CN104131044A

CN104131044A - 一种回收利用微生物提油后的生物质来生产不饱和脂肪酸的方法

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Publication number: CN104131044A
Application number: CN201410262970.9A
Authority: CN
Inventors: 顾慧雅
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2034-06-13
Also published as: CN104131044B

Abstract

本发明公开了一种回收利用微生物提油后的生物质来生产不饱和脂肪酸的方法。本发明将微生物发酵提油后废弃的生物质再次用于微生物发酵以提取不饱和脂肪酸，减少废物的排放，可以大大节省微生物培养过程中营养物质的投入，明显降低生产成本，且生产效率高。

Description

一种回收利用微生物提油后的生物质来生产不饱和脂肪酸的方法

技术领域

本发明涉及发酵生产技术领域，特别涉及一种回收利用微生物提油后的生物质来生产不饱和脂肪酸的方法。

背景技术

Omega 3 不饱和脂肪酸（PUFAs）特指有双键位于倒数第三个碳原子上的一种不饱和脂肪酸，其中对人体有益的不饱和脂肪酸有二十碳五烯酸（EPA），二十二碳六烯酸（DHA）和α亚麻酸（ALA）。人体本身并不能合成这些不饱和脂肪酸，只能通过在食物中的摄取。海洋鱼类是这些不饱和脂肪酸的直接来源，鱼油作为一种膳食补充剂其营养价值也得到了广泛的认识。但是由于海洋鱼类资源有限，并不能支撑日益增长的不饱和脂肪酸的需求。日渐稀缺的鱼类资源也导致鱼油的价格日渐上涨。

研究表明，鱼类体内的不饱和脂肪酸来源于海洋微藻，因此，工业法生产海洋微藻已经成为另外一种获取不饱和脂肪酸的方法。试验表明，在一些真核生物细胞中，包括微藻、真菌和原生生物，含有大量的不饱和脂肪酸（10%-20%），例如，破囊壶菌（Thraustochytrium）已被正式可以生产DHA，而在一些硅藻生物（Bacillariophyceae）和绿藻（Chlorophyceae）细胞中也发现了EPA 的成分。这些发现利用微藻来去取代深海鱼类来生产不饱和脂肪酸奠定了基础。目前，利用真核微生物细胞来生产这些不饱和脂肪酸的这项技术还没有完全普及，主要的问题在于微藻的繁殖方式和提取的成本较高，不利用商业化的生产。如何降低成本是该研究领域的一大研究方向。

利用传统的发酵工艺，生产极高密度的生物量（大于100 g/L ）是有效的降低生产成本的方法，而达到这一目的，就需要在发酵过程中连续不间断的添加营养物质，达到让细胞持续分裂生长的目的。主要的营养物质，如有机糖原和氮源，将在该生产方式中占到50%以上的成本。因此，寻找便宜的营养物质则成为进一步减低成本的有效途径。

在真核细胞中，不饱和脂肪酸主要以三酰甘油的形式存在，就是普遍意义上的脂肪颗粒。细胞发酵完成之后，通常会将细胞膜破坏进而将油脂和其他的生物物质分离，获得的油脂在进一步纯化得到所需的不饱和脂肪酸。在该过程中，细胞中的糖类物质和蛋白类物质通常都作为废料丢弃。然而，这些物质在经过合适的处理之后是可以被回收利用的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种回收利用微生物提油后的生物质来生产不饱和脂肪酸的方法，将微生物发酵提油后废弃的生物质再次用于微生物发酵以提取不饱和脂肪酸，减少废物的排放，可以大大节省微生物培养过程中营养物质的投入，明显降低生产成本，且生产效率高。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种回收利用微生物提油后的生物质来生产不饱和脂肪酸的方法，包括以下步骤：

（1）微生物发酵：选择富含不饱和脂肪酸的菌种，接种至基础液体培养基中进行发酵，发酵温度控制在22-32℃，发酵100-144小时；

（2）提油：将步骤（1）发酵所得发酵液进行提油，含油的物质层和水层分离，收集水层的生物质废液；

（3）生物质废液回收：向生物质废液中加入氢氧化钠调节pH至中性，然后加入占生物质废液重量1-5%的活性炭，加热生物质废液至55-60℃下搅拌混合，对生物质废液进行脱色并同时浓缩，然后降至室温，静置过滤，获得含糖量大于100g/L、总含氮量大于10g/L的生物质废液的浓缩液I；

（4）生物质废液再利用发酵：选择富含不饱和脂肪酸的菌种，接种至生物质液体培养基中进行发酵，每升生物质液体培养基包括如下含量的组分：生物质浓缩液I 100-400ml, Na₂SO₄ 11-15g，MgSO₄·7H₂O 2-4g， KCl 0.4-0.6g，K₂SO₄ 0.5-0.7g, (NH₄)₂SO₄ 0.95-1.1g, CaCl₂ 0.1-0.15g，葡萄糖10-20g，KH₂PO₄ 0.9-1.2g，痕量金属元素溶液0.5-3mL，复合维生素溶液 1-2mL；发酵温度控制在22-32℃，发酵100-144小时。

本发明首先利用常规的培养基发酵生产第一批微生物，提油后，将废弃的生物质废液脱色浓缩后，用于配制新的培养基（生物质培养基），二次培养微生物用于提油，从而将废弃的生物质二次利用，绿色环保，废弃的生物质的利用，可以大大减少培养基中营养物质如有机碳源、氮源的使用，从而降低生产成本，且本发明限定了特定的培养基配方和发酵工艺，大大提高了生产效率，发酵密度可达到80g/L以上。

本发明中的培养基，除了生物质浓缩液之外，其他的成分均为限定的化学成分，而不是非限定的化学成分，如大豆粉。利用可控的限定化学成分，可以保证每次发酵的成品的均一性和高效率。

本发明中的提油的基本原理是：首先利用溶液酸碱度来达到让细胞破壁的作用，再根据油脂在水溶液中的溶解性低的原理进行离心分离，油脂最后通过非极性溶剂如正己烷萃取得到。提油剩余的生物质废液，浓缩后来取代培养基中的一部分营养物质二次发酵培养。

本发明利用活性炭脱色，可以吸附生物质废液中的毒素如苯酚类物质、重金属等，保证后续发酵的安全可靠。

作为优选，步骤（1）中每升基础液体培养基包括如下含量的组分：Na₂SO₄ 11-15g，MgSO₄·7H₂O 2-4g， KCl 0.4-0.6g， K₂SO₄ 0.5-0.7g, (NH₄)₂SO₄ 0.95-1.1g, CaCl₂ 0.1-0.15g，葡萄糖30-60g， KH₂PO₄ 0.9-1.2g，痕量金属元素溶液0.5-3mL，复合维生素溶液 1-2 mL。

作为优选，每升痕量金属元素溶液包括如下含量的组分：MnCl₂·4H₂O 2.7-3.3g，ZnSO₄·7H₂O 2.5-3g，CoCl₂·6H₂O 0.035-0.045g，Na₂MoO₄·2H₂O 0-0.045g，CuSO₄·5H₂O 1.8-2.2 g，NiSO₄·6H₂O 1.5-2.2g，FeSO₄·7H₂O 8-16g，每升复合维生素溶液包括如下含量的组分：硫铵酸4-11g，泛钙酸 1.3-5.1 g，维生素B₁₂ 100-150 mg。

作为优选，步骤（1）的发酵过程中采取补料工艺，在发酵培养24小时之后向发酵液中持续补加基础补料液，基础补料液的补加速率为每小时注入发酵液总体积的0.1%-0.2%；每升基础补料液包括如下含量的组分： Na₂SO₄ 22-30g，MgSO₄·7H₂O 4-8g， KCl 1-2g，K₂SO₄ 2-3g, (NH₄)₂SO₄ 2-4g, CaCl₂ 0.5-0.8g, 葡萄糖600-900g。采取补料工艺以达到高密度培养的目的，提高生产效率。采用本发明更新的补料工序，无需移除原有的培养液。

作为优选，根据步骤（1）微生物的发酵密度不同，步骤（2）的提油方案可分为两种：

方案一：

当微生物的发酵密度达到130g/L以上时，提油方法为：先将发酵液在鼓式干燥机中进行干燥至水分含量小于10%的粉状物质，所得的粉状物质与浓度为0.1-0.15mol/L的稀硫酸溶液按1-1.5：1的质量比混合，50-80 r/min 的转速下搅拌混合1-2小时，然后500-1000 r/min离心2-3小时，离心所得沉淀为含油的物质层，离心所得上清液为水层，含油的物质层用有机溶剂正己烷萃取得到油脂类物质，水层为生物质废液进入步骤（3）重新利用；

方案二：

当80g/L≤微生物的发酵密度＜130g/L时，提油方法为：将发酵液放入沉淀罐中静置沉淀24小时，抽掉上层清液，向沉淀物中加入体积浓度为5-10%的稀硫酸溶液，调节pH至2-3，然后加热至30-35℃保持1-2小时，冷却至室温，然后500-1000 r/min离心4-6小时，离心所得沉淀为含油的物质层，离心所得上清液为水层，含油的物质层用有机溶剂正己烷萃取得到油脂类物质，水层为生物质废液进入步骤（3）重新利用。

当微生物的发酵密度达到130g/L以上时，发酵产物中的水分含量低，适合方案一的方法。当80g/L≤微生物的发酵密度＜130g/L时，发酵产物中的水分含量高，若采用方案一的方法，能耗大，因此，本发明针对发酵密度的不同，采取了不同的提油方法。

作为优选，萃取时将含油的物质层与有机溶剂按1:3-6的质量比混合，搅拌混合40-60min，静置分层，上层液为有机溶剂和DHA 粗油，再将上层液放入减压蒸馏器中除去有机溶剂得到DHA粗油。

作为优选，步骤（4）的发酵过程中采取补料工艺，在发酵培养24小时之后向发酵液中持续补加生物质补料液，生物质补料液的补加速率为每小时注入发酵液总体积的0.1%-0.2%；每升生物质补料液包括如下含量的组分：Na₂SO₄ 22-30 g，MgSO₄·7H₂O 4-8 g，KCl 1-2g，K₂SO₄ 2-3g，(NH₄)₂SO₄ 2-4g， CaCl₂ 0.5-0.8g，葡萄糖300-500 g，生物质废液的浓缩液II 300-400mL；所述生物质废液的浓缩液II为生物质废液的浓缩液I在55-60℃下继续蒸发水分，至含糖量大于500g/L、总含氮量大于50g/L而得。采取本发明的补料工艺可以达到高密度培养的目的，提高生产效率，且发酵产物的油脂含量可达50-60%，DHA含量可达30-40%。采用本发明更新的补料工序，无需移除原有的培养液。且补料时，采用含糖量及含氮量更大的生物质废液的浓缩液II培养效果好。

作为优选，步骤（1）和步骤（4）中富含不饱和脂肪酸的菌种选择裂殖壶菌（Schizochytrium)、隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）、破囊壶菌（Thraustochytrium）中的一种。这些微生物均为可以进行异养生长的微生物，可以通过聚酮化合物合成酶系统来合成有益的不饱和脂肪酸的微生物。

作为优选，步骤（1）中接种量为基础液体培养基重量的1%-10%，步骤（4）中接种量为生物质液体培养基重量的1%-10%。

作为优选，步骤（1）和步骤（4）的发酵过程中都进行通空气培养，通入的空气流量为1-3 vvm，当发酵培养至24-48小时时控制通入的空气含氧量为4-10%，当发酵培养48之后至72小时控制通入的空气含氧量为3%以下，72小时之后空气含氧量控制在0%。本发明通过控制发酵温度及通入空气的含氧量以提高微生物不饱和脂肪酸的产量。含氧量低有利于微生物产生更多的不饱和脂肪酸。

本发明的有益效果是：

1、将微生物发酵提油后废弃的生物质再次用于微生物发酵以提取不饱和脂肪酸，减少废物的排放，可以大大节省微生物培养过程中营养物质的投入，明显降低生产成本，且生产效率高。

2、本发明中发酵培养的微生物细胞富含可食用的不饱和脂肪酸（DHA），约80%-90%的DHA包含于甘油三酯（Triacylglycerol)中，而甘油三脂是易于被人体吸收。因此，本发明所得的DHA可以经过简单的提纯处理就作为膳食补充剂，提供给需要DHA的人群，例如，婴幼儿和产前或产后的孕妇。

附图说明

图1是基础液体培养基与生物质液体培养基对于微生物细胞生长的对比图。

图2是不同碳氮比的基础液体培养基与生物质液体培养基对于微生物细胞油脂组成的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1：

（1）微生物发酵：选择选择裂殖壶菌为菌种（市售菌种），接种至基础液体培养基中进行发酵，接种量为基础液体培养基重量的1%，发酵温度控制在22℃，发酵144小时。

每升基础液体培养基包括如下含量的组分：Na₂SO₄ 11g，MgSO₄·7H₂O 2g， KCl 0.4g， K₂SO₄ 0.5g, (NH₄)₂SO₄ 0.95g, CaCl₂ 0.1g，葡萄糖30g， KH₂PO₄ 0.9g，痕量金属元素溶液0.5mL，复合维生素溶液 1mL。

发酵过程中采取补料工艺，在发酵培养24小时之后向发酵液中持续补加基础补料液，基础补料液的补加速率为每小时注入发酵液总体积的0.1%；每升基础补料液包括如下含量的组分： Na₂SO₄ 22g，MgSO₄·7H₂O 4g， KCl 1g，K₂SO₄ 2g, (NH₄)₂SO₄ 2g, CaCl₂ 0.5g, 葡萄糖600g。

（2）提油：根据步骤（1）微生物的发酵密度不同，步骤（2）的提油方案可分为两种：

方案一：

当微生物的发酵密度达到130g/L以上时，提油方法为：先将发酵液在鼓式干燥机中进行干燥至水分含量小于10%的粉状物质，所得的粉状物质与浓度为0.1mol/L的稀硫酸溶液按1：1的质量比混合，50 r/min 的转速下搅拌混合2小时，然后500r/min离心3小时，离心所得沉淀为含油的物质层，离心所得上清液为水层，含油的物质层用有机溶剂正己烷萃取得到油脂类物质，水层为生物质废液进入步骤（3）重新利用；

方案二：

当80g/L≤微生物的发酵密度＜130g/L时，提油方法为：将发酵液放入沉淀罐中静置沉淀24小时，抽掉上层清液，向沉淀物中加入体积浓度为5%的稀硫酸溶液，调节pH至3，然后加热至30℃保持2小时，冷却至室温，然后500 r/min离心6小时，离心所得沉淀为含油的物质层，离心所得上清液为水层，含油的物质层用有机溶剂正己烷萃取得到油脂类物质，水层为生物质废液进入步骤（3）重新利用。

萃取时将含油的物质层与有机溶剂按1:3的质量比混合，搅拌混合40min，静置分层，上层液为有机溶剂和DHA 粗油，再将上层液放入减压蒸馏器中除去有机溶剂得到DHA粗油。

（3）生物质废液回收：向生物质废液中加入氢氧化钠调节pH至中性，然后加入占生物质废液重量1%的活性炭，加热生物质废液至55℃下搅拌混合，对生物质废液进行脱色并同时浓缩，然后降至室温，静置过滤，获得含糖量大于100g/L、总含氮量大于10g/L的生物质废液的浓缩液I；

（4）生物质废液再利用发酵：选择裂殖壶菌为菌种，接种至生物质液体培养基中进行发酵，接种量为生物质液体培养基重量的1%，每升生物质液体培养基包括如下含量的组分：生物质浓缩液I 100ml, Na₂SO₄ 11g，MgSO₄·7H₂O 2g， KCl 0.4g，K₂SO₄ 0.5g, (NH₄)₂SO₄ 0.95g, CaCl₂ 0.1g，葡萄糖10g，KH₂PO₄ 0.9g，痕量金属元素溶液0.5mL，复合维生素溶液 1mL；发酵温度控制在22℃，发酵144小时。

步骤（4）发酵过程中采取补料工艺，在发酵培养24小时之后向发酵液中持续补加生物质补料液，生物质补料液的补加速率为每小时注入发酵液总体积的0.1%；每升生物质补料液包括如下含量的组分：Na₂SO₄ 22g，MgSO₄·7H₂O 4g，KCl 1g，K₂SO₄ 2g，(NH₄)₂SO₄ 2g， CaCl₂ 0.5g，葡萄糖300g，生物质废液的浓缩液II 300mL；所述生物质废液的浓缩液II为生物质废液的浓缩液I在55℃下继续蒸发水分，至含糖量大于500g/L、总含氮量大于50g/L而得。

每升痕量金属元素溶液包括如下含量的组分：MnCl₂·4H₂O 2.7g，ZnSO₄·7H₂O 2.5g， CoCl₂·6H₂O 0.035g，Na₂MoO₄·2H₂O 0g，CuSO₄·5H₂O 1.8g，NiSO₄·6H₂O 1.5g，FeSO₄·7H₂O 8g，每升复合维生素溶液包括如下含量的组分：硫铵酸4g，泛钙酸 1.3g，维生素B₁₂ 100mg。

步骤（1）和步骤（4）的发酵过程中都进行通空气培养，通入的空气流量为1vvm，当发酵培养至24-48小时时控制通入的空气含氧量为4%，当发酵培养48之后至72小时控制通入的空气含氧量为3%以下，72小时之后空气含氧量控制在0%。

实施例2：

（1）微生物发酵：选择选择隐甲藻为菌种（市售菌种），接种至基础液体培养基中进行发酵，接种量为基础液体培养基重量的10%，发酵温度控制在32℃，发酵100小时。

每升基础液体培养基包括如下含量的组分：Na₂SO₄ 15g，MgSO₄·7H₂O 4g， KCl 0.6g， K₂SO₄ 0.7g, (NH₄)₂SO₄ 1.1g, CaCl₂ 0.15g，葡萄糖60g， KH₂PO₄ 1.2g，痕量金属元素溶液3mL，复合维生素溶液2mL。

发酵过程中采取补料工艺，在发酵培养24小时之后向发酵液中持续补加基础补料液，基础补料液的补加速率为每小时注入发酵液总体积的0.2%；每升基础补料液包括如下含量的组分： Na₂SO₄ 30g，MgSO₄·7H₂O 8g， KCl 2g，K₂SO₄ 3g, (NH₄)₂SO₄ 4g, CaCl₂ 0.8g, 葡萄糖900g。

方案一：

当微生物的发酵密度达到130g/L以上时，提油方法为：先将发酵液在鼓式干燥机中进行干燥至水分含量小于10%的粉状物质，所得的粉状物质与浓度为0.15mol/L的稀硫酸溶液按1.5：1的质量比混合， 80 r/min 的转速下搅拌混合1小时，然后1000 r/min离心2小时，离心所得沉淀为含油的物质层，离心所得上清液为水层，含油的物质层用有机溶剂正己烷萃取得到油脂类物质，水层为生物质废液进入步骤（3）重新利用；

方案二：

当80g/L≤微生物的发酵密度＜130g/L时，提油方法为：将发酵液放入沉淀罐中静置沉淀24小时，抽掉上层清液，向沉淀物中加入体积浓度为10%的稀硫酸溶液，调节pH至2，然后加热至35℃保持1小时，冷却至室温，然后1000 r/min离心4小时，离心所得沉淀为含油的物质层，离心所得上清液为水层，含油的物质层用有机溶剂正己烷萃取得到油脂类物质，水层为生物质废液进入步骤（3）重新利用。

萃取时将含油的物质层与有机溶剂按1:6的质量比混合，搅拌混合60min，静置分层，上层液为有机溶剂和DHA 粗油，再将上层液放入减压蒸馏器中除去有机溶剂得到DHA粗油。

（3）生物质废液回收：向生物质废液中加入氢氧化钠调节pH至中性，然后加入占生物质废液重量5%的活性炭，加热生物质废液至60℃下搅拌混合，对生物质废液进行脱色并同时浓缩，然后降至室温，静置过滤，获得含糖量大于100g/L、总含氮量大于10g/L的生物质废液的浓缩液I；

（4）生物质废液再利用发酵：选择隐甲藻为菌种，接种至生物质液体培养基中进行发酵，接种量为生物质液体培养基重量的10%，每升生物质液体培养基包括如下含量的组分：生物质浓缩液I 400ml, Na₂SO₄ 15g，MgSO₄·7H₂O 4g， KCl 0.6g，K₂SO₄ 0.7g, (NH₄)₂SO₄ 1.1g, CaCl₂ 0.15g，葡萄糖20g，KH₂PO₄ 1.2g，痕量金属元素溶液3mL，复合维生素溶液2mL；发酵温度控制在32℃，发酵100小时。

步骤（4）发酵过程中采取补料工艺，在发酵培养24小时之后向发酵液中持续补加生物质补料液，生物质补料液的补加速率为每小时注入发酵液总体积的0.2%；每升生物质补料液包括如下含量的组分：Na₂SO₄ 30 g，MgSO₄·7H₂O 8 g，KCl 2g，K₂SO₄ 3g，(NH₄)₂SO₄ 4g， CaCl₂ 0.8g，葡萄糖500 g，生物质废液的浓缩液II 400mL；所述生物质废液的浓缩液II为生物质废液的浓缩液I在60℃下继续蒸发水分，至含糖量大于500g/L、总含氮量大于50g/L而得。

每升痕量金属元素溶液包括如下含量的组分：MnCl₂·4H₂O 3.3g，ZnSO₄·7H₂O 3g， CoCl₂·6H₂O 0.045g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.045g，CuSO₄·5H₂O 2.2 g，NiSO₄·6H₂O 2.2g，FeSO₄·7H₂O 16g，每升复合维生素溶液包括如下含量的组分：硫铵酸11g，泛钙酸5.1g，维生素B₁₂ 150mg。

步骤（1）和步骤（4）的发酵过程中都进行通空气培养，通入的空气流量为3 vvm，当发酵培养至24-48小时时控制通入的空气含氧量为10%，当发酵培养48之后至72小时控制通入的空气含氧量为3%以下，72小时之后空气含氧量控制在0%。

实施例3：

（1）微生物发酵：选择选择破囊壶菌为菌种（市售菌种），接种至基础液体培养基中进行发酵，接种量为基础液体培养基重量的5%，发酵温度控制在28℃，发酵120小时。

每升基础液体培养基包括如下含量的组分：Na₂SO₄ 12.5g，MgSO₄·7H₂O 2.5g， KCl 0.5g， K₂SO₄ 0.6g, (NH₄)₂SO₄ 1g, CaCl₂ 0.12g，葡萄糖50g， KH₂PO₄ 1g，痕量金属元素溶液2mL，复合维生素溶液 1.5mL。

发酵过程中采取补料工艺，在发酵培养24小时之后向发酵液中持续补加基础补料液，基础补料液的补加速率为每小时注入发酵液总体积的0.15%；每升基础补料液包括如下含量的组分： Na₂SO₄ 25g，MgSO₄·7H₂O 6g， KCl 1.5g，K₂SO₄ 2.5g, (NH₄)₂SO₄ 3g, CaCl₂ 0.6g, 葡萄糖700g。

（2）提油：根据步骤（1）微生物的发酵密度不同，提油方案可分为两种：

方案一：

当微生物的发酵密度达到130g/L以上时，提油方法为：先将发酵液在鼓式干燥机中进行干燥至水分含量小于10%的粉状物质，所得的粉状物质与浓度为0.1mol/L的稀硫酸溶液按1：1的质量比混合，70 r/min 的转速下搅拌混合1.5小时，然后800 r/min离心2.5小时，离心所得沉淀为含油的物质层，离心所得上清液为水层，含油的物质层用有机溶剂正己烷萃取得到油脂类物质，水层为生物质废液进入步骤（3）重新利用；

方案二：

当80g/L≤微生物的发酵密度＜130g/L时，提油方法为：将发酵液放入沉淀罐中静置沉淀24小时，抽掉上层清液，向沉淀物中加入体积浓度为8%的稀硫酸溶液，调节pH至2.5左右，然后加热至32℃保持1.5小时，冷却至室温，然后800 r/min离心5小时，离心所得沉淀为含油的物质层，离心所得上清液为水层，含油的物质层用有机溶剂正己烷萃取得到油脂类物质，水层为生物质废液进入步骤（3）重新利用。

萃取时将含油的物质层与有机溶剂按1:4的质量比混合，搅拌混合50min，静置分层，上层液为有机溶剂和DHA 粗油，再将上层液放入减压蒸馏器中除去有机溶剂得到DHA粗油。

（3）生物质废液回收：向生物质废液中加入氢氧化钠调节pH至中性，然后加入占生物质废液重量3%的活性炭，加热生物质废液至60℃下搅拌混合，对生物质废液进行脱色并同时浓缩，然后降至室温，静置过滤，获得含糖量大于100g/L、总含氮量大于10g/L的生物质废液的浓缩液I（具体见下表）；

（4）生物质废液再利用发酵：选择破囊壶菌为菌种，接种至生物质液体培养基中进行发酵，接种量为生物质液体培养基重量的5%，每升生物质液体培养基包括如下含量的组分：生物质浓缩液I 200ml, Na₂SO₄ 12.5g，MgSO₄·7H₂O 2.5g， KCl 0.5g，K₂SO₄ 0.6g, (NH₄)₂SO₄ 1g, CaCl₂ 0.12g，葡萄糖15g，KH₂PO₄ 1g，痕量金属元素溶液2mL，复合维生素溶液 1.5mL；发酵温度控制在28℃，发酵120小时。

步骤（4）发酵过程中采取补料工艺，在发酵培养24小时之后向发酵液中持续补加生物质补料液，生物质补料液的补加速率为每小时注入发酵液总体积的0.15%；每升生物质补料液包括如下含量的组分：Na₂SO₄ 25g，MgSO₄·7H₂O 6 g，KCl 1.5g，K₂SO₄ 2.5g，(NH₄)₂SO₄ 3g， CaCl₂ 0.6g，葡萄糖400 g，生物质废液的浓缩液II 350mL；所述生物质废液的浓缩液II为生物质废液的浓缩液I在60℃下继续蒸发水分，至含糖量大于500g/L、总含氮量大于50g/L而得。

每升痕量金属元素溶液包括如下含量的组分：MnCl₂·4H₂O 3g，ZnSO₄·7H₂O 2.8g， CoCl₂·6H₂O 0.04g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.02g，CuSO₄·5H₂O 2 g，NiSO₄·6H₂O 1.8g，FeSO₄·7H₂O 10g，每升复合维生素溶液包括如下含量的组分：硫铵酸6g，泛钙酸3 g，维生素B₁₂ 120mg。

步骤（1）和步骤（4）的发酵过程中都进行通空气培养，通入的空气流量为2 vvm，当发酵培养至24-48小时时控制通入的空气含氧量为6%，当发酵培养48之后至72小时控制通入的空气含氧量为3%以下，72小时之后空气含氧量控制在0%。

图1是基础液体培养基与生物质液体培养基对于微生物细胞生长的对比图，从图1中可知：用生物质废液取代培养基中的营养物质也可以达到同样的发酵效果，由此证明，利用生物质废液二次发酵的概念是可行的。

图2是不同碳氮比的基础液体培养基与生物质液体培养基对于微生物细胞油脂组成的影响，从图2中可知：采用生物质废液取代培养基中的营养物质而配制的生物质液体培养基的发酵模式可以产生更多的不饱和脂肪酸，其中包括DHA。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1.一种回收利用微生物提油后的生物质来生产不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中每升基础液体培养基包括如下含量的组分：Na₂SO₄ 11-15g，MgSO₄·7H₂O 2-4g， KCl 0.4-0.6g， K₂SO₄ 0.5-0.7g, (NH₄)₂SO₄ 0.95-1.1g, CaCl₂ 0.1-0.15g，葡萄糖30-60g， KH₂PO₄ 0.9-1.2g，痕量金属元素溶液0.5-3mL，复合维生素溶液 1-2 mL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：每升痕量金属元素溶液包括如下含量的组分：MnCl₂·4H₂O 2.7-3.3g，ZnSO₄·7H₂O 2.5-3g， CoCl₂·6H₂O 0.035-0.045g，Na₂MoO₄·2H₂O 0-0.045g，CuSO₄·5H₂O 1.8-2.2 g，NiSO₄·6H₂O 1.5-2.2g，FeSO₄·7H₂O 8-16g，每升复合维生素溶液包括如下含量的组分：硫铵酸4-11 g，泛钙酸 1.3-5.1 g，维生素B₁₂ 100-150 mg。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）的发酵过程中采取补料工艺，在发酵培养24小时之后向发酵液中持续补加基础补料液，基础补料液的补加速率为每小时注入发酵液总体积的0.1%-0.2%；每升基础补料液包括如下含量的组分： Na₂SO₄ 22-30g，MgSO₄·7H₂O 4-8g， KCl 1-2g，K₂SO₄ 2-3g, (NH₄)₂SO₄ 2-4g, CaCl₂ 0.5-0.8g, 葡萄糖600-900g。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：根据步骤（1）微生物的发酵密度不同，步骤（2）的提油方案可分为两种：

方案一：

方案二：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：萃取时将含油的物质层与有机溶剂按1:3-6的质量比混合，搅拌混合40-60min，静置分层，上层液为有机溶剂和DHA 粗油，再将上层液放入减压蒸馏器中除去有机溶剂得到DHA粗油。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（4）的发酵过程中采取补料工艺，在发酵培养24小时之后向发酵液中持续补加生物质补料液，生物质补料液的补加速率为每小时注入发酵液总体积的0.1%-0.2%；每升生物质补料液包括如下含量的组分：Na₂SO₄ 22-30 g，MgSO₄·7H₂O 4-8 g，KCl 1-2g，K₂SO₄ 2-3g，(NH₄)₂SO₄ 2-4g， CaCl₂ 0.5-0.8g，葡萄糖300-500 g，生物质废液的浓缩液II 300-400mL；所述生物质废液的浓缩液II为生物质废液的浓缩液I在55-60℃下继续蒸发水分，至含糖量大于500g/L、总含氮量大于50g/L而得。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（4）中富含不饱和脂肪酸的菌种选择裂殖壶菌、隐甲藻、破囊壶菌中的一种。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中接种量为基础液体培养基重量的1%-10%，步骤（4）中接种量为生物质液体培养基重量的1%-10%。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（4）的发酵过程中都进行通空气培养，通入的空气流量为1-3 vvm，当发酵培养至24-48小时时控制通入的空气含氧量为4-10%，当发酵培养48之后至72小时控制通入的空气含氧量为3%以下，72小时之后空气含氧量控制在0%。