CN103805517A - 高山被孢霉的分离的新菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高山被孢霉(Mortierella Alpina)的分离的新菌株及其应用。具体地，本发明涉及高山被孢霉CGMCC No.6254、其子代、培养物和/或突变株以及利用所述菌株、其子代、培养物和/或突变株生产花生四烯酸的方法和用途。本发明的分离的菌株为天然菌株，能够稳定高产花生四烯酸，其花生四烯酸的产量高达14.32g/L。

Description

高山被孢霉的分离的新菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种高山被孢霉(Mortierella Alpina)的分离的菌株或其子代、培养物或突变株以及利用所述菌株或其子代、培养物或突变株来制备花生四烯酸的方法和用途。

背景技术

花生四烯酸(Arachidonic Acid，简称AA或ARA)的化学名称为5,8,11,14-二十碳四烯酸，属于ω-6系列的长链多不饱和脂肪酸(PUFA)，是人体最重要、含量最丰富的二十碳多不饱和脂肪酸。AA具有酯化胆固醇、抑制血小板聚集、增加血管弹性、降低血液粘度、调节白细胞功能、提高免疫力等一系列生理活性。AA还是许多具有重要生理调节功能的二十碳烯酸衍生物的直接前体。AA的营养保健功能体现在婴幼儿生长发育(特别是婴幼儿智力及视神经发育)、孕产妇营养、心脑血管疾病、糖尿病、肿瘤等各个方面。

尽管AA对人体很重要，但是它不能在人体从头合成，大部分AA必需靠饮食来提供。过去商业AA主要来源于鱼油、猪肝和蛋黄，但含量极低且不稳定，开发费用昂贵，难以满足社会的需求。而且鱼油中含有大量二十碳五烯酸(EPA)，其在婴儿体内会抑制AA合成，所以提供的AA中最好不含EPA。

由于微生物具有生长速度快、油脂及AA含量高、发酵制备工艺比较简单且不受原料限制等优点，所以利用微生物生产花生四烯酸成为世界各国研究的热点，其中主要使用高山被孢霉。但是，目前的高山被孢霉菌株的AA产量仍然不能满足工业生产的要求。而且，众多研究中所用的菌株多由低产的天然菌株经过诱变而得，虽然产量得以提高，但在使用过程中，存在一定的不确定因素。众所周知，诱变菌株较天然筛选菌株遗传稳定性差，容易发生回复突变。对此，国际食品法典委员会(CAC)在“食品的益生菌的指导原则(Guidelines for the Evaluation of Probiotics in food)”中明确指出，对于用于食品的益生菌而言，不能对其进行全系统感染、不能存在毒性代谢、不能存在个体免疫缺陷，也不能对其进行基因改造。因此，在食品安全方面，采取天然菌株是本领域公知的安全可靠的做法。

因此，本领域亟需能够高产花生四烯酸的天然菌株。

发明内容

本发明通过提供一种高山被孢霉的分离的菌株、其子代、培养物和/或突变株来解决本领域中的上述问题。

在第一方面，本发明公开了一种高山被孢霉的分离的菌株，其是于2012年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、保藏编号为CGMCC No.6254的高山被孢霉或其子代。

进一步地，本发明还涉及上述分离的菌株的培养物和突变株。

在第二方面，本发明涉及一种生产花生四烯酸的方法，所述方法包括：用本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254或其子代、培养物或突变株在发酵培养基中进行发酵；以及收获发酵后的微生物并提取花生四烯酸。

本发明进一步涉及一种生产花生四烯酸的方法，所述方法包括：将本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254或其子代、培养物或突变株接种于种子培养基中以获得种子培养物；将所述种子培养物接种于发酵培养基中进行发酵；以及收获发酵后的微生物，任选烘干，并提取花生四烯酸。

在第三方面，本发明涉高山被孢霉菌株CGMCC No.6254或其子代、培养物或突变株在生产花生四烯酸中的用途。

附图说明

图1示出本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254菌株在固体培养基(PDA)上的生长形态，其在固体培养基中产生大量黄色孢子。

图2a示出高山被孢霉CBS343.4在固体培养基(PDA)上的生长形态，其在固体培养基中仅产生白色棉花状菌丝体。

图2b示出高山被孢霉ATCC 32222在固体培养基(PDA)上的生长形态，其在固体培养基中产生大量白色棉花状菌丝体，有少量黄色孢子出现。

图3示出高山被孢霉CGMCC No.6254的ITS序列分析的系统树。

具体实施方式

除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域(如细胞培养、微生物学和生物化学)普通技术人员的通常理解具有相同的含义。

在第一方面，本发明公开了一种高山被孢霉的分离的菌株，其于2012年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6254。

所述高山被孢霉菌株CGMCC No.6254是未经任何人工诱变且可高产花生四烯酸的天然菌株，产量高达14.32g/L。

本文所用的术语“花生四烯酸”是具有以下结构的5,8,11,14-二十碳四烯酸或者其药学或生理学可接受的盐、酯或衍生物：

本文所用的术语“人工诱变”指通过包括但不限于物理、化学或生物学方法在内的任何人为手段使得突变发生的频率高于自然界中自发突变的频率。

本文所用的术语“天然菌株”指在天然状态下存在于自然界中的细菌、真菌或霉菌及其子代、繁殖或营养形式等，例如孢子、菌丝或菌丝体等。这样的菌株是未经人工干预或改造的，特别是未经人工诱变的。

本发明的高山被孢霉CGMCC No.6254从新疆赛里木湖山坡的土壤中筛选获得，其形态特征为：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基中，于25℃下培养7天，菌落为白色菌丝、花瓣状、单菌落的直径为3-6cm、产黄色孢子。显微镜观察，菌丝直径为2-8μm。

本发明的高山被孢霉菌株可以在本领域用于培养高山被孢霉的常用条件和培养基中生长和维持(例如，参见表1)。在一实施方案中，本发明的高山被孢霉菌株可以使用的培养条件包括但不限于：温度为5-30℃，例如20-28℃、20-25℃或20-22℃；pH值为4-9，例如6.0-7.0。

表1：常用的一些高山被孢霉培养条件和培养基

用于维持和生长本发明的高山被孢霉菌株的培养方式包括液体培养和固体培养。培养基中的氮源为有机含氮化合物或无机含氮化合物或其混合物。在一实施方案中，所述有机含氮化合物例如包括豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、鱼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或任意几种的混合物，所述无机含氮化合物包括硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙)，铵盐(如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵)中的一种或任意几种的混合物。在一实施方案中，所述培养基中的碳源为葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、富马酸和乙醇中的一种或任意几种的混合物。固体培养基可以用于本发明的高山被孢霉菌株的斜面生长。固体培养基例如马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。在一实施方案中，PDA培养基的组成为：马铃薯(200g/L)、葡萄糖(20g/L)和酵母粉(3.0g/L)，自然pH。本文所用的术语“自然pH”指配制的培养基保持原料原本的酸碱状态，不添加额外的酸或碱进行调节。在另一实施方案中，液体培养基的组成为：葡萄糖(60g/L)、酵母粉(5g/L)、KH₂PO₄(3g/L)、NaNO₃(6g/L)、MgSO₄·7H₂O(1g/L)，pH 6.0。

本发明所述的高山被孢霉菌株包括高山被孢霉菌株CGMCC No.6254及其子代。本文所用的术语“子代”指微生物繁殖的后代，所述后代产生花生四烯酸的能力与高山被孢霉菌株CGMCC No.6254基本上相同。

在另一实施方案中，本发明还涉及高山被孢霉菌株CGMCC No.6254或其子代的突变株，所述突变株产生花生四烯酸的能力与高山被孢霉菌株CGMCC No.6254基本上相同。本文所用的术语“突变株”包括高山被孢霉菌株CGMCC No.6254或其子代的天然突变株，其经历了遗传改变，所述遗传改变以对于自然界中的所有微生物一致的速率在基因组中累积，和/或所述遗传改变通过自发突变和/或基因的获取和/或基因的丢失而发生，其不是通过对基因组进行故意(体外)操作实现的，而是通过当暴露于环境压力例如抗生素时能够提供选择性优势从而支持细菌生存的对变异株和/或突变株的自然选择来实现的，其并没有在根本上改变所述生物体的生物化学功能，即产生花生四烯酸的能力与高山被孢霉菌株CGMCC No.6254基本上相同。

本领域所属技术人员应该理解高山被孢霉的突变株可通过与亲本菌株的DNA序列同源性分析进行鉴定。与亲本菌株具有接近序列一致性的高山被孢霉菌株被认为是突变株。与亲本菌株具有96%或更高序列一致性(同源性)、例如97%或更高、或98%或更高、或99%或更高的高山被孢霉菌株被认为是突变株。可以使用例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/的“BLAST”程序来确定序列的同源性。

在另一实施方案中，本发明还涉及所述高山被孢霉菌株CGMCCNo.6254或其子代的培养物。

本文所用的术语“培养物”指通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分，只要这些成分不会实质上影响该培养物生产花生四烯酸的活性。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。所述(传代)培养物产生花生四烯酸的能力与本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254基本上相同。本文所用的术语“传代”指将微生物接种至新鲜培养基上/内进行培养，每萌发一次即称为一代。

本文所用的术语“生产花生四烯酸(AA)的能力”指生产花生四烯酸(AA)的产量。

本文所用的术语“基本上相同”指产生花生四烯酸的能力为高山被孢霉CGMCC No.6254的50%或更高，例如60%或更高、70%或更高、80%或更高，优选90%或更高，最优选100%或更高。

在第二方面，本发明公开一种生产花生四烯酸的方法，所述方法包括：

(a)用本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254或其子代、培养物或突变株在发酵培养基中进行发酵；以及

(b)收获发酵后的微生物并提取花生四烯酸。

在步骤(a)中，可以使用常用于高山被孢霉的发酵培养基(例如，参见表1)。用于本发明的高山被孢霉菌株的发酵培养基可以包括合适的氮源，例如有机含氮化合物或无机含氮化合物或其混合物。在一实施方案中，所述有机含氮化合物例如选自豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、鱼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或任意几种的混合物，所述无机含氮化合物选自硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙)，铵盐(如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵)中的一种或任意几种的混合物。在一实施方案中，用于本发明的高山被孢霉菌株的发酵培养基可以包括合适的碳源，例如选自葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、富马酸和乙醇中的一种或任意几种的混合物。

在一实施方案中，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖：50-200g/L，如100-180g/L，优选130-160g/L，最优选150g/L；酵母粉：5-15g/L，如8-12g/L，优选10g/L；KH₂PO₄：1-5g/L，如2-4g/L，优选3g/L；NaNO₃：2-10g/L，如4-8g/L，优选6g/L；MgSO₄·7H₂O：0.1-2g/L，如0.5-1.5g/L，优选1g/L。

在一实施方案中，发酵步骤(a)可以在4-9的pH值下进行，例如6.0-7.0。

在一实施方案中，发酵步骤(a)可以20-28℃下进行，例如20-25℃，如20-22℃。

在一实施方案中，发酵步骤(a)可以进行7-15天，例如11-14天。

在步骤(b)中，可以通过本领域的常规方法收获发酵后的微生物，例如离心、过滤等。在一实施方案中，通过离心收获发酵后的微生物。在一实施方案中，离心条件为8000rpm，10min。

任选地，在发酵步骤(a)之前，可以将本发明的高山被孢霉菌株CGMCCNo.6254或其子代、培养物或突变株接种于种子培养基中以获得种子培养物用于发酵步骤(a)。

本文所用的术语“任选(地)”指可以存在或不存在。例如，所述“任选地，在发酵步骤(a)之前，可以将本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254或其子代、培养物或突变株接种于种子培养基中以获得种子培养物用于发酵步骤(a)”指本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254或其子代、培养物或突变株可以被接种于种子培养基中以获得种子培养物用于发酵，或者也可以不接种于种子培养基而直接用于发酵。

在一实施方案中，发酵步骤可以在本领域技术人员已知的需氧条件下进行。

在一实施方案中，所述种子培养基包含选自豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、鱼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆、硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙)、铵盐(如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵)以及其任意组合的氮源，和/或包含选自葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、富马酸和乙醇中的以及其任意组合的碳源。

在一实施方案中，所述种子培养基的组成为：葡萄糖：10-50g/L，优选30g/L；酵母粉：1-10g/L，优选5g/L；磷酸二氢钾：1-6g/L，优选3g/L；硝酸钠：1-6g/L，优选3g/L；pH：4-9，优选6.0-7.0，例如6.5。

在种子培养基中进行培养的温度可以为20-28℃、20-25℃或20-22℃。

在种子培养基中进行培养的pH值可以为4-9，例如6.0-7.0。

在种子培养基中进行培养的时间可以为1-4天，例如2天。

本发明的方法可以使用本领域常规的接种比例(例如，参见表1)，例如体积比(v/v)为1-20%，如4-15%，如4%-10%。

任选地，在步骤(b)中的提取花生四烯酸之前，可以将收获的微生物干燥，例如在40-80℃(如60℃)下，任选地干燥至恒重，然后进行破壁提油。也可以用离心收集后的湿菌体直接进行破壁提油。

在一实施方案中，步骤(b)的通过破壁提油提取花生四烯酸的过程可以根据国标GBT22223-2008的方法进行。操作步骤例如：称取干菌体样品0.6-0.8g(湿菌体直接提取的，换算成等同重量的干菌体样品量)于50mL离心管中；用移液管吸取3mL蒸馏水于上述离心管中，加入4mL饱和浓盐酸，摇匀，于振荡水浴锅中70℃水浴30min来水解破壁，每隔10min取出用振荡器振荡一次；冷却后，加入正己烷30mL，常温下于水浴锅中振荡40min，离心8000rpm×8min，吸取上层有机相于称重的离心管中；按照上述步骤重复提取2-3次，合并有机相于离心管中，于60℃烘箱中挥发溶剂至恒重，所得的残留物为油脂提取物。所得的油脂提取物可以任选地进一步纯化。

上文所示的步骤和参数仅为示例性的，本领域技术人员可以根据需要对其进行修改和/或放大。

本发明的优势

利用本发明的高山被孢霉菌株(CGMCC No.6254)进行发酵，花生四烯酸产量可以高达14.32g/L。A.Singh等1997报道的天然菌株ATCC 32222的AA最高产量为11.1g/L，这是迄今文献资料上已知的天然菌株摇瓶发酵的最高产量。本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254的AA产量显著高于这一结果。表2中列出高山被孢霉CGMCC No.6254和本领域中部分菌株产AA的能力。

表2：已知的一些高山被孢霉产AA的能力

为了证实本发明菌株的高产优势，发明人还进行了与ATCC 32222(CBS528.72)的比较实验，以进一步证明本发明的菌株(CGMCC No.6254)的高产优势。

总体而言，本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254的优势在于：

1)本发明的菌株为从自然界直接筛选获得的高产野生型分离菌株，传代和生产能力非常稳定，不存在通过人工育种或诱变方式获得的菌株的生产性能不稳定和安全性问题。

2)本发明的菌株产花生四烯酸的能力很高，其产量高达14.32g/L，这明显高于目前已知的天然菌株，甚至还显著高于许多通过诱变获得的高产菌株，例如CN 101113410A报道的CCTCC M207067(10.0g/L)。

3)本发明的菌株的适宜发酵温度接近室温(20-28℃，优选20-25℃，如20-22℃)，相比之下，现有技术的高产菌株如ATCC 32222的适宜发酵温度为15℃，如此的低温发酵会增加发酵生产过程的冷却成本。相比之下，利用本发明的菌株进行发酵生产则能够显著降低冷却成本。

4)本发明的菌株具有非常稳定的传代稳定性。传代是检验微生物菌株的生长与产量稳定性方面的重要标准，一般传代次数为3代以上，例如5代(袁成凌等2003)，但5代以后，产量容易下降(岑沛霖等2001)。本发明的菌株传代至少7代后仍然能够保持稳定的产花生四烯酸的能力。

此外，本发明的菌株具有较强的生命力，对营养要求简单，生长范围宽，易收集菌体，细胞壁薄易破碎提取其中的油脂，生产的菌油中AA含量高，在工业上具很好的应用前景。

实施例

除非另有说明，本发明的实验中所用的试剂除酵母粉购自唐山绿仙生物科技有限公司外，其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。除非另有说明，本文中培养基组成中各成份的配比用(g/L)表示，即1升(L)培养基中某成份所占的克(g)数。

实施例1菌株筛选

从新疆赛里木湖山坡的土壤分离得到的原始菌株G-12，进行PDA平板稀释，挑取最先长出来个比较肥大的单菌落20个，进行摇瓶实验，对比各单菌落摇瓶发酵生成的生物量(即每升发酵液中所得的干菌体量：DCW，g/L)、油脂含量(即破壁提取油脂后，所得油脂占干生物量的重量百分比)和油脂中的AA含量，并且筛选出一株最优良的菌株，命名为高山被孢霉(Mortierella Alpina)WG-12N。

实验步骤：

1)挑取原始菌株G-12斜面(PDA)上的高山被孢霉G-12，制备孢子悬浮液(浓度为10³-10⁴/ml)，梯度稀释至10^-3-10^-4倍的浓度待用。

2)取稀释好的G-12的孢子悬浮液均匀涂布到固体平皿中(固体培养基组成见表3)，在25℃恒温培养箱中静置培养7天。挑选最先长出来且菌落形态比较肥大的20个单菌落，一方面进行斜面(PDA)保种，另一方面进行摇瓶发酵筛选。

3)将上述筛选出的20个菌落分别直接接种到装有50ml发酵培养基的250ml普通三角瓶中(本实施例的发酵培养基组成见表4)，在20℃恒温摇床中以120rpm培养7天，取100mL发酵液用CR22G型日立冷冻离心机，以8000rpm×10分钟离心收集所得发酵液菌体，于60℃中烘箱烘至恒重，称重，计算每升发酵液中所得干菌体量(DC W，g/L)。将所得干菌体破壁提油，并用Agilen 7890气相色谱仪测定油脂中各脂肪酸的组成(FAC)。

破壁提油方法如下：称取干菌体样品0.6-0.8g(湿菌体直接提取的，则换算成等同重量的干菌体样品量)于50mL离心管中；用移液管吸取3mL蒸馏水于上述离心管中，加入4mL饱和浓盐酸，摇匀，于振荡水浴锅中70℃水浴30min水解破壁，每隔10min取出用振荡器振荡一次；冷却后，加入正己烷30mL，常温下于水浴锅中振荡40min，离心8000rpm×8min，吸取上层有机相于称重的离心管中；按照上述步骤重复提取2-3次，合并有机相于离心管中，于60℃烘箱中挥发溶剂至恒重，所得的残留物为油脂提取物。

测定FAC组成的方法如下：称取提取的油脂样品(0.2-0.5g)于50mL离心管中，加入5mL正己烷，3mL 0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液，振荡均匀后，放入60℃烘箱中，保持30min，其间摇动一次离心管，使样品甲酯化完全；取出后冷却至室温，振荡均匀，以4500rpm离心3min后，取上清液，进样检测。

Agilen 7890气相色谱仪的色谱条件为：色谱柱：VARIAN CP6173 50m×250μm×0.2μL；升温程序：80℃保持2min；10℃/min升至120℃，保持0min；5℃/min升至180℃，保持2min；2℃/min升至206℃，保持0min；25℃/min升至230℃，保持5min；进样口温度：250℃；检测器温度：280℃；进样量：1μL；分流比20:1。实验结果见表5。

表3固体PDA培养基组成

表4发酵培养基组成

表5菌筛培养结果

注释：DCW(g/L)表示每升发酵液中的干菌体含量；

TFA (%)表示干重量中油脂的重量百分比含量；

TFA(g/L)表示每升发酵液中的油脂的含量；

AA(%)表示油脂中花生四烯酸的重量百分含量；

AA(g/L)表示每升发酵液中的花生四烯酸的含量。

由表5的结果可知，7号菌株生产AA(g/L)的能力远高于其他菌株，其AA产量高于平均值31.3%。所述菌株为优势菌株，命名为高山被孢霉WG-12N。所述菌株于2012年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6254。

该菌株具有高山被孢霉菌种特有的特征：

生长形态：在PDA固体培养基中于25℃下培养7天，菌落为白色菌丝、花瓣状、单菌落的直径为3-6cm、产黄色孢子；显微镜下观察，菌丝直径为2-8μm。

脂肪酸组成：该菌株经培养、菌丝收集、破壁提油、气相色谱分析油脂FAC组成，产生的油脂组成与已经报导的高山被孢霉所产生的油脂具有非常相似的脂肪酸组成(见表6)。

表6：一些高山被孢霉产生的油脂中脂肪酸组成(单位：重量%)

对本发明的菌株CGMCC No.6254进行ITS(内转录间隔序列)序列分析：从NCBI数据库下载已知的高山被孢霉ITS序列，通过Bioedit SequenceAlignment Editor软件(版本7.0.5.3)分析和绘制Neighbor Phylogenetic tree。从得到系统树(图3)看，本发明的菌株CGMCC No.6254与其他高山被孢霉菌种具有极高的同源性。可知，本发明的菌株CGMCC No.6254为高山被孢霉(Mortierella Alpina)。

ITS序列分析：

GGACTTGTGTCTACTTGATTTGAGATCGAGTTTACAAAGTCGGCCGAAGCCTGTCTTTGTGAATCCTGCATCAGTCAGCACAAGAACTAATCTCCTTTATGTTAGCTGCAGCAAAGGTAATAATCTGTTTTTTAGGCAGACTAAATAGATATGCTTATAGCTCAGAGAAAAGTCCAGCTGCACCTGCATTTCAAGTAACCCGCCACTTTTCGGTGAGGAAAAGCGTTGGGATCACTCAAGTCCAACTCCCATTTCAAAAAAGATATGGAAGTTGAGGTGTTTACTGATACTCAAACAAGCATGCTCTCCGGAATACCAGAGAGCGCAATATGCGTTCAAAGATTCGATGATTTCACA(SEQ ID NO：1)

实施例2传代实验

在本实施例中，将实施例1中筛选所得的高山被孢霉菌株CGMCCNo.6254进行传代，并且分别进行摇瓶发酵实验。实验结果表明本发明的菌株具有非常优异的传代稳定性。

实验步骤：

1)将筛选得到的菌株CGMCC No.6254进行传代发酵试验：将每代CGMCC No.6254的PDA斜面中的菌体制备孢子悬浮液(浓度为10³-10⁴/ml)，并以4%(v/v)的接种量接种到种子培养基中(表7)。250ml普通三角瓶装液量为50ml，培养温度为25℃、摇床转速为120rpm，培养时间48小时，待用。

2)将上述培养好的种子培养物(步骤1中获得的培养物)以10%(v/v)的接种量接种到发酵培养基中(见表4)。250ml普通三角瓶装液量为50ml，在25℃和150rpm下摇床培养7天。

表7种子培养基组成

3)根据实施例1所述离心收集菌体、在60℃烘箱中烘至恒重，破壁提油，并气相色谱测定FAC组成。实验结果如表8所示。

表8传代培养结果

注释：同表5

从表8的结果可知，本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254具有非常优异的传代稳定性。

实施例3发酵条件

在本实施例中，将本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254进行摇瓶发酵实验。

实验步骤：

1)挑取CGMCC No.6254斜面(PDA)孢子，制成孢子悬浮液(浓度为10³-10⁴/ml)，以4%(v/v)的接种量直接接种到发酵培养基中(见表4)。

2)分别在20℃、22℃、25℃和28℃下以150rpm培养8天。

三种摇瓶培养方式为：30mL/250mL普通三角瓶、45mL/250mL普通三角瓶以及45mL/250mL挡板三角瓶。

3)根据实施例1中所述分析各样品瓶生成的生物量、油脂含量及油中的FAC含量。

实验结果：

表9不同培养方式的实验结果

注释：DCW(g/L)、TFA(%)、AA(%)、TFA(g/L)和AA(g/L)同表5

P30：250mL普通摇瓶，装液量为30mL；

P45：250mL普通摇瓶，装液量为45mL；

D45：250mL挡板摇瓶，装液量为45mL。

从实验结果可知挡板三角瓶培养所得的AA(g/L)产量最高，而同为普通三角瓶培养，装液量小的比装液量多的产量高。由此可知，高溶氧率利于高山被孢霉CGMCC No.6254产生AA。

相同摇瓶方式，不同温度培养，随着温度的降低DCW、TFA、AA均呈上升趋势，可知高山被孢霉CGMCC No.6254产AA喜低温培养，适宜的培养温度为20-28℃，优选22-25℃，更优选20-22℃；考虑到冷却成本，优选22℃。

实施例4产花生四烯酸能力比较

在本实施例中，比较本发明的菌株CGMCC No.6254和菌株ATCC32222(CBS528.72)产AA能力。

1)在以下发酵条件下比较两种菌株产AA的能力

1.1将保藏于4℃冰箱中的CGMCC No.6254及ATCC 32222的斜面(PDA)菌种分别制备成菌悬液(浓度为10³-10⁴/ml)，并分别以4%(v/v)的接种量接种到种子培养基中(表7)。250mL挡板三角瓶装液量为45ml，培养温度25℃、摇床转速为120rpm，培养2天待用。

1.2上述培养好的两种种子培养物分别按10%(v/v)的接种量接种到以下发酵培养基中(表10)。250mL挡板三角瓶装液量为50ml，在25℃、150rpm下摇床培养7天。

表10实施例4中1)的发酵培养基组成

2)在A.Singh等1997的条件下比较两种菌株产AA的能力

2.1将保藏于4℃冰箱中CGMCC No.6254及ATCC 32222的斜面(PDA)菌种分别制备成菌悬液(浓度为10³-10⁴/ml)，分别以4%(v/v)的接种量接种到种子培养基中，该种子培养基组成为：葡萄糖50g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硝酸钠3g/L，MgSO₄0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeCl₃1.45mg/L，CuSO₄0.01mg/L，MnCl₂·4H₂O 4.3mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.13mg/L，ZnCl₂0.3mg/L，pH 6.0。250mL三角瓶装液量为50ml，培养温度为25℃、摇床转速为200rpm，培养2天。

2.2将上述培养好的两种种子培养物分别按5%的接种量(v/v)接种到发酵培养基中，该发酵培养基组成为：葡萄糖50g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硝酸钠3g/L，MgSO₄0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeCl₃1.45mg/L，CuSO₄0.01mg/L，MnCl₂·4H₂O 4.3mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.13mg/L，ZnCl₂0.3mg/L，1%w/v大豆粉，1%v/v玉米油，1%w/v玉米浆粉，pH 6.0。250ml三角瓶装液量为50ml。在25℃、200rpm下摇床培养3天。然后转移到15℃、200rpm摇床中培养，并且每天加入20g/L葡萄糖，在15℃下培养8天。发酵培养共进行11天。

3)根据实施例1中所述离心收集菌体、60℃干燥至恒重，破壁提油、分析脂肪酸的FAC组成。

实验结果：

A.在实施例4中1)的条件下比较两种菌株产AA的结果

表11实施例4中1)的条件下两种菌株的对比(7天)

菌株	DCW(g/L)	TFA(%)	AA(%)	AA(g/L)
					CGMCC No.6254	30.09	44.84	56.13	7.57
ATCC 32222	36.4	42.90	26.15	4.08

注释：同表5

B.在A.Singh等1997的条件下比较两种菌株产AA的结果

表12在A.Singh等1997的条件下两种菌株的对比(11天)

菌株	DCW(g/L)	TFA(%)	AA(%)	AA(g/L)
					CGMCC No.6254	43.29	57.08	52.17	12.89
ATCC 32222	55.09	63.85	27.38	9.63

注释：同表5

由上述实验结果可知，本发明的高山被孢霉菌株CGMCC No.6254产AA的能力显著优于ATCC 32222(CBS528.72)，因此具有很好的应用价值和前景。

实施例5生产花生四烯酸

在本实施例中，利用高山被孢霉CGMCC No.6254进行摇瓶发酵产花生四烯酸。

步骤：

1)将保藏于4℃冰箱中的CGMCC No.6254斜面(PDA)菌种制备菌悬液(浓度为10³-10⁴/ml)，并以4%(v/v)的接种量接种到种子培养基中(表7)。250mL挡板三角瓶装液量为45ml，培养温度为22℃、摇床转速120rpm，培养2天待用。

2)将以上述培养好的种子培养物以10%(v/v)的接种量接种到发酵培养基中(见表13)。250mL挡板三角瓶，装液量45ml，在22℃、150rpm下摇床培养14天。

表13发酵培养基组成(g/L)

3)根据实施例1中所述分析离心收集样品、烘干、破壁提油并测定FAC。

结果：

获得的发酵液中的高山被孢霉干生物量为44.83g/L，总脂含量为26.53g/L，AA含量为14.32g/L。可见，本发明的高山被孢霉CGMCC No.6254的花生四烯酸的产量高于现有技术，具有非常高的应用价值。

上文描述了本发明的一些优选实施方案。应该理解，尽管本文为了说明的目的已经描述了本发明的具体实施方案，但在不背离本发明精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，本发明只受所附权利要求书的限制。可以根据本公开进行和执行本文公开和要求保护的所有实施方案而无需进行过度的实验。

参考文献

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K.Higashiyama等1998^b：JAOCS,Vol.75,No.12(1998)1815-1819

Claims (15)

1.一种高山被孢霉(Mortierella Alpina)的分离的菌株，其是于2012年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCC No.6254的菌株或其子代。

2.权利要求1的菌株的培养物。

3.权利要求1的菌株的突变株，其产生花生四烯酸的能力与保藏编号为CGMCC No.6254的菌株基本上相同或更高。

4.一种生产花生四烯酸的方法，所述方法包括：

(a)用权利要求1的菌株、权利要求2的培养物或权利要求3的突变株在发酵培养基中进行发酵；以及

(b)收获发酵后的微生物并提取花生四烯酸。

5.权利要求4的方法，其中(a)的发酵温度为20-28℃。

6.权利要求4的方法，其中(a)的发酵的pH值为4-9。

7.权利要求4的方法，其中(a)的发酵时间为7-15天。

8.权利要求4的方法，其中(a)的发酵在需氧条件下进行。

9.权利要求4-8任一项的方法，所述方法包括在(a)之前将权利要求1的菌株、权利要求2的培养物或权利要求3的突变株在种子培养基中培养以获得种子培养物的步骤。

10.一种生产花生四烯酸的方法，所述方法包括：

-将权利要求1的菌株、权利要求2的培养物或权利要求3的突变株在种子培养基中培养1-4天，获得种子培养物；

-将所述种子培养物接种于发酵培养基中，在pH 6.0-7.0、20-25℃下发酵11-14天；以及

-收获发酵后的微生物，任选烘干，并提取花生四烯酸。

11.权利要求4-10任一项的方法，其中所述发酵培养基或所述种子培养基包含选自如下的氮源：豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、鱼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆、硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙)、铵盐(如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵)以及其任意组合。

12.权利要求4-11任一项的方法，其中所述发酵培养基或所述种子培养基包含选自如下的碳源：葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、富马酸、乙醇以及其任意组合。

13.权利要求9-12任一项的方法，其中所述种子培养基的组成为：葡萄糖：10-50g/L；酵母粉：1-10g/L；磷酸二氢钾：1-6g/L；硝酸钠：1-6g/L；pH：6.0-7.0。

14.权利要求4-13任一项的方法，其中所述发酵培养基的组成为：葡萄糖：50-200g/L；酵母粉：5-15g/L；KH₂PO₄：1-5g/L；NaNO₃：2-10g/L；MgSO₄·7H₂O：0.1-2g/L；pH：6.0-7.0。

15.权利要求1的菌株、权利要求2的培养物或权利要求3的突变株在生产花生四烯酸中的用途。

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