CN106755151A - 一种利用微生物发酵生产ara的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵工程领域，涉及一种利用微生物发酵生产ARA的方法，具体地，涉及利用高山被孢霉菌株工业化发酵生产含花生四烯酸(ARA)混合油脂的方法。更具体地，本发明涉及一种培养用于生产ARA的微生物的方法，其中：一种培养用于生产ARA的微生物的方法，其中：从发酵罐培养的100－140小时开始，将发酵温度控制在20－25℃；和/或，从发酵罐培养的第8－10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上。本发明的方法制备ARA，产量高，纯度高，并且有利于ARA的大规模工业化生产。

Description

一种利用微生物发酵生产ARA的方法
技术领域
本发明属于发酵工程领域，涉及一种利用微生物发酵生产ARA的方法，具体地，涉及利用高山被孢霉菌株工业化发酵生产含花生四烯酸(ARA)混合油脂的方法。
背景技术
ARA，又称花生四烯酸，全名二十碳四烯酸(cis－5,8,11,14－arachidonic acid,ARA)，是ω－6系列的一种多元不饱和脂肪酸。ARA是一种人体重要的必需脂肪酸，也是人体中含量最高、分布最广的一种多不饱和脂肪酸。ARA在血液、肝脏、肌肉和其他器官系统中作为磷脂结合的结构脂类起重要作用，ARA是许多循环二十烷酸衍生物的直接前体。这些生物活性物质对脂质蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用。此外，有研究表明，ARA降血脂、降血压和降血胆固醇的效果均强于亚油酸和亚麻酸；同时能缓解氯化钡、乌头碱等引起的心律不齐，其作用效果也强于亚油酸和亚麻酸。因此，ARA具有重要的营养、保健和医疗功能。
目前，ARA主要由微生物发酵法生产。公开号为CN105112466A的专利公开了一种添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，其所公开的添加产物促进剂的摇瓶在培养结束后检测发酵液中ARA含量为5.41g/L，产量较对照提高了45.1％。公开号为CN102925502A的专利公开了一种利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其所公开的产量为花生四烯酸的单位产量达到10g/L发酵液。公开号为CN104278107A的专利公开了一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其所公开的产量为25m3发酵罐发酵高山被孢霉细胞干重、油脂含量、花生四烯酸占总油脂的百分含量、花生四烯酸的单位产量分别可以达到55g/L、54％、65％、20.628g/L，花生四烯酸生产强度达到1.753g/(L·d)，这也是目前报道的采用高山被孢霉大规模工业化生产ARA的最高生产水平。虽然其ARA生产率较之前的研究有了较大提高，但对于利用高山被孢霉进行工业化生产花生四烯酸，大大降低其生产成本，提高单位产量，使微生物发酵工业化生产ARA的方法能够得到大力推广和普及使用还是远远不够的。
现有从高山被孢霉发酵培养物中提取ARA的方法主要有三种，一是离心法，二是有机溶剂萃取法，三是超临界萃取法。离心法如公告号为CN1282745C的专利公开了一种从微生物细胞中获得油的方法，所述的油包含一种或多种不饱和脂肪酸，该方法包括：(a)裂解微生物细胞的细胞壁以释放出油来；和(b)通过离心从至少部分(a)中所形成的细胞壁碎片中分离油。但该发明离心后的油层品质较差，除含油脂外，还含有水分、培养基成分和细胞碎片，不利于后续的精炼，另外离心后的废水层含有大量菌渣，COD很高，难以处理或处理成本极高。有机溶剂萃取法如公告号为CN101109015B的专利公开了一种花生四烯酸油脂的制备方法，其中所述的油脂提取方法为：将老化后的菌体收集、烘干、磨碎，用石油醚和乙醇萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到花生四烯酸油脂。但该方法使用到有机溶剂进行萃取，最终产品可能会有溶剂残留，且萃取过程存在易燃易爆等安全隐患。超临界萃取方法如公开号为CN101579019A的专利公开了一种用CO2超临界萃取法提取多不饱和脂肪酸油脂的方法，其步骤如下：①粉碎过筛；②加温萃取；③将液态CO2注入萃取釜中，加压；④萃取完毕收集油脂。但超临界设备价格昂贵，萃取收率也不高，该发明萃取出油率最高只有50％。
现有技术中ARA毛油的精炼多采用化学精炼技术，ARA毛油经过脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到ARA精油。该工艺技术不可避免地存在一些问题，如：碱炼为了达到控制酸价低的要求，通常都会加入过量碱，部分甘油三酯不可避免会被皂化；碱炼产生的高COD废水会污染环境；碱炼需要高温处理时间长，容易造成产品过氧化值、茴香胺值升高；脱臭温度高、时间长易产生反式脂肪酸等缺点。
目前，尚需要开发新的ARA生产工艺。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种培养用于生产ARA的微生物的方法。本发明人惊奇地发现，所述培养方法能够大幅度地提高生物量及ARA产量。进一步地，本发明人还发现了一种提取ARA毛油的方法，所述提取方法能够提高ARA毛油的提取收率和品质。进一步地，本发明人还发现了一种纯化ARA毛油的方法，其能够提升ARA成品油的各项技术指标和纯化收率。本发明显著地提高了含ARA的粗油脂产量、ARA产量以及ARA生产率。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种培养用于生产ARA的微生物的方法，其中：
从发酵罐培养的100－140小时开始，将发酵温度保持在20－25℃(例如21－25℃、20－24℃、21－23℃、22－25℃、22－24℃、23－25℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃)；优选地，直至发酵结束；
和/或
从发酵罐培养的第8－10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上(例如55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或95％以上)；优选地，直至发酵结束。
在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中：
从发酵罐培养的105－135小时、110－130小时、115－125小时(例如115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125小时)或者120小时开始，将发酵温度控制在20－25℃(例如21－25℃、20－24℃、21－23℃、22－25℃、22－24℃、23－25℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃)，和/或
从发酵罐培养的第8天、第9天或者第10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上(例如55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或95％以上)。
在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，在保持发酵温度为20－25℃之前，发酵温度为25－30℃(例如26－30℃、25－29℃、26－28℃、27－30℃、26－29℃、28－30℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)。
在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，所述发酵液的pH为6.0－7.0；
优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上之前，发酵液中葡萄糖的浓度保持1－5g/L(例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5g/L)。
在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，发酵液中葡萄糖的浓度1－2g/L；
优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，发酵温度20－25℃；
优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，停止搅拌；
优选地，将上述3个条件即葡萄糖浓度、发酵温度、停止搅拌，保持至发酵结束；
优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上之前，滤去发酵液，并加入适量水或新鲜的发酵培养基。
在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，所述发酵罐培养还包括在发酵罐培养起始的36－60小时(例如40－56小时、42－54小时、44－52小时、46－50小时、46、47、48、49或50小时)，进行分罐培养的步骤；例如，分为两个或更多个发酵罐进行发酵罐培养。
在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其在发酵罐培养之前，还包括接种和种子扩大培养的步骤；
优选地，所述种子扩大培养包括一级种子扩大培养和二级种子扩大培养；
优选地，所述一级种子扩大培养包括下述步骤：
按照0.4％－1％的接种量将摇瓶种子液接入装有灭菌后培养基的一级种子罐中，培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养30－35h，完成一级种子扩大培养；
优选地，所述二级种子扩大培养包括下述步骤：
按照1％－3％的接种量将一级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的二级种子罐中，培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养20－25h，完成二级种子扩大培养。
在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，还包括在接种和种子扩大培养之前，进行活化培养的步骤；优选地，所述活化培养的温度为25－32℃，搅拌转速100－200rpm，时间为40－48h。
在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，所述发酵罐培养包括下述步骤：
按照1％－3％的接种量将二级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的发酵罐中，培养温度20－30℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，搅拌转速0－50rpm，进行发酵罐培养。
在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中用于生产ARA的微生物为高山被孢霉或其突变菌株；所述高山被孢霉可以是本领域已知的高山被孢霉，例如，所述高山被孢霉选自保藏号为CCTCC No.M2012073、CCTCC No.M2013392、CCTCC No.M2015421和ATCCNo.42430的菌株。
在本发明一个具体的实施方式中，所述的培养方法，包括下述步骤：
1)将高山被孢霉(Mortierella alpine)斜面保藏菌株接入装有400mL培养基的2L摇瓶，在25－32℃的温度下以150rpm的转速培养40－48h，完成菌株活化培养；
2)按照0.4％－1％的接种量将摇瓶种子液接入装有灭菌后培养基的一级种子罐中，培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养30－35h，完成一级种子扩大培养；
3)按照1％－3％的接种量将一级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的二级种子罐中，培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养20－25h，完成二级种子扩大培养；
4)按照1％－3％的接种量将二级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的发酵罐中，培养温度20－30℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，搅拌转速0－50rpm，进行发酵培养；
5)将120h前的罐温控制在25－30℃、120h及之后的罐温控制在20－25℃；
6)发酵至48h将发酵罐中发酵液一分为二培养，一半发酵液留在主罐中继续培养，另一半发酵液通过压差法转移至无菌保压的副罐中培养，主副罐中分别补入适量灭菌后新鲜培养基或无菌水，分罐培养后主副罐通气量、罐压及搅拌转速均稍作调整；
7)发酵过程中葡萄糖浓度随菌体生长不断下降，流加碳源将发酵液中糖点(葡萄糖浓度)维持在1－5g/L；
8)发酵培养8－10d，中止发酵，主副罐均通过放料管路筛网过滤，得到的菌体重新加入等体积一次水，稍开搅拌将菌体重悬后，停搅拌，停止通气，维持罐温20－25℃，流加碳源控制主副罐糖点在1－2g/L，静置1－2d；
不拘于理论的限制，步骤8)可以刺激高山被孢霉菌体中短链及低碳脂肪酸往ARA转化积累，提高菌体中ARA含量；
9)放罐，测定发酵液中生物量达50－60g/L，粗油脂含量达50％－65％，ARA占总油脂含量为55％－60％，ARA产量最高可达20.1g/L，ARA产率最高可达1.83g/(L·d)。
上述步骤7)中，糖点(葡萄糖的浓度)采用本领域技术人员知悉的方法测定，例如生物传感仪测定。
在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中所用的发酵培养基碳源中添加20％－40％(粗甘油的质量/碳源的质量×100％)预处理后的生物柴油副产物粗甘油。生物柴油是以植物油和动物油脂等可再生油脂为原料制成的可再生能源，经过转酯反应后可生成生物柴油及副产物甘油。粗甘油的预处理过程包括调节pH值至酸性、稀释、水解、分离。在本发明的一个实施方案中，粗甘油的预处理包括下述步骤：i)将粗甘油与去离子水以1:4(体积比)混合；ii)以盐酸调节pH至6.5左右；iii)以5000rpm的转速分离去除沉淀物质。不拘于理论的限制：步骤i)中，稀释后可以降低粘度；步骤ii)中，将粗甘油中可溶性的皂角类物质转化为不溶的游离脂肪酸固体物质；步骤iii)中，沉淀物质包括游离脂肪酸固体和不溶解的重金属杂质。
上述种子培养基可以采用本领域培养已有的菌种高山被孢霉(Mortierellaalpine)种子培养基。上述发酵培养基可以采用本领域培养已有的菌种高山被孢霉(Mortierella alpine)发酵培养基。
上述发酵培养基中碳源包括葡萄糖、玉米浆粉、糖蜜、甘油和淀粉中的一种或多种；氮源包括大豆粉、酵母粉、蛋白胨、氨水、硝酸钠、谷氨酸钠、硫酸铵中的一种或多种。
上述发酵培养基中添加的微量元素包括丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、泛酸钙、生物素、维生素B1、微生物B6、微生物B12、维生素K中的一种或多种，当为其中一种时，添加量为0.001％－0.01％；当为其中多种时，任意一种组分的添加量为0.001％－0.005％。
上述发酵培养基中添加的无机盐包括硫酸镁、氯化钾、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或多种。
本发明的另一方面涉及一种微生物的发酵培养物，其由本发明中任一项所述的培养方法得到。
本发明的再一方面涉及一种提取ARA毛油的方法，包括如下步骤：
1)将用于生产ARA的微生物的发酵培养物进行脱水处理；
2)将步骤1)的产物进行柔性压榨，得到ARA毛油。
在本发明的一个实施方案中，所述的提取方法，其中，步骤1)中，所述发酵培养物为高山被孢霉发酵培养物；优选地，所述发酵培养物为本发明的发酵培养物。
在本发明的一个实施方案中，所述的提取方法，其中，步骤1)中，所述脱水处理选自如下的任意一种、两种或三种：
离心或板框过滤、第一级柔性压榨、干燥例如气流干燥；
优选地，所述脱水处理依次包括离心和第一级柔性压榨，或者依次包括板框过滤和气流干燥；
优选地，所述气流干燥的进风温度110－150℃，出风温度30－70℃，至水分含量小于10％。
在本发明的一个实施方案中，所述的提取方法，其中，步骤1)中，所述第一级柔性压榨采用逐步加压方式，设定压力为20－40MPa，加压时间为1－6h，到达设定压力后保压1－4h。
在本发明的一个实施方案中，所述的提取方法，其中，步骤2)中，所述柔性压榨采用逐步加压方式，设定压力为50－150MPa，加压时间为1－6h，到达设定压力后保压1－4h。
在本发明一个具体的实施方式中，所述的提取方法，包括下述步骤：
1)布料：将一定量的发酵培养物用布料器运送至布料腔中，布料器回到初始位置，待下一步布料。
2)一级柔性压榨：采用逐步加压方式，一级柔性压榨的压力范围为20－40MPa，加压时间约为1－6h，到达设定压力，保压1－4h至基本无水滴流出，结束后，待物料下降到重压腔中，将物料推入二级柔性压榨位置。
3)二级柔性压榨：采用逐步加压方式，压榨的最终压力为50－150MPa，加压时间大约为1－6h，到达设定压力，保压1－4h至基本无油滴流出，收集压榨出来的ARA毛油，卸压，去掉二级压榨笼，将菌渣与滤布进行分离。
上述ARA发酵液可直接进行一级柔性压榨，也可以先采用离心方法除去一部分水分，提高发酵液的含固量后再进行一级柔性压榨，可缩短压榨时间和提高生产能力。
上述发酵液离心方法可采用卧式螺旋离心机、碟式离心机、管式离心机中的一种进行。
在本发明另一个具体的实施方式中，所述的提取方法，包括下述步骤：发酵培养物经板框过滤、气流干燥得到菌粉，菌粉进行柔性压榨，得到ARA毛油。
上述板框过滤方式为：发酵液进料后，过滤至压滤机滤嘴全开且进料压力达到0.6－1.0MPa，过滤完毕后吹气，吹气压力0.3－0.6MPa，吹气时间1－3h。
上述气流干燥进风温度110－150℃，出风温度30－70℃，ARA菌粉水分控制在10％以内。
本发明的再一方面涉及一种ARA毛油，其由本发明中任一项所述的提取方法制得。
本发明的再一方面涉及一种纯化ARA毛油的方法，包括将ARA毛油进行水化、脱色和分子蒸馏的步骤；优选地，所述ARA毛油为本发明的ARA毛油。
在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其中，所述水化包括如下步骤：
将ARA毛油加热至70－85℃，按1kg毛油加入50－150g水的比例加入75－90℃水，搅拌10－60min，搅拌速度30－90转/min，静置1－6h，分层去掉下层磷脂，得到水化油。
在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其中，所述脱色包括如下步骤：
将水化产物升温至90－110℃，控制真空度≤-0.07MPa，真空脱水0.5－2h，然后降温至60－80℃，加入脱色剂(例如水化油重量1％－3％的活性炭和2％－4％活性白土)，搅拌0.5－1h，停止搅拌，过滤去除脱色剂，得到脱色油。
在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其中，所述分子蒸馏为三级分子蒸馏；
优选地，所述分子蒸馏包括如下步骤：
将脱色油进入三级分子蒸馏，控制第一级真空度≤100Pa、温度150－200℃，去除第一级的轻组分；得到的第一重组分进入第二级分子蒸馏，控制二级真空度≤50Pa、温度180－220℃，去除第二级轻组分；得到的第二重组分进入第三级分子蒸馏，控制第三级真空度≤5Pa、温度200－250℃，去除第三级轻组分，得到第三重组分，为ARA成品油。
优选地，重复分子蒸馏1次或多次(例如2、3、4或5次)。
在本发明一个具体的实施方式中，所述的纯化方法，包括下述步骤：
1)水化：ARA毛油加热至70－85℃，按1kg毛油加入50－150g纯化水的比例加入75－90℃纯化水，搅拌10－60min，搅拌速度30－90转/min，静置1－6h，分层去掉下层磷脂，得到水化油；
2)脱色：水化油移入脱色锅，升温至90－110℃，控制真空度≤－0.07MPa，真空脱水0.5－2h，然后降温至60－80℃，加入脱色剂(水化油重量1％－3％的活性炭和2％－4％活性白土)，搅拌脱色0.5－1h，停止搅拌，过滤去除脱色剂，得到脱色油；
3)分子蒸馏：脱色油进入三级分子蒸馏，控制第一级真空度≤100Pa、温度150－200℃，去除第一级的轻组分，重组分进入第二级分子蒸馏，控制二级真空度≤50Pa、温度180－220℃，去除第二级轻组分，重组分进入第三级分子蒸馏，控制第三级真空度≤5Pa、温度200－250℃，去除第三级轻组分，收集重组分，得到分子蒸馏油。分子蒸馏遍数控制1－3遍，至酸价、气味符合标准要求。分子蒸馏完毕，降温至20－40℃，添加抗氧化剂，包装，得到ARA成品油。
本发明的再一方面涉及一种ARA成品油，其由本发明中任一项所述的纯化方法制得。
本发明的再一方面涉及一种利用微生物生产ARA或含有ARA的产品(例如ARA成品油)的方法，包括：
本发明任一项所述的培养用于生产ARA的微生物的方法、
本发明任一项所述的提取ARA毛油的方法、和/或
本发明任一项所述的纯化ARA毛油的方法。
在本发明的一个实施方式中，生产ARA成品油的工艺流程如图1所示。
在本发明的另一个实施方式中，生产ARA成品油的工艺流程如图2所示。
本发明中，
术语“柔性压榨”是指采用PLC(可编程逻辑控制器)程序控制来进行加压－保压－加压循环，逐步达到预定压力的一种高压压榨方式。
术语“纯化水”是指饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。在本发明的一个实施方案中，所述纯化水参照《中国药典》的规定。
术语“ARA毛油”是指，从ARA发酵液中制取、没经过精炼加工的初级油。
术语“ARA成品油”是指，ARA毛油经过精炼加工得到的精油。
术语“发酵罐培养”是指种子扩大培养之后，在发酵罐中进行的用于生产目的产物的发酵培养。
本发明中，当提及“通气”或“通气量”时，如果没有特别说明，是指通入空气或者通入空气的量。
发明的有益效果
本发明具有下述技术效果中的至少一种：
(1)本发明的工艺技术指标均明显优于现有的工艺技术指标，所得ARA油脂产量高、纯度高，有利于ARA的大规模工业化生产，粗甘油的添加也降低了ARA发酵生产成本，大大提高了ARA发酵生产的市场竞争力。
(2)本发明采用柔性压榨工艺制备ARA毛油，不需要使用有机溶剂进行提取，整条生产工艺路线无需使用有机溶剂，最终产品不会有溶剂残留，一方面所得产品绿色健康，产品质量好，另一方面生产车间安全环保，是一个绿色的清洁生产工艺。
(3)发酵培养物经一级柔性压榨除去的水溶液，基本不含菌渣，COD比较低，容易生化处理，二级柔性压榨得到毛油后，剩下的菌渣还含有少量的油脂和大量的蛋白，可以作为饲料添加剂使用，经济环保。
(4)本发明采用分子蒸馏一步工艺替代传统脱酸、脱臭两步工艺。分子蒸馏能够在保留物质生理活性的基础上快速去除大量的游离脂肪酸和臭味。对比传统的碱炼脱酸方法，分子蒸馏脱酸工艺简单，降低了过度碱炼的风险，减少从皂脚带走中性油脂的损失，脱酸收率明显提高，脱酸过程在高真空条件下进行且时间短，避免了碱炼脱酸受热时间长造成过氧化值、茴香胺值升高的风险，产品稳定性好；对比传统水蒸气蒸馏脱臭工艺，分子蒸馏脱臭时间短，真空度高，减少了反式脂肪酸的产生，且臭味物质脱除效果好，产品无腥味。
(5)生产过程避免了有机溶剂的使用，避免了溶剂消耗和溶剂回收的成本，污水COD低容易处理，精炼收率高，从而大大降低了生产成本。
附图说明
图1：本发明一个实施方式的生产ARA成品油的工艺流程示意图。
图2：本发明另一个实施方式的生产ARA成品油的工艺流程示意图。
图3：所公开的高山被孢霉Mortierella alpine在不同培养方式下100m3发酵罐发酵生产ARA的结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
关于本发明涉及的物理量或者指标的测定方法或者计算方法，如果没有特别说明，按照下面所述的方法进行：
生物量的测定方法：取适量发酵培养物(发酵液)置于扁形称量瓶中，于105℃电热恒温干燥箱中干燥4h后，放入干燥器冷却至室温，称重，减去称量瓶重量，再除以发酵液体积，所得数值即为生物量，单位g/L。
粗油脂产量的测定方法：取一定体积发酵培养物(发酵液)，加入2倍体积的浓盐酸，70℃下恒温搅拌50min至菌体完全消化，加入适量正己烷，静置分层，用滴管取上层有机相至茄型瓶中，连续萃取5－8次，直至上层有机相为无色，通过80℃水浴旋转蒸发除去正己烷，然后将茄型瓶置于105℃电热恒温干燥箱中干燥1h，放入干燥器冷却至室温，称重，减去茄型瓶重量，再除以发酵液体积，所得数值即为粗油脂产量，单位g/L。
ARA产量：以气相色谱法测得粗油脂中ARA的含量，乘以粗油脂产量所得，单位g/L。
ARA生产率：ARA产量除以发酵周期(天数)所得数值，单位g/(L·d)。
脂肪酸组成分析的方法和本发明中ARA成品油检测方法均依据GB 26401－2011花生四烯酸油脂(发酵法)进行。
毛油提取收率计算方式：收率＝毛油重量g/(发酵液体积L×发酵液粗油脂产量g/L)×100％。
以下的实施例1－5涉及用100m3发酵罐发酵生产ARA。
下面的实施例1－5中，如果没有特别说明：
所用的菌株为高山被孢霉Mortierella alpine(ATCC No.42430)；
所用种子培养基配方为：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂15－20g、蒸馏水1000ml，自然pH；
所用发酵培养基配方为：葡萄糖22g/L，酵母粉12g/L，蛋白胨8g/L，氯化钠15g/L，硫酸铵6g/L，KH2PO4 5g/L，CuSO4·5H2O 1.5μg/L，MnSO4 2μg/L，ZnSO4·7H2O 3μg/L，pH 6－7。
实施例1
将高山被孢霉(Mortierella alpine)斜面保藏菌株接入装有400mL培养基的2L摇瓶，在28℃的温度下以150rpm的转速培养48h，完成菌株活化培养。按照0.4％的接种量将摇瓶种子液接入装有灭菌后培养基的一级种子罐中，在培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.04MPa的条件下培养30h，完成一级种子扩大培养。按照3％的接种量将一级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的二级种子罐中，在培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.04MPa的条件下培养24h，完成二级种子扩大培养。按照3％的接种量将二级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的发酵罐中。
发酵过程的培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.04MPa、搅拌转速50rpm，流加含30％预处理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖浓度在5g/L左右，进行发酵培养。发酵过程中检测发酵液葡萄糖浓度、pH、菌体生物量、粗油脂产量及ARA产量变化。
培养9d后终止发酵，测定发酵液中生物量为43g/L，粗油脂产量为21.5g/L，ARA产量为10.1g/L，ARA生产率为1.12g/(L·d)，如图3。发酵液放罐体积为83m3，整批发酵含ARA粗油脂产量为1784.5kg。表1为发酵后所得混合油脂脂肪酸组成气相分析结果。
表1：实施例1所得混合油脂脂肪酸组成
脂肪酸组成 含量％
C14:0 0.27
C15:0 0.12
C16:0 17.63
C17:0 0.46
C18:0 19.13
C18:1 5.34
C18:2 4.61
C18:3 4.47
C20:0 0.99
C20:4 46.98
实施例2
将高山被孢霉(Mortierella alpine)斜面保藏菌株接入装有400mL培养基的2L摇瓶，在28℃的温度下以150rpm的转速培养48h，完成菌株活化培养。按照0.4％的接种量将摇瓶种子液接入装有灭菌后培养基的一级种子罐中，在培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.04MPa的条件下培养30h，完成一级种子扩大培养。按照3％的接种量将一级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的二级种子罐中，在培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.04MPa的条件下培养24h，完成二级种子扩大培养。按照3％的接种量将二级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的发酵罐中。
发酵过程的通气量1vvm、罐压0.04MPa、搅拌转速50rpm，将120h前的罐温控制在28±1℃、120h及之后的罐温控制在22±1℃，流加含30％预处理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖浓度在5g/L左右，进行发酵培养。发酵过程中检测发酵液葡萄糖浓度、pH、菌体生物量、粗油脂产量及ARA产量变化。
培养9d后终止发酵，测定发酵液中生物量为50g/L，粗油脂产量为29g/L，ARA产量为15.1g/L，ARA生产率为1.68g/(L·d)，如图3。发酵液放罐体积为82m3，整批发酵含ARA粗油脂产量为2378kg，比实施例1的产量提高了0.33倍。以下表2为发酵后所得混合油脂脂肪酸组成气相分析结果。
表2：实施例2所得混合油脂脂肪酸组成
脂肪酸组成 含量％
C14:0 0.43
C15:0 0.16
C16:0 15.21
C17:0 0.56
C18:0 16.89
C18:1 5.07
C18:2 4.51
C18:3 4.12
C20:0 0.98
C20:4 52.07
实施例3
将高山被孢霉(Mortierella alpine)斜面保藏菌株接入装有400mL培养基的2L摇瓶，在28℃的温度下以150rpm的转速培养48h，完成菌株活化培养。按照0.4％的接种量将摇瓶种子液接入装有灭菌后培养基的一级种子罐中，在培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.04MPa的条件下培养30h，完成一级种子扩大培养。按照3％的接种量将一级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的二级种子罐中，在培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.04MPa的条件下培养24h，完成二级种子扩大培养。按照3％的接种量将二级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的发酵罐中。
发酵过程的培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.04MPa、搅拌转速50rpm，流加含30％预处理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖浓度在5g/L，进行发酵培养。发酵过程中发酵至48h将发酵罐中发酵液一分为二培养，一半发酵液留在主罐中继续培养，另一半发酵液通过压差法转移至无菌保压的副罐中培养，主副罐中分别补入适量灭菌后新鲜培养基或无菌水，分罐培养后主副罐通气量、罐压及搅拌转速均稍作调整。发酵过程中检测发酵液葡萄糖浓度、pH、菌体生物量、粗油脂产量及ARA产量变化。
培养9d后终止发酵，测定发酵液中生物量为45g/L，粗油脂产量为22.05g/L，ARA产量为10.6g/L，ARA生产率为1.18g/(L·d)，如图3。发酵液放罐体积为145m3，整批发酵含ARA粗油脂产量为3197.25kg，比实施例1的产量提高了0.79倍，虽然放罐生物量、粗油脂产量、ARA产量等指标与原始培养方式比较差异不大，但是由于采用分罐培养，发酵液放罐体积为原始培养方式的1.75倍，所以整批发酵产量较原始培养方式提高了0.79倍。这对于工业化大规模生产含ARA油脂具有重要意义，可以极大的节约成本，提高ARA生产的市场竞争力。以下表3为发酵后所得混合油脂脂肪酸组成气相分析结果。
表3：实施例3所得混合油脂脂肪酸组成
脂肪酸组成 含量％
C14:0 0.48
C15:0 0.17
C16:0 17.12
C17:0 0.52
C18:0 18.54
C18:1 5.28
C18:2 4.25
C18:3 4.36
C20:0 1.21
C20:4 48.07
实施例4
将高山被孢霉(Mortierella alpine)斜面保藏菌株接入装有400mL培养基的2L摇瓶，在28℃的温度下以150rpm的转速培养48h，完成菌株活化培养。按照0.4％的接种量将摇瓶种子液接入装有灭菌后培养基的一级种子罐中，在培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.04MPa的条件下培养30h，完成一级种子扩大培养。按照3％的接种量将一级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的二级种子罐中，在培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.04MPa的条件下培养24h，完成二级种子扩大培养。按照3％的接种量将二级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的发酵罐中。
发酵过程的培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.04MPa、搅拌转速50rpm，流加含30％预处理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖浓度在5g/L，进行发酵培养。培养9d后，中止发酵，通过放料管路筛网滤去发酵液，重新加入等体积一次水，稍开搅拌将菌体重悬后，停搅拌，停止通气，流加碳源控制糖点在2g/L左右，静置2d，刺激高山被孢霉菌体中短链及低碳脂肪酸往ARA转化积累，提高菌体中ARA含量。发酵过程中检测发酵液葡萄糖浓度、pH、菌体生物量、粗油脂产量及ARA产量变化。
培养11d后，测定发酵液中生物量为52g/L，粗油脂产量为31.2g/L，ARA产量为16.5g/L，ARA生产率为1.5g/(L·d)，如图3。发酵液放罐体积为83m3，整批发酵含ARA粗油脂产量为2589.6kg，比实施例1的产量提高了0.45倍。以下表4为发酵后所得混合油脂脂肪酸组成气相分析结果。
表4：实施例4所得混合油脂的脂肪酸组成
实施例5
将高山被孢霉(Mortierella alpine)斜面保藏菌株接入装有400mL培养基的2L摇瓶，在25℃的温度下以200rpm的转速培养24h，完成菌株活化培养。按照0.4％的接种量将摇瓶种子液接入装有灭菌后培养基的一级种子罐中，在培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.02MPa、搅拌转速50rpm的条件下培养30h，完成一级种子扩大培养。按照3％的接种量将一级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的二级种子罐中，在培养温度28℃、通气量1vvm、罐压0.02MPa、搅拌转速75rpm的条件下培养24h，完成二级种子扩大培养。按照3％的接种量将二级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的发酵罐中。
发酵过程的通气量1vvm、罐压0.04MPa、搅拌转速50rpm，将120h前的罐温控制在28±1℃、120h及之后的罐温控制在22±1℃，流加含30％预处理后粗甘油的碳源，控制葡萄糖浓度在5g/L左右，进行发酵培养。发酵过程中发酵至48h将发酵罐中发酵液一分为二培养，一半发酵液留在主罐中继续培养，另一半发酵液通过压差法转移至无菌保压的副罐中培养，主副罐中分别补入适量灭菌后新鲜培养基或无菌水，分罐培养后主副罐通气量、罐压及搅拌转速均稍作调整。培养9d后，中止发酵，主副罐均通过放料管路筛网滤去发酵液，重新加入等体积一次水，稍开搅拌将菌体重悬后，停搅拌，停止通气，维持罐温22±1℃，流加碳源控制主副罐糖点在2g/L左右，静置2d，刺激高山被孢霉菌体中短链及低碳脂肪酸往ARA转化积累，提高菌体中ARA含量。发酵过程中检测发酵液葡萄糖浓度、pH、菌体生物量、粗油脂产量及ARA产量变化。
培养11d后，测定发酵液中生物量为54g/L，粗油脂产量为34.02g/L，ARA产量为20.1g/L，ARA生产率为1.82g/(L·d)，如图3。发酵液放罐体积为146m3，整批发酵含ARA粗油脂产量为4966.92kg，比实施例1的产量提高了1.78倍。以下表5为发酵后所得混合油脂脂肪酸组成气相分析结果。
表5：实施例5所得混合油脂脂肪酸组成
脂肪酸组成 含量％
C14:0 0.45
C15:0 0.11
C16:0 14.22
C17:0 0.45
C18:0 10.46
C18:1 5.28
C18:2 4.16
C18:3 4.37
C20:0 1.42
C20:4 59.08
以下的实施例6－10和对比例1涉及提取ARA毛油
实施例6
取实施例5得到的ARA发酵液200L，经加热灭活处理后，用布料器将发酵液运至布料腔中，进行布料包裹，布料完毕后，进行一级压榨，采用逐步加压的方式，在设定的2h内达到设定的30MPa压力，保压2h到基本没有水滴流出。去掉一级压榨笼，换上二级压榨笼，推入二级压榨处，进行二级压榨，采用逐步加压的方式，在设定的2h内达到设定的100MPa压力，保压2h到基本没有油滴流出，收集压榨出来的ARA毛油，共得到ARA毛油6.0kg，发酵液至毛油收率88.2％。去掉二级压榨笼，将压完的菌渣与滤布进行分离。
实施例7
取实施例5得到的ARA发酵液200L，经加热灭活处理后，用布料器将发酵液运至布料腔中，进行布料包裹，布料完毕后，进行一级压榨，采用逐步加压的方式，在设定的5h内达到设定的40MPa压力，保压4h到基本没有水滴流出。去掉一级压榨笼，换上二级压榨笼，推入二级压榨处，进行二级压榨，采用逐步加压的方式，在设定的5h内达到设定的150MPa压力，保压4h到基本没有油滴流出，收集压榨出来的ARA毛油，共得到ARA毛油6.2kg，发酵液至毛油收率91.1％。去掉二级压榨笼，将压完的菌渣与滤布进行分离。
实施例8
取实施例5得到的ARA发酵液300L，经加热灭活处理后，采用蝶式离心机离心，去除离心轻液，得到145L浓缩后的发酵液，用布料器将浓缩后的发酵液运至布料腔中，进行布料包裹，布料完毕后，进行一级压榨，采用逐步加压的方式，在设定的5h内达到设定的40MPa压力，保压4h到基本没有水滴流出。去掉一级压榨笼，换上二级压榨笼，推入二级压榨处，进行二级压榨，采用逐步加压的方式，在设定的5h内达到设定的150MPa压力，保压4h到基本没有油滴流出，收集压榨出来的ARA毛油，共得到ARA毛油9.4kg，发酵液至毛油收率92.1％。去掉二级压榨笼，将压完的菌渣与滤布进行分离。
实施例9
取实施例5得到的ARA发酵液1000L，经加热灭活处理后，进入板框压滤机进行过滤，过滤至进料压力达到0.7MPa，过滤完毕后，用压缩空气进行吹气，吹气压力0.4MPa，吹气2h，吹气完毕后，拆卸板框，得到滤泥。设定气流干燥进风温度120℃，出风温度40℃，滤泥进入气流干燥，得到ARA菌粉58.1kg。ARA菌粉运至布料腔中，进行布料包裹，布料完毕后，进行柔性压榨，采用逐步加压的方式，在设定的2h内达到设定的100MPa压力，保压2h到基本没有油滴流出，收集压榨出来的ARA毛油，共得到ARA毛油31.8kg，发酵液至毛油收率93.5％。
实施例10
取实施例5得到的ARA发酵液1000L，经加热灭活处理后，进入板框压滤机进行过滤，过滤至进料压力达到1.0MPa，进料完毕后，用压缩空气进行吹气，吹气压力0.6MPa，吹气1h，吹气完毕后，拆卸板框，得到滤泥。设定气流干燥进风温度140℃，出风温度50℃，滤泥进入气流干燥，得到ARA菌粉55.8kg。ARA菌粉运至布料腔中，进行布料包裹，布料完毕后，进行柔性压榨，采用逐步加压的方式，在设定的4h内达到设定的150MPa压力，保压4h到基本没有油滴流出，收集压榨出来的ARA毛油，共得到ARA毛油32.5kg，发酵液至毛油收率95.5％。
对比例1
取实施例5得到的ARA发酵液1000L，经加热灭活处理后，进入板框压滤机进行过滤，过滤至进料压力达到1.0MPa，进料完毕后，用压缩空气进行吹气，吹气压力0.6MPa，吹气1h，吹气完毕后，拆卸板框，得到滤泥。设定气流干燥进风温度140℃，出风温度50℃，滤泥进入气流干燥，得到ARA菌粉55.6kg。双螺杆压榨机先预热至80℃，将ARA菌粉加入双螺杆压榨机中榨油，得到ARA毛油18.2kg，发酵液至毛油收率53.5％。
可见，本发明的提取ARA毛油的方法的毛油收率显著高于现有方法。
以下的实施例11－14和对比例2涉及纯化(精炼)ARA毛油
实施例11
取10kg实施例6、7、8合并所得的ARA毛油，按水化、脱色、分子蒸馏步骤进行精炼。
水化：10kg ARA毛油，升温至至75℃，加入1kg温度为80℃的纯化水，搅拌30min，搅拌速度30转/min，静置2h，分去下层，得到水化油9.76kg。
脱色：水化油升温至100℃，控制真空度－0.075MPa，真空脱水1h，然后降温至70℃，加入脱色剂(191g活性炭和286g活性白土)，搅拌脱色0.5h，停止搅拌，过滤去除脱色剂，得到脱色油9.33kg。
分子蒸馏：脱色油进入三级分子蒸馏，控制第一级真空度90Pa左右、温度160℃，去除第一级的轻组分，重组分进入第二级分子蒸馏，控制二级真空度40Pa左右、温度200℃，去除第二级轻组分，重组分进入第三级分子蒸馏，控制第三级真空度3Pa左右、温度220℃，去除第三级轻组分，收集重组分，脱臭完毕，降温至30℃，添加抗氧化剂，包装，得到ARA成品油9.13kg，检验结果见表6。
表6：ARA成品油检验结果
实施例12
取10kg实施例6、7、8合并所得的ARA毛油，按水化、脱色、分子蒸馏步骤进行精炼。
水化：10kg ARA毛油，升温至至85℃，加入1kg温度为90℃的纯化水，搅拌15min，搅拌速度90转/min，静置4h，分去下层，得到水化油9.81kg。
脱色：水化油升温至110℃，控制真空度－0.075MPa，真空脱水0.5h，然后降温至80℃，加入脱色剂(192g活性炭和288g活性白土)，搅拌脱色1h，停止搅拌，过滤去除脱色剂，得到脱色油9.39kg。
分子蒸馏：脱色油进入三级分子蒸馏，控制第一级真空度90Pa左右、温度200℃，去除第一级的轻组分，重组分进入第二级分子蒸馏，控制二级真空度40Pa左右、温度220℃，去除第二级轻组分，重组分进入第三级分子蒸馏，控制第三级真空度3Pa左右、温度250℃，去除第三级轻组分，收集重组分，分子蒸馏完毕，降温至30℃，添加抗氧化剂，包装，得到ARA成品油9.08kg，检验结果见表7。
表7：ARA成品油检验结果
实施例13
取10kg实施例9、10合并所得的ARA毛油，按实施例11的精炼方法进行精炼，得到ARA成品油9.20kg，检验结果见表8。
表8：ARA成品油检验结果
实施例14
取10kg实施例9、10合并所得的ARA毛油，按实施例12的精炼方法进行精炼，得到ARA成品油9.13kg，检验结果见表9。
表9：ARA成品油检验结果
对比例2
取10kg实施例9、10合并所得的ARA毛油，按传统精炼方法即水化、碱炼、脱色、脱臭步骤进行精炼。
水化：10kg ARA毛油，升温至至85℃，加入1kg温度为90℃的纯化水，搅拌15min，搅拌速度90转/min，静置4h，分去下层，得到水化油9.80kg。
碱炼：水化油保温在75℃，加入1L浓度10％(质量分数)的NaOH溶液，搅拌30min，搅拌速度30转/min，静置4h，分离掉皂脚，得到碱炼油，碱炼油搅拌情况下喷洒入油重10％的80℃纯化水进行水洗，加水时间控制在10－30min，加完水后采用静置2h，分离水层，重复洗涤2次，得到碱炼油9.10kg。
脱色：碱炼油升温至110℃，控制真空度－0.075MPa，真空脱水0.5h，然后降温至80℃，加入脱色剂(182g活性炭和273g活性白土)，搅拌脱色1h，停止搅拌，过滤去除脱色剂，得到脱色油8.65kg。
脱臭：脱色油移入脱臭锅，通水蒸气进行脱臭，脱臭温度控制在185℃，真空度控制在600Pa以内，脱臭时间2h，脱臭完毕，停止通蒸汽，降温至20－40℃，添加抗氧化剂，包装，得到ARA成品油8.41kg，检测结果见表10。
表10：ARA成品油检验结果
结果表明，本发明的纯化ARA毛油的方法能够更好地去除过氧化物和不皂化物，避免反式脂肪酸的产生，酸价也更低。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (23)

1.一种培养用于生产ARA的微生物的方法，其中：
从发酵罐培养的100－140小时开始，发酵温度为20－25℃；优选地，直至发酵结束；
和/或
从发酵罐培养的第8－10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上；优选地，直至发酵结束。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其中：
从发酵罐培养的105－135小时、110－130小时、115－125小时或者120小时开始，发酵温度为20－25℃，和/或
从发酵罐培养的第8天、第9天或者第10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其中，在发酵温度为20－25℃之前，发酵温度为25－30℃。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的培养方法，其中，所述发酵液的pH为6.0－7.0；
优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上之前，发酵液中葡萄糖的浓度为1－5g/L。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的培养方法，其中，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，发酵液中葡萄糖的浓度为1－2g/L；
优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，发酵温度为20－25℃；
优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，停止搅拌；
优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上之前，滤去发酵液，并加入适量水或新鲜的发酵培养基。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的培养方法，其中，所述发酵罐培养还包括在发酵罐培养起始的36－60小时(例如48小时)，进行分罐培养的步骤；例如，分为两个或更多个发酵罐进行发酵罐培养。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的培养方法，其在发酵罐培养之前，还包括接种和种子扩大培养的步骤；
优选地，所述种子扩大培养包括一级种子扩大培养和二级种子扩大培养；
优选地，所述一级种子扩大培养包括下述步骤：
按照0.4％－1％的接种量将摇瓶种子液接入装有灭菌后培养基的一级种子罐中，培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养30－35h，完成一级种子扩大培养；
优选地，所述二级种子扩大培养包括下述步骤：
按照1％－3％的接种量将一级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的二级种子罐中，培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养20－25h，完成二级种子扩大培养。
8.根据权利要求7所述的培养方法，还包括在接种和种子扩大培养之前，进行活化培养的步骤；优选地，所述活化培养的温度为25－32℃，搅拌转速100－200rpm，时间为40－48h。
9.根据权利要求7或8所述的培养方法，其中，所述发酵罐培养包括下述步骤：
按照1％－3％的接种量将二级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的发酵罐中，培养温度20－30℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，搅拌转速0－50rpm，进行发酵罐培养。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的培养方法，其中用于生产ARA的微生物为高山被孢霉或其突变菌株；优选地，所述高山被孢霉选自保藏号为CCTCC No.M2012073、CCTCC No.M2013392、CCTCC No.M2015421和ATCC No.42430的菌株。
11.一种微生物的发酵培养物，其由权利要求1至10中任一权利要求所述的培养方法得到。
12.一种提取ARA毛油的方法，包括如下步骤：
1)将用于生产ARA的微生物的发酵培养物进行脱水处理；
2)将步骤1)的产物进行柔性压榨，得到ARA毛油。
13.根据权利要求12所述的提取方法，其中，步骤1)中，所述发酵培养物为高山被孢霉发酵培养物；优选地，所述发酵培养物为权利要求11所述的发酵培养物。
14.根据权利要求12所述的提取方法，其中，步骤1)中，所述脱水处理选自如下的任意一种、两种或三种：
离心或板框过滤、第一级柔性压榨、干燥例如气流干燥；
优选地，所述脱水处理依次包括离心和第一级柔性压榨，或者依次包括板框过滤和气流干燥；
优选地，所述气流干燥的进风温度110－150℃，出风温度30－70℃，至水分含量小于10％。
15.根据权利要求12所述的提取方法，其中，步骤1)中，所述第一级柔性压榨采用逐步加压方式，设定压力为20－40MPa，加压时间为1－6h，到达设定压力后保压1－4h。
16.根据权利要求12所述的提取方法，其中，步骤2)中，所述柔性压榨采用逐步加压方式，设定压力为50－150MPa，加压时间为1－6h，到达设定压力后保压1－4h。
17.一种ARA毛油，其由权利要求12至16中任一权利要求所述的提取方法制得。
18.一种纯化ARA毛油的方法，包括将ARA毛油进行水化、脱色和分子蒸馏的步骤；优选地，所述ARA毛油为权利要求17所述的ARA毛油。
19.根据权利要求18所述的纯化方法，其中，所述水化包括如下步骤：
将ARA毛油加热至70－85℃，按1kg毛油加入50－150g水的比例加入75－90℃水，搅拌10－60min，搅拌速度30－90转/min，静置1－6h，分层去掉下层磷脂，得到水化油。
20.根据权利要求18所述的纯化方法，其中，所述脱色包括如下步骤：
将水化产物升温至90－110℃，控制真空度≤-0.07MPa，真空脱水0.5－2h，然后降温至60－80℃，加入脱色剂(例如水化油重量1％－3％的活性炭和2％－4％活性白土)，搅拌0.5－1h，停止搅拌，过滤去除脱色剂，得到脱色油。
21.根据权利要求18所述的纯化方法，其中，所述分子蒸馏为三级分子蒸馏；
优选地，所述分子蒸馏包括如下步骤：
将脱色油进入三级分子蒸馏，控制第一级真空度≤100Pa、温度150－200℃，去除第一级的轻组分；得到的第一重组分进入第二级分子蒸馏，控制二级真空度≤50Pa、温度180－220℃，去除第二级轻组分；得到的第二重组分进入第三级分子蒸馏，控制第三级真空度≤5Pa、温度200－250℃，去除第三级轻组分，得到第三重组分，为ARA成品油。
优选地，重复分子蒸馏1次或多次。
22.一种ARA成品油，其由权利要求18至21中任一权利要求所述的纯化方法制得。
23.一种利用微生物生产ARA或含有ARA的产品(例如ARA成品油)的方法，包括：
权利要求1至10中任一权利要求所述的培养用于生产ARA的微生物的方法、
权利要求12至16中任一权利要求所述的提取ARA毛油的方法、和/或
权利要求18至21中任一权利要求所述的纯化ARA毛油的方法。
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