CN101113410A - 一种高山被孢霉及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高山被孢霉及其应用。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M207067。利用该菌株进行发酵生产花生四烯酸，产量最高可达10g/l，产率高达1.54g/l/d。该菌株可用于工业化生产花生四烯酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产花生四烯酸的高山被孢霉及其应用。
背景技术
花生四烯酸(ArachidonicAcid，简称AA，即5，8，11，14-二十碳四烯酸)属于ω-6系列长链多不饱和脂肪酸。AA是一种重要的人体必需脂肪酸，是许多二十碳酸衍生物如前列腺素E2(PGE2)、前列环素(PGI2)、血栓烷A2(TXA2)、白三烯Leukotirene B4(LTB4)和C4(LT C4)的直接前体，这些生物活性物质对脂蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用。AA还具有调节体内多种离子通道作用，维持细胞膜功能，控制细胞膜的通透性，维持机体保水性等许多重要的生理功能。同时，AA是构成神经组织的重要结构脂类，它对婴幼儿的脑发育和视力功能至关重要。它能帮助神经系统的信息正常传递，增强记忆，对人体视力、大脑功能和协调能力起着极为重要的作用。鉴于AA对婴幼儿生长的重要作用，世界卫生组织(WHO)及联合国粮农组织(FAO)权威推荐：婴幼儿每日应摄取40毫克AA(以每千克体重计算)，而欧洲和美国已经强制要求只有添加AA的婴儿奶粉方可进入市场进行销售。
AA广泛存在于动物体中，过去商业AA主要来源于猪肝和鱼油，但含量极低且不稳定、开发费用昂贵，难以满足社会的需求，特别是奶制品和制药行业所需的AA量很大。十年代初期，人们相继发现某些丝状真菌及微藻类含有花生四烯酸。由于微生物具有生长速度快、油脂及AA含量高、发酵制备工艺比较简单且不受原料限制等优点，利用微生物法生产花生四烯酸成为各国研究的热点。而筛选得到富含AA的微生物资源是关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产花生四烯酸的高山被孢霉。
本发明另一个目的是提供该菌在生产花生四烯酸中的应用。
一种高山被孢霉(Mortierella alpina)，菌株代号为ME-AA01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 207067。
所述的高山被孢霉，该菌的培养条件为：培养基为能提供碳源、氮源的常规培养基，生长温度为25～28℃。所述培养基中碳源为糖类，其中糖类为葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、牛肉膏中的一种或多种。
所述的高山被孢霉，其中所述培养基为PDA培养基(每L)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。
所述的高山被孢霉在生产花生四烯酸中的应用。
本发明提供的高产花生四烯酸的霉菌，菌株代号为ME-AA01。其形态为白色菌丝，直径2-8μm，不产孢子，在PDA培养基28℃培养3天，形成的菌落为圆形，直径为5cm。经鉴定为高山被孢霉(Mortierella alpina)。
该菌株在0～38℃均能生长，25～28℃为最适生长温度，但产AA的最适温度为23℃。在23℃下，摇瓶发酵6～7天菌株产生的AA可达最大值。
ME-AA01菌株在培养液的pH3～9范围内均可生长，并产生花生四烯酸。适宜生长及生成AA的pH为5～7。
ME-AA01菌株适合液体生长，可以通过发酵罐扩大培养，具有占用空间小，生产规模较易控制等特点，有利于大规模生产。ME-AA01菌株生命力强，对营养要求简单，生长范围宽，生产的菌油AA含量高，且易于提取，具有很好的发展前景。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种高产AA的保藏编号为CCTCC NO：M 207067的高山被孢霉菌株，利用该菌株进行摇瓶发酵，AA产量最高可达10g/l，产率高达1.54g/l/d，比目前世界最高水平的日本Higashiyama K等人报道的菌株Mortierella alpina 1S-4(1.3g l-1d-1)和韩国Hwang BH等人报道的Mortierella alpina DSA-12(1.5g l-1d-1)都要高。
高山被孢霉ME-AA01菌株的获得不但为我国AA生产增加一个新品种，更重要的是该菌种可通过液体发酵罐工业化生产，因此，该发明必将对我国的AA工业产生积极的推动作用。
保藏信息：
本发明的高山被孢霉Mortierella alpina ME-AA01已于2007年5月14日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏中心地址为：武汉，武汉大学，邮政编码：430072。保藏编号为：CCTCC NO：M 207067。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1
菌株最佳生长的温度及pH范围的测定
ME-AA01菌株培养液包含质量体积比的下列物质：葡萄糖6％，酵母膏0.4％，KH2PO4 0.2％，其余为水。接种量10％。温度设为：20℃、23℃、、28℃4个梯度，考察温度时不调pH。pH值设3、5、7、94个酸碱度，温度取25℃。分别在第4天，第5天，第6天，第7天取样一次，测干重，及用气质联用测AA含量，分析最适温度及pH，以及干重、AA产量达到最大的时间。
实验结果(见表1)表明ME-AA01菌株在pH3～9范围内均可生长，但pH为3时菌体产生的AA量非常少，且生长很差。菌株在pH 5～7生长最好，且AA产量最高。
菌株生长最旺盛的温度为25～28℃，但AA产量最高的温度为23℃。
表1 ME-AA01菌株在不同pH及不同温度、不同时间时干重和产AA情况
| 温度干重(g/l)AA(g/l) | 20℃11.51.04 | 23℃12.21.15 | 25℃12.71.07 | 28℃13.11.0 |
| pH干重(g/l)AA(g/l) | 39.80.7 | 512.31.13 | 713.61.21 | 911.20.93 |
| 时间(天)干重(g/l)AA(g/l) | 410.10.79 | 511.90.95 | 612.81.15 | 713.61.21 |
实施例2
ME-AA01菌株的实验室培养
PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。121℃灭菌20分钟，倒入试管制成斜面，冷却后接入ME-AA01菌株，28℃培养5天，将菌丝接入摇瓶活化培养。摇瓶活化培养基包含质量体积比的下列物质：葡萄糖3％，酵母膏0.6％，KH2PO4 0.3％，NaNO3 0.3％，MgSO4·7H2O 0.05％，其余为水，pH 7.0，装液量250ml的摇瓶装入50ml的活化培养基，120rpm，25℃，活化3天。再将活化后的菌株接入发酵培养基，装液量250ml的摇瓶装入50ml的发酵培养基，接种量10％v/v，125rpm，23℃，发酵6.5天。发酵培养基包含质量体积比的下列物质：葡萄糖8％，酵母膏0.6％，KH2PO4 0.3％，其余为水，pH 7。
结果：干重17.8g/l；AA 4.2g/l。
实施例3
利用ME-AA01菌株进行摇瓶发酵
菌种活化：将高山被孢霉菌种ME-AA01接于PDA斜面28℃培养5天。
种子活化：培养5天的PDA斜面用无菌水洗下菌丝，接入摇瓶活化。摇瓶活化培养基包含质量体积比的下列物质：葡萄糖3％，酵母膏0.6％，KH2PO4 0.3％，NaNO30.3％，MgSO4·7H2O 0.05％，其余为水，pH 7.0，装液量：250ml的摇瓶装入50ml的活化培养基，120rpm，25℃，活化3天。
发酵培养：将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。装液量250ml的摇瓶装入50ml的发酵培养基，接种量10％v/v，温度23℃，pH 7.0，转速：130rpm，周期6.5天。发酵培养基包含质量体积比的下列物质：葡萄糖10％、酵母膏1.0％、KH2PO4 0.3％、NaNO30.3％、MgSO4·7H2O 0.05％、泛酸钙0.1％以及微生素C 0.02％，其余为水。
发酵结果：干重：35.3g/l；AA 10g/l。
Claims (5)
1.一种高山被孢霉(Mortierella alpina)，菌株代号为ME-AA01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 207067。
2.根据权利要求1所述的高山被孢霉，其特征在于该菌的培养条件为：培养基为能提供碳源、氮源的常规培养基，生长温度为25～28℃。
3.根据权利要求2所述的高山被孢霉，其特征在于所述培养基中碳源为糖类，其中糖类为葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、牛肉膏中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的高山被孢霉，其特征在于所述培养基为PDA培养基。
5.权利要求1所述的高山被孢霉在生产花生四烯酸中的应用。
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