JP6118904B2

JP6118904B2 - 微生物（単細胞真菌モルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ））のアラキドン酸が富化された油の製造方法

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Description

本発明は、新規な、アラキドン酸に富む油の組成物に関し、前記油は、微生物により産生され、優先的にはモルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の単細胞真菌（糸状菌）、この場合にはモルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）という特定の種により産生される。

脂質は、蛋白質および炭水化物と共に、３つの主要な多量要素群の１つを構成する。

脂質の中で、トリグリセリドおよびリン脂質が特に際立つ。

トリグリセリドは、摂取された食物脂質のほぼ９５％に相当する。生物では、トリグリセリドは主に脂肪組織中に存在し、主要なエネルギー貯蔵形を構成する。

リン脂質は、とりわけ、流動性を提供する細胞膜の構成要素であるため、構造性脂質である。

トリグリセリドおよびリン脂質は、両者とも食事により提供される脂肪酸から主に構成され、それらの一部については、生物により合成される。

生化学的分類（脂肪酸分子に含まれる二重結合数に基づく）は、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）、一不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）および多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を区別する。

生理的観点から、以下が区別される：
・必須脂肪酸（人体の発育と正しい機能に必要であるが、我々の身体が産生することはできない）；
・「条件付き」必須脂肪酸（細胞の正常な成長および生理的機能に不可欠であるが、それらの前駆物質が食事によって提供されるのであれば、産生され得る。したがって、それらの必須前駆物質が存在しないのであれば、それらは厳密には必要である）；
・非必須脂肪酸。

必須脂肪酸と「条件付き」必須脂肪酸のセットが、不可欠な脂肪酸を構成する。

他の脂肪酸が非必須と呼ばれる。

不可欠な脂肪酸の２つの主要なファミリーが著名である：オメガ６脂肪酸（あるいはｎ−６ＰＵＦＡ）（その前駆物質および主要な代表はリノール酸（ＬＡ）である）、およびオメガ３脂肪酸（あるいはｎ−３ＰＵＦＡ）（その前駆物質はα−リノレン酸（ＡＬＡ）である）。

非必須脂肪酸の中には、特に：
・オメガ３脂肪酸ファミリーのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、
・オレイン酸（我々の食事における主な一不飽和脂肪酸）、および
・飽和脂肪酸、
がある。

ピーナッツ、ベニバナ、ナタネ、トウモロコシ、亜麻、ヘーゼルナッツ、ゴマ、大豆またはヒマワリからの製造に加えて、多種多様の多価不飽和脂肪酸を様々な単細胞生物（藻類、菌類等）から製造することができる。

アラキドン酸（「ＡＲＡ」）は、特定の植物油に存在する長鎖脂肪酸である。

これは、Ｃ２０：４（ｎ−６、ｎ−９、ｎ−１２、ｎ−１５）多価不飽和脂肪酸であり、すなわち２０個の炭素原子ならびに炭素原子ｎ°５（ｎ−１５）、ｎ°８（ｎ−１２）、ｎ°１１（ｎ−９）およびｎ°１４（ｎ−６）に位置する４個のエチレン結合を含む脂肪酸である。

これは、４個の不飽和（４個の炭素−炭素二重結合）を有するため、「テトラエン」とも呼ばれる脂肪酸である。

これはまた、「オールシス−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン」という名前でも文献に見られる。（「シス」は二重結合の立体配置を定義し、「全て」の二重結合が「シス」立体配置である）。

ＡＲＡは、人体で最も豊富なＣ２０ＰＵＦＡの１つであり、人体でリノール酸から産生される。

これは、器官、筋肉および血液で見られる。

ＡＲＡは、総称として「エイコサノイド類」（プロスタグランジン類、トロンボキサン類およびロイコトリエン類を含む群）として知られる、多種多様の生物学的に活性な化合物の重要な前駆物質である。

これらのエイコサノイド類は、リポ蛋白質代謝、血液流動学、筋緊張、白血球機能、小板活性化および細胞成長に対して調節作用を示す。

ＡＲＡはまた、人間の母乳の脂質画分の成分の１つでもあり、乳児における至適神経学的発達に不可欠であると考えられる。

母乳の長鎖脂肪酸プロフィールに相当する乳児用調合物を得ようとして、科学者および食糧管理機構は、乳児用調合物、特に未熟児に使用される人工乳に、アラキドン酸を添加することを推奨している。

特に、乳児用調合物で使用するために製造されたアラキドン酸を含有する油が、他のＰＵＦＡ（たとえば、エイコサペンタエン酸またはＥＰＡ）をほとんどまたは何も含まないことが好ましい。

これらの他のＰＵＦＡは、これらの脂肪酸の一部が小児によるアラキドン酸それ自体の使用を妨害する可能性があるため、および／または、母乳（再構成母乳）の脂肪酸の適切な比率を達成するためまたは他の所望の用途のために、アラキドン酸含有油と他の油類とを混合することを害する可能性があるため、事実上推奨されない。

さらに、ＡＲＡには多種多様な用途があり、人間用食料製品の調製にも使用されるが、動物飼料としても使用される。

ＡＲＡは事実、動物飼料で認知された幾つかの特徴を有する：
・抗炎症性（ＡＲＡは、シリーズＩＩプロスタグランジンおよびアナンダミドの前駆物質である（主としてブタで証明されている）ため）、
・プロスタグランジン以外の手段による、魚（タイ）における抗ストレス性、
・ブタにおける免疫調節性。

アラキドン酸の、産生される肉、乳または卵への移行を可視化するために、トランスファー試験も実施された。

アラキドン酸が微生物から単離されるとき、特にモルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の糸状菌の発酵により得られるアラキドン酸に富む油の状態で、商用製品が入手できる。

従って、特許文献１には、モルチエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｅｌｏｎｇａｔａ）、モルチエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｅｘｉｇｕａ）、およびモルチエレラ・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）によりＡＲＡを製造するためのプロセスが記述されている。

特許文献２は、その立場で、ＥＰＡを実質的に欠くＡＲＡを製造するためにモルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）を使用する発酵プロセスを記述している。

しかしながら、特許文献３で確認される通り、ＡＲＡ産生について試験した全てのモルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）（アルピナ（ａｌｐｉｎａ）、ヒグロフィラ（ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）、シュマッケリ（ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）およびカルマゲンシス（ｃａｒｍａｇｅｎｓｉｓ））の中で最も有利な生産性を示す種は、モルチエレラ・シュマッケリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）またはモルチエレラ・カルマゲンシス（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｃａｒｍａｇｅｎｓｉｓ）である。

したがって、Ｍ．シュマッケリ（Ｍ．ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）またはＭ．カルマゲンシス（Ｍ．ｃａｒｍａｇｅｎｓｉｓ）の種を選択することにより、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）、Ｍ．ヒグロフィラ（Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）またはＭ．スピノサ（Ｍ．ｓｐｉｎｏｓａ）に不利益になる程、より良い収量、生産性および品質を保証することが可能なことが、ＡＲＡ産生の分野における専門家によって認められている。

欧州特許第２７６５４１号明細書国際公開第９４／２８９１３号欧州特許第７２６３２１号明細書

しかしながら、高含量ＡＲＡを有し、且つ完全に特定された長鎖飽和脂肪酸プロフィールまたは多価不飽和脂肪酸プロフィールを有する上質の油を製造するための代替手段を有する必要が残っている。

さらに、諸国の監督官庁（ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＡｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）では、モルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）のみが、乳児食糧で認可されている。

第一に、
・ＡＲＡ以外の多価不飽和脂肪酸（ＥＰＡ等）が低含量である、
・長鎖飽和脂肪酸（ベヘン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸またはリグノセリン酸）が限られた含量である：
アラキドン酸が富化された、新規な油の組成を提供することは、出願人企業の功績であった。

さらに、これらの飽和脂肪酸が低含量であることによって、低温のときに清澄および低濁度の観点から、市販のものより良質の油を得ることが可能なことが、出願人企業により言及されてきた。

先行技術に記述されているものよりはるかに効率良く且つはるかに安価である製造プロセスの開発に関連して、出願人企業はその調査研究中に、５０％超に達するアラキドン酸産生を可能にするため（％は、本明細書では、全脂肪酸中の重量によると理解される）並みはずれたアラキドン酸産生能を有するモルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）の新種を同定していた。

したがって、出願人企業は、Ｍ．シュマッケリ（Ｍ．ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）またはＭ．カルマゲンシス（Ｍ．ｃａｒｍａｇｅｎｓｉｓ）タイプの種の中で、最高のＡＲＡ産生種を探索することを目標とする、技術的偏見に直面していた。

さらに、注目すべきアラキドン酸産生能に加えて、この種は：
・０．５％未満、好ましくは０．２％未満のＥＰＡ、
・０．５％未満、好ましくは０．２％未満のミリスチン酸（Ｃ１４：０）、
・９％未満、好ましくは７％未満のパルミチン酸（Ｃ１６：０）、
・３％未満、好ましくは２．５％未満のベヘン酸（Ｃ２２：０）、および
・３％未満、好ましくは２．５％未満のリグノセリン酸（Ｃ２４：０）、
を得ることも可能にする（％は、本明細書では、全脂肪酸中の重量によると理解される）。

このモルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）種は、２０１２年６月１２日に、フランスのパスツール研究所（ｔｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ（ＣＮＣＭ））の国立微生物培養物コレクション（ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［ＮａｔｉｏｎａｌＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ］）に、ＣＮＣＭＩ−４６４２の番号で提出されたが、中国では、武漢大学（Ｗｕｈａｎ
ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の中国典型培養物保蔵センター（ＣＨＩＮＡＣＥＮＴＥＲＦＯＲＴＹＰＥＣＵＬＴＵＲＥＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ）（ＣＣＴＣＣ）（武漢４３００７２、Ｐ．Ｒ．中国）にも、Ｍ２０９１１６の番号で提出された。

これは、２５ＳＲＮＡ（配列番号１）をコード化する遺伝子のＤ１−Ｄ２領域の配列を特徴とする：

これによって、モルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）タイプの種であるとして、それを同定することが可能になった。

従って、本発明は、２０１２年６月１２日にＩ−４６４２の番号でＣＮＣＭに提出された、モルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）種に関する。

この種は、本出願で、その後「ＣＮＣＭＩ−４６４２」と表されることもある。

本発明はまた、この種の変種または前記種に由来する種にも関し、前記変種または前記誘導された種は、アラキドン酸高含量をもたらす特性を保持する。特に、それは、重量基準で全脂肪酸の最小限５０％のアラキドン酸を含む、ＡＲＡの産生を可能にする。

特に、本発明は、突然変異誘発または遺伝子形質転換によりＣＮＣＭＩ−４６４２種から得られるモルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）種に関する。突然変異誘発は、部位特異的および／またはランダムであってもよい。

本発明はまた、ＣＮＣＭＩ−４６４２種の突然変異誘発または遺伝子形質転換および、任意選択的に、重量基準で全脂肪酸の少なくとも５０％のアラキドン酸を産生する種を選択することを可能にするスクリーニング工程を含む、そのような種を調製する方法にも関する。

本発明は、ＣＮＣＭＩ−４６４２種または、アラキドン酸産生能を保持する変種または前記種に由来する種を培養する方法であって、前記種を適切な培地中および適当な発酵条件で培養する工程を含む方法に関する。

本発明は、さらに、アラキドン酸を含有する油が：
・４０重量％〜５５重量％の脂質、優先的には４０重量％〜５０重量％の脂質、さらに優先的には約４５重量％の脂質および全脂肪酸の重量と比較して５０重量％〜５５重量％のＡＲＡを有するバイオマスを製造するために、その種を従属栄養条件で培養すること、
・そのようにして調製されたバイオマスを回収すること、
・前記バイオマスを乾燥すること、
・ヘキサンおよびブタンからなる群から選択される溶媒で、より詳細には液体ブタンで、油を抽出すること、および
・そのように抽出された油を精製および回収すること、
を含む方法を用いて調製されることを特徴とする、ＣＮＣＭＩ−４６４２種あるいは変種または前記種に由来する種から抽出された油の状態のアラキドン酸を調製する方法に関する。

任意選択的に、油を抽出する工程から生じるバイオマスはそれ自身、回収して動物飼料
で（家畜（ブタ等々）用、ペット用、および水産養殖における、飼料補助材として）利用することができる。

培養は、従属栄養条件で実施される。一般に、培養工程は、種を回復させるための前培養工程、および次に実際の培養または発酵工程を含む。後者の工程は、目的の脂質化合物を製造するための工程に相当する。

下文で確認される通り、ＣＮＣＭＩ−４６４２種には、５工程好気性発酵を実施することを出願人企業は推奨する。

最初の４工程は、炭素源の供給がバイオマス、全脂質およびアラキドン酸の産生動態学に従って制御される培地でＣＮＣＭＩ−４６４２種を培養することを特徴とする。

これらの４工程で、注目すべきは、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）の発酵によりアラキドン酸を製造するための先行技術の他のプロセスとは違って、炭素源の供給が、微生物の成長に関して、制限的でないかまたはほとんど制限的でないことである。

一方、第５工程中、培養培地は、最大でも１重量％という低濃度の炭素源を有し、また炭素源の供給さえ停止される。

この工程で、炭素源は、微生物の成長にとって制限的になるか、または微生物自身の脂肪および／または脂質を微生物に代謝させるように制限される。

文献に記述されているものとは違って、以下のことに注目することが重要である：
・ここでは培養培地中の溶存酸素濃度を制御する／管理する必要はなく、むしろ最大に保たれる。したがってここでは、ＡＲＡ産生を高めるために、酸素供給に関して制御はない；
・特に発酵中に微生物菌糸体の形態を管理するために、培養培地中のリン酸塩、カリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウム供給を正確に規定する必要もない。

本発明は次に、発酵の終わりの、目的の脂質化合物（この場合にはＡＲＡ）に富むバイオマス回収に関する。

発酵工程の後、バイオマスは：
・バイオマスそれ自体のみならず、培養培地中にも存在する脂質分解酵素（リパーゼ）を失活させるために、低温殺菌することが可能である、
・それ自体が当業者に周知である任意の方法により発酵培地から回収することが可能である；たとえば、発酵槽からバイオマスを抽出し、精密濾過または遠心分離によって単に濃縮するか、または水性溶液を用いた一連の濃縮−希釈により洗浄することが可能である。

本発明はこのように、ＣＮＣＭＩ−４６４２種あるいは、ＡＲＡ産生能を保持する変種または前記種に由来する種を含む、バイオマスに関する。

かなり具体的には、発酵培養工程または培養工程の後、このバイオマスは目的の脂質化合物、たとえばＡＲＡ等に富む。

このバイオマスは、本文書に記述されている方法を用いて得ることができる。

発酵後、バイオマスは以下を含んでもよい：
・バイオマスの総重量と比較して、４０重量％〜５５重量％の脂質、優先的に４０重量％〜５０重量％の脂質、さらに優先的に約４５重量％の脂質、および
・全脂肪酸の重量と比較して５０重量％〜５５重量％のＡＲＡ。

バイオマスに加えて、本発明はまた、ＣＮＣＭＩ−４６４２種あるいはＡＲＡ産生能を保持する変種または前記種に由来する種を含むこのバイオマスから調製される、細胞抽出物または細胞可溶化物にも関する。

特に、この抽出物または可溶化物は、発酵後に回収されるバイオマスから調製される。

この抽出物またはこの可溶化物はそのとき、目的の脂質化合物、たとえばＡＲＡ等に富む。特に、４０重量％〜５５重量％の脂質、優先的に４０重量％〜５０重量％の脂質、より優先的には約４５重量％の脂質および全脂肪酸の重量と比較して５０重量％〜５５重量％のＡＲＡ、および全脂肪酸の重量と比較して５０重量％〜５５重量％のＡＲＡを含むことが可能である。

脂質内容を抽出するための細胞の破壊は、様々な経路で、なかでも機械的経路、化学的経路および酵素的経路で、実施することができる。

本発明はまた、ヘキサンおよびブタンからなる群から選択される溶媒を用いて、より具体的には液体ブタンを用いて、特に数回の連続抽出で、バイオマスから抽出される油にも関する。

油は、真空蒸留後に回収することができる。

しかしながら、優先的には、油はその後、２つの精製相および純正化相の後で回収される。

精製相は、当業者により従来の方法で実施される、連続した６工程を含む：
・脱ガム：クエン酸による酸性化、
・鹸化：アルカリによる中和、
・ガム質および石鹸を除去するための遠心分離、
・水による洗浄、
・珪質土、活性炭およびクレイによる退色、ならびに
・濾過。

純正化相の目的は、まずい味および過酸化物を除去するためであり、またこれは油の安定性を最適化する。

この相は：
・分子蒸留（不鹸化物（ＵＮＳ因子）の含量が余りにも多い場合に使用される）、
・強真空下での蒸気脱臭、
の１つまたは２つの工程を連続的に含む。

以下で例証される通り、出願人企業はまた、強真空下での蒸気脱臭工程により生じる揮発性画分を回収することも推奨する。

事実、この画分は、少なくとも８０％のトリグリセリド（その脂肪酸分布は、精製されたＡＲＡ油のそれに匹敵する）からなり、また約１０％のスクアレンを含有する。

したがって、ＡＲＡを製造する方法は：
・バイオマスを回収すること、
・バイオマスを乾燥することまたは細胞可溶化物を調製すること、
・油を抽出すること、および
・油を精製および純正化すること、
を含む。

油は、低温殺菌した発酵ブロス由来の乾燥微生物バイオマスから抽出される。

バイオマスを回収して乾燥し、次いで、たとえば、液体ブタンを溶媒として使用して、乾燥バイオマスから油を抽出する。

残留バイオマスを回収して乾燥し、動物飼料用に調整する。

最終的に、油は、全酸の重量と比較して少なくとも５０％のＡＲＡおよび少なくとも９０％のトリグリセリドを含有する。

最後に、本発明は、本発明のプロセスのいずれか１つにより製造される、ＡＲＡまたはＡＲＡに富む油の、食糧部門、特に乳児食糧向けの化合物の調製における使用に関する。

したがって、本発明は、本発明のプロセスのいずれか１つによる、ＡＲＡまたはＡＲＡに富む油の製造、次いで、前記ＡＲＡまたはＡＲＡに富む油を添加することによる食糧部門向け組成物の調製を含む、食糧部門向けの組成物を調製する方法に関する。

本発明は特に、ＣＮＣＭＩ−４６４２種あるいはＡＲＡ産生能を保持する変種または前記種に由来する種、前記種を培養または発酵することにより得られるバイオマス、あるいはその細胞抽出物または可溶化物を含む生成物または組成物に関する。本発明はまた、本発明のプロセスのいずれか１つにより製造されるＡＲＡに富む油を含む生成物または組成物にも関する。前記生成物または前記組成物は、目的の脂質化合物、たとえばアラキドン酸（すなわちＡＲＡ）等に富む。特に、前記生成物または前記組成物はＡＲＡに富む。好ましくは、前記生成物または前記組成物は、全脂肪酸と比較して重量基準で５０％超のアラキドン酸（すなわちＡＲＡ）を含む。さらに、前記生成物または前記組成物は：
・０．５％未満、好ましくは０．２％未満のＥＰＡ、
・０．５％未満、好ましくは０．２％未満のミリスチン酸（Ｃ１４：０）、
・９％未満、好ましくは７％未満のパルミチン酸（Ｃ１６：０）、
・３％未満、好ましくは２．５％未満のベヘン酸（Ｃ２２：０）、および
・３％未満、好ましくは２．５％未満のリグノセリン酸（Ｃ２４：０）、
を含む。

好ましくは、この生成物またはこの組成物は、食品組成物あるいは食品補助材または栄養補助材である。

それは液体であってもよく、固体であってもよい。

特に、生成物は、細胞凍結乾燥物またはその細胞抽出物または可溶化物を含んでもよい。

この生成物またはこの組成物は、粉末、顆粒、ゲルカプセル、カプセルまたは錠剤形であってもよく、好ましくは粉末状である。

或いは、本生成物または組成物は液体であって、本発明のプロセスのいずれか１つにより得られる粗製油または精製油を含む。

以下で例証する通り、油抽出工程から生じる残留バイオマスに関して、残留バイオマスは、動物飼料における目的に完全に適した組成を有する。

本発明は、例示であり非限定的であることを目的とする、下記の実施例からより明らかに理解されるであろう。

実施例１：モルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）種ＣＮＣＭＩ−４６４２によるＡＲＡに富む粗製油の産生
主発酵は、２シリーズのより小さい発酵槽から接種された培養培地が入った発酵槽で実施される。

急速前培養（６×２００ｍＬ）
・グルコース３％、酵母粉末（７％窒素含量）１．５％を含有する培地中、
・温度２８℃、
・２４０ｒｐｍで撹拌、
・継続期間２４〜４８時間。

この前培養の終わりに：３Ｌ反応器内で、６×２００ｍＬを混ぜ合わせる。

第１発酵工程（１ｍ ^３反応器）
・グルコース３％、酵母粉末（７％窒素含量）１．５％を含有する培地中、
・接種材料の量：０．１〜１容量％、
・温度：２８℃、
・圧力：０．０３ｍＰａ、
・通気度：最大
・機械的撹拌なし、
・継続期間：３２〜４８時間、
・作用量：全容積の７０％、
・ｐＨ：６〜６．５（アルカリで調節）、
・最終量：７５０Ｌ。

第２発酵工程（１０ｍ ^３反応器）
・グルコース４％、酵母粉末（７％窒素含量）１．５％、消泡剤（ひまわり油）０．２％を含有する培地中、
・接種材料の量：１０〜１５容量％、
・温度：２８℃、
・圧力：０．０３ｍＰａ、
・通気度：最大、
・機械的撹拌なし、
・継続期間：２４〜３２時間、
・作用量：全容積の７０％、
・ｐＨ：６〜６．５（アルカリで調節）、
・最終量：７．５ｍ^３。

主発酵（８５ｍ ^３反応器）
・グルコース３％、酵母粉末（７％窒素含量）２％、（ひまわり油）０．２％を含有する
培地中、
・Ｃ／Ｎ（炭素／窒素）比：７〜８、
・接種材料の量：１５〜２５容量％、
・温度：２７〜２８℃、
・通気度：最大、
・機械的撹拌なし、
・継続期間：１５５〜１６５時間、
・作用量：全体積の７０％、
・ｐＨ：７〜７．１、
・最終量：６０〜６３ｍ^３。

この主発酵工程を記述しようとする際、この場合、好気性発酵プロセスであるということを覚えておかれたい。

発酵反応器は、機械的手段なしで、細胞および培養培地の通気および混合を実施するような方法で規定される：好ましくは、この場合、直径３．５ｍおよび高さ８．７ｍを有する気泡塔である。

発酵槽の全容積は８５ｍ^３である。発酵は一般に６〜７日間（１５５〜１６５時間）持続し、温度は２７〜２８℃である。

好適であるが簡単な培地が発酵で使用される。

好ましい炭素源は、グルコースのみからなり、窒素源は酵母粉末（７％Ｎ含量）からなる。

Ｃ／Ｎモル比は７〜８に維持される。

窒素源および炭素源は、別々に滅菌されて、別々に添加される。

窒素源は、グルコース発酵の始めに全部一度に供給され、「フェッドバッチ」方式で添加される。

培養培地は：
・生じる泡のレベルを調節するための、消泡剤（食品用シリコーンを主成分とする）および／またはひまわり油、および
・ｐＨを６．５〜７．１の最適値に調節するための、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、
を含有する水である。

最適温度は、好ましくは２７〜２８℃である。

発酵中、培地を撹拌する。

これは、殺菌した空気を培地に「注入」することによりもたらされる通気によって実施され、また細胞に酸素を提供する。

通気は調節されず、発酵を通して最大（０．８〜１ＶＶＭの値）に保たれる。

通気を促進するための、追加の機械的撹拌はない。

発酵の終わりに、グルコース含量がゼロと等しく、ｐＨの上昇が７．５超のとき（細胞溶解の開始を示す）、反応器を停止し、次いで濾過（フィルター−プレス）により発酵タンクから微生物を回収する。

８５ｍ^３反応器での発酵中、培地中に存在する炭素源の全量が調節され、以下に記載の通り、５つの工程は明らかに識別された。

１．第１工程
これはｔ＝０時間から始まり、一般に２０〜２４時間後に終了する。

この期間中、炭素源は過剰であり、細胞成長にとって制限的であってはならない。

炭素源はこの期間中添加されず、培地中の還元糖類の含量は３０ｇ／Ｌから２０ｇ／Ｌまで減少する。

ｐＨは管理されない：その値は６．３から５．７まで僅かに低下する。

この第１工程の終わりに、バイオマスの濃度は１６ｇ／Ｌ培地に達することがあり、全脂質含量は少なくとも４．７ｇ／Ｌ培地であり、アラキドン酸含量は好ましくは１．３ｇ／Ｌ培地より多い。

２．第２工程
これは、ｔ＝２０時間に開始し、一般に５０〜５５時間後に終了する。

この期間中、利用できる炭素源は制限的であってはならず、添加速度は通常は、細胞による消費速度より僅かに低いはずである。

グルコース溶液（２５ｇ／Ｌ）は、１時間当たり０．１５Ｍ炭素／ｋｇ培地の平均速度（単位は、炭素源中の炭素のモル量である）で添加され、培地中の還元糖類の含量は、２０ｇ／Ｌから１１ｇ／Ｌまで減少する。

ｐＨは、ＮａＯＨ溶液を給送することにより５．７〜７に調整され、管理される。

この第２工程の終わりに、バイオマスの濃度は、２１ｇ／Ｌ培地に達することができ、全脂質含量は少なくとも８．３ｇ／Ｌ培地であり、アラキドン酸含量は好ましくは３．１ｇ／Ｌ培地より多い。

これらの最初の２工程の目的は、主要量のバイオマスを製造することである。

３．第３工程
これは、ｔ＝５５時間に開始し、一般に１００〜１０５時間後に終了する。

この期間中、利用できる炭素源はまだ制限的ではなく、添加速度は通常、細胞による消費速度より低いはずである。

グルコース溶液（２５ｇ／Ｌ）は、１時間当たり０．０８Ｍ／ｋｇ培地の平均速度で添加され、還元糖類の含量は１１ｇ／Ｌから４ｇ／Ｌまで減少する。

ｐＨは、ＮａＯＨ溶液を添加することにより７〜７．１に調整され、管理される。

この第３工程の終わりに、バイオマスの濃度は２４ｇ／Ｌに達することができ、全脂質含量は少なくとも１１ｇ／Ｌであり、アラキドン酸含量は好ましくは５ｇ／Ｌ培地より多い。

４．第４工程
これは、ｔ＝１００時間に開始し、一般に１３０〜１３５時間後に終了する。

この期間中、炭素源は僅かに制限され、また添加速度は通常、細胞による消費速度より低いはずである。

グルコース溶液（２５ｇ／Ｌ）は、１時間当たり０．０４Ｍ炭素／ｋｇ培地の平均速度で添加され、還元糖類の含量は４ｇ／Ｌから１ｇ／Ｌまで減少する。

ｐＨは管理されず、わずかに上昇し、７．１から７．３になる。

この第４工程の終わりに、バイオマスの濃度は２６ｇ／Ｌ培地に達することができ、全脂質含量は少なくとも１２．４ｇ／Ｌ培地であり、アラキドン酸含量は好ましくは６．２ｇ／Ｌ培地より多い。

第３工程および第４工程の目的は、主要量の脂質を製造することである。

５．第５工程
これはｔ＝１３０時間に開始し、一般に１６０〜１７０時間後に終了する。

この期間中、利用できる炭素源は制限的であり、炭素源の供給は停止される。

培地中の還元糖類の含量は１ｇ／Ｌから０ｇ／Ｌに急速に減少する。

ｐＨは管理されず、７．３から７．５にわずかに上昇する。

この第５工程の終わりに、バイオマスの濃度は２７ｇ／Ｌ培地に達することができ、全脂質含量は少なくとも１４ｇ／Ｌであり、アラキドン酸含量は好ましくは７．６ｇ／Ｌ培地より多い。

この第５工程の目的は、脂質の全濃度に影響を及ぼさずにアラキドン酸含量を高めることである。

ｐＨが７．５という値を超えるとき（細胞溶解の開始を示す）、反応器を停止して、発酵培地を７０℃で３０分間、低温殺菌し、３０℃〜２５℃に冷却した後、フィルタープレスを通過させることにより微生物を発酵槽から除去する。

この発酵を実施する主要な指標を、下表Ｉに示す。

この発酵の結果を下表ＩＩに示す。

実施例２：ＣＮＣＭＩ−４６４２種バイオマスの回収および調整
実施例１の発酵を実行する第５工程の終わりに、培地を７０℃で３０分間、低温殺菌した後に３０〜２５℃に冷却した後、プレス下で濾過による機械的脱水後、次には微生物を発酵培地から回収することができる。

濾過および浄水による洗浄後（水０．５Ｖ／培地１Ｖ）、バイオマスケーキの乾物含量は６５％〜７５％である。

第２工程で、バイオマスケーキを、０．５〜１．５ｃｍ^２の粒子に粒状化し、次いで流動層乾燥装置を使用して粒子を乾燥させる。

乾燥時間は、導入される空気の投入温度１５０℃で約４５〜５５分である。

出力空気温度が９５〜１００℃を超えるとき、空気投入は停止される。

バイオマスを周囲温度まで冷却し、酸化を制限するために、２５ｋｇバッグ内、窒素下で、バイオマスを保存する。

バイオマスの組成を下表ＩＩＩに示す。

実施例３．乾燥して粒状化したバイオマスからの粗製油の抽出
本テクニックは、液体溶媒とのアフィニティによる油の抽出にある。

油は、実施例２で得られる顆粒から、６〜７ｂａｒの圧力下で液体ブタンを使用して抽出される。

抽出収率を最適化するために、バイオマスを、リサイクルされた新しい溶媒と連続７回混合するが、いずれの回も接触時間は５０〜６０分である。

抽出収率は８５％超である（９０％〜９５％という値に達することができる）。

溶媒の真空蒸留および乾燥（圧力０．１ｍＰａおよび温度７０〜８０℃）後に、油を回収する。

下表ＩＶは、得られた粗製油のプロフィールを示す。

実施例４．油の精製および純正化
１．精製相
この精製相は、当業者により従来法で実施される、連続した６工程：
・脱ガム：クエン酸による酸性化、
・鹸化：アルカリによる中和、
・ガム質および石鹸を除去するための遠心分離、
・水による洗浄、
・珪質、活性炭およびクレイによる退色、ならびに
・濾過、
を含む。

２．純正化相
純正化相の目的は、まずい味および過酸化物を除去するためであり、また純正化相は、油の安定性を最適化する。

この相は：
・分子蒸留（ＵＮＳ因子があまりにも高い場合に使用される）、
・強真空下での蒸気脱臭、
の１つまたは２つの工程を連続的に含む。

本プロセス全体を通して、純正化収率は約７８〜８０％であり、また達成指標を下表Ｖに示す。

最終的な油は、４０℃で透き通った黄色液体の形であって、均質であり、外来不純物を含まない。

臭いは不明確であり、変敗臭はない。

強真空下での蒸気脱臭工程からの揮発性画分も回収される。

慣習的に、この脱臭工程は特定の反応器で実施され、ここで揮発性画分を放出するために油が加熱され、強真空にかけられる。

ここでは、このバッチテクニックは１２００Ｌ反応器内、５０％の供給原料量、不活性窒素雰囲気で実施される。

油を、周囲温度から１８５℃（ジャケットおよび１９０℃の蒸気の内部注入によってもたらされる温度）まで徐々に加熱する。

温度が１８５℃で安定した後、２６０Ｐａまで真空を徐々に作り、３０分間維持する。

この処理により放出されるガス画分は、周囲温度で凝縮され、外部サイクロンにより回収される。

この画分の組成は：
・２５℃で、ＣＤＣＬ_３＋ＣＤ_３ＯＤに溶解した、赤外分光光度法およびプロトンＮＭＲ分光光度法、および２５℃で、ＣＤＣＬ_３＋ＣＤ_３ＯＤ＋バッファーｐＨ７に溶解した、リンＮＭＲ分光光度法、および
・全脂肪酸については、Ｆ−ＣＰＧ−０４３によるガスクロマトグラフィ、
で測定される。

画分は、主としてトリグリセリド（含量は約８０％と推定される）からなり、スクアレンは１０％の量で検出される。

脂肪酸プロフィールは下記の通りである。

実施例５．市販の油または文献に記述されている油と比較した、本発明による油の脂質プ
ロフィールの比較試験
脂肪酸は、エタノール性塩酸とのエステル交換反応およびクロロホルムによる抽出後に、メチルエステルの形でガスクロマトグラフィにより測定した。結果は、％分布として表す；分析は、内部標準法により実施する。

タップフォーカスライナーおよび水素炎イオン化検出器と共に、スプリット―スプリットレスインジェクタ（ａｓｐｌｉｔ−ｓｐｌｉｔｌｅｓｓｉｎｊｅｃｔｏｒ）を備えたクロマトグラフ（Ｖａｒｉａｎ３８００）を使用した。

メタノール１ｍＬ当たり、正確に約０．５ｍｇのヘプタデカン酸メチルを含有する内部標準溶液を調製した。ヘプタデカン酸メチルは、リファレンスのクロマトグラフィポイントの役割をした。

正確に約３０ｍｇの予備乾燥試料を６ｍＬチューブに量り込む。２本の測定線が付いたピペットを使用して、内部標準溶液１ｍＬを、次いで３Ｎエタノール性塩酸２ｍｌを加えた。次いでこのチューブに栓をし、１１０℃の恒温乾浴槽に４時間入れた。

冷却後、水約０．５ｍＬおよび飽和塩化ナトリウム水溶液０．５ｍＬを加え、クロロホルム１ｍＬで３回、抽出を実施した。クロロホルム相を６ｍＬチューブに回収し、硫酸ナトリウが入ったカラムで乾燥した。それらを窒素流下で約１ｍＬまで濃縮して注入した。

各脂肪酸の％分布（ｉ）は、ヘプタデカン酸メチルピークを除外し、ラウリン酸（Ｃ１２：０）からＤＨＡ（Ｃ２２：６ Δ４ｃ、７ｃ、１０ｃ、１３ｃ、１６ｃ、１９ｃ）まで（両者を含む）の、クロマトグラム上の特定された全ピークの面積の合計と比較した、この脂肪酸のピーク面積の比率によって得た。

この方法に従って分析された油（下表ＶＩ）は、本発明のものの他に、Ｃａｒｇｉｌｌ社、Ｆｕｘｉｎｇ社およびＳｕｎｔｏｒｙ社により販売されている油である。

文献に記述されているＭ．カルマゲンシス（Ｍ．ｃａｒｍａｇｅｎｓｉｓ）およびＭ．シュマッケリ（Ｍ．ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）から抽出された油の脂肪酸プロフィールは、コントロールとして存在する。

本発明によるアラキドン酸に富む油は：
・５０％超のＡＲＡ、
・ＥＰＡ含量約０．１％、
・および特に、商用微生物に由来するかまたは文献に記述されている他の油と比較して、０．５％未満、好ましくは０．２％未満のミリスチン酸（Ｃ１４：０）、９％未満、好ましくは７％未満のパルミチン酸（Ｃ１６：０）、３％未満、好ましくは２．５％未満のベヘン酸（Ｃ２２：０）および３％未満、好ましくは２．５％未満のリグノセリン酸（Ｃ２４：０）、
を含む。

実施例６．油抽出工程後に得られる残留バイオマスの特性化
実施例４の精製工程および純正化工程の後、得られる残留バイオマスは、８５％〜９５％の乾物含量を有する。

次いで、その含量を決定するために、分析を実施する：
・全窒素（Ｎ６．２５の％の決定）
・全脂質、
・全糖類、
・可溶性繊維
ならびに：
・残留脂肪酸分布、
・残留糖プロフィール、
・アミノグラム。

下表ＶＩＩは、５バッチの残留バイオマスのプロフィールを示す。

したがって残留バイオマスは、その蛋白質窒素含量（３５％〜４５％）、その可溶性繊維含量（２０％〜３０％）およびその残留糖含量（１５％〜２０％）のため、また特定の種（ペット、水産養殖）には、その残留ＡＲＡ含量（３．５％〜４．５％）のため、動物飼料におけるその用途に完全に適していると思われる。

Claims

２０１２年６月１２日にＩ−４６４２の番号でＣＮＣＭに提出された、モルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）種。
請求項１に記載の種を培養することおよび目的の脂質化合物に富むバイオマスを回収することを含む、目的の脂質化合物を製造する方法。
前記目的の脂質化合物がアラキドン酸（すなわちＡＲＡ）である、請求項２に記載の方法。
前記アラキドン酸（ＡＲＡ）が油の状態である、請求項３に記載の方法。
前記アラキドン酸を含有する油が：
・バイオマスの総重量と比較して、４０重量％〜５５重量％の脂質および全脂肪酸の重量と比較して５０重量％〜５５重量％のＡＲＡを有するバイオマスを製造するために、前記種を従属栄養条件で培養すること、
・このようにして調製された前記バイオマスを回収すること、
・前記バイオマスを乾燥すること、
・前記油を、ヘキサンおよびブタンからなる群から選択される溶媒で抽出すること、および
・このようにして抽出された油を精製および回収すること、
を含む方法によって調製されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
目的の脂質化合物を産生するための、請求項１に記載の種の使用。
請求項５に記載の油の抽出後に得られる、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種の残留バイオマスの、動物飼料における使用。