CN104662147B

CN104662147B - 微生物(单细胞真菌高山被孢霉)的富含花生四烯酸的油及其制备方法

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Publication number: CN104662147B
Application number: CN201380048102.4A
Authority: CN
Inventors: 钱云; 周洁; 伯纳德·波拉
Original assignee: Roquette Freres SA
Current assignee: Roquette Freres SA
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2033-09-12
Also published as: CN104662147A; KR102055229B1; US20150252395A1; JP2015529465A; AU2013316906A1; AU2013316906B2; KR20150052084A; EP2895628B1; EP2895628A1; CN103667068A; WO2014041303A1; ES2703520T3; PL2895628T3; JP6118904B2; US9476075B2; DK2895628T3

Abstract

本发明涉及一种能够生产大量花生四烯酸(或ARA)的高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株，涉及使用所述菌株生产感兴趣的脂类化合物的方法，并且涉及使用所述菌株生产的产品和组合物。

Description

微生物(单细胞真菌高山被孢霉)的富含花生四烯酸的油及其制备方法

本发明涉及一种富含花生四烯酸油的新颖组合物，所述油是通过微生物产生，优先地通过被孢霉属的单细胞真菌(丝状霉菌)(在这种情况下是高山被孢霉(Mortierellaalpina)的特定菌株)产生。

脂类与蛋白质和碳水化合物一起构成了大量营养元素的三个主要家族。

在脂类中，甘油三酸酯和磷脂尤其突出。

甘油三酸酯代表大约95％的摄取的食物脂类。在生物中，它们主要存在于脂肪组织并构成主要的能量存储形式。

磷脂是结构性脂质，因为它们是细胞膜的组分，它们尤其为细胞膜提供流动性。

甘油三酸酯和磷脂主要由脂肪酸组成，它们都是由饮食提供，并且对于它们中的一些，是由生物合成的。

生物化学分类(基于脂肪酸分子中包含的双键数量)区分饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)。

从生理学角度，区分为以下：

-必需脂肪酸，人体成长和正常运行所必需的，但我们身体不能够产生的脂肪酸；

-“条件性”必需脂肪酸，其对于细胞正常生长和生理功能是必需的，但如果通过饮食提供的话，其可以从它们的前体中产生。因此，如果它们必需的前体不存在，它们是严格必需的。

-非必需脂肪酸。

必需脂肪酸和“条件性”必需脂肪酸的组组成了必需脂肪酸。

另外的脂肪酸称为非必需脂肪酸。

将必需脂肪酸分为两个主要家族：ω6脂肪酸(或n-6PUFA)，其前体和主要代表是亚油酸(LA)，以及ω3脂肪酸(或n-3PUFA)，其前体是α-亚麻酸(ALA)。

在非必需脂肪酸中，尤其是：

-ω3脂肪酸家族的二十碳五烯酸(EPA)，

-油酸，即一种在我们饮食中的主要的单不饱和脂肪酸，以及

-饱和脂肪酸。

除了产自花生、红花、油菜、玉米、亚麻、榛子、芝麻、大豆或向日葵外，多种多不饱和脂肪酸可以通过不同的单细胞生物(藻类、真菌，等)产生。

花生四烯酸(“ARA”)是一种长链脂肪酸，其发现于某些植物油。

它是一种C 20：4(n-6、n-9、n-12、n-15)多不饱和脂肪酸，即包含20个碳原子以及位于碳原子n°5(n-15)、n°8(n-12)、n°11(n-9)和n°14(n-6)上的四个烯键的脂肪酸。

它是一种还被称作“四烯酸”的脂肪酸，因为它具有4处不饱和(4个碳-碳双键)。

还在文献中发现它名为“全顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸”(“顺式”定义了双键的构型，“全部”双键均处于“顺式”构型)。

ARA是人体内最丰富的C20PUFA之一，在人体中它是从亚油酸产生的。

它在机体、肌肉和血液中被发现。

ARA是多种生物活性化合物的重要前体，这些生物活性化合物统称为“类二十烷酸”，即一个包括前列腺素、凝血噁烷和白细胞三烯的组。

这些类二十烷酸展现出对脂蛋白代谢、血液流变、肌肉张力、白细胞功能、血小板激活和细胞生长的调节作用。

ARA还是人类母乳的脂类部分的组分之一，并被认为对婴幼儿最佳的神经发育是必需的。

科学家和食品监管机构为了努力获得与母乳的长链脂肪酸谱相对应的婴幼儿制品，他们已经建议向婴幼儿制品中添加花生四烯酸，尤其是用于早产儿的配方中。

具体而言，对于生产的用于婴幼儿制品的包含花生四烯酸的油，优选包含少量或不包含其他PUFA(例如二十碳五烯酸或EPA)。

实际上并不推荐这些其他PUFA，因为这些脂肪酸的一些可以与儿童这样使用的花生四烯酸互相干扰，和/或可以损害为了实现母乳脂肪酸的适当比率(重构母乳)或其他所希望的应用而进行的包含花生四烯酸的油与其他油类的混合。

此外，ARA还有多种应用，诸如用于人类食物产品的制品中，还用作动物饲料。

实际上ARA在动物饲料中具有几个被认可的特性：

-抗炎特性，因为ARA是系列II前列腺素和花生四烯酸乙醇胺(anandamide)的前体(主要在猪上证明)，

-在鱼(海鲤)中的抗应激特性，通过与前列腺素不同的途径，

-在猪中的免疫调节特性。

还已经进行了传递研究，以便使花生四烯酸进入生产的肉、奶或蛋中的通路可视化。

当将它从微生物中分离时，商业产品的具体可用形式为通过被孢菌属的丝状霉菌发酵获得的富含花生四烯酸的油。

在EP 276541中，这样描述了通过伸长被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exigua)和喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)生产ARA的方法。

国际专利申请WO 94/28913，就其本身而言，描述了一种使用高山被孢霉用于生产基本上没有EPA的ARA的发酵方法。

然而，正如EP 726 321中所确认的，针对其生产ARA所测试的所有被孢霉属(高山被孢霉、喜湿被孢霉、刺孢被孢霉(Mortierella spinosa)、施穆克瑞被孢霉(Mortierellaschmuckeri)和卡马捷尼斯被孢霉(Mortierella carmagensis))，其中展现最有利的生产力的是施穆克瑞被孢霉或卡马捷尼斯被孢霉的菌株。

因此ARA生产领域中的专家们接受了，针对高山被孢霉、喜湿被孢霉或刺孢被孢霉的损害，通过选择施穆克瑞被孢霉或卡马捷尼斯被孢霉菌株，才可能保证更好的产量、生产量和质量。

然而，仍需要具有可替代的方式用于生产具有高ARA含量并且具有全部特定的长链饱和或多不饱和脂肪酸谱的优质油。

此外，对于许多国家监管当局而言，仅高山被孢霉在婴儿食品中授权。

首先，本申请公司的荣誉在于提供一种富含花生四烯酸的油的新颖组合物，该组合物具有：

-低含量的除ARA以外的多不饱和脂肪酸(诸如EPA)，

-有限含量的某些长链饱和脂肪酸(诸如山萮酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或木蜡酸)。

此外，本申请公司注意到低含量的这些饱和脂肪酸使得有可能获得在透明度和低浑浊度方面(当冷时)比可商购的油的质量更好的油。

考虑到开发一种与现有技术描述的相比更有效更低廉的生产方法，本申请公司已经在其研究中鉴定了一种新颖的高山被孢霉菌株，该菌株具有用于生产花生四烯酸的超常能力，因为它允许达到高于50％的花生四烯酸的产量(这里该％应理解为按总脂肪酸的重量计)。

因此，本申请公司已经面临对抗一种旨在在施穆克瑞被孢霉或卡马捷尼斯被孢霉类型的菌株中寻找生产ARA的最佳菌株的技术偏见。

此外，除了用于生产花生四烯酸的显著能力之外，该菌株还使得有可能获得以下项(这里该％应理解为按总脂肪酸的重量计)：

-低于0.5％，优选地低于0.2％的EPA，

-低于0.5％，优选地低于0.2％的肉豆蔻酸(C14：0)，

-低于9％，优选地低于7％的棕榈酸(C16：0)，

-低于3％，优选地低于2.5％的山萮酸(C22：0)，以及

-低于3％，优选地低于2.5％的木蜡酸(C24：0)。

这种高山被孢霉菌株在2012年6月12日提交于法国巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes[NationalMicroorganism Culture Collection]of the Institut Pasteur(CNCM))中编号CNCM I-4642下，并且还在中国保藏在中国武汉(430072)的武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION(CCTCC))编号M 209116下。

它已经通过编码25S RNA基因的D1-D2区域的测序来表征(SEQ ID No 1)：

1TTAAACAGTG CGTGAAATTG TTGAAAGGGA AACGCTTGAC ACCAGTCATG CGAGCGGAAA

61ATCAGTCTTT TGCAGTGGGG AGTTGTGTGG GTTCGGACCG CAAGGCCGGC CTGTGCTGCA

121TCTCTGCTGT AAGTGATGCA CTTTTTCGTT TGCAGGCCAA CATCAGTTTC TTCTGCTGGA

181CAAAACTCTT GAGAAGGTAG CAGCTTTGGC TGTGTTATAG CTCTTGAGCG ATACAGTGGA

241GGGGACTGAG GTTTTCGCAG CGCGTGCTCT CGGGCAAGGC TGATTGGGTG CTATGGGATC

301GTTCGGTGTA CAATGCATGC ATTTTGCGCC GTGTCTTTTC TGTACTCGCT CAACTCGGCT

361C

这可以使得有可能将其鉴定为高山被孢霉类型的一个菌株。

因此，本发明涉及于2012年6月12日提交的高山被孢霉菌株，其CNCM编号为I-4642。

这个菌株可以在本申请中随后被指定为“CNCM I-4642”。

本发明还涉及这种菌株的变种或衍生自所述菌株的菌株，所述变种或所述衍生菌株保留了生产高含量花生四烯酸的特性。具体而言，它允许生产具有按总脂肪酸重量计最低50％的花生四烯酸的ARA。

特别地，本发明涉及通过诱变或通过基因转化从CNCM I-4642菌株中获取的一种高山被孢霉菌株。该诱变可以是定位诱变和/或随机诱变。

本发明还涉及用于制备这种菌株的方法，该方法包括CNCM I-4642菌株的诱变或基因转化以及任选地，一个筛选步骤，该筛选步骤使得选择这些生产按总脂肪酸的重量计至少50％的花生四烯酸的菌株成为可能。

本发明涉及用于培养CNCM I-4642菌株或一种保留了生产四烯酸能力的变种或衍生自所述菌株的菌株的方法，该方法包括在适当的培养基和合适的发酵条件下培养所述菌株的步骤。

此外，本发明还涉及以从CNCM I-4642菌株或从变种或衍生自所述菌株的菌株中提取的油的形式制备花生四烯酸的方法，其特征在于是采用包含下列步骤的方法来制备包含花生四烯酸的油：

ο在异养条件下培养菌株，以生产一种生物质，该生物质具有按重量计在40％和55％之间的脂类，优先地，按重量计在40％和50％之间的脂类，甚至更优先地，按重量计大约45％的脂类以及按相对于总脂肪酸重量的重量计在50％和55％之间的ARA。

ο收获由此制备的生物质，

ο干燥所述生物质，

ο用选自己烷和丁烷的溶剂、更具体地用液体丁烷提取该油，以及，

ο精炼并回收由此提取的油。

任选地，可以将由提取油的步骤所产生的生物质本身进行回收并且开发用于动物饲料(如用于家畜(猪，等)、宠物及水产业中的饲料增补剂)。

该培养在异养条件下进行。总的来讲，该培养步骤包括预培养步骤(为了使该菌株复苏)，并且然后是实际培养或发酵步骤。后一步骤相对应于生产感兴趣的脂类化合物的步骤。

申请公司推荐对CNCM I-4642菌株采取五步骤的需氧发酵，如将在下文中进行鉴定的。

前四个步骤的特征在于在培养基中培养CNCM I-4642菌株，在培养基中根据生物质、总脂类和花生四烯酸的生产动力学来调节碳源的供应。

在这四个步骤中，应注意的是，与通过被孢霉属发酵生产花生四烯酸的其他现有技术的方法相反，关于微生物生长，碳源供应没有限制性或几乎没有限制性。

另一方面，在第五步骤期间，培养基具有低浓度的碳源，按重量计最多为1％，并且碳源供应甚至被停止。

在该步骤中，碳源对于微生物生长变成限制性的或被限制为导致微生物对它们自身的脂肪和/或脂类进行代谢。

重要的是应注意到，与文献中描述的相反：

-这里不需要调节/控制培养基中的溶氧浓度，而是要尽量保持其在最大值。因此，这里在氧气供应方面无需调节以便增加ARA的产量。

-也不需要精确地限定培养基中磷、钾、钠、镁和钙的供应量，尤其是为了控制发酵期间微生物菌丝形态。

随后，本发明涉及在发酵结束后，回收富含感兴趣的脂类化合物(在这种情况下是ARA)的生物质。

在发酵步骤之后，可以将生物质：

-进行巴氏消毒，以使生物质中的存在的以及培养基中存在的脂类降解酶(脂肪酶)就此失活，

-通过本领域普通技术人员本身已知的任何方法从发酵培养基中进行回收，例如，可以从发酵罐中提取生物质，并且通过微过滤或离心来简单地浓缩，或经由具有水性溶液的连续浓度-稀释物来洗涤。

因此本发明涉及包括CNCM I-4642菌株或保留生产ARA能力的变种或衍生自所述菌株的菌株的生物质。

非常特别地，发酵或培养步骤之后，这种生物质富含感兴趣的脂类化合物，诸如ARA。

它可以通过在本文件中描述的方法获得。

发酵后，生物质可包含：

-按相对于生物质总重量的重量计在40％和55％之间的脂类，优先地，按重量计在40％和50％之间的脂类，甚至更优先地，按重量计大约45％的脂类，并且

-按相对于总脂肪酸重量的重量计在50％和55％之间的ARA。

除了生物质，本发明还涉及从该生物质制备的细胞提取物或细胞裂解物，该生物质包括CNCM I-4642菌株或保留生产ARA能力的变种或衍生自所述菌株的菌株。

特别地，这种提取物或裂解物是从发酵后回收的生物质制备的。

该提取物或该溶解产物进而富含感兴趣的脂类化合物，诸如ARA。特别地，它可以包含按重量计在40％和55％之间的脂类，优先地，按重量计在40％和50％之间的脂类，甚至更优先地按重量计大约45％的脂类以及按相对于总脂肪酸重量的重量计在50％和55％之间的ARA，以及按相对于总脂肪酸重量的重量计在50％和55％之间的ARA。

用于提取脂类含量的细胞破裂可以通过不同途径进行，在这些途径中有机械的、化学的和酶的途径。

本发明还涉及使用选自己烷和丁烷的溶剂、更具体地使用液体丁烷从生物质中提取的油，尤其是经多次连续提取。

在真空蒸馏后可以回收油。

然而，优先地，进而在精炼和纯化两个阶段之后回收该油。

精炼阶段包括六个连续步骤，所述步骤通过本领域的普通技术人员常规地进行：

-脱胶：用柠檬酸酸化，

-皂化：用碱中和，

-离心以去除胶和皂，

-用水洗涤，

-用硅藻土、活性炭和粘土褪色，并且

-过滤。

纯化阶段的目的是以去除不好的味道和过氧化物，并且其使油的稳定性最优化。

该阶段依次包括以下项中的一个或两个步骤：

-分子蒸馏(如果不可皂化物的含量(UNS因子)太高的话使用)，

-在强的真空下蒸汽除臭。

如将在下文中示例的，本申请公司还推荐回收从强的真空下的蒸汽除臭步骤中产生的挥发性部分。

实际上，该部分由至少80％的甘油三酸酯组成(其脂肪酸分布与精炼的ARA油的脂肪酸分布相当)并且包含大约10％的角鲨烯。

因此，用于生产ARA的方法包括：

-收获生物质，

-干燥生物质或制备细胞裂解物，

-提取油，以及

-精炼和纯化油。

从源自经巴氏消毒的发酵液的干燥的微生物生物质中提取油。

收获生物质并进行干燥，并且然后使用诸如液体丁烷作为溶剂将该油从干生物质中进行提取。

将残余的生物质进行回收、干燥及调节用于动物饲料施用。

最后，油包含按相对于总脂肪酸的重量计至少50％的ARA和至少90％的甘油三酯。

最后，本发明涉及在预期用于食品行业的化合物(特别是婴幼儿食品)的制备中使用通过本发明的任一种方法生产的ARA或富含ARA的油。

因此，它涉及一种用于制备预期用于食品行业的组合物的方法，该方法包括通过本发明的任一种方法生产ARA或富含ARA的油，然后通过添加所述ARA或富含ARA的油来制备预期用于食品行业的组合物。

具体而言，本发明涉及一种包含CNCM I-46-42菌株或保留生产ARA能力的变种或衍生自所述菌株的菌株的产品或组合物，一种通过培养或发酵所述菌株得到的生物质，或其一种细胞提取物或细胞裂解物。它还涉及包含通过本发明任一种方法生产的富含ARA的油的产品或组合物。所述产品或所述组合物富含感兴趣的脂类化合物，诸如花生四烯酸(或ARA)。特别地，所述产品或所述组合物富含ARA。优选地，它包括按相对于总脂肪酸的重量计高于50％的花生四烯酸(或ARA)。此外，它包含：

-低于0.5％，优选地低于0.2％的EPA，

-低于0.5％，优选地低于0.2％的肉豆蔻酸(C14：0)，

-低于9％，优选地低于7％的棕榈酸(C16：0)，

-低于3％，优选地低于2.5％的山萮酸(C22：0)，以及

-低于3％，优选地低于2.5％的木蜡酸(C24：0)。

优选地，这种产品或这种组合物是一种食品组合物或一种食品增补剂或营养增补剂。

它可以处于液体或固体形式。

特别地，该产品可以包含细胞冻干物或其细胞提取物或细胞裂解物。

这种产品或这种组合物的形式可以是粉末、颗粒、胶囊剂、胶囊或片剂形式，优选粉末形式。

可替代地，该产品或该组合物是处于液体形式并且包括通过本发明任一种方法获得的粗制油或精制油。

关于从油提取步骤中产生的残余的生物质，它具有一种组合物，该组合物在动物饲料中是完全适用于其目的，如将在下文中示例的。

本发明将从以下旨在为说明性的和非限制性的实例中更清楚地得以理解。

实例1：通过高山被孢霉菌株CNCM I-4642生产富含ARA的粗制油

在包含从两组较小的发酵罐中接种的培养基的发酵罐中进行主发酵：

快速预培养(6×200ml)

-在包含3％葡萄糖、1.5％酵母粉(7％氮含量)的培养基中，

-温度28℃，

-在240rpm进行搅拌，

-持续时间24-48小时。

在这种预培养结束时：将6×200ml一起混合在31反应器中。

第一发酵步骤(1m ³ 反应器)

-在包含3％葡萄糖、1.5％酵母粉(7％氮含量)的培养基中，

-接种物的量：0.1至1vol％，

-温度：28℃，

-压力：0.03mpa，

-通风度：最大，

-未机械搅拌，

-持续时间：32至48h，

-工作体积：总体积的70％，

-pH：6至6.5(用碱调节)，

-最终体积：7501。

第二发酵步骤(10m ³ 反应器)

-在包含4％葡萄糖、1.5％酵母粉(7％氮含量)、0.2％消泡剂(向日葵油)的培养基中，

-接种物的量：10至15vol％，

-温度：28℃，

-压力：0.03mpa，

-通风度：最大，

-未机械搅拌，

-持续时间：24至32h，

-工作体积：总体积的70％，

-pH：6至6.5(用碱调节)，

-最终体积：7.5m³。

主发酵(85m ³ 反应器)

-在包含3％葡萄糖、2％酵母粉(7％氮含量)、0.2％(向日葵油)的培养基中，

-C/N(碳/氮)比率：7至8，

-接种物的量：15至25vol％，

-温度：27℃-28℃，

-通风度：最大，

-未机械搅拌，

-持续时间：155至165h，

-工作体积：总体积的70％，

-pH：7-7.1，

-最终体积：60-63m³。

如果努力描述该主发酵步骤，所记住的是它是在需氧发酵工艺的这种情况下。

以能够进行通风并且无需机械装置使细胞与培养基混合的这样一种方式来限定发酵反应器：在这种情况下，其优选的是具有3.5m直径和8.7m高度的泡罩塔。

发酵罐的总体积是85m³。发酵通常持续6至7天(155至165小时)并且温度是从27℃到28℃。

在发酵中使用一种适当但简单的培养基。

优选的碳源仅由葡萄糖组成，并且氮源由酵母粉组成(7％的N含量)。

C/N摩尔比保持在7到8。

氮源和碳源是分开灭菌的并且分开添加。

在葡萄糖发酵开始时一次性提供全部氮源，并以“分批补料”(fed batch)方式添加。

培养基是包含以下项的水：

-消泡剂(基于食品级硅酮)和/或向日葵油，用于控制生成泡沫的水平，以及

-氢氧化钠(NaOH)，用于将pH控制在6.5和7.1之间的最优值。

最适温度优选地是27℃到28℃。

在发酵期间搅拌培养基。

这是通过将灭菌空气“鼓吹”进培养基中而产生的通风进行的，并且通风为细胞提供了氧气。

对通风不进行控制，并且整个发酵期间将通风保持在最大值，即为在0.8与1VVM之间的一个值。

不进行额外的机械搅拌来促进通风。

发酵结束后，当葡萄糖含量等于零并且pH增加到高于7.5(其表明细胞溶解的开始)时，停止反应器，并且然后可以通过过滤方式(压滤机)从发酵罐中去除微生物。

在85m³的反应器中发酵期间，控制存在于培养基中的碳源的总量，并且对五个步骤进行明确地鉴别，如在下文中所描述的：

1.第一步骤

该步骤从t＝0小时开始，并且一般在20到24小时后结束。

在此期间内，碳源是过量的并且不得限制细胞的生长。

在此期间内不添加碳源，并且培养基中还原糖的含量从30g/l下降低到20g/l。

不控制pH值：其数值从6.3略微降低至5.7。

在该第一步骤结束后，生物质的浓度可以达到16g/l培养基，总脂类含量是至少4.7g/l培养基，并且花生四烯酸含量优选是高于1.3g/l培养基。

2.第二步骤

该步骤在t＝20小时开始，并且一般在50到55小时后结束。

在此期间内，可用碳源不得是限制性的，并且添加的速度正常地应当略微低于被细胞消耗的速率。

以每小时0.15M碳/kg培养基的平均速率(单位是碳源中的碳摩尔量)添加葡萄糖溶液(25g/l)，并且培养基中的还原糖含量从20g/l降低到11g/l。

调节pH并且通过填充NaOH溶液将其控制在5.7至7。

在该第二步骤结束后，生物质的浓度可以达到21g/l培养基，总脂类含量是至少8.3g/l培养基，并且花生四烯酸含量优选是高于3.1g/l培养基。

这前两个步骤的目的是生产主要量的生物质。

3.第三步骤

该步骤在t＝55小时开始，并且一般在100到105小时后结束。

在此期间内，可用碳源仍是非限制性的，并且添加的速度正常地应当低于被细胞消耗的速率。

以每小时0.08M/kg培养基的平均速率添加葡萄糖溶液(25g/l)，并且还原糖含量从11g/l降低到4g/l。

调节pH值并通过添加NaOH溶液将其控制在从7到7.1的值。

在该第三步骤结束后，生物质的浓度可以达到24g/l，总脂类含量是至少11g/l，并且花生四烯酸含量优选是高于5g/l培养基。

4.第四步骤

该步骤在t＝100小时开始，并且一般在130到135小时后结束。

在此期间内，轻微限制碳源，并且添加的速度正常地应当低于被细胞消耗的速率。

以每小时0.04M的碳/kg的培养基的平均速率添加葡萄糖溶液(25g/l)，并且降低的还原糖含量从4g/l减少到1g/l。

不控制pH值，并且pH值略微增加，从7.1上升到7.3。

在第四步骤结束后，生物质浓度可以达到26g/l的培养基，总脂类含量至少是12.4g/l的培养基，并且花生四烯酸含量优选的是高于6.2g/l的培养基。

第三和第四步骤的目的是生产主要数量的脂类。

5.第五步骤

这个步骤在t＝130小时开始，并且一般在160到170小时后结束。

在此期间内，可用碳源是限制性的，并停止碳源的供应。

培养基中还原糖的含量从1g/l迅速降低到0g/l。

不控制pH，并且pH略微从7.3增加到7.5。

在第五步骤结束后，生物质的浓度可以达到27g/l培养基，总脂类含量是至少14g/l，并且花生四烯酸含量优选是高于7.6g/l培养基。

该第五阶段的目的是在不影响总的脂类浓度的情况下增加花生四烯酸的含量。

当pH超过7.5的值时，这表明细胞溶解的开始，停止反应器，将发酵培养基在70℃下巴氏消毒30分钟，并且，在冷却至30℃-25℃后，通过压滤机从发酵罐中去除微生物。

该发酵进行的主要指标呈现于以下表I中：

该发酵的结果在以下表II中给出。

表II

实例2：CNCM I-4642菌株生物质的回收和调节

在实例1的发酵进行的第五阶段结束时，将培养基在70℃下巴氏消毒30分钟之后，并且冷却至30℃-25℃后，然后可以通过压力过滤将微生物机械脱水后从发酵培养基中回收。

在过滤并用清水(0.5V的水/1V培养基)洗涤之后，生物质滤饼的干物质含量是65％到75％。

在第二步骤中，将生物质滤饼粒化为0.5到1.5cm²的颗粒，并且然后使用流化床干燥器干燥颗粒。

干燥时间大约为45到55分钟，其中引入的空气输入温度在150℃。

当空气输出温度超过从95℃到100℃时，停止空气输入。

将生物质冷却至环境温度，并且在氮气下将生物质储存在25kg袋中，以限制氧化。

该生物质的组合物在以下表III中给出。

表III.

实例3.从干燥的和粒状的生物质中提取粗制油。

该技术在于通过与液体溶剂的亲和力来提取油。

在6到7巴压力下使用液体丁烷从在实例2中获取的颗粒中提取油。

为了优化提取率，将生物质与回收利用的新鲜溶剂连续混合七次，并且每次接触时间为50到60分钟。

该提取率高于85％(并且可以达到90％与95％之间的值)。

将溶剂真空蒸馏和干燥(压力为0.1mpa并且温度为70℃到80℃)后回收油。

以下表IV给出获得的粗制油的特征谱。

表IV.

实例4.油的精炼和纯化

1.精炼阶段

该精炼阶段包括六个连续步骤，所述步骤通过本领域的普通技术人员常规地进行：

-脱胶：用柠檬酸酸化，

-皂化：用碱中和，

-离心以去除胶和皂，

-用水洗涤，

-用硅藻土、活性炭和粘土褪色，以及

-过滤。

2.纯化阶段

该纯化阶段的目的是去除不好的味道和过氧化物，并且它使油的稳定性最优化。

该阶段依次包括以下项中的一个或两个步骤：

-分子蒸馏(如果UNS因子太高的话使用)，

-在强的真空下蒸汽除臭。

经过整个方法，纯化产率是约78％到80％，并且以下表V中呈现了性能指标：

表V.

PUFA：多不饱和脂肪酸

反式FA：反式脂肪酸

最终的油在40℃下处于一种澄清的黄色溶液的形式，该溶液是均匀的且未包含外部的杂质。

气味是中性的、且无酸败味。

还对来自在强的真空下的蒸汽除臭步骤中的挥发性部分进行回收。

常规地，这个除臭步骤是在特定的反应器中进行，在其中将油进行加热并且经受强的真空，以便释放挥发性部分。

在惰性的氮气氛下，这种批次技术是在具有50％的进料量的12001反应器中在此来实现的。

将油从环境温度逐渐加热至185℃(通过夹套和通过内部注入190℃蒸汽带来的温度)。

在185℃温度稳定之后，将真空逐渐地产生至260Pa并维持30分钟。

将通过此处理释放的气体部分在环境温度下冷凝并且通过外部的旋流器进行收集。

该部分的组合物通过以下方式确定：

-在25℃下，在于CDCL₃+CD₃OD中的溶液里红外和质子NMR光谱法，并且在25℃下，在于CDCL₃+CD₃OD+缓冲液pH 7中的溶液里的磷NMR光谱法，以及

-针对总脂肪酸，根据F-CPG-043的气相色谱。

该部分主要由甘油三酸酯(估计大约80％的含量)、以10％的量所检测到的角鲨烯组成。

脂肪酸谱如下：

定量限：0.3％/粗制品

检测限：0.1％/粗制品

实例5.根据本发明的油与商品油或在文献中描述的油的脂类谱的对比研究

使用甲醇盐酸进行酯基转移作用及使用氯仿进行提取后通过气相色谱以甲酯形式确定了脂肪酸。结果用％分布来表示；通过内部标准化方法进行分析。

使用一个装配有分流-不分流注射器(带有tapfocus衬垫)以及火焰离子化检测器的色谱仪(美国瓦里安公司(Varian)3800)。

制备了一种内部标准溶液，该溶液包含大约精确地0.5mg十七酸甲酯/ml甲醇。十七酸甲酯作为色谱参考点使用。

将大约精确地30mg的预干燥样品称量进入6ml试管。使用具有两个测量线的移液器添加1ml的内部标准溶液并且进而添加2ml 3N的甲醇盐酸。然后将试管塞住并将其放置在干浴中恒温在110℃持续4h。

冷却后，添加0.5ml的水和0.5ml的饱和水性氯化钠溶液，并用1ml的氯仿进行三次提取。氯仿相在6ml的试管中回收并将它们在包含硫酸钠的柱上干燥。将它们在氮流下浓缩至1ml并注射。

每种脂肪酸(i)的％分布通过相对于在色谱上精确定位的所有峰的面积总和(包括从月桂酸(C12：0)到DHA(C22：6Δ4c，7c，10c，13c，16c，19c)，十七酸甲酯的峰排除在外)的这种脂肪酸的峰面积比率获得。

根据该方法分析的油(在以下表VI中)，除本发明的那些油之外，是嘉吉(Cargill)、福星(Fuxing)和三得利(Suntory)公司销售的油。

将文献中描述的从卡马捷尼斯被孢霉和施穆克瑞被孢霉中提取的油的脂肪酸谱表示为对照。

根据本发明富含花生四烯酸的油包含：

-高于50％的ARA，

-大约0.1％的EPA含量，

-并且尤其是与其他源自商业微生物的或文献中描述的油相比，肉豆蔻酸(C14：0)低于0.5％，优选低于0.2％；棕榈酸(C16：0)低于9％，优选低于7％；山萮酸(C22：0)低于3％，优选低于2.5％，并且木蜡酸(C24：0)低于3％，优选低于2.5％。

实例6.从油提取步骤之后获得的残余的生物质的表征。

在实例4的精炼和纯化步骤之后，获得的残余生物质具有在85％和95％之间的干物质含量。

然后进行分析以便确定其以下项的含量：

-总氮(确定N 6.25的％)

-总脂类，

-总糖，

-可溶的纤维

以及还有：

-残余的脂肪酸分布，

-残余的糖谱，

-氨基酸谱。

以下表VII给出五批残余的生物质谱。

因此残余的生物质凭借其蛋白质含氮量(在35％和45％之间)、其可溶的纤维含量(在20％和30％之间)和其残余的糖含量(在15％和20％之间)，并且对于某些特定物种(宠物、水产业)凭借其残余的ARA含量(在3.5％和4.5％之间)两者，而显现出绝对适合将其应用在动物饲料中。

Claims

1.一种于2012年6月12日提交的高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株，其CNCM编号为I-4642。

2.一种用于生产感兴趣的脂类化合物的方法，该方法包括培养如权利要求1中所述的菌株并且回收富含感兴趣的脂类化合物的生物质。

3.如权利要求2所述的方法，其还包括收获感兴趣的脂类化合物。

4.如权利要求2或3所述的方法，其中感兴趣的脂类化合物是花生四烯酸(ARA)。

5.如权利要求4所述的方法，其中该花生四烯酸(ARA)是处于油的形式。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于这种包含该花生四烯酸的油是通过包括以下步骤的方法来制备：

o在异养条件下培养菌株，以生产一种生物质，该生物质具有按重量计在40％和55％之间的脂类，以及按相对于总脂肪酸的重量计在50％和55％之间的ARA，

o收获由此制备的生物质，

o干燥所述生物质，

o用选自己烷和丁烷的溶剂提取该油，以及

o精炼并回收由此提取的油。

7.如权利要求1所述的菌株用于生产感兴趣的脂类化合物的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述感兴趣的脂类化合物是花生四烯酸(ARA)。

9.通过如权利要求2或3所述的方法生产的感兴趣的脂类化合物在制备预期用于食品行业的化合物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其中所述感兴趣的脂类化合物是花生四烯酸(ARA)。

11.一种产品或组合物，其包括如权利要求1所述的菌株或其富含感兴趣的脂类化合物的细胞裂解物或提取物，其特征在于它富含花生四烯酸(ARA)，并且它包括按相对于总脂肪酸的重量计高于50％的花生四烯酸(ARA)，并且包含：

-低于0.5％的EPA，

-低于0.5％的肉豆蔻酸(C14:0)，

-低于9％的棕榈酸(C16:0)，

-低于3％的山萮酸(C22:0)以及

-低于3％的木蜡酸(C24:0)。

12.如权利要求11所述的产品或组合物，其特征在于，它包含：

-低于0.2％的EPA，

-低于0.2％的肉豆蔻酸(C14:0)，

-低于7％的棕榈酸(C16:0)，

-低于2.5％的山萮酸(C22:0)以及

-低于2.5％的木蜡酸(C24:0)。

13.如权利要求11至12中任一项所述的产品或组合物，其特征在于它是一种食物产品或食品增补剂。

14.在如权利要求6中所述的提取油之后获得的该被孢霉属菌株的残余生物质在动物饲料中的用途。

15.如权利要求14所述的用途，其中所述残余生物质作为一种饲料增补剂用于农畜、宠物、以及在水产业中。