KR102565648B1 - Dha 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법 - Google Patents

Dha 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법 Download PDF

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Abstract

DHA 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법은 균종이 발효한지 0~80시간 동안은 배양기의 탄질비를 3~20:1로 제어하고, 배양 온도를 29~32℃ 사이로 제어하는 단계; 및 균종이 발효한지 81시간 이후로는 배양기의 탄질비를 1~15:1로 제어하고, 배양 온도를 19~28℃ 사이로 제어하는 단계를 포함함으로써, DHA 변환율을 향상시키고 기타 지방산의 함량을 저감시킨다. 본 발명은 또한 상기 방법으로 제조되는 DHA 미생물 오일 및 당해 오일을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

DHA 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법
본 발명은 미생물 발효 기술분야에 관한 것이며, 구체적으로 DHA 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법에 관한 것이다.
미생물 오일은 단세포 오일이라고도 하며, 효모, 곰팡이균과 미세조류 등의 지질 생성 미생물로부터 일정 조건에서 탄소원, 질소원, 미량 원소를 이용하여 균체 내에서 대량으로 발생하는 오일이다.
오일 생성 미생물은 자원이 풍부하고 다양한 배양 조건에서 성장할 수 있어 산업화 대규모 생산과 개발에 거대한 저력을 가지고 있다. 미생물 오일은 고도 불포화 지방산의 함량이 높고, 그 중의 도코사헥사엔산(DHA), 아라키돈산(ARA) 등은 인체의 필수 지방산이며 중요한 생리적 기능을 가지고 있다.
영아에게 만약 ARA와 DHA가 결핍되면 영구성 지력 저하와 시력 장애를 초래할 수 있으며, 6~12세 아동은 피부 가려움증, 안각 건조증, 수강 시 집중력 저하를 유발할 수 있다. ARA와 DHA는 고혈압, 고혈지, 당뇨병, 바이러스 감염 등 질병의 예방과 치료에도 현저한 효과를 가진다.
시중에서 판매되는 DHA, ARA 등 제품은 주로 심해어 기름에서 추출되며, 원료의 한계로 인해 대규모 생산이 어렵다. 또한, 불포화 지방산의 함량이 안정적이지 않으며, 산량이 낮고 비용이 높다. 따라서, 미생물 오일은 리놀렌산(GLA), 아라키돈산(ARA), 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA) 등과 같은 고부가가치 창출 지방산을 얻는 중요한 원료로 되었다.
그러나 종래의 연구에 따르면, 과량의 EPA는 태아와 영유아의 성장과 대사에 좋지 않은 영향을 미치는 것으로 밝혀져, 임산부와 영유아가 먹는 미생물 오일은 그 속의 EPA 함량을 엄격히 통제해야 한다.
울케니아(Ulkenia) 속, 쉬조키트리움(Schizochytrium) 속, 트라우스토카이트리움(Thraustochytrium) 목, 크립세코디늄(Crypthecodinium) 속, 효모 등의 미생물은 이를 발효시켜 생산되는 미생물 오일의 DHA 함량이 높아, DHA 오일 생산에 주로 사용되는 균종이다. 다만, 울케니아(Ulkenia) 속, 쉬조키트리움(Schizochytrium) 속, 트라우스토카이트리움(Thraustochytrium) 목, 크립세코디늄(Crypthecodinium) 속, 효모 등의 미생물을 발효시켜 미생물 오일을 생산하는 종래의 방법으로 획득되는 오일은 DHA의 함량이 그다지 높지 않고, 오일에 비교적 많은 EPA와 일부 유해 지방산 예컨대 미리스트산, 라우르산, 에루크산 등이 포함되어 있어 미생물 오일의 사용에 영향을 미친다.
본 발명의 목적은 종래기술로 생산되는 DHA 미생물 오일 중의 유해 지방산의 함량이 높고, DHA의 함량이 그다지 높지 않으며, EPA 함량이 높은 문제점을 해결하기 위해 DHA 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법을 제공한다. 이 방법은 울케니아(Ulkenia) 속, 쉬조키트리움(Schizochytrium) 속, 트라우스토카이트리움(Thraustochytrium) 목, 크립세코디늄(Crypthecodinium) 속, 효모 등의 미생물을 발효시켜 DHA 미생물 오일을 생산하며, 미생물 오일 중 지방산 조성물의 함량을 통제하여, DHA 함량이 높고 유해 지방산 함량이 매우 낮은 미생물 오일을 생산할 수 있다.
상기 목적을 구현하기 위해, 제1 측면에서 본 발명은 DHA 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법을 제공한다. 상기 방법은 균종이 발효한지 0~80시간 동안은 배양기의 탄질비를 3~20:1로 제어하고, 배양 온도를 29~32℃ 사이로 제어하는 단계; 및 균종이 발효한지 81시간 이후로는 배양기의 탄질비를 1~15:1로 제어하고, 배양 온도를 19~28℃ 사이로 제어하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 탄질비를 제어하는 방식은, 배양기 내의 포도당과 글루타민산 나트륨의 함량을 제어하여 필요한 탄질비를 유지하는 것이다.
바람직하게는, 상기 배양기 내의 포도당과 글루타민산 나트륨의 함량을 제어하는 프로세스는, 발효한지 0~16시간 동안은 포도당 함량을 2~8g/100ml로, 글루타민산 나트륨의 함량을 1~5g/100ml로 하고; 발효한지 17~55시간 동안은 포도당 함량을 2~6g/100ml로, 글루타민산 나트륨의 함량을 1~3g/100ml로 하며; 발효한지 56~80시간 동안은 포도당 함량을 1~5g/100ml로, 글루타민산 나트륨의 함량을 1~2g/100ml로 하며; 발효한지 81~95시간 동안은 포도당 함량을 0.5~1.0g/100ml로, 글루타민산 나트륨의 함량을 0.75~1.0g/100ml로 하며; 발효한지 95시간 이후로는 포도당 함량을 <0.5g/100ml로, 글루타민산 나트륨의 함량을 0.5~0.75g/100ml로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 DHA 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법은 또한, 미생물 오일 정제 프로세스에서 먼저 오일을 70~90℃까지 승온시켜 탈수시킨 후, 점차 20~30℃까지 냉각시켜 상온에서 16~24시간 탈랍시키고, 여과 및 탈수 후, 설정된 프로그램에 따라 다시 점차 -10~1℃까지 강온시켜 보온하여 저온에서 48~90시간 탈랍시키는 단계를 더 포함한다.
제2 측면에서 본 발명은 DHA 미생물 오일을 제공한다. 상기 미생물 오일은 본 발명의 제1 측면에 따른 어느 하나의 DHA 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법으로 제조되며, 미생물 오일 총량 기준으로, 40wt%보다 적지 않은 DHA와 3wt%를 초과하지 않는 EPA; 0~5wt%의 C12:0 지방산; 0~8wt%의 C14:0과 C14:1 지방산; 5~50wt%의 C16:0과 C16:1 지방산; 0.5~10wt%의 C18:0, C18:1과 C18:2 지방산; 0~5wt%의 C22:1n9 지방산을 함유한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 DHA 미생물 오일에서 DHA와 EPA의 비율은 13.3~600:1이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 DHA 미생물 오일에서 불포화 지방산과 포화 지방산의 함량비는 0.6이상이다.
더 바람직하게는, 본 발명에 따른 DHA 미생물 오일에서 불포화 지방산과 포화 지방산의 함량비는 2.3이상이다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 DHA 미생물 오일을 포함하며, 영유아용 조제식품(영유아용 조제분유), 보건식품, 건강식품 및 일반식품 등의 제조에 적용되는 조성물을 제공한다.
상기 기술적 수단에 따르면, 미생물 오일의 산량이 높을 뿐만 아니라, 미생물 오일 중 DHA의 함량이 높고, EPA의 함량이 낮으며, 유해 지방산인 미리스트산, 라우르산, 에루크산의 함량이 매우 낮으며, -10~5℃ 조건에서 맑고 투명한 상태를 유지할 수 있다.
본 명세서에 개시된 범위의 끝점 및 모든 값은 그 정확한 범위 또는 값으로 한정되지 않으며, 이러한 범위 또는 값은 이러한 범위 또는 값에 가까운 값을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 수치 범위의 경우, 각 범위의 끝점 값 사이, 각 범위의 끝점 값과 개별 포인트 값 사이, 및 개별 포인트 값 사이는 서로 조합되어 하나 또는 다수의 새로운 수치 범위를 얻을 수 있으며, 이러한 수치 범위는 본 명세서에 구체적으로 개시된 것으로 보아야 한다.
본 발명의 실시예와 대조예에서, DHA 미생물 오일의 발효 균종은 모두 쉬조키트리움(Schizochytrium) 속을 사용하며, 사용된 균종과 각종 배양 용품은 모두 시중으로부터 얻었으며, 관련된 시제와 검출 방법은 모두 국가 표준에 따랐다.
실시예 1
1) 균종 생산: 원시 균종을 멸균과 냉각 처리된 배양기 내에 넣고, 진탕 플라스크에서 배양했다.
플라스크 배양기의 조성으로는, 포도당 4.5%, 글루타민산 나트륨 3.2%, 효모 추출물(extractum) 0.62%, 염화나트륨 1.8%, 인산이수소칼륨 0.7%, 황산마그네슘 0.55%, 염화칼슘 0.03%, 미량 원소(황산니켈, 황산구리, 몰리브덴산나트륨, 염화망간, 염화코발트, 황산아연, 황산제일철 등) 0.1%, 비타민(B2, B6, B12 등) 0.1%이다.
배양 조건으로는, 200rpm의 쉐이커에서 28±1℃로 36~44시간 배양하고, 균사가 자란 후 이를 취해 병에 병합()하여 1단계 시드 탱크에 넣었다.
2) 1단계 시드: 균종을 멸균과 냉각 처리된 배양기 내에 넣고, 1단계 시드 탱크에서 배양했다.
배양기의 조성으로는, 포도당 3%, 효모 분말 0.83%, 글루타민산 나트륨 0.62%, 효모 추출물 0.62%, 염화나트륨 0.62%, 인산이수소칼륨 0.7%, 황산마그네슘 0.52%, 염화칼슘 0.02%, 탄산수소나트륨 0.02%, 황산나트륨 0.93%, 황산암모늄 0.10%, 염화칼륨 0.08%, 미량 원소(성분은 위와 같음) 0.10%, 비타민(성분은 위와 같음) 0.10%, 에폭시 실리콘 에테르 0.03%이다.
배양 조건으로는, 온도 30±2℃, 회전속도 90rpm, 통기량은 0.50vvm이며, 18~24시간 배양했다.
3) 2단계 시드: 4%의 1단계 균종을 멸균과 냉각 처리된 배양기 내에 넣고, 2단계 시드 탱크에서 배양했다.
배양기의 조성으로는, 포도당 5%, 글루타민산 나트륨 2.0%, 효모 추출물 1.0%, 염화나트륨 0.14%, 인산이수소칼륨 0.16%, 황산마그네슘 0.50%, 염화칼슘 0.02%, 탄산수소나트륨 0.02%, 황산나트륨 0.91%, 황산암모늄 0.10%, 염화칼륨 0.08%, 미량 원소(성분은 위와 같음) 0.09%, 비타민(성분은 위와 같음) 0.09%, 에폭시 실리콘 에테르 0.36%이다.
배양 조건으로는, 온도 30±2℃, 회전속도 90rpm이며, 14~16시간 배양했다.
4) 주발효: 2단계 시드액을 10%의 비율로 발효 탱크의 발효 배양기 내에 접종하여 발효시켰다.
배양기 조성으로는, 포도당 5%, 글루타민산 나트륨 2.5%, 효모 추출물 1.0%, 염화나트륨 0.29%, 인산이수소칼륨 0.28%, 황산마그네슘 0.66%, 염화칼슘 0.03%, 탄산수소나트륨 0.02%, 황산나트륨 0.58%, 황산암모늄 0.13%, 염화칼륨 0.11%, 미량 원소(성분은 위와 같음) 0.13%, 비타민(성분은 위와 같음) 0.13%, 에폭시 실리콘 에테르 0.03%이다.
배양 조건으로는, 회전속도 90rpm, 0~80시간에서 온도를 30℃로 제어하고, 80시간 이후로는 온도를 22℃로 제어했다. 통기량은 0.5VVm이다. 50% 포도당을 함유한 설탕 탱크를 이용하여 포도당을 첨가하고, 농도가 60%인 글루타민산 나트륨 용액을 첨가하여, 배양기 내의 포도당과 글루타민산 나트륨의 함량을 조정하여 탄질비를 제어했다. 배양기 내의 포도당과 글루타민산 나트륨의 함량과 PH의 제어는 표 1과 같았으며, 5일간 배양했다.
시간(h) 0~16 17~55 56~80 81~95 96~120
포도당
(g/100ml)		 4~6 3~4 2~3 0.5~1 <0.5
글루타민산 나트륨
(g/100ml)		 2~3 1.5~2 1.2~1.5 0.75~1 0.5~0.75
PH 자연 6.2~6.5 6.5~6.7 6.7~7.0 6.7~7.0
5) 원유 추출: 발효 완료 후, 3상 원심 분리기를 이용하여 탈수시키고, 균사체와 물을 분리하고, 95% 에탄올로 탈수시킨 후, 다시 헥산을 넣어 추출하여 원유를 얻었다.
6) 수세 및 탈검: 오일 중량의 10%를 차지하는 정제수를 넣고 85℃까지 가열했다. 80rpm의 회전속도로 20분간 교반하고 2시간 방치한 후 물을 분리했다.
7) 산 정제: 오일을 75℃까지 가열하고, 오일 중량의 4‰를 차지하는 구연산을 넣고 80rpm의 회전속도로 40분간 교반했다. 다시 오일 중량의 10%를 차지하는 85℃의 가열 수를 넣어 20분간 교반하고, 3시간 방치한 후 물을 분리했다.
8) 알칼리 정제: 오일을 45℃까지 가열하고, 오일 산가에 따라 염기 추가량을 산출했다(염기 추가량=7.13×10-4×산가×오일 중량). 40%의 수산화나트륨 용액을 넣고, 80rpm의 회전속도로 50분간 교반했다. 오일 온도를 80℃까지 승온시킨 후, 다시 오일 중량의 5%를 차지하는 85℃의 정제수를 넣고, 80rpm의 속도로 15분간 교반한 후, 2상 원심 분리기로 원심 처리하여 조각자(角)를 제거했다.
9) 탈수: 알칼리 정제를 거친 오일을 80℃까지 가열하고, -0.1MPa의 음압에서 35분간 탈수시켰다.
10) 상온 탈랍: 탈수된 오일을 자연 강온시키고, 오일 온도를 25℃까지 낮춘 후 유지하여 결정을 성장시켰다. 상온 탈랍 시간은 20시간으로 했다.
11) 여과: 상온 탈랍한 오일을 플레이트-프레임 필터 프레스(plate-and-frame filter press)로 여과하되, 여과 매질로서 공업용 여과포를 사용하고, 여과 압력은 0.3MPa로 했다.
12) 재탈수: 여과한 오일을 80℃까지 가열하고, -0.1MPa의 음압에서 35분간 탈수시켰다.
13) 저온 탈랍: 탈수된 오일을 기설정 프로그램에 따라 강온시켰다. 이때, 먼저 오일을 30분당 10℃의 속도로 신속하게 강온시키고, 45℃에 도달한 후 시간당 3℃씩 강온시킨 후, 점차 줄여 시간당 1℃씩 강온시켰다. 오일 온도가 14℃로 낮아진 시점에 온도를 재상승시켜 결정을 성장시키되, 온도 재상승 온도는 1.5℃, 온도 재상승 시간은 4.5시간으로 했다. 온도 재상승 이후, 시간당 1.5℃의 속도로 계속 강온시켜 -5℃에 도달한 후 보온시켰다. 저온 탈랍 시간은 70시간으로 했다.
14) 재여과: 상온 탈랍한 오일을 플레이트-프레임 필터 프레스로 여과하되, 여과 재질로서 공업용 여과포를 사용하고, 여과 압력은 0.2MPa로 했다.
15) 탈색: 1.5%의 활성탄과 1.5%의 활성 백토를 첨가하여, 70분간 탈색시켰다.
16) 탈취: 탈취 온도 175±2℃부터 시간을 기록하고, 탈취 온도를 175±2℃로 유지하고, 탈취 시간은 4시간으로 하였다. 스팀 압력을 0.2MPa~0.3MPa로 유지하고, 진공도를 50Pa로 유지하고, 스팀 소모량을 오일 중량의 약 5%로 제어했다. 강온과 진공 파괴를 거쳐 최종 오일 제품을 얻었다.
실시예 2
1) 균종 생산: 원시 균종을 멸균과 냉각 처리된 배양기 내에 넣고, 진탕 플라스크에서 배양했다.
플라스크 배양기의 조성으로는, 포도당 4.5%, 글루타민산 나트륨 3.2%, 효모 추출물 0.62%, 염화나트륨 1.8%, 인산이수소칼륨 0.7%, 황산마그네슘 0.55%, 염화칼슘 0.03%, 미량 원소(황산니켈, 황산구리, 몰리브덴산나트륨, 염화망간, 염화코발트, 황산아연, 황산제일철 등) 0.1%, 비타민(B2, B6, B12 등) 0.1%이다.
배양 조건으로는, 200rpm의 쉐이커에서 28±1℃로 36~44시간 배양하고, 균사가 자란 후 이를 취해 병에 병합하여 1단계 시드 탱크에 넣었다.
2) 1단계 시드: 균종을 멸균과 냉각 처리된 배양기 내에 넣고, 1단계 시드 탱크에서 배양했다.
배양기의 조성으로는, 포도당 3%, 효모 분말 0.83%, 글루타민산 나트륨 0.62%, 효모 추출물 0.62%, 염화나트륨 0.62%, 인산이수소칼륨 0.7%, 황산마그네슘 0.52%, 염화칼슘 0.02%, 탄산수소나트륨 0.02%, 황산나트륨 0.93%, 황산암모늄 0.10%, 염화칼륨 0.08%, 미량 원소(성분은 위와 같음) 0.10%, 비타민(성분은 위와 같음) 0.10%, 에폭시 실리콘 에테르 0.03%이다.
배양 조건으로는, 온도 30±2℃, 회전속도 90rpm, 통기량은 0.5vvm이며, 18~22시간 배양했다.
3) 2단계 시드: 4%의 1단계 균종을 멸균과 냉각 처리된 배양기 내에 넣고, 2단계 시드 탱크에서 배양했다.
배양기의 조성으로는, 포도당 5%, 글루타민산 나트륨 2.0%, 효모 추출물 1.0%, 염화나트륨 0.14%, 인산이수소칼륨 0.16%, 황산마그네슘 0.50%, 염화칼슘 0.02%, 탄산수소나트륨 0.02%, 황산나트륨 0.91%, 황산암모늄 0.10%, 염화칼륨 0.08%, 미량 원소(성분은 위와 같음) 0.09%, 비타민(성분은 위와 같음) 0.09%, 에폭시 실리콘 에테르 0.36%이다.
배양 조건으로는, 온도 30±2℃, 회전속도 90rpm이며, 14~16시간 배양했다.
4) 주발효: 2단계 시드액을 10%의 비율로 발효 탱크의 발효 배양기 내에 접종하여 발효시켰다.
배양기 조성으로는, 포도당 5%, 글루타민산 나트륨 2.5%, 효모 추출물 1.0%, 염화나트륨 0.29%, 인산이수소칼륨 0.28%, 황산마그네슘 0.66%, 염화칼슘 0.03%, 탄산수소나트륨 0.02%, 황산나트륨 0.58%, 황산암모늄 0.13%, 염화칼륨 0.11%, 미량 원소(성분은 위와 같음) 0.13%, 비타민(성분은 위와 같음) 0.13%, 에폭시 실리콘 에테르 0.03%이다.
배양 조건으로는, 회전속도 90rpm, 0~80시간에서 온도를 29℃로 제어하고, 80시간 이후로는 온도를 19℃로 제어했다. 통기량은 0.45VVm이다. 50% 포도당을 함유한 설탕 탱크를 이용하여 포도당을 첨가하고, 60% 글루타민산 나트륨 용액을 첨가하여, 배양기 내의 포도당과 글루타민산 나트륨의 함량을 조정하여 탄질비를 제어했다. 배양기 내의 포도당과 글루타민산 나트륨의 함량 및 PH의 제어는 표 2와 같았으며, 5일간 배양했다.
시간(h) 0~16 17~55 56~80 81~95 96~120
포도당
(g/100ml)		 2~4 2~3 1~2 0.5~1 <0.5
글루타민산 나트륨(g/100ml) 1~2 1~1.5 1~1.2 0.75~1 0.5~0.75
PH 자연 6.2~6.5 6.5~6.7 6.7~7.0 6.7~7.0
5) 원유 추출: 발효 완료 후, 3상 원심 분리기를 이용하여 탈수시키고, 균사체와 물을 분리하고, 95% 에탄올로 탈수시킨 후, 헥산을 넣어 추출하여 원유를 얻었다.
6) 수세 및 탈검: 오일 중량의 10%를 차지하는 정제수를 넣고 85℃까지 가열했다. 80rpm의 회전속도로 20분간 교반하고 2시간 방치한 후 물을 분리했다.
7) 산 정제: 오일을 75℃까지 가열하고, 오일 중량의 4‰를 차지하는 구연산을 넣고 80rpm의 회전속도로 40분간 교반했다. 다시 오일 중량의 10%를 차지하는 85℃의 가열 수를 넣고 20분간 교반하고, 3시간 방치한 후 물을 분리했다.
8) 알칼리 정제: 오일을 45℃까지 가열하고, 오일 산가에 따라 염기 추가량을 산출했다(염기 추가량=7.13×10-4×산가×오일 중량). 40%의 수산화나트륨 용액을 넣고, 80rpm의 회전속도로 50분간 교반했다. 오일 온도를 80℃까지 승온시킨 후, 다시 오일 중량의 5%를 차지하는 85℃의 정제수를 넣고, 80rpm의 속도로 15분간 교반한 후, 2상 원심 분리기로 원심 처리하여 사포닌을 제거했다.
9) 탈수: 알칼리 정제를 거친 오일을 70℃까지 가열하고, -0.1MPa의 음압에서 35분간 탈수시켰다.
10) 상온 탈랍: 탈수된 오일을 자연 강온시키고, 오일 온도를 20℃까지 낮춘 후 유지하여 결정을 성장시켰다. 상온 탈랍 시간은 16시간으로 했다.
11) 여과: 상온 탈랍한 오일을 플레이트-프레임 필터 프레스로 여과하되, 여과 매질로서 공업용 여과포를 사용하고, 여과 압력은 0.3MPa로 했다.
12) 재탈수: 여과한 오일을 80℃까지 가열하고, -0.1MPa의 음압에서 35분간 탈수시켰다.
13) 저온 탈랍: 탈수된 오일을 기설정 프로그램에 따라 강온시켰다. 이때, 먼저 오일을 30분당 10℃의 속도로 신속하게 강온시키고, 45℃에 도달한 후 시간당 3℃씩 강온시킨 후, 점차 줄여 시간당 1℃씩 강온시켰다. 오일 온도가 15℃로 낮아진 시점에 온도를 재상승시켜 결정을 성장시키되, 온도 재상승 온도는 1℃, 온도 재상승 시간은 4시간으로 했다. 온도 재상승 이후, 시간당 2℃의 속도로 계속 강온시켜 1℃에 도달한 후 보온시켰다. 저온 탈랍 시간은 48시간으로 했다.
14) 재여과: 상온 탈랍한 오일을 플레이트-프레임 필터 프레스로 여과하되, 여과 재질로서 공업용 여과포를 사용하고, 여과 압력은 0.2MPa로 했다.
15) 탈색: 1.5%의 활성탄과 1.5%의 활성 백토를 첨가하여, 70분간 탈색시켰다.
16) 탈취: 탈취 온도 175±2℃부터 시간을 기록하고, 탈취 온도를 175±2℃로 유지하고, 탈취 시간은 4시간으로 하였다. 스팀 압력을 0.2MPa~0.3MPa로 유지하고, 진공도를 50Pa로 유지하고, 스팀 소모량을 오일 중량의 약 5%로 제어했다. 강온과 진공 파괴를 거쳐 최종 오일 제품을 얻었다.
실시예 3
1) 균종 생산: 원시 균종을 멸균과 냉각 처리된 배양기 내에 넣고, 진탕 플라스크에서 배양했다.
플라스크 배양기의 조성으로는, 포도당 4.5%, 글루타민산 나트륨 3.2%, 효모 추출물 0.62%, 염화나트륨 1.8%, 인산이수소칼륨 0.7%, 황산마그네슘 0.55%, 염화칼슘 0.03%, 미량 원소(황산니켈, 황산구리, 몰리브덴산나트륨, 염화망간, 염화코발트, 황산아연, 황산제일철 등) 0.1%, 비타민(B2, B6, B12 등) 0.1%이다.
배양 조건으로는, 200rpm의 쉐이커에서 28±1℃로 36~44시간 배양하고, 균사가 자란 후 이를 취해 병에 병합하여 1단계 시드 탱크에 넣었다.
2) 1단계 시드: 균종을 멸균과 냉각 처리된 배양기 내에 넣고, 1단계 시드 탱크에서 배양했다.
배양기의 조성으로는, 포도당 3%, 효모 분말 0.83%, 글루타민산 나트륨 0.62%, 효모 추출물 0.62%, 염화나트륨 0.62%, 인산이수소칼륨 0.7%, 황산마그네슘 0.52%, 염화칼슘 0.02%, 탄산수소나트륨 0.02%, 황산나트륨 0.93%, 황산암모늄 0.10%, 염화칼륨 0.08%, 미량 원소(성분은 위와 같음) 0.10%, 비타민(성분은 위와 같음) 0.10%, 에폭시 실리콘 에테르 0.03%이다.
배양 조건으로는, 온도 30±2℃, 회전속도 90rpm, 통기량은 0.50vvm이며, 18~22시간 배양했다.
3) 2단계 시드: 4%의 1단계 균종을 멸균과 냉각 처리된 배양기 내에 넣고, 2단계 시드 탱크에서 배양했다.
배양기의 조성으로는, 포도당 5%, 글루타민산 나트륨 2.0%, 효모 추출물 1.0%, 염화나트륨 0.14%, 인산이수소칼륨 0.16%, 황산마그네슘 0.50%, 염화칼슘 0.02%, 탄산수소나트륨 0.02%, 황산나트륨 0.91%, 황산암모늄 0.10%, 염화칼륨 0.08%, 미량 원소(성분은 위와 같음) 0.09%, 비타민(성분은 위와 같음) 0.09%, 에폭시 실리콘 에테르 0.36%이다.
배양 조건으로는, 온도 30±2℃, 회전속도 90rpm이며, 14~16시간 배양했다.
4) 주발효: 2단계 시드액을 10%의 비율로 발효 탱크의 발효 배양기 내에 접종하여 발효시켰다.
배양기 조성으로는, 포도당 5%, 글루타민산 나트륨 2.5%, 효모 추출물 1.0%, 염화나트륨 0.29%, 인산이수소칼륨 0.28%, 황산마그네슘 0.66%, 염화칼슘 0.03%, 탄산수소나트륨 0.02%, 황산나트륨 0.58%, 황산암모늄 0.13%, 염화칼륨 0.11%, 미량 원소(성분은 위와 같음) 0.13%, 비타민(성분은 위와 같음) 0.13%, 에폭시 실리콘 에테르 0.03%이다.
배양 조건으로는, 회전속도 90rpm, 0~80시간에서 온도를 32℃로 제어하고, 80시간 이후로는 온도를 28℃로 제어했다. 통기량은 0.5VVm이다. 50% 포도당을 함유한 설탕 탱크를 이용하여 포도당을 첨가하고, 60% 글루타민산 나트륨을 첨가하여, 배양기 내의 포도당과 글루타민산 나트륨의 함량을 조정하여 탄질비를 제어했다. 배양기 내의 포도당과 글루타민산 나트륨의 함량 및 PH의 제어는 표 3과 같았으며, 5일간 배양했다.
시간(h) 0~16 17~55 56~80 81~95 96~120
포도당
(g/100ml)		 6~8 5~6 4~5 0.5~1.0 < 0.5
글루타민산 나트륨(g/100ml) 1~5 1~3 1~2 0.75~1 0.5~0.75
PH 자연 6.2~6.5 6.5~6.7 6.7~7.0 7.0~7.4
5) 원유 추출: 발효 완료 후, 3상 원심 분리기를 이용하여 탈수시키고, 균사체와 물을 분리하고, 95% 에탄올로 탈수시킨 후, 헥산을 넣어 추출하여 원유를 얻었다.
6) 수세 및 탈검: 오일 중량의 10%를 차지하는 정제수를 넣고 85℃까지 가열했다. 80rpm의 회전속도로 20분간 교반하고 2시간 방치한 후 물을 분리했다.
7) 산 정제: 오일을 75℃까지 가열하고, 오일 중량의 4‰를 차지하는 구연산을 넣고 80rpm의 회전속도로 40분간 교반했다. 다시 오일 중량의 10%를 차지하는 85℃의 가열 수를 넣고 20분간 교반하고, 3시간 방치한 후 물을 분리했다.
8) 알칼리 정제: 오일을 45℃까지 가열하고, 오일 산가에 따라 염기 추가량을 산출했다(염기 추가량=7.13×10-4×산가×오일 중량). 40%의 수산화나트륨 용액을 넣고, 80rpm의 회전속도로 50분간 교반했다. 오일 온도를 80℃까지 승온시킨 후, 다시 오일 중량의 5%를 차지하는 85℃의 정제수를 넣고, 80rpm의 속도로 15분간 교반한 후, 2상 원심 분리기로 원심 처리하여 사포닌을 제거했다.
9) 탈수: 수세 및 탈검, 알칼리 정제를 거쳐 사포닌이 제거된 오일을 90℃까지 가열하고, -0.1MPa의 음압에서 35분간 탈수시켰다.
10) 상온 탈랍: 탈수된 오일을 자연 강온시키고, 오일 온도를 30℃까지 낮춘 후 유지하여 결정을 성장시켰다. 상온 탈랍 시간은 24시간으로 했다.
11) 여과: 상온 탈랍한 오일을 플레이트-프레임 필터 프레스로 여과하되, 여과 매질로서 공업용 여과포를 사용하고, 여과 압력은 0.3MPa로 했다.
12) 재탈수: 여과한 오일을 85℃까지 가열하고, -0.1MPa의 음압에서 35분간 탈수시켰다.
13) 저온 탈랍: 탈수된 오일을 기설정 프로그램에 따라 강온시켰다. 이때, 먼저 오일을 30분당 10℃의 속도로 신속하게 강온시키고, 45℃에 도달한 후 시간당 3℃씩 강온시킨 후, 점차 줄여 시간당 1℃씩 강온시켰다. 오일 온도가 13℃로 낮아진 시점에 온도를 재상승시켜 결정을 성장시키되, 온도 재상승 온도는 2℃, 온도 재상승 시간은 5시간으로 했다. 온도 재상승 이후, 시간당 1℃의 속도로 -10℃까지 계속 강온시켰다. 결정 성장 시간은 16시간보다 적지 않도록 확보했다. 저온 탈랍 시간은 90시간으로 했다.
14) 재여과: 상온 탈랍한 오일을 플레이트-프레임 필터 프레스로 여과하되, 여과 재질로서 공업용 여과포를 사용하고, 여과 압력은 0.2MPa로 했다.
15) 탈색: 1.5%의 활성탄과 1.5%의 활성 백토를 첨가하여, 70분간 탈색시켰다.
16) 탈취: 탈취 온도 175±2℃부터 시간을 기록하고, 탈취 온도를 175±2℃로 유지하고, 탈취 시간은 4시간으로 하였다. 스팀 압력을 0.2MPa~0.3MPa로 유지하고, 진공도를 50Pa로 유지하고, 스팀 소모량을 오일 중량의 약 5%로 제어했다. 강온과 진공 파괴를 거쳐 최종 오일 제품을 얻었다.
대조예
실시예 1의 방법을 참고하여 균종을 배양하고 발효시키되, 주발효 배양기 내에 포도당 4.5%, 글루타민산 나트륨 2%, 효모 추출물 0.9%을 포함하고, (탄질비 10.7:1), 28℃의 항온에서 5일간 배양하였으며, 저온 탈랍 시 0℃까지 신속하게 강온시켜 결정을 48시간 성장시킨 점이 다르다.
실험 결과
실시예 1, 실시예 2, 실시예 3과 대조예로부터 얻은 최종 오일 제품에 대해 각각 기상크로마토그래피를 통해 지방산 성분을 검출했다. 최종 오일 제품에서 각 지방산이 차지하는 비율은 표 4와 같다.
지방산 명칭 실시예 1 실시예 2 실시예 3 대조예
라우르산(C12:0) 0.105 0.124 0.119 1.47
미리스트산(豆酸)(C14:0) 0.822 0.793 0.851 1.89
미리스트산(肉豆酸)(C14:1) 0.024 0.031 0.035 1.62
팔미트산(C16:0) 14.806 17.975 19.112 27.92
팔미톨레산(C16:1) 0.51 0.493 0.572 0.11
스테아르산(C18:0) 1.01 1.21 1.17 17.49
올레산(C18:1, n9) 2.18 2.31 2.28 0.22
리놀레산(C18:2,n6) 0.83 0.79 0.91 0.13
γ-리놀렌산(C18:3n6) 2.12 2.37 2.29 0.23
ARA(C20:4,n6) 0.147 0.159 0.143 0.12
아라키드산(C22:0) 1.64 2.612 2.722 4.51
EPA(C20:5,n3) 0.93 0.89 0.96 0.27
DPA(C22:5,n6) 13.45 15.68 15.71 0.24
DHA(C22:6,n3) 55.71 48.76 47.25 35.31
리그노세린산(C24:0) 1.23 1.32 1.25 3.29
에루크산(C22:1n9) 0.141 0.163 0.171 0.133
기타 지방산 4.331 4.324 4.452 5.04
DHA:EPA 59.90 54.79 49.22 34.06
불포화 지방산:포화 지방산 3.17 2.52 2.36 0.58
표 4의 결과로부터 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 DHA 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법을 이용한 실시예는 DHA 함량이 더 많고, 유해 지방산 함량이 더 적다. 또한, 저온 응고 성능도 더 바람직하다.
본 발명에 따른 미생물 오일은 DHA 함량이 높고, EPA 함량이 낮으며, 유해 지방산 함량이 낮고, 저온 응고 성능이 좋아, 영유아용 조제식품, 특히 영유아용 조제분유 제조에 이용될 수 있다. 또한, 보건식품을 제조할 수도 있으며, 본 분야의 통상의 기술자에게 알려진 DHA와 많은 질병의 관계에 따라, 관련 수요가 있는 사람들에게 치료 및 보건 요구용으로 제공될 수 있다. 또한, 건강식품과 일반식품 등으로 제조되어 인체에 필요한 영양분을 제공하고, 일상에서 부족한 섭취를 보충할 수 있다.
이상, 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세히 기술했으나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 기술적 구상 범위에서 본 발명의 기술적 수단을 다양하고도 간단하게 변형할 수 있으며, 이러한 변형은 각각의 기술적 특징을 기타 적절한 방식으로 조합하는 것을 포함한다. 이러한 간단한 변형과 조합도 본 발명에 개시된 내용으로 보아야 함은 마찬가지이며, 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.

Claims (9)

  1. 균종이 발효한지 0~16시간 동안은 포도당 함량을 2~8g/100ml로, 글루타민산 나트륨의 함량을 1~5g/100ml로 제어하고, 배양 온도를 29~32℃사이로 제어하는 단계;
    균종이 발효한지 17~55시간 동안은 포도당 함량을 2~6g/100ml로, 글루타민산 나트륨의 함량을 1~3g/100ml로 제어하고, 배양 온도를 29~32℃사이로 제어하는 단계;
    균종이 발효한지 56~80시간 동안은 포도당 함량을 1~5g/100ml로, 글루타민산 나트륨의 함량을 1~2g/100ml로 제어하고, 배양 온도를 29~32℃사이로 제어하는 단계;
    균종이 발효한지 81~95시간 동안은 포도당 함량을 0.5~1.0g/100ml로, 글루타민산 나트륨의 함량을 0.75~1.0g/100ml로 제어하고, 배양 온도를 19~28℃사이로 제어하는 단계; 및
    균종이 발효한지 96시간 이후로는 포도당 함량을 <0.5g/100ml로, 글루타민산 나트륨의 함량을 0.5~0.75g/100ml로 제어하고, 배양 온도를 19~28℃사이로 제어하는 단계를 포함함으로써,
    DHA 변환율을 향상시키고 다른 지방산의 함량을 저감시키는, DHA 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 방법은, 먼저 오일을 70~90℃까지 승온시켜 탈수시킨 후, 점차 20~30℃까지 냉각시켜 상온에서 16~24시간 탈랍시키고(winterization), 여과 및 탈수 후, 설정된 프로그램에 따라 다시 점차 -10~1℃까지 강온시켜 보온하여 저온에서 48~90시간 탈랍시키는 단계를 포함하는, 미생물 오일 정제 프로세스를 더 포함하는, DHA 미생물 오일 중 지방산 조성물의 성분 조정 방법.
  3. 제1항에 따른 방법으로 제조되며, 미생물 오일 총량 기준으로,
    40wt%보다 적지 않은 DHA와 3wt%를 초과하지 않는 EPA;
    0~5wt%의 C12:0 지방산;
    0~8wt%의 C14:0과 C14:1 지방산;
    5~50wt%의 C16:0과 C16:1 지방산;
    0.5~1.2wt%의 C18:0 지방산;
    2.18~2.31wt%의 C18:1 n9 지방산;
    0.79~0.91wt%의 C18:2 n6 지방산;
    2.12~2.37wt%의 C18:3 n6 지방산;
    13.45~15.71wt%의 C22:5 n6 지방산; 및
    0~5wt%의 C22:1 n9 지방산을 함유하는, DHA 미생물 오일.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 DHA 미생물 오일에서 DHA와 EPA의 비율은 (13.3~600):1인, DHA 미생물 오일.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 DHA 미생물 오일에서 포화 지방산에 대한 불포화 지방산의 함량비는 0.60 이상인, DHA 미생물 오일.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 DHA 미생물 오일에서 포화 지방산에 대한 불포화 지방산의 함량비는 2.3 이상인, DHA 미생물 오일.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 DHA 미생물 오일을 포함하고, 영유아용 조제식품, 보건식품, 건강식품 및 일반식품 제조에 적용되는, 조성물.
  8. 삭제
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