意识到，本文描述的公开内容除了具体描述的内容，还可进行变形和改进。应理解，本文描述的公开内容包括所有此类变形和改进。本公开也包括本说明书单独或概括地述及或指出的所有此类步骤、特征、组成和复合，以及所述步骤或特征的任意或多种的全部组合。
定义
为了方便，在进一步描述本公开之前，此处汇集了说明书和实施例中使用的某些术语。这些定义应根据本公开的提示和本领域技术人员的理解来解读。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本领域技术人员通常的理解相同。
冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”用来指代本文的一个或多个(即至少一个)语法对象。
术语“多个”意指多于一个。
术语“至少两个”、“多于一个”和“多个”可互换使用。
在整个说明书中，除非上下文有要求，否则词语“包括(comprise)”及变体“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将理解为意味着包含所述元素或步骤、或者元素或步骤的组，但也不排除任何其它元素或步骤、或者元素或步骤的组。
术语“包含(including)”用来表示“包含但不限于”。“包含”和“包含但不限于”可互换使用。
术语“微生物(microorganism)”和“微小生物(microbe)”可互换用于表示微观单细胞生物。
术语“微生物质(microbial biomass)”意指由微生物细胞的生长和繁殖产生的材料。微生物质可含有细胞和/或胞内内容物和由细胞分泌的胞外化合物。
术语“微生物培养物”或“培养物”意指在受控的实验室条件下于预定的生长培养基中增殖和生殖的微生物。
术语“生长培养基”或“培养基”意指含有特定微生物生长所需的所有营养物质的固体或液体制备物。
术语“传代培养”意指将微生物细胞从原微生物培养物转移至新鲜的生长培养基来获得传代培养物。其延长培养物中微生物细胞的生命并增加微生物细胞的数量。
术语“传代培养物”意指通过将微生物细胞从原培养物转移至新鲜的生长培养基而获得的新的微生物培养物。
术语“含油微生物”意指脂类含量至少为20-25％的微小生物。
术语“藻类”意指具有叶绿素且光能自养的真核微生物。
术语“微藻”意指产生大分子例如脂类的真核光能自养微生物。
术语“脂类”意指在非极性溶剂中可溶而在水中相对不可溶的一类烃类。脂类分子由性质上疏水的长的烃尾构成。脂类的实例包括脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯等。
术语“三酰基甘油(triacylglyceride)”、“甘油三酯”和“TAG”可交换用来表示从甘油和三分子脂肪酸衍生的酯。
在本公开的实施方案中，提供脂类的产生和胞外分泌方法。
在本公开的实施方案中，所述脂类为TAGs。
在本公开的实施方案中，提供通过使用缺乏氮的改良生长培养基而在含油微生物中产生TAGs的方法。
在本公开的实施方案中，提供通过使用缺乏铁的改良生长培养基而在含油微生物中产生TAGs的方法。
在本公开优选实施方案中，提供通过使用缺乏铁和氮的改良生长培养基而在含油微生物中产生TAGs的方法。
在本公开的实施方案中，提供通过使用缺乏铁的改良生长培养基，从含油微生物胞外分泌TAGs的方法。
在本公开优选的实施方案中，提供通过使用缺乏氮和铁的改良生长培养基，从含油微生物产生和胞外分泌TAGs的方法。
在本公开的实施方案中，提供TAGs的产生和胞外分泌方法，所述方法包括：(a)使含油微生物的培养物在未改良的生长培养基中生长5-7天；(b)通过离心分离微生物质；且(c)在缺乏氮和铁的改良生长培养基中使来自(b)的微生物质生长。
在本公开的实施方案中，提供TAGs的产生和胞外分泌方法，所述方法包括：(a)获得含油微生物的生物质；且(b)在缺乏氮和铁的改良生长培养基中培养所述含油微生物的生物质，导致脂类产生和胞外分泌的增强。
在本公开的实施方案中，所述未改良的生长培养基为桑格-格兰尼克(Sanger and Granick)培养基。
在本公开的实施方案中，所述未改良的生长培养基为TAP培养基。
在本公开的实施方案中，所述未改良的生长培养基为末刚高盐培养基(Sueoka’s high salt medium)。
在本公开优选的实施方案中，所述未改良的生长培养基为营养肉汤生长培养基。
在本公开的实施方案中，所述营养肉汤生长培养基的pH为7.0。
在本公开的实施方案中，在桑格-格兰尼克培养基中生长5天时的微生物质浓度为10.9mg/L。
在本公开的实施方案中，在末刚高盐培养基中生长5天时的微生物质浓度为13.2mg/L。
在本公开的实施方案中，在TAP培养基中生长5天时的微生物质浓度为12.1mg/L。
在本公开的实施方案中，在营养肉汤培养基中生长5天时的微生物质浓度为15.8mg/L。
在本公开的实施方案中，所述缺乏铁的生长培养基具有0.1％酵母提取物、0.1％牛肉提取物、0.2％胰蛋白(tryptose)和1％葡萄糖。
在本公开的实施方案中，所述缺乏铁的生长培养基的pH为7.0。
在本公开的实施方案中，所述缺乏氮的生长培养基具有0.1％酵母提取物、0.1％牛肉提取物、0.2％葡萄糖和痕量FeSO4。
在本公开的实施方案中，所述缺乏氮的生长培养基的pH为7.0。
在本公开优选的实施方案中，所述缺乏氮和铁的改良生长培养基具有0.1％酵母提取物、0.1％牛肉提取物和1％葡萄糖。
在本公开的实施方案中，所述缺乏氮和铁的改良生长培养基的pH在6.5-7.5的范围内。
在本公开优选的实施方案中，所述缺乏氮和铁的改良生长培养基的pH为7.0。
在本公开的实施方案中，所述含油微生物为藻类。
在本公开的实施方案中，所述藻类为微藻。
在本公开的实施方案中，所述微藻选自但不限于莱哈衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、具尾维氏衣藻(Chlamydomonas caudate Wille)、莫吴斯衣藻(Chlamydomonas moewusii)、雪衣藻(Chlamydomonas nivalis)和卵形衣藻(Chlamydomonas ovoidae)的组。
在本公开优选的实施方案中，所述微藻为莱哈衣藻。
在本公开的实施方案中，未改良的生长培养基的葡萄糖浓度在5g/L至24.0g/L的范围内。
在本公开优选的实施方案中，未改良的生长培养基的葡萄糖浓度为23.11g/L。
在本公开的实施方案中，使生长在未改良的生长培养基中的微生物培养物受到范围在4.69小时至24小时的光照循环周期。
在本公开的实施方案中，使生长在未改良的生长培养基中的微生物培养物受到范围在8小时至16小时的光照循环周期。
在本公开优选的实施方案中，使生长在未改良的生长培养基中的微生物培养物受到16小时的光照循环周期。
在本公开的实施方案中，微生物培养物在葡萄糖浓度为23.11g/L的未改良的生长培养基中生长，并暴露于16小时的光照循环。
在本公开的实施方案中，所述缺乏铁和氮的改良生长培养基包含(a)范围在0.05％-0.2％的酵母提取物，(b)范围在0.05％-0.2％的牛肉提取物，和(c)范围在0.5％-3％的葡萄糖。
在本公开优选的实施方案中，所述缺乏铁和氮的改良生长培养基包含(a)0.1％酵母提取物，(b)0.1％牛肉提取物，和(c)1％葡萄糖。
在本公开的实施方案中，所述缺乏铁和氮的改良生长培养基的pH在6.5-7.5的范围。
在本公开优选的实施方案中，所述缺乏铁和氮的改良生长培养基的pH为7.0。
在本公开的实施方案中，所述缺乏氮和铁的改良生长培养基的葡萄糖浓度在5g/L至30g/L的范围。
在本公开优选的实施方案中，所述缺乏氮和铁的改良生长培养基的葡萄糖浓度为23.11g/L。
在本公开的实施方案中，含油微生物的生物质在缺乏氮和铁的改良生长培养基中受到4.69小时至24小时范围的光照循环周期下生长。
在本公开的实施方案中，含油微生物的生物质在缺乏氮和铁的改良生长培养基中在受到8小时至16小时范围的光照循环周期下生长。
在本公开优选的实施方案中，含油微生物的生物质在缺乏氮和铁的改良生长培养基中在受到16小时的光照循环周期下生长。
在本公开的实施方案中，含油微生物的生物质生长在葡萄糖浓度为23.11g/L的缺乏氮和铁的改良生长培养基中，并受到16小时的光照循环周期。
在本公开的实施方案中，在含有23.11g/L葡萄糖的改良生长培养基中生长、在16小时光照循环和铁缺乏下培养的微生物培养物中的胞内TAG浓度为1000mg/L。
在本公开的实施方案中，在含有23.11g/L葡萄糖的生长培养基中生长、在16小时光照循环和铁缺乏下培养的微生物培养物中的胞外TAG浓度为300mg/L。
在本公开的实施方案中，在铁缺乏生长培养基中生长的微生物培养物所产生的TAGs的25％被胞外分泌。
在本公开的实施方案中，在缺乏氮的改良生长培养基中培养的微生物质诱导TAG合成。
在本公开的实施方案中，在含有23.11g/L葡萄糖的生长培养基中生长、在16小时光照循环和氮缺乏下培养的微生物培养物中的胞内TAG浓度为200mg/L。
在本公开的实施方案中，在含有23.11g/L葡萄糖的改良生长培养基中生长、在16小时光照循环和氮缺乏下生长的微生物培养物中的胞内TAG浓度为2000mg/L。
在本公开优选的实施方案中，在缺乏铁和氮两者的改良生长培养基中培养的微生物质促进TAG合成。
在本公开优选的实施方案中，在缺乏铁和氮的改良生长培养基中培养的微生物质促进TAGs的胞外分泌。
在本公开的实施方案中，在含有23.11g/L葡萄糖的改良生长培养基中生长、在16小时光照循环且缺乏铁和氮两者下培养的微生物培养物中的胞内TAG浓度为3000mg/L。
在本公开的实施方案中，在含有23.11g/L葡萄糖的改良生长培养基中生长、在16小时光照循环且缺乏铁和氮两者下培养的微生物培养物中的胞外TAG浓度为6000mg/L。
在本公开的实施方案中，在铁和氮缺乏的改良生长培养基中生长的微生物质所合成脂类的50％-70％被胞外分泌。
在本公开的实施方案中，在铁和氮缺乏的改良生长培养基中生长的微生物质所合成脂类的66％被胞外分泌。
在本公开的实施方案中，由培养在缺乏铁和氮的改良生长培养基中培养的微生物质所胞外分泌的脂类的100％为TAGs。
在本公开的实施方案中，由培养在缺乏铁的改良生长培养基中培养的微生物质所胞外分泌的脂类的100％为TAGs。
虽然参照某些优选的实施方案对主题进行了相当详细的描述，但其它实施方式也是可能的。
虽然含油微生物质的特征(产率)在如本文所述的四种不同的培养基类型中试验，但本领域技术人员可使用任何其它培养基来获得含油微生物质。
虽然TAGs的产生和胞外分泌在如本文定义的缺乏铁或氮、或者同时缺乏铁和氮二者的培养基中试验，但本领域技术人员可使用任何其它的培养基组成来产生和胞外分泌TAGs。
在本公开的实施方案中，提供胞外分泌的TAGs的常规纯化和分离方法。
本领域技术人员可使用其它常规方法来纯化或分离胞外分泌的TAGs。
实施例
现通过工作原理例来说明本公开内容，该实施例意图说明本公开的原理，但并不意图限制性地表示对本公开范围的任何限制。除非另有说明，否则此处使用的所有技术和科学术语的含义与本公开所属领域普通技术人员通常的理解相同。
实施例1
微生物培养物和生长培养基
微生物培养物：莱哈衣藻(ATCC-18798)培养物取自美国模式培养物保藏所(ATCC)。原代培养物保存在20℃下的35％甘油中供进一步使用。
生长培养基：制备四种不同类型的生长培养基，即营养肉汤(NB)培养基、tris-醋酸-磷酸(TAP)培养基、末刚高盐培养基和桑格-格兰尼克培养基，并用于试验莱哈衣藻的生长能力(growth potential)。生长培养基制备于蒸馏水中并平衡pH。使用前在标准条件下将培养基高压灭菌。
营养肉汤生长培养基的构成提供于表1中。
表1
| 成分 | 量 |
| 酵母提取物 | 1g |
| 牛肉提取物 | 1g |
| 葡萄糖 | 10g |
| 胰蛋白月示 | 2g |
| FeSO4 | 痕量 |
| 蒸馏水 | 1000mL |
| pH | 7.0 |
TAP生长培养基的构成提供于表2中。
表2
TAP盐
| 成分 | 量 |
| NH4Cl | 15g |
| MgSO4.7H2O | 4g |
| CaCl2.2H2O | 2g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
磷酸盐溶液
| 成分 | 量 |
| K2HPO4 | 28.8g |
| KH2PO4 | 14.4g |
| 蒸馏水 | 100mL |
亨特(Hutner’s)痕量元素
| 成分 | 量 | 水 |
| EDTA二钠盐 | 50g | 250mL |
| ZnSO4.7H2O | 22g | 100mL |
| H3BO3 | 11.4g | 200mL |
| MnCl2.4H2O | 5.06g | 50mL |
| CoCl2.6H2O | 1.61g | 50mL |
| CuSO4.5H2O | 1.57g | 50mL |
| (NH4)6Mo7O24.4H2O | 1.1g | 50mL |
| FeSO4.7H2O | 4.99g | 50mL |
除EDTA外的所有痕量元素通过煮沸混合，接着将EDTA添加至溶液。溶液冷却至70℃，并添加85mL热的20％KOH溶液。终体积调节至1000mL并将其放置2周。随后，经过Whatman’s滤纸过滤该溶液，直至溶液澄清。进行分装并保存在4℃供进一步使用。
TAP培养基制备：将2.42g的Tris添加至25mL TAP盐溶液、0.375mL磷酸盐溶液、1mL亨特痕量元素和1mL冰醋酸。终体积调节至1000mL。
末刚高盐培养基的构成提供于表3中。
表3
贝叶林克(Beijerinck’s)溶液
| 成分 | 量 |
| NH4Cl | 100g |
| MgSO4.7H2O | 4g |
| CaCl2.2H2O | 2g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
磷酸盐溶液
| 成分 | 量 |
| K2HPO4 | 288g |
| KH2PO4 | 144g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
末刚高盐培养基的制备：将5mL贝叶林克溶液添加至5mL磷酸溶液和1mL亨特痕量元素。终体积调节至1000mL。
桑格-格兰尼克培养基的构成提供于表4中。
表4:痕量元素
| 成分 | 量 |
| H3BO3 | 1g |
| ZnSO4.7H2O | 1g |
| MnSO4.4H2O | 0.3g |
| CoCl2.6H2O | 0.2g |
| Na2MoO4.2H2O | 0.2g |
| CuSO4 | 0.04g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
柠檬酸钠溶液
| 成分 | 量 |
| 柠檬酸钠 | 500g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
氯化铁
| 成分 | 量 |
| FeCl3.6H2O | 10g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
氯化钙
| 成分 | 量 |
| CaCl2.2H2O | 53g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
硫酸镁
| 成分 | 量 |
| MgSO4.7H2O | 300g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
硝酸铵
| 成分 | 量 |
| NH4NO3 | 450g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
磷酸二氢钾
| 成分 | 量 |
| KH2PO4.7H2O | 200g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
磷酸氢二钾
| 成分 | 量 |
| K2HPO4.7H2O | 200g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
桑格-格兰尼克培养基的制备：将1mL痕量元素溶液、1mL柠檬酸钠溶液、1mL氯化铁溶液、1mL氯化钙溶液、1mL硫酸镁溶液、1mL硝酸铵溶液、0.55mL磷酸氢二钾溶液和0.5mL磷酸二氢钾溶液混合在一起。
缺乏铁的培养基的构成提供于表5中。
表5
| 成分 | 量 |
| 酵母提取物 | 1.00g |
| 牛肉提取物 | 1.00g |
| 胰蛋白月示 | 2.00g |
| 葡萄糖 | 10.00g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
| pH | 7.0 |
缺乏氮的培养基的构成提供于表6中。
表6
| 成分 | 量 |
| 酵母提取物 | 1.00g |
| 牛肉提取物 | 1.00g |
| FeSO4 | 痕量 |
| 葡萄糖 | 10.00g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
| pH | 7.0 |
缺乏铁和氮的改良培养基的构成在表7中给出。
表7
| 成分 | 量 |
| 酵母提取物 | 1.00g |
| 牛肉提取物 | 1.00g |
| 葡萄糖 | 10.00g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
| pH | 7.0 |
莱哈衣藻的传代培养：莱哈衣藻的传代培养在所有四种不同的培养基，即营养肉汤培养基、TAP培养基、末刚高盐培养基和桑格-格兰尼克培养基中进行。表8示在出不同生长培养基中生长5天时的微生物质。
表8：在四种不同培养基中生长的微生物质
| 培养基 | 第5天的生物质(g/L) |
| 营养肉汤 | 15.8 |
| 末刚高盐培养基 | 13.2 |
| TAP培养基 | 12.1 |
| 桑格-格兰尼克 | 10.9 |
鉴定到在第5天时在营养肉汤培养基中观察到最大生物质生长，即15.8g/L，并用于进一步的实验。微生物质生长在与本文描述的试验的培养基不同的其它培养基中也是可能的。
图1示出在营养肉汤培养基中生长的微生物质的生长曲线。可得出由5-7天的连续培养获得最大生物质。
图2是在不同生长培养基中生长5天时微生物质的图示。与其它试验的培养基相比，最高微生物质从生长在营养肉汤培养基中的培养物获得。因此，选择营养肉汤培养基用于随后的实验。
培养物在摇床上180RPM、24小时光照循环下生长。在7天的时间段内每天通过获取750nm处的OD并对干的生物质称重来检测生长。干的生物质通过将微生物培养物在1800rpm下离心10分钟而获得。丸粒在60℃的热风炉中干燥5分钟。表9表示在营养肉汤中培养7天期间微生物质的增长。
表9
| 天 | 生物质(g\L) | 750nm处的OD |
| 0 | 0.80 | 0.02 |
| 1 | 1.85 | 0.06 |
| 2 | 5.02 | 0.12 |
| 3 | 10.23 | 0.16 |
| 4 | 13.56 | 1.11 |
| 5 | 15.80 | 1.56 |
| 6 | 16.42 | 1.64 |
| 7 | 16.73 | 1.64 |
实施例2
葡萄糖浓度和光照循环对微生物质的影响
使用不同的葡萄糖浓度和光照循环周期作为最大化微生物质的参数，进行初步研究。表10示出不同葡萄糖浓度或光照循环周期对5天后微生物质产率的影响。
表10
从表10中可知，改变生长培养基中的葡萄糖浓度显著影响微生物质产率。相似地，光照循环周期的变化也显著影响微生物质产率。该结果也揭示出，在20.0g/L-24.0g/L葡萄糖范围内变动的葡萄糖与8小时-16小时的光照循环周期的特定组合给出最大的微生物质浓度。表10示出的生物质产率结果代表多个独立进行的实验。
实施例3
改良培养基中培养的微生物细胞中增强脂类产生
微生物在未改良营养肉汤生长培养基中生长之后，细胞悬浮液在1008RCF下离心5分钟。丸粒用无菌蒸馏水洗涤一次，并在层流通风橱中称重。重量为1.673g/100mL营养肉汤。随后将丸粒转移至缺乏铁(表5)或缺乏氮(表6)或者缺乏铁和氮二者(表7)的改良生长培养基，并分析脂类的存在并定量TAGs。
从图3可知，微生物细胞在未改良培养基中生长时没有TAGs产生。当微生物细胞在只缺乏氮的改良培养基中生长时，与生长在未改良培养基中的微生物细胞形成对照，TAGs的产生受诱导。生长于氮缺乏培养基中的微生物细胞所产生的TAGs在胞内积累。生长于只缺乏铁的改良培养基中的微生物细胞也导致TAGs的产生，且25％的TAGs被胞外分泌。出乎意料地，当微生物培养物在缺乏氮和铁二者的改良培养基中生长时，微生物细胞的TAGs产生增加。微生物细胞将TAGs向胞外环境的分泌也增加。微生物细胞所产生的TAGs的66％被胞外分泌。表11示出微生物培养物(100mL)在不同缺乏培养基中生长时产生的TAGs的浓度和量。
表11
虽然TAGs的合成和胞外分泌在如表5、6或7所定义的改良培养基上试验，但是TAGs的合成和胞外分泌也可在其它缺乏铁和氮的培养基组合物中诱导。
进行下列试验来检测胞外环境中脂类的存在。
可溶性试验：可溶性试验是以脂类在有机溶剂中的可溶性和在水中的不可溶性这样的性质为依据。可溶性试验的原理是根据油因其比重较低而浮在水上这一事实。取3ml有机溶剂置于各试管，并向所有试管中都加入5滴样品。观察到样品溶解在有机溶剂即氯仿和醚中，然而样品在水和醇中不溶。结论是给定样品为脂类。
皂化试验：将2mL上清添加至5mL KOH醇溶液，并短暂涡旋5分钟。涡旋后的样品置于沸水浴中15分钟。表12示出皂化试验结果。观察到振摇试管时有泡沫产生。
表12
进行下列试验来检测或定量特别处于胞外环境中的TAGs。
丙烯醛试验：丙烯醛(aceolein)(即丙烯醛，propenal)是最简单的不饱和醛。它是一种具有穿透性、令人不悦、刺鼻气味的无色液体。燃烧脂肪的气味(如同食用油加热至发烟点时)是由燃烧的脂肪中的甘油分解为丙烯醛而造成的。工业上丙烯醛从丙烯制得，并主要用作杀生物剂(biocide)和其它化合物例如氨基酸甲硫氨酸的构造单元。
CH2＝CHCH3+O2→CH2＝CHCHO+H2O
工业上丙烯醛通过丙烯的氧化制备。该过程用空气作为氧源，并需要金属氧化物作为多相催化剂。取5mL上清，向其添加0.1g固体硫酸氢钾，并在本生燃烧器(Bunsen burner)上加热。
用异丙醇法定量TAGs：通过将3mL储备液(三棕榈精)与10mL异丙醇混合，制备工作标准溶液。将不同体积(空白、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml)的工作标准溶液加入各试管。取1mL试验溶液(对于所有培养基的上清和丸粒二者)置于单独的试管。丸粒在研杵和研钵中磨碎，并用氯仿提取脂类。向各试管添加异丙醇溶液，以使体积为2mL。在各试管中添加0.6mL皂化试剂、1mL偏高碘酸钠、0.5mL乙酰丙酮。震摇各试管并在沸水浴中保持30分钟。冷却试管，在405nm处测定吸光度。
在20g/L浓度的葡萄糖存在下生长时，生长于铁和氮缺乏的改良培养基中的微生物培养物产生的甘油三酯的量为6gTAGs/L，其相当于75％的碳向TAGs的转化。
Claims (10)
1.一种增强脂类产生和胞外分泌的方法，其包括：
a.获得含油微生物的生物质；和
b.在缺乏氮和铁的改良生长培养基中培养所述含油微生物的生物质，导致脂类产生和胞外分泌增强。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述含油微生物为藻类或微藻。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述微藻选自由莱哈衣藻、具尾维氏衣藻、莫吴斯衣藻、雪衣藻和卵形衣藻组成的组。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述缺乏氮和铁的改良生长培养基包含：
a..05％-0.2％范围内的酵母提取物；
b.0.5％-0.2％范围内的牛肉提取物；和
c.0.5％-3.0％范围内的葡萄糖。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述缺乏氮和铁的改良生长培养基包含：
a.0.1％酵母提取物；
b.0.1％牛肉提取物；和
c.2.3％葡萄糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述缺乏氮和铁的改良生长培养基的pH在6.5-7.5的范围内。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述含油微生物的生物质在缺乏氮和铁的改良生长培养基中受到4.69小时至24小时范围的光照循环周期的培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述含油微生物的生物质在缺乏氮和铁的改良生长培养基中受到12小时至18小时范围的光照循环周期的培养。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所产生的脂类的50％-70％被胞外分泌。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述胞外分泌的脂类的大于90％为甘油三酯。
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